用于治疗癌症的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2020年3月18日提交的美国临时申请第62/991,314号以及2019年6月14日提交的美国临时申请第62/861,838号的权益，以上申请各自通过引用整体并入本文。
3.关于序列表的声明
4.与本技术相关的序列表以文本格式提供，代替纸质副本，并且特此通过引用并入说明书中。含有序列表的文本文件的名称是blbd_123_02wo_st25。文本文件为152kb，创建于2020年6月5日，并在本说明书提交的同时，经由efs-web以电子方式提交。
背景技术：
技术领域
5.本发明涉及用于治疗癌症的改进的组合物和方法。更具体地，本发明涉及编码抗cd79a嵌合抗原受体(car)和抗cd20嵌合共刺激受体(ccr)的融合多肽、表达所述融合多肽的基因修饰的免疫效应细胞，任选地包含一种或多种基因组编辑，以及这些组合物有效治疗癌症的用途。
6.现有技术
7.癌症是全世界的重要健康问题。基于2008-2010年的发病率，目前出生的40.76％的男性和女性将在其一生中的某个时间被诊断患有某种形式的癌症。20.37％的男性将在其50岁至70岁之间发展成癌症，而女性为15.30％。2010年1月1日，美国大约有13,027,914名男性和女性仍然有癌症史
‑‑
6,078,974名男性和6,948,940名女性。据估计，2013年，美国的1,660,290名男性和女性(854,790名男性和805,500名女性)将被诊断为患有癌症，并且580,350名男性和女性将死于所有部位的癌症。howlader等人2013。
8.b细胞的恶性转化导致癌症，包括但不限于淋巴瘤，例如多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。患有b细胞恶性肿瘤(包括非霍奇金淋巴瘤(nhl)和多发性骨髓瘤(mm))的绝大部分患者是癌症死亡的重要促成因素。b细胞恶性肿瘤对各种形式的治疗的反应是混合的。治疗b细胞恶性肿瘤的传统方法，包括化学疗法和放射疗法，由于毒性副作用而具有有限的效用。
9.复发/难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)的新治疗尚未满足治疗该疾病的未满足需求，这通过尝试改进标准r-chop(利妥昔单抗(rituximab)[rituxan]与环磷酰胺、多柔比星(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)和泼尼松(prednisone))疗法的临床试验中的若干近期挫折所证明。将依鲁替尼(ibrutinib)(imbruvica)与r-chop组合的iii期phoenix试验未能其无事件生存率改善的主要终点。来自coral和scholar-1试验的结果进一步证明了患有难治性dlbcl的患者的高未满足需求。在这些各项研究中，干细胞移植后12个月内复发或患有难治性疾病的患者的长期总存活率(os)仅为15％至20％。
[0010]
cd19 car t细胞疗法yescarta和kymriah已被批准用于治疗患有复发性/难治性
dlbcl的患者，并且cd19 car t细胞疗法jcar017正在批准过程中。仍然限制此类car t细胞疗法的功效的一个主要障碍是“抗原阴性”癌症的复发。例如，尽管抗cd19 car t细胞疗法最初导致复发性和难治性急性dlbcl中的适度应答率，但cd19阴性母细胞复发的可能性很大。适度有效的car t细胞疗法与令人震惊的高抗原阴性复发率结合再次证实了向dlbcl患者提供高效car t免疫疗法的未满足的医疗需求。
技术实现要素：
[0011]
本发明通常提供了改进的过继细胞疗法及其使用方法。更具体地，本发明提供了用于预防、治疗或改善表达cd79a和/或cd20的癌症的至少一种症状的过继细胞疗法。
[0012]
在各种实施方案中，提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含抗cd79a嵌合抗原受体(car)、多肽裂解信号和抗cd20嵌合共刺激受体(ccr)。
[0013]
在特定实施方案中，所述抗cd79a car包含抗cd79a抗体或其抗原结合片段；第一跨膜结构域；第一细胞内共刺激信号传导结构域；以及初级信号传导结构域。
[0014]
在一些实施方案中，所述抗cd79a car包含选自由以下组成的组的抗cd79a抗体或其抗原结合片段：fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab,纳米抗体)。
[0015]
在各种实施方案中，所述抗cd79a car包含作为scfv的抗cd79a抗体或其抗原结合片段。
[0016]
在某些实施方案中，所述抗cd79a car包含抗cd79a抗体或其抗原结合片段，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:1-3或9-11中所示的cdrl1-cdrl3序列的可变轻链序列和包含seq id no:4-6或12-14中所示的cdrh1-cdrh3序列的可变重链序列。
[0017]
在特定实施方案中，所述抗cd79a car包含抗cd79a抗体或其抗原结合片段，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:1-3中所示的轻链cdr和如seq id no:4-6中所示的重链cdr。
[0018]
在一些实施方案中，所述抗cd79a car包含抗cd79a抗体或其抗原结合片段，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:9-11中所示的轻链cdr和如seq id no:12-14中所示的重链cdr。
[0019]
在各种实施方案中，所述抗cd79a car包含抗cd79a抗体或其抗原结合片段，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:7或15中任一者所示的可变轻链序列和如seq id no:8或16中任一者所示的可变重链序列。
[0020]
在特定实施方案中，所述抗cd79a car包含抗cd79a抗体或其抗原结合片段，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:7中所示的可变轻链序列和/或如seq id no:8中所示的可变重链序列。
[0021]
在某些实施方案中，所述抗cd79a car包含抗cd79a抗体或其抗原结合片段，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:15中所示的可变轻链序列和/或如seq id no:16中所示的可变重链序列。
[0022]
在特定实施方案中，所述抗cd79a car包含从多肽中分离的第一跨膜结构域，所述
多肽选自由以下组成的组：t细胞受体的α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154和pd1。
[0023]
在一些实施方案中，所述抗cd79a car包含从cd8α中分离的第一跨膜结构域。
[0024]
在各种实施方案中，所述抗cd79a car包含从共刺激分子中分离的第一共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c、slp76、trim和zap70。
[0025]
在某些实施方案中，所述抗cd79a car包含从cd137中分离的第一共刺激信号传导结构域。
[0026]
在特定实施方案中，所述抗cd79a car包含从多肽中分离的初级信号传导结构域，所述多肽选自由以下组成的组：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。
[0027]
在另外的实施方案中，所述抗cd79a car包含从cd3ζ中分离的初级信号传导结构域。
[0028]
在一些实施方案中，所述融合多肽包含抗cd79a car、cd8α铰链结构域、cd8α跨膜结构域、cd137共刺激结构域和cd3ζ初级信号传导结构域、多肽裂解信号和抗cd20 ccr，所述抗cd79a car包含如seq id no:7或15中任一者所示的可变轻链序列和如seq id no:8或16中任一者所示的可变重链序列。
[0029]
在特定实施方案中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解多肽。
[0030]
在各种实施方案中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解2a多肽。
[0031]
在一些实施方案中，所述多肽裂解信号是选自由以下组成的组的病毒自裂解多肽：口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)肽、马a型鼻炎病毒(erav)2a(e2a)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(tav)2a(t2a)肽、猪捷申病毒-1(ptv-1)2a(p2a)肽、泰勒病毒2a肽和脑心肌炎病毒2a肽。
[0032]
在某些实施方案中，提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含：包含如seq id no:17-20中任一者所示的氨基酸序列的抗cd79a car、t2a自裂解多肽和本文预期的抗cd20 ccr。
[0033]
在特定实施方案中，所述抗cd20 ccr包含抗cd20抗体或其抗原结合片段、第二跨膜结构域和第二细胞内共刺激结构域。
[0034]
在另外的实施方案中，所述抗cd20 ccr包含选自由以下组成的组的抗cd20抗体或其抗原结合片段：fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab,纳米抗体)。
[0035]
在各种实施方案中，所述抗cd20 ccr包含作为scfv的抗cd20抗体或其抗原结合片段。
[0036]
在其他实施方案中，所述抗cd20 ccr包含抗cd20抗体或其抗原结合片段，所述抗cd20抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:25-27中所示的cdrl1-cdrl3序列的可变轻链序列和包含seq id no:28-30中所示的cdrh1-cdrh3序列的可变重链序列。
[0037]
在某些实施方案中，所述抗cd20 ccr包含抗cd20抗体或其抗原结合片段，所述抗
cd20抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:31中所示的可变轻链序列和如seq id no:32中所示的可变重链序列。
[0038]
在特定实施方案中，所述抗cd20 ccr包含从多肽中分离的第二跨膜结构域，所述多肽选自由以下组成的组：t细胞受体的α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154和pd1。
[0039]
在一些实施方案中，所述抗cd20 ccr包含从cd8α中分离的第二跨膜结构域。
[0040]
在另外的实施方案中，所述抗cd20 ccr包含从共刺激分子中分离的第二共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c、slp76、trim和zap70。
[0041]
在各种实施方案中，所述抗cd20 ccr包含从cd28中分离的第二共刺激信号传导结构域。
[0042]
在某些实施方案中，所述抗cd20 ccr包含cd8α铰链、cd8α跨膜结构域和cd28共刺激信号传导结构域。
[0043]
在特定实施方案中，提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含：包含seq id no:17-20中任一者所示的氨基酸序列抗cd79a car、t2a自裂解多肽以及包含seq id no:33或seq id no:35中所示的氨基酸序列的抗cd20 ccr。
[0044]
在另外的实施方案中，融合多肽包含seq id no:37或seq id no:39中所示的氨基酸序列。
[0045]
在特定实施方案中，提供了编码本文涵盖的抗cd79a car和抗cd20car的多核苷酸。
[0046]
在一些实施方案中，提供了编码本文涵盖的融合多肽的多核苷酸。
[0047]
在各种实施方案中，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含seq id no:38或seq id no:40中所示的序列。
[0048]
在一些实施方案中，提供了包含本文涵盖的多核苷酸的载体。
[0049]
在特定实施方案中，所述载体是表达载体。
[0050]
在其他实施方案中，所述载体是附加型载体。
[0051]
在特定实施方案中，所述载体是病毒载体。
[0052]
在某些实施方案中，所述载体是逆转录病毒载体。
[0053]
在各种实施方案中，所述载体是慢病毒载体。
[0054]
在各种实施方案中，提供了表达本文涵盖的融合多肽的细胞。
[0055]
在特定实施方案中，提供了包含编码本文涵盖的融合多肽的多核苷酸的细胞或包含本文涵盖的载体的细胞。
[0056]
在各种实施方案中，提供了一种细胞，所述细胞包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码：包含抗cd79a抗体或其抗原结合片段的抗cd79a car；第一跨膜结构域；第一细胞内共刺激信号传导结构域；和初级信号传导结构域；以及包含抗cd20抗体或其抗原结合片段的抗cd20 ccr；第二跨膜结构域；第二细胞内共刺激信号传导结构域。
[0057]
在特定实施方案中，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段和抗cd20抗体或其抗原
结合片段都独立地选自由以下组成的组：fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab,纳米抗体)。
[0058]
在某些实施方案中，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段和抗cd20抗体或其抗原结合片段都是scfv。
[0059]
在各种实施方案中，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:1-3或9-11中所示的cdrl1-cdrl3序列的可变轻链序列和包含seq id no:4-6或12-14中所示的cdrh1-cdrh3序列的可变重链序列。
[0060]
在其他实施方案中，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:1-3中所示的轻链cdr和如seq id no:4-6中所示的重链cdr。
[0061]
在特定实施方案中，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:9-11中所示的轻链cdr和如seq id no:12-14中所示的重链cdr。
[0062]
在各种实施方案中，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:7或15中任一者所示的可变轻链序列和如seq id no:8或16中任一者所示的可变重链序列。
[0063]
在一些实施方案中，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:7中所示的可变轻链序列和/或如seq id no:8中所示的可变重链序列。
[0064]
在另外的实施例中，所述抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:15中所示的可变轻链序列和/或如seq id no:16中所示的可变重链序列。
[0065]
在某些实施方案中，所述抗cd20抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:25-27中所示的cdrl1-cdrl3序列的可变轻链序列和包含seq id no:28-30中所示的cdrh1-cdrh3序列的可变重链序列。
[0066]
在各种实施方案中，所述抗cd20抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:31中所示的可变轻序链列和如seq id no:32中所示的可变重链序列。
[0067]
在特定实施方案中，所述第一跨膜结构域和所述第二跨膜结构域各自独立地从多肽中分离，所述多肽选自由以下组成的组：t细胞受体的α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154和pd1。
[0068]
在另外的实施方案中，所述第一跨膜结构域和所述第二跨膜结构域都从cd8α中分离。
[0069]
在各种实施方案中，所述第一共刺激信号传导结构域和所述第二共刺激信号传导结构域各自独立地从共刺激分子中分离，所述共刺激分子选自由以下组成的组：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c、slp76、trim和zap70。
[0070]
在某些实施方案中，所述第一共刺激信号传导结构域从cd137中分离。
[0071]
在其他实施方案中，所述初级信号传导结构域从多肽中分离，所述多肽选自由以下组成的组：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。
[0072]
在特定实施方案中，所述初级信号传导结构域从cd3ζ中分离。
[0073]
在各种实施方案中，所述第二共刺激信号传导结构域从cd28中分离。
[0074]
在特定实施方案中，所述抗cd20 ccr包含cd8α铰链结构域、cd8α跨膜结构域和cd28共刺激信号传导结构域。
[0075]
在特定实施方案中，所述细胞表达包含seq id no:17-20中任一者所示的氨基酸序列的抗cd79a car和包含seq id no:33或seq id no:35中所示的氨基酸序列的抗cd20 ccr。
[0076]
在一些实施方案中，所述细胞包含编码抗cd79a car的第一多核苷酸和编码抗cd20 ccr的第二多核苷酸。
[0077]
在各种实施方案中，分离的多核苷酸编码抗cd79a car和抗cd20 ccr。
[0078]
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸编码抗cd79a car、ires序列和抗cd20 ccr。
[0079]
在特定实施方案中，所述分离的多核苷酸编码抗cd79a car、多肽裂解信号和抗cd20 ccr。
[0080]
在各种实施方案中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解多肽。
[0081]
在某些实施方案中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解2a多肽。
[0082]
在各种实施方案中，所述多肽裂解信号是选自由以下组成的组的病毒自裂解多肽：口蹄疫病毒(fmdv)2a(f2a)肽、马a型鼻炎病毒(erav)2a(e2a)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(tav)2a(t2a)肽、猪捷申病毒-1(ptv-1)2a(p2a)肽、泰勒病毒2a肽和脑心肌炎病毒2a肽。
[0083]
在特定实施方案中，所述细胞包含在casitas b谱系(cbl)淋巴瘤原癌基因b(cblb)基因中的归巢核酸内切酶(he)变体裂解靶位点或megatal裂解靶位点中的一个或多个核苷酸的插入或缺失。
[0084]
在某些实施方案中，所述he变体将一个或多个插入或缺失引入到seq id no 55中所示的所述cblb基因中的所述he靶位点中。
[0085]
在一些实施方案中，所述megatal将一个或多个插入或缺失引入到seq id no 56中所示的所述cblb基因中的所述megatal靶位点中。
[0086]
在特定实施方案中，所述cblb基因中的插入或缺失降低cblb表达、功能和/或活性。
[0087]
在另外的实施方案中，所述细胞包含一个或多个修饰的cblb等位基因。
[0088]
在另外的实施方案中，所述细胞包含一个或多个修饰的cblb等位基因，所述一个或多个修饰的cblb等位基因不表达或产生cblb，或表达或产生非功能性cblb。
[0089]
在特定实施方案中，所述细胞包含在程序性细胞死亡1(pdcd-1)基因中的归巢核酸内切酶(he)变体裂解靶位点或megatal裂解靶位点中的一个或多个核苷酸的插入或缺失。
[0090]
在一些实施方案中，所述he变体将一个或多个插入或缺失引入到seq id no:51中所示的所述pdcd-1基因中的所述he靶位点中。
[0091]
在另外的实施方案中，所述megatal将一个或多个插入或缺失引入到seq id no:52中所示的所述pdcd-1基因中的所述megatal靶位点中。
[0092]
在特定实施方案中，所述pdcd-1基因中的插入或缺失降低pdcd-1表达、功能和/或活性。
[0093]
在一些实施方案中，所述细胞包含一个或多个修饰的pdcd-1等位基因。
[0094]
在特定实施方案中，所述细胞包含一个或多个修饰的pdcd-1等位基因，所述一个或多个修饰的pdcd-1等位基因不表达或产生pdcd-1，或表达或产生非功能性pdcd-1。
[0095]
在另外的实施方案中，所述细胞是造血细胞。
[0096]
在某些实施方案中，所述细胞是造血干细胞或祖细胞。
[0097]
在其他实施方案中，所述细胞是cd34
造血干细胞或祖细胞。
[0098]
在特定实施方案中，所述细胞是免疫效应细胞。
[0099]
在各种实施方案中，所述细胞是t细胞。
[0100]
在某些实施方案中，所述细胞是cd3
、cd4 和/或cd8
细胞。
[0101]
在特定实施方案中，所述细胞是细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)或辅助t细胞。
[0102]
在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(nk)细胞或自然杀伤t(nkt)细胞。
[0103]
在各种实施方案中，提供了包含本文涵盖的多个细胞的细胞群。
[0104]
在另外的实施方案中，提供了包含本文涵盖的一种或多种造血干细胞或祖细胞和一种或多种免疫效应细胞的细胞群。
[0105]
在各种实施方案中，提供了包含本文所涵盖的一种或多种cd34
造血干细胞或祖细胞和一种或多种t细胞的细胞群。
[0106]
在某些实施方案中，组合物包含本文涵盖的基因修饰的细胞和生理学上可接受的赋形剂。
[0107]
在一些实施方案中，组合物包含本文涵盖的细胞群和生理学上可接受的赋形剂。
[0108]
在特定实施方案中，提供了用于杀死受试者中表达cd79a或cd20的癌细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文涵盖的组合物。
[0109]
在特定实施方案中，提供了用于杀死受试者中表达cd79a和cd20的癌细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文涵盖的组合物。
[0110]
在特定实施方案中，提供了用于杀死受试者中表达cd79a和/或cd20的癌细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文涵盖的组合物。
[0111]
在各种实施方案中，提供了一种用于减少受试者中表达cd79a和cd20的癌细胞数目的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文涵盖的组合物，与施用之前表达cd79a和cd20的癌细胞数目相比，所述治疗有效量足以减少表达cd79a和cd20的癌细胞数目。
[0112]
在各种实施方案中，提供了一种用于减少受试者中表达cd79a或cd20的癌细胞数目的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文涵盖的组合物，与施用之前表达cd79a或cd20的癌细胞数目相比，所述治疗有效量足以减少表达cd79a或cd20的癌细胞数目。
[0113]
在各种实施方案中，提供了一种用于减少受试者中表达cd79a和/或cd20的癌细胞数目的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文涵盖的组合物，与施用之前表达cd79a和/或cd20的癌细胞数目相比，所述治疗有效量足以减少表达cd79a和/或cd20的癌细胞数目。
[0114]
在一些实施方案中，提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文涵盖的组合物。
[0115]
在特定实施方案中，所述癌症是实体癌。
[0116]
在其他实施方案中，所述实体癌是骨肉瘤或尤文氏肉瘤。
[0117]
在某些实施方案中，所述癌症是液体癌。
[0118]
在一些实施方案中，所述癌症是血液恶性肿瘤。
[0119]
在各种实施方案中，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、毛细胞白血病(hcl)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)或慢性髓性白血病(cml)。
[0120]
在特定实施方案中，所述非霍奇金淋巴瘤是伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、套细胞淋巴瘤(mcl)或边缘区淋巴瘤(mzl)。
[0121]
在各种实施方案中，所述非霍奇金淋巴瘤是弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。
[0122]
在一些实施方案中，所述癌症是选自由以下组成的组的mm：明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、igd骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。
[0123]
在各种实施方案中，提供了一种用于治疗患有dlbcl的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文涵盖的组合物。
[0124]
在特定实施方案中，提供了一种用于改善与受试者中表达cd79a和/或cd20的癌症相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用足以改善与表达cd79a和/或cd20的癌细胞相关的至少一种症状的治疗有效量的本文涵盖的组合物。
[0125]
在某些实施方案中，改善的所述至少一种症状选自由以下组成的组：虚弱、疲劳、呼吸短促、容易挫伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹部肿胀或疼痛、骨骼或关节疼痛、骨折、意外体重减轻、食欲不振、盗汗、持续性轻度发烧以及排尿减少。
[0126]
在特定实施方案中，提供了一种产生表达本文涵盖的融合多肽的细胞群的方法，所述方法包括将本文涵盖的多核苷酸或载体引入到细胞群中。
[0127]
在各种实施方案中，提供了一种产生表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的细胞群的方法，所述方法包括将一种或多种编码本文涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的多核苷酸引入到细胞群中。
[0128]
在一些实施方案中，提供了一种产生表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的细胞群的方法，所述方法包括将编码本文涵盖的融合多肽的多核苷酸引入到细胞群中。
[0129]
在一些实施方案中，提供了一种产生表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的细胞群的方法，所述方法包括将编码seq id no:37或seq id no:39中所示的融合多肽序列的多核苷酸引入到细胞群中。
[0130]
在某些实施方案中，提供了一种产生表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的细胞群的方法，所述方法包括将编码seq id no:17-20中任一者所示的抗cd79a car的第一多核苷酸和编码seq id no:33或seq id no:35中所示的所述抗cd20 ccr序列的第二多核苷酸引入到所述细胞群中。
[0131]
在特定实施方案中，提供了一种产生表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的细胞群的方法，所述方法包括将seq id no:38或seq id no:40中所示的所述多核苷酸序列引入到所述细胞群中。
[0132]
在各种实施方案中，提供了一种产生表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的细胞群的方法，所述方法包括将seq id no:21至24中任一者所示的第一多核苷酸序列和seq id no:34或seq id no:36中所示的第二多核苷酸序列引入到所述细胞群中。
[0133]
在特定实施方案中，所述细胞群中的一个或多个细胞包含seq id no:51中所示的多核苷酸序列处的pdcd-1基因中的一个或多个插入或缺失，所述一个或多个插入或缺失降低或消除pdcd-1表达和/或功能。
[0134]
在某些实施方案中，将编码结合和裂解seq id no:51中所示的多核苷酸序列的he变体的多核苷酸引入到所述细胞群中。
[0135]
在特定实施方案中，细胞群中的一个或多个细胞包含seq id no:52中所示的多核苷酸序列处的pdcd-1基因中的一个或多个插入或缺失，所述一个或多个插入或缺失降低或消除pdcd-1表达和/或功能。
[0136]
在一些实施方案中，将编码结合和裂解seq id no:52中所示的多核苷酸序列的megatal的多核苷酸引入到所述细胞群中。
[0137]
在某些实施方案中，所述细胞群中的一个或多个细胞包含seq id no:55中所示的多核苷酸序列处的所述cblb基因中的一个或多个插入或缺失，所述一个或多个插入或缺失降低或消除cblb表达和/或功能。
[0138]
在特定实施方案中，将编码结合和裂解seq id no:55中所示的多核苷酸序列的he变体的多核苷酸引入到所述细胞群中。
[0139]
在一些实施方案中，所述细胞群中的一个或多个细胞包含seq id no:56中所示的多核苷酸序列处的所述cblb基因中的一个或多个插入或缺失，所述一个或多个插入或缺失降低或消除cblb表达和/或功能。
[0140]
在特定实施方案中，将编码结合和裂解seq id no:56中所示的多核苷酸序列的megatal的多核苷酸引入到所述细胞群中。
[0141]
在一些实施方案中，所述细胞群包含造血干细胞或祖细胞。
[0142]
在某些实施方案中，所述细胞群包含cd34
造血干细胞或祖细胞。
[0143]
在各种实施方案中，所述细胞群包含免疫效应细胞。
[0144]
在特定实施方案中，所述细胞群包含t细胞、nk细胞和/或nkt细胞。
[0145]
在各种实施方案中，所述细胞群包含t细胞。
附图说明
[0146]
图1a-图1c显示了抗cd79a car和抗cd20 ccr表达和活性。a)未转导的pbmc(utd)或用编码抗cd79a car、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白的慢病毒载体转导的pbmc上的cd79a car表达。b)该图显示了在不存在靶细胞的情况下或与rd细胞(cd79a-、cd20-)、rd.cd79a细胞(cd79a
、cd20-)、rd.cd79a.cd20细胞(cd79a
、cd20
)或daudi细胞(cd79a
、cd20
，高表达)共培养的utd t细胞或表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞的ifnγ分泌。c)该图显示了在不存在靶细胞的情况下或与rd细胞(cd79a-、cd20-)、rd.cd79a细胞(cd79a
、cd20-)、rd.cd79a.cd20细胞(cd79a
、cd20
)或daudi细胞(cd79a
、cd20
，高表达)共培养的utd t细胞、抗cd79a car t细胞或表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞的il-2分泌。
[0147]
图2a和图2b显示了抗cd79a car和抗cd20 ccr针对rd.cd20细胞的活性。a)该图显
ccr融合蛋白的慢病毒载体转导的pbmc在daudi细胞的存在下以1:1的比率共培养24小时，并且收集上清液并使用luminex分析ifnγ(左图，n＝3)。将nsg小鼠静脉内注射2
×
106个表达荧光素酶的daudi细胞；在13天后，将五只小鼠注射媒介物(培养基)、10
×
106个utd t细胞或10
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞；并且将小鼠监测30天(右图)。
[0154]
图9显示了表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞在体外和体内对nu-dul-1细胞(dlbcl肿瘤模型)的功效。未转导的pbmc(utd)或用编码抗cd79a car、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白的慢病毒载体转导的pbmc在nu-dul-1细胞的存在下以1:1的比率共培养24小时，并且收集上清液并使用luminex分析ifnγ(左图，n＝3)。将nsg小鼠静脉内注射2
×
106个表达荧光素酶的nu-dul-1细胞；在15天后，将五只小鼠注射媒介物(培养基)、10
×
106个utd t细胞或5
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞；并且将小鼠监测30天(右图)。
[0155]
图10显示了表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞在体外和体内对toledo(生发中心b细胞(gcb)dlbcl肿瘤模型)的功效。未转导的pbmc(utd)或用编码抗cd79a car、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白的慢病毒载体转导的pbmc在gcb dlbcl细胞的存在下以1:1的比率共培养24小时，并且收集上清液并使用luminex分析ifnγ(左图，n＝3)。将nsg小鼠静脉内注射50
×
106个表达荧光素酶的gcb dlbcl细胞；在16天后(100mm3的肿瘤)，将五只小鼠注射媒介物(培养基)、20
×
106个utd t细胞或2.5
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞；并且将小鼠监测30天(右图)。
[0156]
图11显示了在cblb编辑的存在下表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞在体外和体内对toledo(germinal center b cell(gcb)dlbcl肿瘤模型)的功效。将未转导pbmc(utd)或用编码在cblb基因座具有和不具有基因组编辑的抗cd79a car、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白的慢病毒载体转导的pbmc在gcb dlbcl细胞的存在下以1:1的比率共培养24小时，并且收集上清液并使用luminex分析ifnγ(左图，n＝3)。将nsg小鼠静脉内注射50
×
106个表达荧光素酶的gcb dlbcl细胞；在17天后(130mm3的肿瘤)，将五只小鼠注射媒介物(培养基)、5
×
106个utd t细胞 /-cblb编辑或1
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr /-cblb编辑的t细胞；并且将小鼠监测21天(右图)。
[0157]
图12显示了在cblb编辑的存在下表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞在体内对daudi.cd20ko(cd20敲除)肿瘤模型的功效。将nsg小鼠静脉内注射2
×
106个表达荧光素酶的daudi.cd20ko细胞；在14天后，将五只小鼠注射媒介物(培养基)、20
×
106个utd t细胞 /-cblb编辑或10
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr /-cblb编辑的t细胞；并且将小鼠监测30天。
[0158]
图13示出了在cblb编辑的存在下表达抗cd79a car和抗cd20 ccr并使用抗cd3和抗cd28抗体活化的t细胞中的细胞因子分泌。将1
×
106个细胞/ml的utd t细胞 /-cblb编辑或表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞在包被有针对cd3(从1μg/ml滴定至0.063μg/ml)和cd28(5μg/ml)的单克隆抗体的96孔高结合板中培养24小时，经由luminex测量il-2(左图)和ifnγ(右图)(n＝3)。
[0159]
图14示出了在cblb编辑的存在下表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞中增强的il-2分泌。将utd t细胞 /-cblb编辑和表达抗cd79acar和抗cd20 ccr /-cblb的t细胞以1:1的比率与daudi肿瘤细胞(伯基特淋巴瘤；cd79
、cd20
)共培养24小时，并且收集上清液并使用luminex分析il-2。
[0160]
图15显示了与用tcrα死亡的megatal处理的t细胞相比，用cblb megatal处理的t细胞在连续再刺激测定中表现出增强的增殖。将utd t细胞或用编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的单一慢病毒载体转导的t细胞用cblb megatal或tcrα死亡的megatal处理，并进行连续再刺激测定(n＝4)。
[0161]
图16显示了在针对gcb dlbcl肿瘤模型的cblb编辑的存在下表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞的增强的细胞因子应答。用编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的慢病毒载体转导的来自3个健康供体(dh)和3个dlbcl供体(dl)的pbmc以1:1的比率与toledo gcb dlbcl肿瘤细胞共培养24小时，并且收集上清液并使用luminex分析ifnγ。
[0162]
序列标识符简述
[0163]
seq id no:1-16示出了本文涵盖的抗cd79a car的示例性轻链cdr序列、重链cdr序列、可变结构域轻链和可变结构域重链的氨基酸序列。
[0164]
seq id no:17-20示出了示例性抗cd79a car的氨基酸序列。
[0165]
seq id no:21-24示出了示例性抗cd79a car的核酸序列。
[0166]
seq id no:25-32示出了本文涵盖的抗cd20 ccr的示例性轻链cdr序列、重链cdr序列、可变结构域轻链和可变结构域重链的氨基酸序列。
[0167]
seq id no:33和35示出了示例性抗cd20 ccr的氨基酸序列。
[0168]
seq id no:34和36示出了示例性抗cd20 ccr的氨基酸序列。
[0169]
seq id no:37和39示出了示例性抗cd79a car-t2a-抗cd20 ccr融合蛋白的氨基酸序列。
[0170]
seq id no:38和40示出了示例性抗cd79a car-t2a-抗cd20 ccr融合蛋白的核酸序列。
[0171]
seq id no:41和43示出了示例性抗cd79a car-t2a-抗cd20 cd28zcar融合蛋白的氨基酸序列。
[0172]
seq id no:42和44示出了示例性抗cd79a car-t2a-抗cd20 cd28zcar融合蛋白的核酸序列。
[0173]
seq id no:45和47示出了示例性抗cd79a car-t2a-抗cd20 bbz car融合蛋白的氨基酸序列。
[0174]
seq id no:46和48示出了示例性抗cd79a car-t2a-抗cd20 bbz car融合蛋白的核酸序列。
[0175]
seq id no:49是i-onui lhe变体的氨基酸序列，所述变体被重编程以结合并裂解人pdcd-1基因中的靶位点。
[0176]
seq id no:50是结合并裂解人pdcd-1基因中的靶位点的megatal的氨基酸序列。
[0177]
seq id no:51是人pdcd-1基因中的i-onui lhe变体靶位点。
[0178]
seq id no:52是人pdcd-1基因中的megatal靶位点。
[0179]
seq id no:53是i-onui lhe变体的氨基酸序列，所述变体被重编程以结合并裂解人cblb基因中的靶位点。
[0180]
seq id no:54是结合并裂解人cblb基因中的靶位点的megatal的氨基酸序列。
[0181]
seq id no:55是人cblb基因中的i-onui lhe变体靶位点。
[0182]
seq id no:56是人cblb基因中的megatal靶位点。
[0183]
seq id no:57-67示出了各种接头的氨基酸序列。
[0184]
seq id no:68-92示出了蛋白酶裂解位点和自裂解多肽裂解位点的氨基酸序列。在前述序列中，如果存在x，则其是指任何氨基酸或不存在某一氨基酸。
具体实施方式
[0185]
a.概述
[0186]
癌症通常是表达不同水平的各种抗原的细胞的异质集合。通常，免疫疗法最初被选择以靶向在大多数癌细胞上表达并且在正常细胞上基本上缺乏表达的抗原。有效的靶向免疫疗法将杀死大多数表达靶抗原的癌细胞，导致部分或完全缓解。然而，由于大多数癌症在本质上是异质性的，所以不表达或表达低水平的靶向抗原的剩余癌细胞得以保留，并且可能潜在地产生初始免疫疗法未有效靶向的癌细胞。
[0187]
仍然限制过继细胞疗法功效的一个主要障碍是“抗原阴性”癌症的复发。令人惊异的高抗原阴性复发率表示迄今为止尚未满足的过继细胞疗法的需求。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人已经解决了通过重新工程化免疫效应细胞(例如，t细胞，nk细胞)以表达靶向多种抗原的嵌合抗原受体(car)和嵌合共刺激受体(ccr)来杀伤表达多种靶抗原的异种癌症的问题，并且协同地激活多个细胞内细胞信号传导途径以加强炎性细胞因子应答和杀伤携带一种或两种靶抗原的肿瘤细胞并防止其复发的能力。令人惊讶的是，本发明人已发现表达针对不同抗原的car和ccr的免疫效应细胞不需要靶细胞上存在两种抗原，以便引发炎性细胞因子应答并杀死细胞。这是令人惊讶的，因为ccr不包含信号传导结构域，因此，理论上不应能够自行信号传导。因此，本文涵盖的组合物和方法代表针对异源癌症的t细胞免疫疗法中的重要进展。
[0188]
限制过继细胞疗法的功效的另一个障碍是免疫效应细胞由于肿瘤微环境介导的耗竭而产生低反应性。例如，耗竭的t细胞具有与天然、效应或记忆t细胞显著不同的独特分子标记。它们被定义为细胞因子表达和效应子功能降低的免疫效应细胞。程序性细胞死亡1(pdcd-1)是t细胞耗竭标记物；增加的pd-1表达与降低的t细胞增殖和降低的il-2、tnf和ifn-γ的产生相关。casitas b谱系(cbl)淋巴瘤原癌基因b(cblb)是ring-手指家族或e3泛素连接酶的成员，其涉及效应t细胞活性和持久性的负调节。cblb敲除小鼠t细胞是过度增殖的，响应于抗原刺激而产生升高水平的il2和ifnγ，对tgfβ介导的抑制具有抗性，并且具有较低的活化阈值，表明cblb在负调节t细胞活化中起作用。不希望受任何特定理论的束缚，预期表达针对第一抗原的car和针对第二抗原的ccr的免疫效应细胞中pdcd-1和/或cblb基因的断裂导致更有效和持久的过继细胞疗法。
[0189]
本发明大体上涉及用于预防或治疗表达cd79a和/或cd20的癌症或预防、治疗或改善与表达cd79a和/或cd20的癌症相关的至少一种症状的改进的组合物和方法。在各种实施方案中，本发明涉及使用基因修饰的免疫效应细胞对表达cd79a和/或cd20的癌症的改进的过继细胞疗法，其中所述免疫效应细胞任选地包含一个或多个降低或消除pdcd1和/或cblb的表达和/或功能的基因组编辑。遗传方法提供了增强免疫识别和消除癌细胞的潜在手段。在特定实施方案中，考虑经修饰以表达嵌合抗原受体(car)和嵌合共刺激受体(ccr)的免疫效应细胞，以重定向针对表达car靶抗原或ccr靶抗原的癌细胞的细胞毒性，并且协同增强对癌症的免疫效应细胞应答。在特定优选实施方案中，经修饰以表达car和ccr的免疫效应
细胞还包含一个或多个降低或消除pdcd-1和/或cblb的表达和/或功能的基因组编辑。在其他特定优选实施方案中，经修饰以表达car和ccr的免疫效应细胞还包含一个或多个降低或消除cblb的表达和功能的基因组编辑。
[0190]
在本文的特定实施方案中考虑的过继细胞疗法的改进组合物和方法提供了基因修饰的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞可以容易地扩增，在体内表现出长期的持久性，并且证实对表达cd79a和/或cd20的细胞具有抗原依赖性细胞毒性，以及对肿瘤微环境中的免疫抑制剂信号的抗性。
[0191]
cd79a也称为b细胞抗原受体复合物相关蛋白α链、膜结合免疫球蛋白相关蛋白(mb1、mb-1)、表面igm相关蛋白和ig-α(iga)。编码cd79a的多核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：nm_001783.3、nm_021601.3、enst00000221972(uc002orv.3)、enst00000597454(uc060zdj.1)、enst00000444740(uc002oru.4)、hs.631567和ak223371。编码cd79a的多肽序列的示例性实例包括但不限于：p11912-1、p11912-2、ensp00000400605 ensp00000468922、ensp00000221972、np_001774.1和np_067612.1。
[0192]
cd79由两种蛋白质组成，即cd79a和cd79b。cd79a位于染色体19q13.2，并且编码大约47kda的226个氨基酸的糖蛋白。精确分子量取决于糖基化的程度。cd79b位于染色体17q23，并且编码大约37kda的229个氨基酸的糖蛋白。cd79a和cd79b共享外显子-内含子结构，两者均含有单个igsf ig结构域(对于cd79a为111个残基c型，对于cd79b为129个残基v型)。每个还含有高度保守的跨膜结构域和61(cd79a)或48(cd79b)个氨基酸的胞质尾区，其也表现出引人注目的氨基酸进化保守性。cd79a和cd79b由最早定型的b细胞祖细胞表达。在不存在μ重链的情况下，在早期b细胞祖细胞的表面上也观察到cd79a/b异源二聚体，尽管祖细胞定型为b细胞谱系不需要蛋白质。在发育后期，cd79a和cd79b与b细胞表面上的所有同种型的ig一起共表达为成熟bcr复合物。cd79蛋白对b谱系具有特异性，并且在整个b淋巴细胞中表达。cd79a和cd79b可用于鉴定b细胞肿瘤的标记，包括dlbcl、前体b细胞型的大多数急性白血病、b细胞系、b细胞淋巴瘤和一些骨髓瘤。
[0193]
cd20也称为膜跨4-结构域a(ms4a)、膜跨4-结构域、亚家族a、成员1、白细胞表面抗原leu-16(leu-16)、b-淋巴细胞表面抗原b1(b1)、s7和常见可变免疫缺陷5(cvid5)。编码cd79a的多核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：nm_021950.3、nm_152866.2、ak225630.1、x07203.1、ak292168.1、x12530.1、bc002807.2、nm_023945、nm_152867、enst00000345732和enst00000389939。编码cd79a的多肽序列的示例性实例包括但不限于：p11836、nx_p11836、ensp00000432219、ensp00000433519、ensp00000432270、ensp00000314620、ensp00000437002、ensp00000374589、ensp00000433179、ensp00000433277、np_690605.1和np_068769.2。
[0194]
cd20是跨膜的4a基因家族的成员。该新生蛋白质家族的成员的特征在于共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界，并且在造血细胞和非淋巴组织之间显示出独特的表达模式。该cd20基因编码在b细胞发育和分化成浆细胞中起作用的b淋巴细胞表面分子。cd20在大多数b细胞恶性肿瘤中表达，包括慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
[0195]
在各种实施方案中，经修饰以表达car和ccr的免疫效应细胞是高度有效的；经历稳健的体内扩增；并且识别表达cd79a和/或cd20的癌细胞并显示针对表达cd79a和/或cd20
的癌细胞的细胞毒性活性。
[0196]
在各种优选实施方案中，免疫效应细胞经修饰以表达car和ccr并且还包含一种或多种降低或消除pdcd-1和/或cblb的表达和/或功能的基因组编辑。
[0197]
在一个实施方案中，免疫效应细胞经基因修饰以表达抗cd79 car和抗cd20 ccr，并且还包含一个或多个降低或消除cblb的表达和功能的基因组编辑。表达car和ccr的t细胞在本文中称为car/ccr t细胞或car/ccr修饰的t细胞。
[0198]
在一个实施方案中，考虑了包含抗cd79 car、多肽裂解信号和抗cd20 ccr的融合多肽。
[0199]
在多个实施方案中，将基因修饰的免疫效应细胞施用于具有表达cd79a和/或cd20的癌细胞的受试者，包括但不限于液体肿瘤、血液恶性肿瘤和b细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，将经修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞施用于患有dlbcl的受试者。
[0200]
用于重组(即，工程改造)dna、肽和寡核苷酸合成的技术、免疫分析、组织培养、转化(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应、纯化以及相关技术和程序一般可以如本说明书通篇引用和论述的微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学及免疫学中的各种通用且更特定的参考文献中所描述来执行。参见，例如，sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual,第3版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.；current protocols in molecular biology(john wiley and sons,2008年7月更新)；short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,greene pub.associates and wiley-interscience；glover,dna cloning:a practical approach,第i卷和第ii卷(irl press,oxford univ.press usa,1985)；current protocols in immunology(编辑:john e.coligan,ada m.kruisbeek,david h.margulies,ethan m.shevach,warren strober 2001john wiley&sons,ny,ny)；real-time pcr:current technology and applications,编辑：julie logan,kirstin edwards和nick saunders,2009,caister academic press,norfolk,uk；anand,techniques for the analysis of complex genomes,(academic press,new york,1992)；guthrie和fink,guide to yeast genetics and molecular biology(academic press,new york,1991)；oligonucleotide synthesis(n.gait编,1984)；nucleic acid the hybridization(b.hames&s.higgins编,1985)；transcription and translation(b.hames&s.higgins编,1984)；animal cell culture(r.freshney编,1986)；perbal,a practical guide to molecular cloning(1984)；next-generation genome sequencing(janitz,2008wiley-vch)；pcr protocols(methods in molecular biology)(park编，第3版,2010humana press)；immobilized cells and enzymes(irl press,1986)；the treatise,methods in enzymology(academic press,inc.,n.y.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller和m.p.calos编,1987,cold spring harbor laboratory)；harlow和lane,antibodies,(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,1998)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer和walker编，academic press,london,1987)；handbook of experimental immunology,第i-iv卷
(d.m.weir和cc blackwell编，1986)；roitt,essential immunology,第6版,(blackwell scientific publications,oxford,1988)；current protocols in immunology(q.e.coligan,a.m.kruisbeek,d.h.margulies,e.m.shevach和w.strober编，1991)；annual review of immunology；以及诸如advances in immunology的期刊中的专题论文。
[0201]
b.定义
[0202]
在更加详细地阐述本公开之前，提供本文要使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。
[0203]
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本文所描述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料来实践或测试特定实施方案，但本文中描述组合物、方法和材料的优选实施方案。出于本公开的目的，下文定义以下术语。
[0204]
本文使用的冠词“一(a/an)”是指一个(种)或超过一个(种)(即至少一个(种)或一个(种)或多个(种))该冠词的语法对象。作为实例，“一个元件”意指一个元件或一个或多个元件。
[0205]
替代选择(例如“或”)的使用应理解为意指替代选择中的一种、两种或其任何组合。
[0206]
术语“和/或”应理解为意指替代选择中的一种或两种。
[0207]
如本文所使用，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度在大致参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度
±
15％、
±
10％、
±
9％、
±
8％、
±
7％、
±
6％、
±
5％、
±
4％、
±
3％、
±
2％或
±
1％的范围内。
[0208]
在一个实施方案中，范围，例如1至5、约1至5或约1至约5是指所述范围所涵盖的每个数字值。例如，在一个非限制性且仅说明性实施方案中，范围“1至5”相当于表述1、2、3、4、5；或1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0；或1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
[0209]
如本文所使用，术语“基本上”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度是参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比。在一个实施方案中，“基本上相同”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大致相同。
[0210]
在本说明书通篇，除非上下文另外要求，否则“包含(comprise/comprises/comprising)”一词应理解为暗指包括所述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或任何其他组步骤或要素。“由
……
组成”意指包括且限于短语“由
……
组成”之后的事物。因此，短语“由
……
组成”指示所列要素是必不可少或必需的，并且不能存在其他要素。“基本上由
……
组成”意指包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响关于所列要素的公开内容中所说明的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由
……
组
health and human services,1991，其特此以引用的方式并入)的序列，或通过根据chothia等人(chothia,c.或lesk,a.m.,j mol.biol.,196(4):901-917(1987),chothia,c.等人,nature,342:877-883(1989))的结构来定义或鉴别。
[0218]
用于预测轻链cdr的规则的说明性实例包括：cdr-l1始于约残基24，前接cys，为约10-17个残基，并且后接trp(通常为trp-tyr-gln，但也可为trp-leu-gln、trp-phe-gln、trp-tyr-leu)；cdr-l2始于cdr-l1末端后约16个残基，通常前接ile-tyr，但也前接val-tyr、ile-lys、ile-phe，并且为7个残基；并且cdr-l3始于cdr-l2末端后约33个残基，前接cys，为7-11个残基，并且后接phe-gly-xxx-gly(seq id no:97)(xxx是任何氨基酸)。
[0219]
用于预测重链cdr的规则的说明性实例包括：cdr-h1始于约残基26，前接cys-xxx-xxx-xxx(seq id no:94)，为10-12个残基，后接trp(通常为trp-val，但也可为trp-ile、trp-ala)；cdr-h2始于cdr-h1末端后约15个残基，通常前接leu-glu-trp-ile-gly(seq id no:95)，或许多变化，为16-19个残基，并且后接lys/arg-leu/ile/val/phe/thr/ala-thr/ser/ile/ala；并且cdr-h3始于cdr-h2末端后约33个残基，前接cys-xxx-xxx(通常为cys-ala-arg)，为3至25个残基，并且后接trp-gly-xxx-gly(seq id no:96)。
[0220]
在一个实施方案中，轻链cdr和重链cdr是根据kabat方法确定的。
[0221]
在一个实施方案中，轻链cdr和重链cdr2和cdr3根据kabat方法确定，并且重链cdr1根据abm方法确定，所述方法包含在kabat和clothia方法之间，参见例如whitelegg n&rees ar,protein eng.2000年12月；13(12):819-24和methods mol biol.2004；248:51-91。用于预测cdr的程序是可公开获得的，例如abysis(www.bioinf.org.uk/abysis/)。
[0222]
提及“vl”或“vl”是指免疫球蛋白轻链的可变区。
[0223]
提及“vh”或“vh”是指免疫球蛋白重链的可变区。
[0224]“单克隆抗体”是由b淋巴细胞的单个克隆或由单个抗体的轻链和重链基因转染到其中的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体制备杂合抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
[0225]“嵌合抗体”具有一个物种如人的框架残基和来自另一个物种如小鼠的cdr(其通常赋予抗原结合)。在特定优选实施方案中，car包含作为嵌合抗体或其抗原结合片段的抗原特异性结合结构域。
[0226]
人抗体可以通过将选自人衍生的噬菌体展示文库的fv克隆可变结构域序列与如上文所述的已知人恒定结构域序列组合来构建。或者，人单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系已例如由kozbor j.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等人,monoclonal antibody production techniques and applications,第51-63页(marcel dekker,inc.,new york,1987)；以及boerner等人,j.immunol.,147:86(1991)描述。另外，转基因动物(例如，小鼠)可用于在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人抗体库。参见，例如jakobovits等人,pnas usa,90:2551(1993)；jakobovits等人,nature,362:255(1993)；bruggermann等人,year in immunol.,7:33(1993)。基因混编也可用于从非人类(例如啮齿类动物抗体)衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体类似的亲和力和特异性。(参见1993年4月1日公开的pct wo 93/06213)。与通过cdr移植的非人抗体的传统人源化不同，该技术提供了完全的
人抗体，其不具有来自非人来源的fr或cdr残基。
[0227]
人源化抗体是包括人构架区和一个或多个来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的cdr的免疫球蛋白。提供cdr的非人免疫球蛋白被称为“供体”，并且提供构架的人免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方案中，所有cdr来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。不需要存在恒定区，但是如果存在，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即至少约85-90％，诸如约95％或更多相同。因此，除了可能的cdr之外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。人源化或其他单克隆抗体可以具有另外的保守氨基酸取代，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。人源化抗体可以通过基因工程学构建(参见例如美国专利号5,585,089)。
[0228]
抗体包括其抗原结合片段，诸如骆驼ig、ig nar、fab片段、fab’片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双-scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab,纳米抗体)以及全长抗体的负责抗原结合的部分。所述术语还包括基因工程改造的形式如嵌合抗体(例如人源化鼠类抗体)、异异共轭物抗体(如双特异性抗体)和其抗原结合片段。还参见pierce catalog and handbook,1994-1995(pierce chemical co.,rockford,il)；kuby,j.,immunology,第3版,w.h.freeman&co.,new york,1997。
[0229]“重链抗体”指含有两个vh结构域且无轻链的抗体(riechmann l.等人，j.immunol.methods 231:25
–
38(1999)；wo94/04678；wo94/25591；美国专利6,005,079)。“骆驼科抗体”是指含有两个vh结构域且无轻链的从骆驼、羊驼或美洲驼分离的抗体。“人源化vhh”或“人源化骆驼科抗体”是指已经历人源化以降低抗体在人接受者中的潜在免疫原性的非人vhh或骆驼科抗体。
[0230]“免疫球蛋白新抗原受体”的“ignar”是指来自鲨鱼免疫库的抗体类别，所述抗体由一个可变新抗原受体(vnar)结构域和五个恒定新抗原受体(cnar)结构域的同源二聚体组成。ignar代表一些最小的已知的基于免疫球蛋白的蛋白质支架，并且是高度稳定的并且具有有效的结合特征。固有稳定性可归因于(i)基础ig支架，其与鼠科动物抗体中发现的常规抗体vh和vl结构域相比呈现大量带电和亲水性表面暴露残基；以及(ii)稳定互补决定区(cdr)环中的结构特征，包括环间二硫键和环内氢键的模式。
[0231]
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和残余的“fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的f(ab')2片段。
[0232]“fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链fv物种由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链fv(scfv)物种中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以在类似于双链fv物种中的“二聚体”结构中缔合。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个高变区(hvr)相互作用以限定vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。六个hvr共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性hvr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
[0233]
fab片段含有重链和轻链可变结构域，并且还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab
′
片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端添
加了几个残基，包括来自抗体铰链结构域的一个或多个半胱氨酸。fab
′‑
sh在本文中称为fab
′
，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团。f(ab
′
)2抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的fab
′
片段对产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。双特异性fab二聚体(fab2)具有两个fab
′
片段，每个片段结合不同的抗原。三特异性fab三聚体(fab3)具有三个fab’片段，每个片段结合不同的抗原。
[0234]
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含连接到相同多肽链(vh-vl)中的轻链可变结构域(vh)的重链可变结构域(vh)。通过使用过短二无法在同一条链上的两个结构域之间的配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更全面地描述于例如ep 404,097；wo 1993/01161；hudson等人,nat.med.9:129-134(2003)；以及hollinger等人,pnas usa 90:6444-6448(1993)中。三抗体和四抗体也描述于hudson等人,nat.med.9:129-134(2003)中。
[0235]“单结构域抗体”或“sdab”或“纳米抗体”是指由抗体重链的可变区(vh结构域)或抗体轻链的可变区(vl结构域)组成的抗体片段(holt,l.,等人,trends in biotechnology,21(11):484-490)。
[0236]“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中并且呈任一取向(例如，vl-vh或vh-vl)。通常，scfv多肽还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，其使得scfv能够形成抗原结合所需的结构。关于scfv的综述，参见，例如pluckth
ü
n,in the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编,(springer-verlag,new york,1994),第269-315页。
[0237]“接头”是连接多肽或融合多肽的邻近结构域的氨基酸序列。接头序列包括“可变区连接序列”，其为氨基酸序列，所述氨基酸序列连接抗体或其抗原结合片段的vh和vl结构域并且提供与两个子结合结构域的相互作用兼容的间隔子功能，使得所得多肽对与包括相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子保留特异性结合亲和力。接头的说明性实例包括甘氨酸聚合物(g)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(g1-5s1-5)n，其中n是至少一、两、三、四或五的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此能够充当融合蛋白如本文所述car的结构域之间的中性系链。甘氨酸甚至比丙氨酸进入显著更大的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基受到更少的限制(参见scheraga,rev.computational chem.11173-142(1992))。接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸。其他示例性接头包括但不限于以下氨基酸序列：dgggs(seq id no:57)；tgekp(seq id no:58)(参见例如liu等人,pnas 5525-5530(1997))；ggrr(seq id no:59)(pomerantz等人1995,同上)；(ggggs)n其中n＝1、2、3、4或5(seq id no:60)(kim等人,pnas 93,1156-1160(1996.))；egkssgsgseskvd(seq id no:61)(chaudhary等人,1990,proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:1066-1070)；kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no:62)(bird等人,1988,science 242:423-426)，ggrrgggs(seq id no:63)；lrqrdgerp(seq id no:64)；lrqkdgggserp(seq id no:65)；lrqkd(gggs)2erp(seq id no:66)。另选地，可以使用能够对dna结合位点和肽本身建模的计算机程序(desjarlais&berg,pnas 90:2256-2260(1993),pnas 91:11099-11103(1994))或通过噬菌体展示方法合理地
设计柔性接头。接头可包含以下氨基酸序列：gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no:67)(cooper等人,blood,101(4):1637-1644(2003))。
[0238]“间隔子结构域”是指将抗原结合结构域移离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区域(patel等人,gene therapy,1999；6:412-419)。间隔子结构域可来源于天然、合成、半合成或重组来源。间隔子结构域可以是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如ch2和ch3。间隔子结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链结构域或改变的免疫球蛋白铰链结构域的氨基酸序列。
[0239]“铰链结构域”是一类间隔子结构域，其在定位抗原结合结构域远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用。铰链结构域置于结合结构域与跨膜结构域(tm)之间。铰链结构域可以来源于天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链结构域或改变的免疫球蛋白铰链结构域的氨基酸序列。
[0240]“改变的铰链结构域”是指(a)具有至多30％氨基酸变化(例如，高达25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的天然存在的铰链结构域，(b)天然存在的铰链结构域的一部分，其长度为至少10个氨基酸(例如，至少12、13、14或15个氨基酸)，具有至多30％氨基酸变化(例如，高达25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)，或(c)包含核心铰链结构域的天然存在的铰链结构域的一部分(其长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。铰链结构域可以通过用一个或多个其他氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)取代天然存在的免疫球蛋白铰链结构域中的一个或多个半胱氨酸和/或脯氨酸残基来改变。
[0241]“跨膜结构域”是指将细胞外结构域融合至细胞内结构域并将多肽锚定至细胞的质膜的多肽的一部分。tm结构域可以来源于天然、合成、半合成或重组来源。
[0242]“细胞内信号传导结构域”是指参与将靶抗原与免疫效应细胞上表达的受体的有效结合信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能(例如活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括细胞毒性因子的释放)，或由抗原与免疫效应细胞上表达的受体的结合引发的其他细胞反应的多肽。
[0243]
术语“效应功能”是指免疫效应细胞的专门功能。t细胞的效应功能例如可以是细胞溶解活性或帮助或活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指一种蛋白质中转导效应功能信号并引导细胞执行特有功能的部分。尽管通常可采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分来说，可使用这类截短部分代替整个结构域，只要其转导效应功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域意图包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0244]
众所周知，仅由tcr产生的信号不足以完全活化t细胞并且还需要二次或共刺激信号。因此，t细胞活化可以被认为是由两种不同类别的细胞内信号传导结构域介导：通过tcr(例如tcr/cd3复合物)起始抗原依赖性初级活化的初级信号传导结构域，以及以不依赖抗原的方式起作用以提供二次或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。
[0245]“初级信号传导结构域”是指以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合物的初级活化的信号传导结构域。以刺激性方式起作用的初级信号传导结构域可含有信号传导基元，所述信号传导基元称为基于免疫受体酪氨酸的活化基元或itam。
[0246]
如本文所使用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或fc受体之外的细胞表面分子，所述细胞表面分子提供在与抗原结合后使t淋巴细胞有效活化和起作用所需的第二信号。
[0247]
术语“选择性结合(selectively binds)”或“选择性结合(selectively bound)”或“选择性结合(selectively binding)”或“选择性靶向”描述在多个脱靶分子存在下，一个分子优先结合至靶分子(在靶结合(on-target binding))。在特定实施方案中，靶向pdcd1基因或cblb基因的he或megatal选择性结合在靶dna结合位点的频率比离靶dna靶结合位点的频率高约5、10、15、20、25、50、100或1000倍。
[0248]“在靶”是指靶位点序列。
[0249]“脱靶”是指与靶位点序列类似但不一致的序列。
[0250]“靶位点”或“靶序列”是在存在足以实现结合和/或裂解的条件下，界定核酸中结合分子将结合和/或裂解的一部分的染色体或染色体外核酸序列。当提到仅涉及靶位点或靶序列一条链的多核苷酸序列或seq id no.时，应理解，核酸酶变体所结合和/或裂解的靶位点或靶序列是双链的并且包含参考序列和其补体。在一个优选实施方案中，靶位点是人pdcd1基因中的序列。在一个优选实施方案中，靶位点是人cblb基因中的序列。
[0251]“重组”是指两个多核苷酸之间遗传信息交换的程序，包括但不限于通过非同源末端接合(nhej)和同源重组进行的供体捕获。出于本公开的目的，“同源重组(hr)”是指在例如通过同源性定向修复(hdr)机制修复细胞中的双链断裂期间发生的此类交换的特殊形式。这一程序需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子作为模板来修复“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)，并且不同地称为“不产生交换的基因转化(non-crossover gene conversion)”或“短链基因转化(short tract gene conversion)”，因为其导致遗传信息从供体转移至靶。不希望受任何特定理论束缚，此类转移可涉及在断裂的靶与供体之间形成的异双螺旋dna的错配校正；和/或“合成依赖性链退火(synthesis-dependent strand annealing)”，其中使用供体再合成遗传信息，所述遗传信息将变成靶的一部分；和/或相关程序。此类特异性hr通常引起靶分子序列的改变，使得供体多核苷酸序列的一部分或全部被并入靶多核苷酸中。
[0252]“nhej”或“非同源末端接合”是指在无供体修复模板或同源序列存在下双链断裂的消除。nhej可以在断裂位点处引起插入和缺失。nhej是由若干子路径介导的，这些子路径各自具有不同的突变结果。经典nhej路径(cnhej)需要ku/dna-pkcs/lig4/xrcc4复合物，通过最低限度的加工，将两端重新连接在一起，并且通常引起断裂的精确修复。替代性nhej路径(altnhej)在消除dsdna断裂方面也具有活性，但这些路径明显更易于诱变且通常无法精确修复以插入和缺失为标志的断裂。尽管不希望受任何特定理论束缚，但预期利用末端加工酶，如核酸外切酶，例如trex2修饰dsdna断裂可能增加不精确修复的可能性。
[0253]“裂解”是指dna分子共价主链的断裂。裂解可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶或化学水解。单链裂解和双链裂解都是可能的。双链裂解可作为两个不同的单链裂解事件的结果发生。dna裂解可导致产生钝端或交错端。在某些实施方案中，将本文所涵盖的多肽和核酸酶变体，例如归巢核酸内切酶变体、megatal等用于靶向双链dna裂解。核酸内切酶裂解识别位点可以在任一dna链上。
[0254]“外源”分子是通常不存在于细胞中，而是通过一种或多种基因、生物化学或其他
方法引入细胞中的分子。示例性外源分子包括但不限于小有机分子、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、前述分子的任何经过修饰的衍生物或包含一个或多个前述分子的任何复合物。用于将外源分子引入细胞中的方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子性脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、生物聚合物纳米粒子、磷酸钙共沉淀、deae-葡聚糖介导的转移以及病毒载体介导的转移。
[0255]“内源”分子是在特定环境条件下通常存在于处于特定发育阶段的特定细胞中的分子。另外的内源分子可以包括蛋白质。
[0256]“基因”是指编码基因产物的dna区域，以及调控基因产物的产生的所有dna区域，无论这些调控序列是否邻近于编码序列和/或转录的序列。基因包括但不限于启动子序列、增强子、沉默子、隔离子、边界元件、终止子、聚腺苷酸化序列、转录后反应元件、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、复制起点、基质附着位点以及基因座控制区。
[0257]“基因表达”是指基因中所含信息转化成基因产物。基因产物可以是基因(例如mrna、trna、rrna、反义rna、核酶、结构rna或任何其他类型的rna)的直接转录产物或由mrna翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过如戴帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑之类方法修饰的rna，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、adp-核糖基化、肉豆蔻酸化和糖基化修饰的蛋白质。
[0258]
如本文所使用，术语“基因组编辑”是指在细胞基因组中靶位点处遗传物质的取代、缺失和/或引入，其恢复、校正、破坏和/或修饰基因或基因产物的表达。特定实施方案中所涵盖的基因组编辑包含将一种或多种核酸酶变体(包括但不限于归巢核酸内切酶变体或megatal)引入细胞中以任选地在供体修复模板存在下，在细胞基因组中的靶位点处或附近产生dna损伤。
[0259]
在本公开通篇阐述了另外的定义。
[0260]
c.嵌合抗原受体
[0261]
在各种实施方案中，免疫效应细胞被修饰以表达靶向cd79a的嵌合抗原受体(car)和靶向cd20的嵌合共刺激受体，以便重定向免疫效应细胞对表达cd79a和/或cd20的癌细胞的细胞毒性。在各种实施方案中，免疫效应细胞被修饰以表达抗cd79 car和抗cd20 ccr，并且细胞还具有一个或多个降低cblb和/或pdcd-1的功能和表达的基因组编辑。
[0262]
嵌合抗原受体(car)是将基于抗体的对所需抗原的特异性与t细胞受体活化细胞内结构域相组合以产生展现抗原特异性细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所使用，术语“嵌合”描述由来自不同来源的不同蛋白质或dna部分构成。在特定实施方案中，car包含与cd79a结合的细胞外结构域(也称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。car的主要特性是其能够利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共同受体的细胞特异性靶向能力来重新定向免疫效应细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或可以以主要组织相容性(mhc)非依赖方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子的产生。
[0263]
在各种实施方案中，car包含细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包含cd79a特异性结合结构域；跨膜结构域；共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域。
[0264]
在特定实施方案中，car包含细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包含抗
cd79a抗体或其抗原结合片段；一个或多个铰链结构域或间隔子结构域；跨膜结构域；和共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域。
[0265]
在特定实施方案中，car包含细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包含特异性结合靶细胞(例如癌细胞)上表达的人cd79a多肽的抗cd79a抗体或其抗原结合片段。
[0266]
在特定实施方案中，cd79a特异性结合结构域包含与seq id no:1-3或9-11中所示的轻链cdr序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的轻链cdr序列。在特定实施方案中，cd79a特异性结合结构域包含seq id no:1-3或9-11中所示的轻链cdr序列。
[0267]
在一个特定实施方案中，cd79a特异性结合结构域包含与seq id no:4-6或12-14中所示的重链cdr序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的重链cdr序列。在一个实施方案中，cd79a特异性结合结构域包含seq id no:4-6或12-14中所示的重链cdr序列。
[0268]
在特定实施方案中，抗原特异性结合结构域是结合人cd79a多肽的scfv。
[0269]
在特定实施方案中，抗原特异性结合结构域是结合人cd79a多肽的人源化的骆驼科vhh。
[0270]
在一些实施方案中，抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含与seq id no:1-3或9-11中所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的cdrl1-cdrl3序列，所述可变重链序列包含与seq id nos 4-6或12-14中所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的cdrh1-cdrh3序列。
[0271]
在各种实施方案中，抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含seq id no:1-3或9-11中所示的cdrl1-cdrl3序列，所述可变重链序列包含seq id no:4-6或12-14中所示的cdrh1-cdrh3序列。
[0272]
在优选实施方案中，抗cd79a抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:7或15中任一者所示的可变轻链序列和/或如seq id no:8或16中任一者所示的可变重链序列。
[0273]
在某些实施方案中，抗cd79a car包含各种结构域之间的接头残基，例如，为了分子的适当间距和构象而添加的接头残基。在特定实施方案中，接头是可变区连接序列。抗cd79a car可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定实施方案中，接头的长度是约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸，或约10至约20个氨基酸，或任何中间长度的氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸。示例性接头包括但不限于由seq id no：57-67编码的那些。
[0274]
在特定实施方案中，抗cd79a car的结合结构域后接一个或多个间隔子结构域。在优选实施方案中，间隔子结构域在抗原结合结构域与跨膜结构域之间。在一个实施方案中，间隔子结构域包含igg1、igg4或igd的ch2和ch3。
[0275]
在一些实施方案中，抗cd79a car的结合结构域通常后接一个或多个“铰链结构域”，该铰链结构域在定位抗原结合结构域远离效应细胞表面以便能实现适当细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用。适用于本文所述的car的说明性铰链结构域包括来源于1型
膜蛋白诸如cd8α和cd4的细胞外区域的铰链结构域，其可以是来自这些分子的野生型铰链结构域或可以被改变。在一个实施方案中，铰链是pd-1铰链或cd152铰链。在一个优选实施方案中，铰链结构域包含cd8α铰链结构域。
[0276]
在特定实施方案中，抗cd79a car包含跨膜(tm)结构域，其来源于(即，至少包含)t细胞受体α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154和pd1的跨膜区。在一个特定实施例中，tm结构域是合成的，并且主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。
[0277]
在一个实施方案中，抗cd79a car包含源自pd1、cd152、cd28或cd8α的tm结构域。在另一个实施方案中，抗cd79a car包含来源于pd1、cd152、cd28或cd8α的tm结构域以及长度优选地在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头，所述接头连接car的tm结构域与细胞内信号传导结构域。在一个优选实施方案中，tm结构域来源于cd8α。
[0278]
在一个特定实施方案中，抗cd79a car包含一个或多个细胞内信号传导结构域。在优选实施方案中，抗cd79a car包含共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。细胞内初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以按任何次序串联连接至跨膜结构域的羧基末端。
[0279]
在特定实施方案中，抗cd79a car包含从共刺激分子中分离的共刺激结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
[0280]
在一个优选实施方案中，抗cd79a car包含cd28、cd137或cd134共刺激信号传导结构域。
[0281]
在特定实施方案中，抗cd79a car包含从多肽中分离的含有itam的初级信号传导结构域，所述多肽选自由以下组成的组：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。
[0282]
在一个优选实施方案中，抗cd79a car包含cd3ζ初级信号传导结构域。
[0283]
在特定实施方案中，抗cd79a car包含特异性结合至在癌细胞上表达的cd79a多肽的抗cd79a抗体或其抗原结合片段。
[0284]
在一个实施方案中，抗cd79a car包含结合cd79a多肽的抗cd79a抗体或抗原结合片段；衍生自多肽的跨膜结构域，所述多肽选自由以下组成的组：t细胞受体的α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154、amn1和pd1；以及来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、slp76、trat1、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和zap70；以及来自fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的初级信号传导结构域。
[0285]
在一个实施方案中，抗cd79a car包含结合cd79a多肽的抗cd79a scfv；铰链结构域，其选自由以下组成的组：igg1铰链/ch2/ch3、igg4铰链/ch2/ch3、pd1铰链、cd152铰链和cd8α铰链；衍生自多肽的跨膜结构域，所述多肽选自由以下组成的组：t细胞受体的α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154、amn1和pd1；以及来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、slp76、trat1、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和zap70；以及来自fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的初级信号传导结构域。
[0286]
在一个实施方案中，抗cd79a car包含结合cd79a多肽的抗cd79a scfv；铰链结构域，其选自由以下组成的组：igg1铰链/ch2/ch3、igg4铰链/ch2/ch3、pd1铰链、cd152铰链和cd8α铰链；衍生自多肽的跨膜结构域，所述多肽选自由以下组成的组：t细胞受体的α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154、amn1和pd1；短寡肽或多肽接头，其长度优选在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间，其将tm结构域连接至car的细胞内信号传导结构域；以及来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、slp76、trat1、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和zap70；以及来自fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的初级信号传导结构域。
[0287]
在一个特定实施方案中，抗cd79a car包含结合cd79a多肽的抗cd79a scfv；包含igg1铰链/ch2/ch3多肽和cd8α铰链结构域的铰链结构域；包含具有约3至约10个氨基酸的多肽接头的cd8α跨膜结构域；cd137细胞内共刺激信号传导结构域；以及cd3ζ初级信号传导结构域。
[0288]
在一个特定实施方案中，抗cd79a car包含结合cd79a多肽的抗cd79a scfv；cd8α铰链结构域；包含具有约3至约10个氨基酸的多肽接头的cd8α跨膜结构域；cd134细胞内共刺激信号传导结构域；以及cd3ζ初级信号传导结构域。
[0289]
在一个特定实施方案中，抗cd79a car包含结合cd79a多肽的抗cd79a scfv；cd8α铰链结构域；包含具有约3至约10个氨基酸的多肽接头的cd8α跨膜结构域；cd28细胞内共刺激信号传导结构域；以及cd3ζ初级信号传导结构域。
[0290]
在一个特定实施方案中，抗cd79a car包含结合cd79a多肽的一个或多个抗cd79a vhh；cd8α铰链结构域；包含具有约3至约10个氨基酸的多肽接头的cd8α跨膜结构域；cd28细胞内共刺激信号传导结构域；以及cd3ζ初级信号传导结构域。
[0291]
d.嵌合共刺激受体
[0292]
在各种实施方案中，免疫效应细胞被修饰以表达抗cd79a和抗cd20 ccr，以便重定向免疫效应细胞对表达cd79a和/或cd20的癌细胞的细胞毒性，并且协同地增加免疫效应细胞疗法的有效性。在各种实施方案中，免疫效应细胞被修饰以表达抗cd79a和抗cd20 ccr，
以便重定向免疫效应细胞对表达cd79a或cd20的癌细胞的细胞毒性，并且还包含破坏或消除pdcd-1和/或cblb功能和/或活性以协同增加免疫效应细胞疗法的有效性的一个或多个基因编辑。
[0293]
嵌合共刺激受体(ccr)是将基于抗体的对所需抗原的特异性与t细胞受体-共刺激结构域组合但缺乏初级信号传导结构域的分子。在特定实施方案中，ccr包含与cd20结合的细胞外结构域(也称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域，并且缺乏初级信号传导结构域。ccr的主要特征是其以mhc非依赖性方式重定向免疫效应细胞特异性并且在car的存在下增强免疫效应细胞应答的能力。
[0294]
在各种实施方案中，ccr包含细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包含cd20特异性结合结构域；跨膜结构域；以及共刺激信号传导结构域，但不包含初级信号传导结构域。
[0295]
在特定实施方案中，ccr包含细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包含抗cd20抗体或其抗原结合片段；一个或多个铰链结构域或间隔子结构域；跨膜结构域；以及共刺激信号传导结构域，但不包含初级信号传导结构域。
[0296]
在特定实施方案中，ccr包含细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包含特异性结合至靶细胞(例如癌细胞)上表达的人cd20多肽的抗cd20抗体或其抗原结合片段。
[0297]
在特定实施方案中，cd20特异性结合结构域包含与seq id no:25-27中所示的轻链cdr序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的轻链cdr序列。在特定实施方案中，cd20特异性结合结构域包含seq id no:25-27中所示的轻链cdr序列。
[0298]
在一个特定实施方案中，cd20特异性结合结构域包含与seq id no:28-30中所示的重链cdr序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的重链cdr序列。在一个实施方案中，cd20特异性结合结构域包含seq id no:28-30中所示的重链cdr序列。
[0299]
在特定实施方案中，抗原特异性结合结构域是结合人cd20多肽的scfv。
[0300]
在特定实施方案中，抗原特异性结合结构域是结合人cd20多肽的人源化的骆驼科vhh。
[0301]
在一些实施方案中，抗cd20抗体或其抗原结合片段包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含与seq id no:25-27中所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的cdrl1-cdrl3序列，所述可变重链序列包含与seq id no:28-30中所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的cdrh1-cdrh3序列。
[0302]
在各种实施方案中，抗cd20抗体或其抗原结合片段包含可变轻链序列和/或可变重链序列，所述可变轻链序列包含seq id no:25-27中所示的cdrl1-cdrl3序列，所述可变重链序列包含seq id no:28-30中所示的cdrh1-cdrh3序列。
[0303]
在优选实施方案中，抗cd20抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:31中所示的可变轻链序列和/或如seq id no:32中所示的可变重链序列。
[0304]
在某些实施方案中，抗cd20 ccr包含各种结构域之间的接头残基，例如为了分子
的适当间距和构象而添加的接头残基。在特定实施方案中，接头是可变区连接序列。抗cd20 ccr可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定实施方案中，接头的长度是约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸，或约10至约20个氨基酸，或任何中间长度的氨基酸。
[0305]
在特定实施方案中，抗cd20 ccr的结合结构域后接一个或多个间隔子结构域。在优选实施方案中，间隔子结构域在抗原结合结构域与跨膜结构域之间。在一个实施方案中，间隔子结构域包含igg1、igg4或igd的ch2和ch3。
[0306]
在一些实施方案中，抗cd20 ccr的结合结构域通常后接一个或多个“铰链结构域”，该铰链结构域在定位抗原结合结构域远离效应细胞表面以便能实现适当细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用。适用于本文所述的ccr的说明性铰链结构域包括来源于1型膜蛋白诸如cd8α和cd4的细胞外区域的铰链结构域，其可以是来自这些分子的野生型铰链结构域或可以被改变。在一个实施方案中，铰链是pd-1铰链或cd152铰链。在一个优选实施方案中，铰链结构域包含cd8α铰链结构域。
[0307]
在特定实施方案中，抗cd20 ccr包含跨膜(tm)结构域，其来源于(即，至少包含)t细胞受体α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154和pd1的跨膜区域。在一个特定实施例中，tm结构域是合成的，并且主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。
[0308]
在一个实施方案中，抗cd20 ccr包含来源于pd1、cd152、cd28或cd8α的tm结构域。在另一个实施方案中，抗cd20 ccr包含来源于pd1、cd152、cd28或cd8α的tm结构域以及长度优选地在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头，所述接头将tm结构域连接至ccr的细胞内信号传导结构域。在一个优选实施方案中，tm结构域来源于cd8α。
[0309]
在特定实施方案中，抗cd20 ccr包含一个或多个细胞内信号传导结构域。在优选的特定实施方案中，抗cd20 ccr包含一个或多个共刺激信号传导结构域，但缺乏初级信号传导结构域。共刺激信号传导结构域可以按任何顺序串联连接至跨膜结构域的羧基末端。
[0310]
在特定实施方案中，抗cd20 ccr包含从共刺激分子中分离的共刺激结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
[0311]
在一个优选实施方案中，抗cd79a car包含cd28、cd137或cd134共刺激信号传导结构域，并且抗cd20 ccr包含不同的共刺激结构域。
[0312]
在一个优选实施方案中，抗cd79a car包含cd137或cd134共刺激信号传导结构域，并且抗cd20 ccr包含cd28共刺激信号传导结构域。
[0313]
在一个优选实施方案中，抗cd79a car包含cd137共刺激信号传导结构域，并且抗cd20 ccr包含cd28共刺激信号传导结构域。
[0314]
在特定实施方案中，抗cd20 ccr包含特异性结合至在癌细胞上表达的cd20多肽的抗cd20抗体或其抗原结合片段。
[0315]
在一个实施方案中，抗cd20 ccr包含结合cdcd20多肽的抗cd20scfv；衍生自多肽的跨膜结构域，所述多肽选自由以下组成的组：t细胞受体的α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154、amn1和pd1；以及来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、slp76、trat1、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和zap70。
[0316]
在一个实施方案中，抗cd20 ccr包含结合cd20多肽的抗cd20scfv；铰链结构域，其选自由以下组成的组：igg1铰链/ch2/ch3、igg4铰链/ch2/ch3、pd1铰链、cd152铰链和cd8α铰链；衍生自多肽的跨膜结构域，所述多肽选自由以下组成的组：t细胞受体的α链或β链、cdδ、cd3ε、cdγ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd154、amn1和pd1；短寡肽或多肽接头，其长度优选在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间，其将tm结构域连接至car的细胞内信号传导结构域；以及来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、slp76、trat1、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和zap70。
[0317]
在一个特定实施方案中，抗cd20 ccr包含结合cd20多肽的抗cd20 scfv；包含igg1铰链/ch2/ch3多肽和cd8α铰链结构域的铰链结构域；包含具有约3至约10个氨基酸的多肽接头的cd8α跨膜结构域；以及cd28细胞内共刺激信号传导结构域。
[0318]
在一个特定实施方案中，抗cd20 ccr包含结合cd20多肽的抗cd20 scfv；cd8α铰链结构域；包含具有约3至约10个氨基酸的多肽接头的cd8α跨膜结构域；以及cd28细胞内共刺激信号传导结构域。
[0319]
e.核酸酶变体
[0320]
在各种实施方案中，经修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞也使用核酸酶变体，例如归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)变体或megatal来遗传修饰以减少或消除pdcd-1和/或cblb的表达和/或功能。特定实施方案中所涵盖的核酸酶变体适于基因组编辑人pdcd-1基因或人cblb基因中的靶位点并且包含一个或多个dna结合结构域和一个或多个dna裂解结构域(例如一种或多种核酸内切酶和/或核酸外切酶结构域)，以及任选地一个或多个本文涵盖的接头。术语“重编程的核酸酶”、“工程改造的核酸酶”或“核酸酶变体”可互换使用并且是指包含一个或多个dna结合结构域和一个或多个dna裂解结构域的核酸酶，其中所述核酸酶已自亲本或天然存在的核酸酶设计和/或修饰，以结合并裂解双链dna靶序列。
[0321]
在特定实施方案中，核酸酶变体结合并裂解pdcd-1基因外显子1中的靶序列，优选地pdcd-1基因外显子1中的seq id no:51，并且更优选地pdcd-1基因外显子1中seq id no:51中的序列“atcc”。
[0322]
在优选实施方案中，核酸酶变体结合并裂解cblb基因外显子6中的靶序列，优选地cblb基因外显子6中的seq id no:55，并且更优选地cblb基因外显子6中的seq id no:55中
的序列“atcc”。
[0323]
核酸酶变体可以从天然存在的核酸酶或先前的核酸酶变体设计和/或修饰得到。特定实施方案中所涵盖的核酸酶变体还可包含一个或多个另外的功能结构域，例如末端加工酶中展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如trex2)、5'活瓣核酸内切酶、解螺旋酶、模板依赖性dna聚合酶或模板非依赖性dna聚合酶活性的末端加工酶结构域。
[0324]
结合并裂解pdcd-1或cblb基因中的靶序列的核酸酶变体的说明性实例包括但不限于归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)变体和megatal。
[0325]
1.归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)变体
[0326]
在各种实施方案中，重新编程归巢核酸内切酶或大范围核酸酶以在pdcd-1基因或cblb基因中的靶位点中引入双链断裂(dsb)。在优选实施方案中，重编程归巢核酸内切酶或大范围核酸酶以在cblb基因中的靶位点中引入双链断裂(dsb)。
[0327]
在特定实施方案中，归巢核酸内切酶变体在pdcd-1基因外显子1中，优选地在pdcd-1基因外显子1中的seq id no:51处，并且更优选地在pdcd-1基因外显子1中seq id no:51中的序列“atcc”处引入双链断裂。
[0328]
在优选实施方案中，归巢核酸内切酶变体在cblb基因外显子6中，优选地在cblb基因外显子6中的seq id no:55处，并且更优选地在cblb基因外显子6中seq id no:55中的序列“atcc”处引入双链断裂。
[0329]“归巢核酸内切酶”与“大范围核酸酶”可互换使用并且是指识别具有12-45个碱基对的裂解位点的天然存在的归巢核酸内切酶，并且这些归巢核酸内切酶通常基于序列和结构基元分成五个家族：laglidadg、giy-yig、hnh、his-cys盒以及pd-(d/e)xk。
[0330]“参考归巢核酸内切酶”或“参考大范围核酸酶”是指野生型归巢核酸内切酶或自然界中所发现的归巢核酸内切酶。在一个实施方案中，“参考归巢核酸内切酶”是指被修饰成增加基础活性的野生型归巢核酸内切酶。
[0331]“工程改造的归巢核酸内切酶”、“重编程的归巢核酸内切酶”、“归巢核酸内切酶变体”、“工程改造的大范围核酸酶”、“重编程的大范围核酸酶”或“大范围核酸酶变体”是指包含一个或多个dna结合结构域和一个或多个dna裂解结构域的归巢核酸内切酶，其中所述归巢核酸内切酶已自亲本或天然存在的归巢核酸内切酶设计和/或修饰，以结合并裂解dna靶序列。归巢核酸内切酶变体可以自天然存在的归巢核酸内切酶或自另一归巢核酸内切酶变体设计和/或修饰得到。特定实施方案中所涵盖的归巢核酸内切酶变体还可包含一个或多个另外的功能结构域，例如末端加工酶中展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如trex2)、5'活瓣核酸内切酶、解螺旋酶、模板依赖性dna聚合酶或模板非依赖性dna聚合酶活性的末端加工酶结构域。
[0332]
归巢核酸内切酶(he)变体不存在于自然界中并且可以通过重组dna技术或通过随机诱变获得。he变体可以通过使天然存在的he或he变体中的一个或多个氨基酸改变，例如突变、取代、添加或缺失一个或多个氨基酸获得。在特定实施方案中，he变体包含dna识别界面的一个或多个氨基酸变化。
[0333]
在特定实施方案中，归巢核酸内切酶是结合并裂解seq id no:51中所示的人pdcd-1基因的i-onui he变体，所述变体包含与seq id no:49中所示的氨基酸序列或其生
物学活性片段具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0334]
在优选实施方案中，巢核酸内切酶是结合并裂解seq id no:55中所示的人cblb基因的i-onui he变体，所述变体包含与seq id no:53中所示的氨基酸序列或其生物学活性片段具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0335]
2.megatal
[0336]
在各种实施方案中，包含归巢核酸内切酶变体的megatal被重编程以在pdcd-1基因或cblb基因中的靶位点引入双链断裂(dsb)。在优选实施方案中，包含归巢核酸内切酶变体的megatal被重编程以在cblb基因中的靶位点中引入双链断裂(dsb)。
[0337]
在特定实施方案中，megatal在pdcd-1基因外显子1中，优选地在pdcd-1基因外显子1中的seq id no:52处，并且更优选地在pdcd-1基因外显子1中seq id no:52中的序列“atcc”处引入dsb。
[0338]
在优选实施方案中，megatal在cblb基因外显子6中，优选地在cblb基因外显子6中的seq id no:56处，并且更优选地在cblb基因外显子6中seq id no:56中的序列“atcc”处引入dsb。
[0339]“megatal”是指包含tale dna结合结构域以及结合并裂解基因中的dna靶序列的归巢核酸内切酶变体的多肽，并且任选地包含一个或多个接头和/或另外的功能结构域，例如末端加工酶中展现5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如trex2)、5'活瓣核酸内切酶、解螺旋酶或非模板依赖性dna聚合酶活性的末端加工酶结构域。
[0340]“tale dna结合结构域”是转录活化因子样效应子(tale或tal效应子)的dna结合部分，其模拟植物转录活化因子以操作植物转录物组(参见例如kay等人,2007.science 318:648-651)。特定实施方案中所涵盖的tale dna结合结构域是从头工程改造得到或由天然存在的tale，例如来自野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、大豆黄单胞菌(xanthomonas gardneri)、半透明黄单胞菌(xanthomonas translucens)、地毯草黄单胞菌(xanthomonas axonopodis)、番茄黄单胞菌(xanthomonas perforans)、苜蓿黄单胞菌(xanthomonas alfalfa)、柑橘黄单胞菌(xanthomonas citri)、辣椒-番茄黄单胞菌(xanthomonas euvesicatoria)和水稻黄单胞菌(xanthomonas oryzae)的avrbs3，以及来自茄科雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)的brg11和hpx17工程改造得到。用于得到并设计dna结合结构域的tale蛋白质的示例性实例公开于美国专利第9,017,967号和其中引用的参考文献中，其全部以引用的方式整体并入本文中。
[0341]
在特定实施方案中，megatal结合并裂解在seq id no:52处的人pdcd-1基因中的靶位点，并且包含seq id no:50中所示的氨基酸序列。
[0342]
在优选实施方案中，megatal结合并裂解在seq id no:56处的人cblb基因中的靶位点，并且包含seq id no:54中所示的氨基酸序列。
[0343]
f.多肽
[0344]
本文涵盖各种多肽、融合多肽和多肽变体，包括但不限于car多肽、ccr多肽、car-2a-ccr融合多肽、car-2a-car融合多肽及其片段、归巢核酸内切酶和megatal。在特定实施方案中，本文涵盖的示例性多肽包括包含如seq id no:1-20、25-33、35、37、39、41、43、45和47中任一者所示的氨基酸序列的多肽。
[0345]
除非作相反说明，否则“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且根据常规含义，即，定义为氨基酸序列。多肽不限于特定长度，例如其可以包含全长多肽或多肽片段，并且可以包括多肽的一种或多种翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的天然存在的和非天然存在的其他修饰。
[0346]
如本文所使用，“分离的多肽”等是指从细胞环境中以及从与细胞的其他组分的缔合中体外合成、分离和/或纯化的肽或多肽分子，即所述肽或多肽分子未与体内物质显著缔合。在特定实施方案中，分离的多肽是合成多肽、半合成多肽或从重组来源获得或衍生的多肽。
[0347]
多肽包括“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。这种变体可以是天然存在的或可以通过合成生成，例如通过修饰上述多肽序列中的一个或多个。例如，在特定实施方案中，可以期望通过将一个或多个取代、缺失、添加和/或插入引入到结合结构域、铰链、tm结构域、共刺激信号传导结构域或初级信号传导结构域(如果存在)中来改善car和/或ccr的结合亲和力和/或其他生物性质。在特定实施方案中，多肽包含与本文所涵盖的参考序列中的任何一个有至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％氨基酸同一性的多肽，通常其中变体维持参考序列的至少一种生物活性。在特定实施方案中，生物活性是结合亲和力。在特定实施方案中，生物活性是细胞溶解活性。
[0348]
多肽包括“多肽片段”。多肽片段是指这样的多肽，其可以是单体或多聚体的，具有天然存在或重组产生的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失或取代。生物活性多肽片段的说明性实例包括抗体片段。如本文所使用，术语“生物活性片段”或“最小生物活性片段”是指保留至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％、或至少5％的天然存在的多肽活性的多肽片段。在某些实施方案中，多肽片段可包含长度为至少5个至约500个氨基酸的氨基酸链。应了解，在某些实施方案中，片段长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。在特定实施方案中，特别有用的多肽片段包括功能性结构域，包括抗原结合结构域或抗体片段。
[0349]
多肽还可以在框内融合或与接头或其他序列缀合，以利于多肽(例如聚-his)的合成、纯化或鉴定，或增强多肽与固体载体的结合。
[0350]
如上文所述，在特点实施方案中，多肽可以通过不同方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法是本领域中一般已知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可以通过dna中的突变制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域中众所周知的。参见，例如kunkel(1985,proc.natl.acad.sci.usa.82:488-492),kunkel等人,(1987,methods in enzymol,154:367-382)，美国专利第4,873,192号，watson,j.d.等人(molecular biology of the gene,fourth edition,benjamin/cummings,menlo park,calif.,1987)和其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸取
代的指导可见于dayhoff等人,(1978)atlas of protein sequence and structure(natl.biomed.res.found.,washington,d.c.)的模型中。
[0351]
在某些实施方案中，多肽变体包括一个或多个保守取代。“保守性取代”是氨基酸被具有类似特性的另一个氨基酸取代，使得肽化学领域的技术人员能预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变的取代。修饰可以针对特定实施方案中所涵盖的多核苷酸和多肽的结构进行并且仍然获得了对具有期望特性的变体或衍生多肽进行编码的功能分子。当希望改变多肽的氨基酸序列以产生等效或甚至改良的变体多肽时，本领域技术人员例如可以改变编码dna序列的一个或多个密码子，例如根据表1。
[0352]
表1-氨基酸密码子
[0353][0354][0355]
可以使用本领域中公知的计算机程序如dnastar、dna strider、geneious、mac vector或vector nti软件找到关于确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除
14中所示的cdrh1-cdrh3序列的可变重链序列、cd8α铰链和跨膜结构域、cd137共刺激结构域和cd3ζ初级信号传导结构域；多肽裂解信号；以及抗cd20 ccr，所述抗cd20 ccr包含：包含seq id no:25-27中所示的cdrl1-cdrl3序列的可变轻链序列和包含seq id no:28-30中所示的cdrh1-cdrh3序列的可变重链序列、cd8α铰链和跨膜结构域和4-1bb共刺激结构域。
[0366]
在特定实施方案中，融合多肽包含抗cd79a car，所述抗cd79a car包含如seq id no:7中所示的可变轻链序列和/或如seq id no:8中所示的可变重链序列、cd8α铰链和跨膜结构域、cd137共刺激结构域和cd3ζ初级信号传导结构域；多肽裂解信号；以及抗cd20 ccr，所述抗cd20 ccr包含如seq id no:31中所示的可变轻链序列和如seq id no:32中所示的可变重链序列、cd8α铰链结构域、cd8α跨膜结构域和4-1bb共刺激结构域。
[0367]
示例性多肽裂解信号包括多肽裂解识别位点，如蛋白酶裂解位点、核酸酶裂解位点(例如罕见限制酶识别位点、自裂解核酶识别位点)和自裂解病毒寡肽(参见defelipe and ryan,2004.traffic,5(8)；616-26)。
[0368]
合适的蛋白酶切割位点和自切割肽是技术人员已知的(参见，例如ryan等人,1997.j.gener.virol.78,699-722；scymczak等人.(2004)nature biotech.5,589-594)。示例性蛋白酶裂解位点包括但不限于马铃薯y病毒(potyvirus)nia蛋白酶(例如烟草蚀刻病毒蛋白酶)、马铃薯y病毒hc蛋白酶、马铃薯y病毒p1(p35)蛋白酶、大麦花叶病毒(byovirus)nia蛋白酶、大麦花叶病毒rna-2编码的蛋白酶、口疮病毒(aphthovirus)l蛋白酶、肠病毒2a蛋白酶、鼻病毒2a蛋白酶、细小核糖核酸3c蛋白酶、豇豆花叶病毒(comovirus)24k蛋白酶、线虫传多面体病毒(nepovirus)24k蛋白酶、水稻东格鲁球状病毒(rice tungro spherical virus，rtsv)3c样蛋白酶、欧防风黄点病毒(parsnip yellow fleck virus，pyvf)3c样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子xa以及肠激酶的裂解位点。在一个实施方案中，tev(烟草蚀刻病毒)蛋白酶裂解位点因其较高的裂解严格度而成为优选的，例如exxyxq(g/s)(seq id no:68)，例如enlyfqg(seq id no:69)和enlyfqs(seq id no:70)，其中x表示任何氨基酸(tev裂解发生于q与g或q与s之间)。
[0369]
在特定实施方案中，多肽裂解信号是病毒自裂解肽或核糖体跳跃序列。
[0370]
核糖体跳跃序列的说明性实例包括但不限于：2a或2a样位点、序列或结构域(donnelly等人,2001.j.gen.virol.82:1027-1041)。在特定实施方案中，病毒2a肽是口疮病毒2a肽、马铃薯y病毒2a肽或心病毒2a肽。
[0371]
在一个实施方案中，病毒2a肽选自由以下组成的组：口蹄疫病毒(fmdv)2a肽、马鼻炎a病毒(erav)2a肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(tav)2a肽、猪捷申病毒-1(ptv-1)2a肽、泰勒病毒2a肽以及脑心肌炎病毒2a肽。
[0372]
2a位点的示例性实例提供于表2中。
[0373]
表2
[0374]
[0375][0376]
在优选实施方案中，融合多肽包含：包含seq id no:17-20中任一者所示的氨基酸序列的抗cd79a car；t2a自裂解多肽；以及包含seq id no:33或seq id no:35中所示的氨基酸序列的抗cd20 ccr。
[0377]
在特定优选实施方案中，融合多肽包含seq id no:37或seq id no:39中所示的氨基酸序列。
[0378]
g.多核苷酸
[0379]
在优选实施方案中，提供了编码一种或多种car多肽、ccr多肽或包含car、2a肽和ccr的融合多肽的多核苷酸。如本文所使用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)和dna/rna杂交体。多核苷酸可以是单链或双链的并且是重组、合成或分离的。多核苷酸包括但不限于：前信使rna(pre-mrna)、信使rna(mrna)、rna、基因组dna(gdna)、pcr扩增dna、互补dna(cdna)、合成dna或重组dna。多核苷酸是指长度为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000个或至少15000个或更多个核苷酸，以及所有中间长度的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。容易理解的是，在此情形中，“中间长度”意指在引述值之间的任何长度，如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在特定实施方案中，多核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％,76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
[0380]
多核苷酸的说明性实例包括但不限于seq id no:21-24、34、36、38、40、42、44、46和48以及编码seq id no:1-20、25-33、35、37、39、41、43、45和47的多核苷酸。
[0381]
如本文所使用，“分离的多核苷酸”是指已经从其两侧的处于天然存在状态的序列纯化的多核苷酸，例如，已经从通常与其相邻的序列移除的dna片段。在特定实施方案中，“分离的多核苷酸”还指互补dna(cdna)、重组dna或自然中不存在且已经通过人手制造的其他多核苷酸。在特定实施方案中，分离的多核苷酸是合成多核苷酸、半合成多核苷酸或从重组来源获得或衍生的多核苷酸。
[0382]
在各种实施方案中，多核苷酸包括编码本文所涵盖的多肽的mrna。在某些实施方案中，所述mrna包含帽、一个或多个核苷酸和聚腺苷酸尾。
[0383]
在特定实施方案中，多核苷酸可以经历密码子优化。如本文所使用，术语“密码子优化的”是指取代编码多肽的多核苷酸中的密码子以便增加所述多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包括但不限于以下一个或多个：(i)两种或更多种生物体或基因之间密码子偏好的变化或合成地构造的偏好表；(ii)生物体、基因或基因集内密码子偏好程度的变化；(iii)包括环境在内的密码子的系统性变化；(iv)根据解码trna得到的密码子变化；(v)根据总体或三联体一个位置中的gc％得到的密码子变化；(vi)与参考序列，例如天然存在序列相似程度的变化；(vii)密码子频率截止值的变化；(viii)由dna序列转录的mrna的结构特性；(ix)有关作为设计密码子取代集合的基础的dna序列的功能的先验知识；(x)每个氨基酸的密码子集的系统性变化；和/或(xi)伪翻译起始位点的分离移除。
[0384]
如本文所使用，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列展示相当大的序列同一性的多核苷酸或在下文所定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语包括其中一个或多个核苷酸与参考多核苷酸相比被添加或缺失或修饰，或被置换成不同核苷酸的多核苷酸。就这一点而言，本领域中应充分理解，可以对参考多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代在内的某些改变，由此使改变的多核苷酸保持参考多核苷酸的生物功能或活性。
[0385]
多核苷酸变体包括编码生物活性多肽片段或变体的多核苷酸片段。如本文所使用，术语“多核苷酸片段”是指长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700个或更多个核苷酸的多核苷酸片段，其编码保留至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的天然存在的多肽活性的多肽变体。多核苷酸片段是指编码具有天然存在或重组产生的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失或取代的多肽的多核苷酸。
[0386]
如本文所使用，叙述“序列同一性”或例如包含“与
……
50％一致的序列”是指在核苷酸与核苷酸基础上或在氨基酸与氨基酸基础上，序列在比较窗内一致的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下方式计算：在比较窗内比较两个最佳地比对的序列，测定的一致核酸碱基(例如a、t、c、g、i)或一致氨基酸残基(例如ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys以及met)在两个序列中出现的位置的数目以得到相配位置的数目，用相配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即，窗大小)并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。包含与本文所述的参考序列中的任何一个具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体维持参考多肽的至少一种生物活性。
[0387]
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”的长度是至少12个，但常常是15至18个且通常是至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基在内。因为两个多核苷酸可以各自包含(1)在两个多核苷酸之间类似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的一部分)；和(2)在两个多核苷酸之间相异的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗”内比较两个多核苷酸的序列以鉴别并比较序列局部区域的相似性来进行。“比较窗”是指具有至少6个、通常约50个至约100个、更通常约100个至约150个连续位置的概念性区段，其中在最佳地比对一个序列与具有相同数目连续位置的参考序列之后，比较该两个序列。为了对两条序列进行最佳比对，比较窗可以包含相较于参考序列(不包含添加或缺失的序列)，约20％或更低百分比的添加或缺失(即，空位)。用于比对比较窗的最佳序列比对可以通过计算机实施算法(gap、bestfit、fasta和tfasta，wisconsin genetics software package release 7.0,genetics computer group,575science drive madison,wi,usa)或通过由各种所选方法中的任一种生成的检查和最佳比对(即，在比较窗内产生最高同源性百分比)来进行。还可以参考如例如altschul等人,1997,nucl.acids res.25:3389所公开的blast程序家族。序列分析的详细论述可以见于ausubel等人,current protocols in molecular biology,john wiley&sons inc.,1994-1998,第15章的19.3单元。
[0388]
描述多核苷酸取向的术语包括：5'(通常是多核苷酸具有游离磷酸酯基的一端)和3'(通常是多核苷酸具有游离羟基(oh)的一端)。多核苷酸序列可以按5'至3'取向或3'至5'取向标注。对于dna和mrna，5'至3'链被命名为“有义”链、“正”链或“编码”链，因为其序列与前信使(premrna)的序列一致[不过在rna中是尿嘧啶(u)，而在dna中是胸腺嘧啶(t)]。对于dna和mrna，作为由rna聚合酶转录的链的互补3'至5'链被命名为“模板”链、“反义”链、“负”链或“非编码”链。如本文所使用，术语“反向取向”是指以3'至5'取向书写的5'至3'序列或以5'至3'取向书写的3'至5'序列。
[0389]
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，dna序列5'a g t c a t g 3'的互补链是3't c a gt a c 5'。后一个序列通常被写成反向互补序列，其中5'端在左侧并且3'端在右侧，即5'c a t g a c t 3'。与其反向互补序列相同的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分”的，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“总体”互补性。
[0390]
此外，本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多对多肽或其变体片段进行编码的核苷酸序列，如本文所描述的。这些多核苷酸中有一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。尽管如此，在特定实施方案中特别地涵盖由于密码子使用差异而变化的多核苷酸，例如针对人类和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。此外，也可以使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是因核苷酸的一个或多个突变，如缺失、添加和/或取代而改变的内源性序列。
[0391]
如本文所使用，术语“核酸盒”或“表达盒”是指载体内可以表达rna且随后表达多
肽的基因序列。在一个实施方案中，核酸盒含有目的基因，例如目的多核苷酸。在另一个实施方案中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸序列以及目的基因，例如目的多核苷酸。载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核酸盒。核酸盒在载体内是按位置依序地取向，使得盒中的核酸可以被转录成rna，并且当需要时被翻译成蛋白质或多肽，经历被转化的细胞中的活性所需的适当翻译后修饰，并且通过靶向适当细胞内区室或分泌至细胞外区室中而易位至适当区室中以获得生物活性。优选地，所述盒的3'和5'端适合于迅速地插入载体中，例如其在每一端处具有限制性核酸内切酶位点。在一个优选实施方案中，核酸盒编码抗cd79a car和抗cd20 ccr。所述盒可以作为单一单元移出并插入质粒或病毒载体中。
[0392]
多核苷酸包括目的多核苷酸。如本文所术语，术语“目的多核苷酸”是指编码多肽、多肽变体或融合多肽的多核苷酸。载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个目的多核苷酸。在某些实施方案中，目的多核苷酸编码在治疗或预防疾病或病症中提供治疗效果的多肽。目的多核苷酸和从其编码的多肽包括编码野生型多肽的多核苷酸以及其功能变体和片段。在特定实施方案中，功能变体与对应的野生型参考多核苷酸或多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在某些实施方案中，功能变体或片段具有对应的野生型多肽的生物活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0393]
如本文其他地方所公开的或如本领域已知的，无论编码序列本身的长度如何，本文所涵盖的多核苷酸可以与其他dna序列组合，如启动子和/或增强子、非转译区(utr)、信号序列、kozak序列、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(ires)、重组酶识别位点(例如，loxp位点、frt位点和att位点)、终止密码子、转录终止信号以及对自裂解多肽、表位标记进行编码的多核苷酸，使得所述多核苷酸的总长度可以显著变化。因此，可涵盖可以在特定实施方案中采用几乎任何长度的多核苷酸片段，其总长度优选地受制备的容易性和在预期的重组dna方案中的使用的限制。
[0394]
多核苷酸可以使用本领域中已知并且可用的多种公认技术中的任一种制备、操作和/或表达。为了表达所希望的多肽，可将编码所述多肽的核苷酸序列插入适当载体中。
[0395]
载体的说明性实例包括但不限于质粒、自主复制序列和转座元件，例如piggybac、睡美人、mos1、tc1/mariner、tol2、mini-tol2、tc3、mua、himar i、frog prince以及其衍生物。
[0396]
载体的另外的说明性实例包括但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1源性人工染色体(pac)、如λ噬菌体或m13噬菌体等噬菌体以及动物病毒。
[0397]
可用作载体的病毒的示例性实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒以及乳多泡病毒(例如sv40)。
[0398]
表达载体的示例性实例包括但不限于用于在哺乳动物细胞中表达的pclneo载体(promega)；用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的plenti4/v5-dest
tm
、plenti6/v5-dest
tm
和plenti6.2/v5-gw/lacz(invitrogen——。在特定实施方案中，本文所公开的多肽的编码序列可连接至此类表达载体中以在哺乳动物细胞中表达所述多肽。
[0399]
在特定实施方案中，载体是游离型载体或维持在染色体外的载体。如本文所使用，
术语“附加型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体dna中且不会从分裂的宿主细胞中逐渐丧失的载体，这还意味着所述载体在染色体外或附加地复制。
[0400]
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非翻译区—复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(shine dalgarno序列或kozak序列)内含子、多腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区—其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这些元件在其强度和特异性方面可能有所变化。取决于所利用的载体系统和宿主，可使用多种适合的转录与翻译元件，包括遍在型启动子和诱导型启动子。
[0401]
在特定实施方案中，载体包括但不限于表达载体和病毒载体，将包括外源、内源或异源控制序列，诸如启动子和/或增强子。“内源”控制序列是与基因组中的给定基因天然连接的序列。“外源”控制序列是通过基因操纵(即分子生物学技术)与被放置成与基因并置使得该基因的转录由所连接的增强子/启动子指导的序列。“异源”控制序列是与被基因操纵的细胞来自不同物种的外源序列。
[0402]
如本文所使用，术语“启动子”是指rna聚合酶结合的多核苷酸(dna或rna)的识别位点。rna聚合酶启动并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。在特定实施方案中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包括位于起始转录位点上游大约25个到30个碱基的at富含区和/或发现距离转录起始上游70个到80个碱基的另一个序列，即n可以是任何核苷酸的cncaat区。
[0403]
术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以不依赖于其相对于另一个控制序列的朝向而起作用的dna的区段。增强子可以与启动子和/或其他增强子元件协同地或相加性地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子两者的功能的序列的dna的区段。
[0404]
术语“可操作地连接”是指所描述的组分的关系允许其以其预定方式起作用的并接。在一个实施方案中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列，例如目的多核苷酸之间的功能性连接，其中所述表达控制序列引导对应于所述第二序列的核酸的转录。
[0405]
如本文所使用，术语“组成型表达控制序列”是指连续地或连续不断地允许可操作地连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在各种各样的细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子或分别允许在受限种类的细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
[0406]
适合于在特定实施方案中使用的示例性普遍存在的表达控制序列包括但不限于：巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)ltr启动子、rous肉瘤病毒(rsv)ltr、单纯疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子、h5、来自牛痘病毒的p7.5启动子和p11启动子、延伸因子1-α(ef1a)启动子、早期生长应答1(egr1)、铁蛋白h(ferh)、铁蛋白l(ferl)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)、真核翻译起始因子4a1(eif4a1)、热休克70kda蛋白5(hspa5)、热休克蛋白90kdaβ成员1(hsp90b1)、热休克蛋白70kda(hsp70)、β-驱动蛋白(β-kin)、人rosa 26基因座(irions等人,nature biotechnology 25,1477-1482(2007))、泛素c启动子(ubc)、磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(cag)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤
病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(mnd)u3启动子(haas等人,journal of virology.2003；77(17):9439-9450)。
[0407]
在一个实施方案中，载体包括mndu3启动子。
[0408]
在一个实施方案中，载体包括包含人ef1a基因的第一内含子的ef1a启动子。
[0409]
在一个实施方案中，载体包括缺少人ef1a基因的第一内含子的ef1a启动子。
[0410]
如本文所使用，“条件表达”可以是指任何类型的条件表达，包括但不限于：诱导型表达；可阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中的表达。此定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施方案提供了目的多核苷酸的条件表达，例如通过使细胞、组织、生物体等经受导致多核苷酸表达或导致由目的多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的治疗或病状来控制表达。
[0411]
诱导型启动子/系统的说明性实例包括但不限于：类固醇诱导型启动子如编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用对应的激素处理可诱导)、金属硫蛋白启动子(通过各种重金属处理可诱导)、mx-1启动子(通过干扰素可诱导)、“基因开关(geneswitch)”米非司酮可调节系统(sirin等人,2003,gene,323:67)、cumate诱导型基因开关(wo 2002/088346)、四环素依赖性调节系统等。
[0412]
也可通过使用位点特异性dna重组酶来实现条件表达。根据某些实施方案，载体包含至少一个(通常两个)位点，用于进行由位点特异性重组酶介导的重组。如本文所术语，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包括参与涉及一个或多个重组位点(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、四十个等)白的重组反应的切除性或整合性蛋白、酶、辅因子或相关蛋，其可以是野生型蛋白质(参见landy,current opinion in biotechnology 3:699-707(1993))，或突变体、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段以及其变体。适用于特定实施方案的重组酶的说明性实例包括但不限于：cre、int、ihf、xis、flp、fis、hin、gin、φc31、cin、tn3解离酶、tndx、xerc、xerd、tnpx、hjc、gin、spcce1和para。
[0413]
载体可以包含用于多种位点特异性重组酶中的任一种的一个或多个重组位点。应理解，位点特异性重组酶的靶位点是除整合载体(例如逆转录病毒载体或慢病毒载体)所需的任何位点之外的位点。如本文所使用，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶识别并结合的特定核酸序列。
[0414]
例如，cre重组酶的一个重组位点是loxp，其是包含侧接8个碱基对核心序列侧翼的两个13个碱基对反向重复序列(用作重组酶结合位点)的34个碱基对序列(参见sauer,b.,current opinion in biotechnology 5:521-527(1994)的图1)。其他示例性loxp位点包括但不限于：lox511(hoess等人,1996；bethke and sauer,1997)、lox5171(lee和saito,1998)、lox2272(lee和saito,1998)、m2(langer等人,2002)、lox71(albert等人,1995)以及lox66(albert等人,1995)。
[0415]
flp重组酶的合适识别位点包括但不限于：frt(mcleod等人,1996)、f1,f2,f3(schlake和bode,1994)、f4,f5(schlake和bode,1994)、frt(le)(senecoff等人,1988)、frt(re)(senecoff等人,1988)。
[0416]
识别序列的其他实例是attb、attp、attl和attr序列，其被重组酶λ整合酶，例如phi-c31识别。ssr仅介导异质位点attb(长度34bp)和attp(长度39bp)之间的重组
(groth等人,2000)。分别以细菌和噬菌体基因组上噬菌体整合酶的附着位点命名的attb和attp，均含有可能被同型二聚体结合的不完整反向重复(groth等人,2000)。产物位点attl和attr对于进一步的介导的重组是有效惰性的(belteki等人,2003)，使得反应不可逆。对于催化插入，已发现，携带attb的dna插入基因组attp位点比插入基因组attb位点的attp位点更容易(thyagarajan等人,2001；belteki等人,2003)。因此，典型的策略是通过同源重组将带有attp的“对接位点”定位到确定的基因座中，然后将其与带有attb的输入序列配对用于插入。
[0417]
如本文所使用，“内部核糖体进入位点”或“ires”是指促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白编码区)的如atg等起始密码子由此导致基因的非帽依赖性转译的元件。参见，例如，jackson等人，1990.trends biochem sci 15(12):477-83)以及jackson and kaminski.1995.rna 1(10):985-1000。在特定实施方案中，载体包括编码一种或多种多肽的一个或多个目的多核苷酸。在特定实施方案中，为了实现多个多肽中的每个多肽的高效翻译，多核苷酸序列可以由编码自裂解多肽的一个或多个ires序列或多核苷酸序列分离。在一个实施方案中，本文所涵盖的多核苷酸中使用的ires是emcv ires。
[0418]
如本文所使用，术语“kozak序列”是指大大促进mrna与核糖体的小亚基的初始结合并增加转译的短核苷酸序列。共有kozak序列是(gcc)rccatgg(seq id no:93)，其中r是嘌呤(a或g)(kozak,1986.cell.44(2):283-92，和kozak,1987.nucleic acids res.15(20):8125-48)。在特定实施方案中，载体包含具有共有kozak序列并且编码所需多肽，例如car的多核苷酸。
[0419]
引导异源核酸转录物的高效终止和聚腺苷酸化的元件将增加异源基因的表达。转录终止信号一般见于聚腺苷酸化信号的下游。在特定实施方案中，载体在编码待表达多肽的多核苷酸的3'端包含聚腺苷酸化序列。如本文所使用，术语“聚腺苷酸位点(polya site)”或“聚腺苷酸序列(polya sequence)”表示引导由rna聚合酶ii引起的初生rna转录物终止和聚腺苷酸化的dna序列。聚腺苷酸化序列可以通过在编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾来促进mrna稳定性，并因此促使翻译效率增加。裂解和聚腺苷酸化是由rna中的聚腺苷酸序列引导。哺乳动物pre-mrna的核心聚腺苷酸序列有两个识别元件侧接裂解-聚腺苷酸化位点上。通常，几乎不变的aauaaa六聚物位于富含u或gu残基的可变性较高的元件上游20-50个核苷酸处。初生转录物的裂解发生于这两个元件之间并偶合以将多达250个腺苷添加至5'裂解产物中。在特定实施方案中，核心聚腺苷酸序列是理想的聚腺苷酸序列(例如aataaa、attaaa、agtaaa)。在特定实施方案中，聚腺苷酸序列是sv40聚腺苷酸序列、牛生长激素聚腺苷酸序列(bghpa)、兔β-珠蛋白聚腺苷酸序列(rβgpa)、其变体、或本领域中已知的另一种适合的异源或内源性聚腺苷酸序列。
[0420]
在一些实施方案中，多核苷酸或含有多核苷酸的细胞利用自杀基因，包含用于减小直接毒性和/或不受控制的增殖的风险的诱导型自杀基因。在具体方面中，自杀基因对含有多核苷酸或细胞的宿主不产生免疫性。可以使用的自杀基因的某个实例是半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化学诱导剂(cid)来活化半胱天冬酶-9。
[0421]
在特定实施方案中，通过非病毒或病毒载体将编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的一种或多种多核苷酸引入细胞(例如免疫效应细胞)中。在特定实施方案中，通过非病毒或
病毒载体将编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多顺反子多核苷酸引入细胞中。在特定实施方案中，通过非病毒或病毒载体将编码融合蛋白的多顺反子多核苷酸引入细胞中，所述融合蛋白编码抗cd79a car、2a自身裂解多肽和抗cd20 ccr。
[0422]
术语“载体”在本文中用以指能够转移或输送另一个核酸分子的核酸分子。被转移的核酸一般被连接至载体核酸分子，例如插入载体核酸分子中。载体可以包括引导在细胞中自主复制的序列，或可以包括足以允许整合至宿主细胞dna中的序列。在特定实施方案中，使用了非病毒载体将本文所涵盖的一个或多个多核苷酸递送至t细胞中。在一个实施方案中，载体是编码多顺反子消息的体外合成或合成制备的mrna，所述多顺反子消息编码抗cd79a car的和抗cd20 ccr。
[0423]
在一个实施方案中，载体是编码融合蛋白的体外合成或合成制备的mrna，所述融合蛋白编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20ccr。
[0424]
非病毒载体的示例性实例包括但不限于mrna、质粒(例如dna质粒或rna质粒)、转座子、粘粒和细菌人工染色体。
[0425]
非病毒递送特定实施方案中所涵盖的多核苷酸的说明性方法包括但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质体转染、显微注射、基因枪法、病毒粒子、脂质体、免疫脂质体、纳米粒子、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸dna、人工病毒粒子、deae-葡聚糖介导的转移、基因枪以及热休克。
[0426]
适用于特定实施方案中所涵盖的特定实施方案中使用的多核苷酸递送系统的说明性实例包括但不限于由amaxa biosystems、maxcyte,inc.、btx molecular delivery systems和copernicus therapeutics inc.提供的那些。脂质转染试剂是商业销售的(例如，transfectam
tm
和lipofectin
tm
)。已经在文献中描述了适合于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质。参见例如liu等人(2003)gene therapy.10:180
–
187；和balazs等人(2011)journal of drug delivery.2011:1-12。在特定实施方案中还涵盖了抗体靶向的、源自细菌的、基于无生命纳米细胞的递送。
[0427]
在各种实施方案中，多核苷酸是引入细胞中以便瞬时表达所需多肽的mrna。如本文所使用，“瞬时”是指未整合的转基因在数小时、数天或数周的时间段内表达，其中表达的时间段小于多核苷酸(如果整合到基因组中或包含在细胞中的稳定质粒复制子内)的表达时间段。
[0428]
在特定实施方案中，编码多肽的mrna是体外转录的mrna。如本文所使用，“体外转录的rna”是指已在体外合成的rna，优选mrna。通常，体外转录的rna由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录rna的模板。
[0429]
在特定实施方案中，mrna还可以包含5'帽或修饰的5'帽和/或聚腺苷酸序列。如本文所使用，5'帽(也称为rna帽、rna 7-甲基鸟苷帽或rna m
7g
帽)是在转录开始后不久添加到真核信使rna的“前”或5'端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽包含与第一转录核苷酸连接并且被核糖体识别并且保护免受rna酶影响的末端基团。可修饰封端部分以调节mrna的功能性，诸如其稳定性或翻译效率。在一个特定实施方案中，mrna包含约50和约5000个腺嘌呤之间的聚腺苷酸序列。在一个实施方案中，mrna包含约100至约1000个碱基、约200至约500个碱基或约300至约400个碱基之间的聚腺苷酸序列。在一个实施方案中，mrna包含约65个碱基、约100个碱基、约200个碱基、约300个碱基、约400个碱基、约500个碱基、约600个碱基、约700
个碱基、约800个碱基、约900个碱基或约1000个或更多个碱基的聚腺苷酸序列。聚腺苷酸序列可被化学修饰或酶修饰以调节mrna功能性，例如定位、稳定性或翻译效率。
[0430]
在特定实施方案中所涵盖的包含多核苷酸的病毒载体可以通过施用至个体患者体内递送，通常通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部施用，如下所述。可替代地，载体可以离体递送到细胞，如从个体患者移植的细胞(例如，动员的外周血、淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检等)或通用供体造血干细胞，然后将细胞再植入患者体内。
[0431]
在一个实施方案中，将包含编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多核苷酸的病毒载体直接施用于生物体，用于体内转导细胞。在一个实施方案中，将包含编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的多核苷酸的病毒载体直接施用于生物体，用于体内转导细胞。可替代地，可以施用裸dna。通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径施用，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用这种核酸的合适的方法是本领域技术人员可获得的并且是公知的，并且尽管可以使用多于一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一条途径更直接且更有效的反应。
[0432]
适用于本文所涵盖的特定实施方案中的病毒载体系统的说明性实例包括但不限于腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和牛痘病毒载体。
[0433]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的重组腺相关病毒(raav)转导细胞，将编码多顺反子信息或融合蛋白的一种或多种多核苷酸引入任选包含一个或多个降低或消除pdcd-1或cblb例如t细胞的表达和/或功能的基因组编辑的免疫效应细胞中，所述多顺反子信息编码抗cd79a car和抗cd20 ccr，所述融合蛋白编码抗cd79a car、2a自身裂解多肽和抗cd20 ccr。
[0434]
aav是一种小型(约26nm)复制缺陷型、主要是附加型无包膜病毒。aav可以感染分裂和非分裂细胞，并且可以将其基因组并入到宿主细胞的基因组中。重组aav(raav)通常至少由转基因及其调节序列和5'和3'aav反向末端重复序列(itr)构成。itr序列的长度为约145bp。在特定实施方案中，raav包括从aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10分离的itr和衣壳序列。
[0435]
在一些实施方案中，使用嵌合raav，从一种aav血清型分离itr序列，并从不同的aav血清型分离衣壳序列。例如，具有源自aav2的itr序列和源自aav6的衣壳序列的raav被称为aav2/aav6。在特定实施方案中，raav载体可以包括来自aav2的itr以及来自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10中任一种的衣壳蛋白。在优选实施方案中，raav包括源自aav2的itr序列和源自aav6的衣壳序列。在优选实施方案中，raav包括源自aav2的itr序列和源自aav2的衣壳序列。
[0436]
在一些实施方案中，工程和选择方法可以应用于aav衣壳，以使其更有可能转导所关注细胞。
[0437]
已经公开了raav载体的构建、制备和其纯化，例如在美国专利第9,169,494号；第9,169,492号；第9,012,224号；第8,889,641号；第8,809,058号；以及第8,784,799号，上述美国专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
[0438]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的逆转录病毒，例如慢病毒转导细胞，将编码多顺反子消息或融合蛋白的一种或多种多核苷酸引入任选地包含一个或
多个降低或消除pdcd-1或cblb的表达和/或功能的基因组编辑的免疫效应细胞中，所述多顺反子消息编码抗cd79a car和抗cd20 ccr，所述融合蛋白编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr。
[0439]
如本文所使用，术语“逆转录病毒”是指rna病毒，所述rna病毒将其基因组rna逆转录为线性双链dna拷贝并且随后将其基因组dna共价整合到宿主基因组中。适用于特定实施方案的示例性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mulv)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(momsv)、哈维鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒、弗里德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(mscv)和劳斯肉瘤病毒(rsv)以及慢病毒。
[0440]
如本文所使用，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。示例性慢病毒包括但不限于：hiv(人免疫缺陷病毒；包含hiv 1型和hiv 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，vmv)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；以及猿猴免疫缺陷病毒(siv)。在一个实施方案中，优选基于hiv的载体主链(即，hiv顺式作用序列元件)。
[0441]
在各种实施方案中，本文所涵盖的慢病毒载体包括一个或多个ltr，以及以下辅助元件中的一个或多个或全部：cppt/flap、psi(ψ)包装信号、输出元件、聚腺苷酸序列，并且可以任选地包括wpre或hpre、绝缘子元件、可选择标志物和细胞自杀基因，如本文其他地方所讨论的。
[0442]
在特定实施方案中，本文所涵盖的慢病毒载体可以是整合的或非整合的或整合缺陷型慢病毒。如本文所使用，术语“整合缺陷型慢病毒”或“idlv”是指具有缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组的能力的整合酶的慢病毒。专利申请wo 2006/010834中已经描述了无整合能力的病毒载体，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。
[0443]
适于降低整合酶活性的hiv-1pol基因中的示例性突变包括但不限于：h12n、h12c、h16c、h16v、s81 r、d41a、k42a、h51a、q53c、d55v、d64e、d64v、e69a、k71a、e85a、e87a、d116n、d1161、d116a、n120g、n1201、n120e、e152g、e152a、d35e、k156e、k156a、e157a、k159e、k159a、k160a、r166a、d167a、e170a、h171a、k173a、k186q、k186t、k188t、e198a、r199c、r199t、r199a、d202a、k211a、q214l、q216l、q221 l、w235f、w235e、k236s、k236a、k246a、g247w、d253a、r262a、r263a和k264h。
[0444]
在一个实施方案中，hiv-1整合酶缺陷型pol基因包含d64v、d116i、d116a、e152g或e152a突变；d64v、d116i和e152g突变；或d64v、d116a和e152a突变。
[0445]
在一个实施方案中，hiv-1整合酶缺陷型pol基因包含d64v突变。
[0446]
术语“长末端重复序列(ltr)”是指位于逆转录病毒dna的末端处的碱基对的结构域，其在其天然序列环境中是直接重复序列并含有u3、r和u5区。
[0447]
如本文所使用，术语“flap元件”或“cppt/flap”指代序列包含逆转录病毒(例如，hiv-1和hiv-2)的中心多嘌呤段和中心终止序列(cppt和cts)的核酸。合适的flap元件描述于美国专利第6,682,907号和zennou等人,2000,cell,101:173中。在另一个实施方案中，慢病毒载体含有在cppt和/或cts元件中具有一个或多个突变的flap元件。在又一个实施方案中，慢病毒载体包含cppt或cts元件。在又一个实施方案中，慢病毒载体不包含cppt或cts元件。
[0448]
如本文所用，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的psi[ψ]序列，其是病毒rna插入病毒衣壳或颗粒所需的，参见例如clever等人,1995.j.of virology,第69卷，第4期；第2101-2109页。
[0449]
术语“输出元件”是指调节rna转录物从细胞的细胞核向细胞质转运的顺式作用转录后调节元件。rna输出元件的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(hiv)rev应答元件(rre)(参见例如cullen等人,1991.j.virol.65:1053；以及cullen等人1991.cell 58:423)，和b型肝炎病毒转录后调节元件(hpre)。
[0450]
在特定实施方案中，通过将转录后调节元件、高效的多腺苷酸化位点和任选地转录终止信号结合到载体中来增加异源序列在病毒载体中的表达。多种转录后调节元件可以增加异源核酸在蛋白质上的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre；zufferey等人,1999,j.virol.,73:2886)；存在于b型肝炎病毒(hpre)中的转录后调节元件(huang等人,mol.cell.biol.,5:3864)；等(liu等人,1995,genes dev.,9:1766)。
[0451]
由于修饰ltr，慢病毒载体优选地含有几种安全性增强。“自失活”(sin)载体是指复制缺陷型载体，例如其中被称为u3区的右(3')ltr增强子-启动子区已经被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。通过用异源启动子替代5'ltr的u3区来提供另外的安全性增强以驱动病毒颗粒产生期间病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包括例如病毒性猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(cmv)(例如，立即早期)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(momlv)、劳斯肉瘤病毒(rsv)和单纯性疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子。
[0452]
如本文所使用，术语“假型”或“假型包装”是指具有病毒包膜蛋白的病毒，所述病毒包膜蛋白已被具有优选特性的另一种病毒的包膜蛋白取代。例如，hiv可以用水疱性口炎病毒g蛋白(vsv-g)包膜蛋白进行假型包装，这允许hiv感染更广泛的细胞，因为hiv包膜蛋白(由env基因编码)通常将病毒靶向cd4
呈递细胞。
[0453]
在某些实施方案中，根据已知方法产生慢病毒载体。参见例如kutner等人,bmc biotechnol.2009；9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10；kutner等人nat.protoc.2009；4(4):495
–
505.doi:10.1038/nprot.2009.22。
[0454]
根据本文所涵盖的某些特定实施方案，大多数或所有病毒载体主链序列衍生自慢病毒，例如hiv-1。然而，应理解，可以使用或组合许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，并且可以容置慢病毒序列中的某些慢病毒序列的多种取代和改变而不损害转移载体执行本文所描述的功能的能力。此外，本领域已知多种慢病毒载体，参见naldini等人,(1996a、1996b和1998)；zufferey等人,(1997)；dull等人,1998,美国专利第6,013,516号；和第5,994,136号，其中许多可以适于产生本文所涵盖的病毒载体或转移质粒。
[0455]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的腺病毒转导细胞，将编码多顺反子消息或融合蛋白的一种或多种多核苷酸引入任选地包含一个或多个降低或消除pdcd-1或cblb的表达和/或功能的基因组编辑的免疫效应细胞中，所述多顺反子消息编码抗cd79a car和抗cd20 ccr，所述融合蛋白编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr。
[0456]
基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率并且并不需要细胞分裂。使用这种载体，已经获得了高滴度和高表达水平。此载体可以在相对简单的系统中大量制备。将大多数腺病毒载体工程改造，使得转基因取代ad e1a、e1b和/或e3基因；随后，在
以反式提供缺失的基因功能的人293细胞中繁殖复制缺陷型载体。ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包含如在肝、肾和肌肉中发现的非分裂的分化细胞。常规ad载体具有很大的承载能力。
[0457]
复制缺陷的当前腺病毒载体的产生和繁殖可以利用命名为293的独特辅助细胞系，所述辅助细胞系通过ad5 dna片段从人胚胎肾细胞转化并组成性地表达e1蛋白(graham等人,1977)。由于e3区可从腺病毒基因组中分配出来(jones和shenk,1978)，所以目前的腺病毒载体在293细胞的帮助下在e1、d3区或两个区中携带外源dna(graham和prevec,1991)。腺病毒载体已经用于真核基因表达(levrero等人,1991；gomez-foix等人,1992)和疫苗开发(grunhaus&horwitz,1992；graham&prevec,1992)。向不同的组织施用重组腺病毒方面的研究包含气管滴注(rosenfeld等人,1991；rosenfeld等人,1992)、肌肉注射(ragot等人,1993)、外周静脉注射(herz&gerard,1993)以及立体定向脑内接种(le gal la salle等人,1993)。在临床试验中使用ad载体的实例涉及用于伴随肌内注射的抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(sterman等人,hum.gene ther.7:1083-9(1998))。
[0458]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的单纯疱疹病毒(例如hsv-1、hsv-2)，将编码多顺反子消息或融合蛋白的一种或多种多核苷酸引入任选地包含一个或多个降低或消除pdcd-1或cblb的表达和/或功能的基因组编辑的免疫效应细胞中，所述多顺反子消息编码抗cd79a car和抗cd20 ccr，所述融合蛋白编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr。
[0459]
成熟hsv病毒粒子由包膜的二十面体衣壳组成，其中病毒基因组由152kb的线性双链dna分子组成。在一个实施方案中，基于hsv的病毒载体缺乏一个或多个必需或非必需的hsv基因。在一个实施方案中，基于hsv的病毒载体为复制缺陷型。大多数复制缺陷型hsv载体含有缺失以去除一个或多个中早期、早期或晚期hsv基因从而防止复制。例如，hsv载体可能缺乏选自由以下组成的组的立即早期基因：icp4、icp22、icp27、icp47及其组合。hsv载体的优点是其进入可以导致长期dna表达的潜伏期的能力，以及其可以容纳高达25kb的外源dna插入物的大型病毒dna基因组。基于hsv的载体描述于例如美国专利第5,837,532号、第5,846,782号和第5,804,413号以及国际专利申请wo 91/02788、wo 96/04394、wo 98/15637和wo 99/06583中，所述专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
[0460]
h.经过基因修饰的细胞
[0461]
在各种实施方案中，提供了经基因修饰以表达本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr以用于治疗癌症的细胞。在各种优选实施方案中，将经基因修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr并且包含一个或多个降低或消除pdcd-1和/或cblb的功能和/或表达的基因组编辑的免疫效应细胞用于癌症治疗。在另外的优选实施方案中，将经基因修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr并且包含一个或多个降低或消除cblb的功能和/或表达的基因组编辑的t细胞或nk细胞用于癌症治疗。
[0462]
在特定实施方案中，将本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白引入免疫效应细胞中并在免疫效应细胞中表达，以便重定向它们对所关注的靶抗原，例如cd79a或cd20的特异性。在优选实施方案中，将抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白引入免疫效应细胞中并在免疫效应细胞中表达，所述免疫效应细胞在cblb中包含一个或多个
基因组编辑，以便重定向它们对cd79a和cd20的特异性。“免疫效应细胞”是免疫系统的任何细胞，其具有一种或多种效应功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子分泌、adcc和/或cdc的诱导)。本文所涵盖的示例性免疫效应细胞是t淋巴细胞，包括但不限于细胞毒性t细胞(ctl；cd8
t细胞)、til和辅助t细胞(htl；cd4
t细胞)。在一个特定实施方案中，细胞包括αβt细胞，在一个特定实施方案中，细胞包括γδt细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞包括自然杀伤(nk)细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞包括自然杀伤t(nkt)细胞。
[0463]
免疫效应细胞可以是自体的/自身的(“自我”)或非自体的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异种的)。如本文所使用，“自体”是指来自同一受试者的细胞。如本文所使用，“同种异体”是指来自同一物种的在基因上与比较细胞不同的细胞。如本文所使用，“同基因”是指来自不同受试者的在基因上与比较细胞相同的细胞。如本文所使用，“异种”是指来自与比较细胞不同的物种的细胞。在优选实施方案中，所述细胞是自体的。
[0464]
在特定实施方案中所涵盖的与抗cd79a car和抗cd20 ccr一起使用的示例性免疫效应细胞包括t淋巴细胞。术语“t细胞”或“t淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包含胸腺细胞、未成熟t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静息t淋巴细胞或活化t淋巴细胞。t细胞可以是t辅助(th)细胞，例如t辅助1(th1)或t辅助2(th2)细胞。t细胞可以是辅助t细胞(htl；cd4
t细胞)cd4
细胞、细胞毒性t细胞(ctl；cd8
t细胞)、cd4
cd8
t细胞、cd4-cd8-t细胞或任何其他的t细胞亚群。适合在特定实施方案中使用的其他示例性t细胞群包括初始t细胞(tn)、t记忆干细胞(t
scm
)、中心记忆t细胞(t
cm
)、效应记忆t细胞(t
em
)和效应t细胞(t
eff
)。
[0465]
如技术人员将理解的，其他细胞也可以用作具有本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞。特别地，免疫效应细胞还包括nk细胞、nkt细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中可以在体内或体外诱导此类祖细胞分化成免疫效应细胞。因此，在特定实施方案中，免疫效应细胞包括免疫效应细胞的祖细胞，诸如源自脐带血、骨髓或动员的外周血的cd34 细胞群内含有的造血干细胞(hsc)，所述hsc在受试者中施用后分化为成熟免疫效应细胞，或可以在体外诱导所述hsc分化为成熟免疫效应细胞。
[0466]
如本文所使用，术语“cd34 细胞”是指在其细胞表面上表达cd34蛋白的细胞。如本文所使用，“cd34”是指通常充当细胞-细胞粘附因子并且参与t细胞进入淋巴结的细胞表面糖蛋白(例如，唾液黏蛋白)。cd34 细胞群含有造血干细胞(hsc)，其在施用给患者时分化并促成所有造血谱系，包括t细胞、nk细胞、nkt细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞。
[0467]
在特定实施方案中提供了用于制备表达本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多顺反子消息或编码本文所涵盖的抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白。
[0468]
在优选实施方案中，该方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多顺反子消息或编码本文所涵盖的抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白。该方法还包括将编码he变体或megatal的多核苷酸引入细胞中，所述he变体或megatal结合和裂解pdcd-1基因或cblb基因中，优选cblb基因中的靶位点。在特定实施方案中，随后在向受试者施用之前培养转导和编
辑的细胞用于扩增。
[0469]
在某些实施方案中，免疫效应细胞从个体分离并经基因修饰和/或编辑而无需在体外进一步操纵。然后，可以将这种细胞直接再次施用到个体。在另外的实施方案中，免疫效应细胞首先被活化和刺激以在体外增殖，然后经基因修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr，并且然后使用靶向pdcd-1或cblb，优选cblb的he变体或megatal进行编辑。在这方面，可以在基因修饰和/或基因组编辑(即，转导或转染以表达本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr)之前和/或之后培养免疫效应细胞。
[0470]
在特定实施方案中，在本文所述的免疫效应细胞的体外操纵或基因修饰之前，从受试者获得细胞来源。在特定实施方案中，经修饰的免疫效应细胞包括t细胞。
[0471]
在特定实施方案中，可以使用本文所涵盖的方法直接对pbmc进行基因修饰以表达编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多顺反子消息或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白。在某些实施方案中，在pbmc的分离之后，进一步分离t淋巴细胞，并且在某些实施方案中，可以在基因修饰和/或扩增之前或之后将细胞毒性和辅助t淋巴细胞分类为初始、记忆和效应t细胞亚群。
[0472]
免疫效应细胞，诸如t细胞，可以在使用已知方法分离后进行基因修饰，或免疫效应细胞可以在经基因修饰和/或基因组编辑之前在体外活化和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在一个特定实施方案中，免疫效应细胞，诸如t细胞被活化并刺激用于扩增，并且然后用本文所涵盖的嵌合抗原受体进行基因修饰(例如，用包含编码多顺反子消息或融合蛋白的核酸的病毒载体转导)，并且然后在体外被活化并扩增，所述多顺反子消息编码抗cd79a car和抗cd20 ccr，所述融合蛋白编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr。在各种实施方案中，可以使用如下中所述的方法在基因修饰之前或之后使t细胞活化并扩增：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开第20060121005号。
[0473]
在一个实施方案中，cd34
细胞用本文所涵盖的核酸构建体转导。在某些实施方案中，转导的cd34
细胞在施用给受试者(通常是最初分离细胞的受试者)后在体内分化为成熟的免疫效应细胞。在另一个实施方案中，cd34
细胞可以在暴露于一种或多种以下细胞因子之前或在用一种或多种以下细胞因子进行基因修饰之后根据前述的方法在体外刺激：flt-3配体(flt3)、干细胞因子(scf)、巨核细胞生长和分化因子(tpo)、il-3和il-6(asheuer等人,2004；imren等人,2004)。
[0474]
在特定实施方案中，用于治疗癌症的修饰的免疫效应细胞群包含本文所涵盖的car和ccr。例如，修饰的免疫效应细胞群由从被诊断患有本文所述的b细胞恶性肿瘤的患者(自体供体)获得的外周血单核细胞(pbmc)制备。pbmc形成可以是cd4 、cd8 或cd4 和cd8 的t淋巴细胞的异质群体。
[0475]
pbmc还可包括其他细胞毒性淋巴细胞，诸如nk细胞或nkt细胞。将携带特定实施方案中所涵盖的car和ccr的编码序列的表达载体引入人供体t细胞、nk细胞或nkt细胞的群体中。在特定实施方案中，携带表达载体的成功转导的t细胞可以使用流式细胞术分选，以分离cd3阳性t细胞，并且接着除了使用抗cd3抗体和/或抗cd28抗体和il-2或如本文其他地方所述本领域已知的任何其他方法进行细胞活化之外，进一步增殖以增加这些表达car和ccr
的t细胞的数目。标准程序用于t细胞的冷冻保存，以用于人类受试者中的储存和/或制备。在一个实施方案中，在不存在非人动物衍生产物如胎牛血清(fetal calf serum/fetal bovine serum)的情况下进行t细胞的体外转导、培养和/或扩增。由于异质pbmc群体经基因修饰，因此所得转导细胞是经修饰细胞的异质群体，其包含编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多顺反子消息或编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白编码本文所涵盖的抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr。在特定实施方案中，异质pbmc群体经基因修饰和基因组编辑，并且所得细胞是经修饰细胞的异质群体，其包含编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多顺反子消息或编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr，并且还包含一个或多个降低或消除pdcd-1和/或cblb功能和表达的基因组编辑。
[0476]
在另外的实施方案中，例如一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同表达载体的混合物可用于基因修饰免疫效应细胞的供体群，其中每个载体编码如本文所涵盖的不同嵌合抗原受体蛋白。所得应的经修饰免疫效细胞形成经修饰细胞的混合群体。
[0477]
i.t细胞制造方法
[0478]
在各种实施方案中，通过与刺激cd3 tcr复合物相关信号的试剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体接触来扩增经基因修饰的t细胞。
[0479]
在特定实施方案中，pbmc或分离的t细胞与刺激剂和共刺激剂，诸如可溶性抗cd3和抗cd28抗体，或附接到珠粒或其他表面的抗体在具有适当细胞因子诸如il-2、il-7和/或il-15的培养基中接触。
[0480]
在特定实施方案中，pbmc或分离的t细胞与刺激剂和共刺激剂，诸如可溶性抗cd3和抗cd28抗体，或附接到珠粒或其他表面的抗体在具有适当细胞因子诸如il-2、il-7和/或il-15和/或pi3k抑制剂的培养基中接触。
[0481]
在一个实施方案中，外周血单核细胞(pbmc)在本文所涵盖的t细胞制造方法中用作t细胞的来源。pbmc形成可为cd4
、cd8
或cd4
和cd8
的t淋巴细胞异源群并且可以包括其他单核细胞，诸如单核细胞、b细胞、nk细胞和nkt细胞。将包含编码多顺反子消息或融合蛋白的多核苷酸的表达载体引入人供体t细胞、nk细胞或nkt细胞群体中，所述多顺反子消息编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的，所述融合蛋白编码特定实施方案中所涵盖的抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr。在一个特定实施方案中，携带表达载体的成功转导的t细胞可以使用流式细胞术分选以分离cd3阳性t细胞，并且然后除了使用抗cd3抗体和/或抗cd28抗体以及il-2、il-7和/或il-15的细胞活化之外，进一步增殖以增加修饰的t细胞的数目。
[0482]
为了实现足够治疗剂量的t细胞组合物，通常对t细胞进行一轮或多轮刺激、活化和/或扩增。通常可以使用如下中所述的方法使t细胞活化和扩增：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041，上述美国专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
[0483]
在优选实施方案中，通过本文所涵盖的方法制造的t细胞提供了改良的过继免疫疗法组合物。不希望受任何特定理论的束缚，据信通过本文所涵盖的特定实施方案中的方法制造的t细胞组合物具有优异的特性，包括增加的存活率、在相对无分化的情况下的扩增
以及体内持久性。在一个实施方案中，制造t细胞的方法包括使细胞与一种或多种调节pi3k细胞信号传导路径的试剂接触。
[0484]
在一个特定实施方案中，通过在一种或多种刺激信号和pi3k抑制剂的存在下刺激t细胞变得活化并增殖来制造t细胞。
[0485]
然后可以修饰t细胞以表达编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多顺反子消息或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白。在一个实施方案中，通过用病毒载体转导t细胞来修饰t细胞，所述病毒载体包含编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多顺反子消息或编码本文所涵盖的抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白。在某些实施方案中，在pi3k细胞信号传导路径的抑制剂的存在下，在刺激和活化之前修饰t细胞。在另一个实施方案中，在pi3k细胞信号传导路径的抑制剂的存在下，在刺激和活化之后修饰t细胞。在一个特定实施方案中，在pi3k细胞信号传导路径的抑制剂的存在下，在刺激和活化的12小时、24小时、36小时或48小时内修饰t细胞。在一个特定实施方案中，在pi3k抑制剂的存在下修饰t细胞。
[0486]
在特定实施方案中，在用包含编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的多核苷酸或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白的病毒载体转导免疫效应细胞后，将编码的多核苷酸引入细胞中，多核苷酸编码结合和裂解pdcd-1基因或cblb基因中，优选cblb基因中的靶位点的he变体或megatal。
[0487]
在转导和/或编辑t细胞之后，培养细胞以增殖。t细胞可培养至少1、2、3、4、5、6或7天，至少2周、至少1、2、3、4、5或6个月或更长时间，伴随1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多轮扩增。在一个特定实施方案中，培养t细胞以在pi3k抑制剂的存在下增殖。
[0488]
在各种实施方案中，在pi3k抑制剂的存在下制造t细胞组合物。不希望受任何特定理论约束，考虑在制造工艺的刺激、活化和/或扩增期期间，治疗或使t细胞与pi3k路径的一种或多种抑制剂接触优先增加年轻t细胞，从而产生优异的治疗性t细胞组合物。
[0489]
如本文所使用，术语“pi3k抑制剂”是指结合并抑制pi3k的至少一种活性的核酸、肽、化合物或小有机分子。pi3k蛋白可以分为三类，1类pi3k、2类pi3k和3类pi3k。1类pi3k作为异源二聚体存在，该异源二聚体由四种p110催化亚基(p110α、p110β、p110δ和p110γ)中的一种和两个调控亚基家族中的一种组成。pi3k抑制剂优选靶向1类pi3k抑制剂。在一个实施方案中，pi3k抑制剂对1类pi3k抑制剂的一种或多种同种型将显示出选择性(即，对p110α、p110β、p110δ和p110γ以及p110α、p110β、p110δ和p110γ中的一种或多种的选择性)。在另一个方面，pi3k抑制剂将不显示同种型选择性并且被视为“pan-pi3k抑制剂”。在一个实施方案中，pi3k抑制剂将与atp竞争结合到pi3k催化结构域。
[0490]
在某些实施方案中，pi3k抑制剂可以例如靶向pi3k以及pi3k-akt-mtor路径中的另外的蛋白质。在特定实施方案中，靶向mtor和pi3k两者的pi3k抑制剂可被称为mtor抑制剂或pi3k抑制剂。仅靶向pi3k的pi3k抑制剂可以被称为选择性pi3k抑制剂。在一个实施方案中，选择性pi3k抑制剂可以理解为指相对于pi3k表现出50％抑制浓度的试剂，所述抑制浓度比抑制剂相对于mtor和/或路径中的其他蛋白的ic50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多。
[0491]
在一个特定实施方案中，示例性pi3k抑制剂以约200nm或更低，优选约100nm或更低、甚至更优选约60nm或更低、约25nm、约10nm、约5nm、约1nm、100μm、50μm、25μm、10μm、1μm
或更低的ic50(抑制50％活性的浓度)抑制pi3k。在一个实施方案中，pi3k抑制剂以约2nm至约100nm、更优选地约2nm至约50nm、甚至更优选地约2nm至约15nm的ic50抑制pi3k。
[0492]
适用于特定实施例中所涵盖的t细胞制造方法中的pi3k抑制剂的说明性实例包括但不限于bkm120(1类pi3k抑制剂，novartis)、xl147(1类pi3k抑制剂，exelixis)、(pan-pi3k抑制剂，glaxosmithkline)和px-866(1类pi3k抑制剂；p110α、p110β和p110γ同种型，oncothyreon)。
[0493]
选择性pi3k抑制剂的其他说明性实例包括但不限于byl719、gsk2636771、tgx-221、as25242、cal-101、zstk474和ipi-145。
[0494]
pan-pi3k抑制剂的更多说明性实例包括但不限于bez235、ly294002、gsk1059615、tg100713和gdc-0941。
[0495]
在一个优选实施方案中，pi3k抑制剂是zstk474。
[0496]
在一个特定实施方案中，提供了一种用于增加表达经工程改造的t细胞受体的t细胞的增殖的方法。此类方法可以包括例如从受试者收获t细胞源，刺激和活化t细胞，修饰t细胞以表达抗cd79a car和抗cd20ccr，用he变体或megatal编辑细胞基因组并在培养物中扩增t细胞，其中t细胞在pi3k路径的一种或多种抑制剂的存在下制造。
[0497]
本文所涵盖的制造方法还可包括低温保存修饰的t细胞，用于在人受试者中的储存和/或制备。在一个实施方案中，储存经基因修饰的免疫效应细胞的方法包括低温保存免疫效应细胞，使得细胞在解冻后保持活力。将t细胞低温保存，使得细胞在解冻后保持活力。当需要时，可使低温保存的转化的免疫效应细胞解冻、生长和扩增更多此类细胞。如本文所用，“低温保存”是指通过冷却到零下温度，诸如(通常)77k或-196℃(液氮的沸点)来保存细胞。低温保护剂常常在零下温度使用，以防止由于低温下冷冻或升温至室温而使细胞保存受损。低温保护剂和最佳冷却速率可以防止细胞损伤。可以使用的低温保护剂包括但不限于二甲基亚砜(dmso)(lovelock和bishop，nature,1959；183:1394-1395；ashwood-smith，nature,1961；190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷(rinfret,ann.n.y.acad.sci.,1960；85:576)和聚乙二醇(sloviter和ravdin,nature,1962；196:48)。优选的冷却速率是1℃/分钟至3℃/分钟。在至少两小时后，t细胞已达到-80℃的温度并且可以直接置于液氮(-196℃)中永久储存，诸如置于长期低温储存容器中。
[0498]
j.组合物和配制物
[0499]
本文所涵盖的组合物可以包含一种或多种如本文所涵盖的car多肽、ccr多肽、多核苷酸、包含其的载体、基因修饰的免疫效应细胞等。组合物包括但不限于药物组合物。在优选实施方案中，组合物包含一种或多种经修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白的细胞。在优选实施方案中，组合物包含一种或多种经修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白的细胞，其中所述细胞还经历基因组编辑以降低或消除cblb的表达和功能。
[0500]“药物组合物”是指单独地或与一种或多种其他治疗方式组合地施用于细胞或动物的药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制的组合物。还应理解，如果需要，组合物也可以与其他药剂组合施用，例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其他各种药学活性剂。对组合物中还可以包含的其他组分实际上不存在限制，
条件是另外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。在优选实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂以及一种或多种基因组编辑的细胞，所述细胞也被修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白。
[0501]
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0502]
如本文所用，“药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂”包括但不限于任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂，这些已被美国食品和药物管理局批准可接受用于人类或家畜。示例性的药学上可接受的载剂包括但不限于糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪；麦芽；明胶；滑石；可可油、蜡、动植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和药物配制剂中采用的任何其他相容性物质。
[0503]
在特定实施方案中，组合物包含本文所涵盖的表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞。在优选实施方案中，组合物包含一定量的表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的基因组编辑的免疫效应细胞，其中基因组编辑降低或消除pdcd-1和/或cblb，优选cblb的表达和功能。如本文所使用，术语“量”是指实现有益或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)的基因修饰的治疗细胞，例如t细胞的“有效的量”或“有效量”。
[0504]“预防有效量”是指有效实现所需预防结果的经基因修饰的治疗细胞的量。通常，但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或疾病早期用于受试者的，所以预防有效量小于治疗有效量。
[0505]
基因修饰的治疗细胞的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效地“治疗”受试者(例如，患者)的量。当指示治疗量时，待施用的组合物的精确量可以由内科医生涵盖年龄、体重、肿瘤大小、感染程度或转移程度以及患者(受试者)的病状的个体差异来确定。
[0506]
通常可以说，包含本文所述的t细胞的药物组合物可以以102至10
10
个细胞/kg体重，优选地105至106个细胞/kg体重(包含那些范围内的所有整数值)的剂量施用。细胞的数目将取决于组合物的期望最终用途，其中包含的细胞的类型也是如此。对于本文所提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以为500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所期望细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过105、106、107、108、109、10
10
、10
11
或10
12
个细胞的多次输注中。在一些方面，特别是由于所有输注的细胞将被重新定
向至特定靶抗原，所以可以施用106/千克(10
6-10
11
/患者)范围内的较低数目的细胞。组合物可以这些范围内的剂量多次施用。对于接受治疗的患者，细胞可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。如果需要，治疗还可以包括施用如本文所描述的有丝分裂原(例如，pha)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，ifn-γ、il-2、il-12、tnf-α、il-18和tnf-β、gm-csf、il-4、il-13、flt3-l、rantes、mip1α等)以增强免疫应答的诱导。
[0507]
通常，包含如本文所描述的活化和扩增的细胞的组合物可以用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。在特定实施方案中，包含经修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码本文所涵盖的抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白的免疫效应细胞并且包含一个或多个降低或消除pdcd-1和/或cblb、优选cblb的基因组编辑的组合物用于治疗。修饰的免疫效应细胞可以单独施用，或作为药物组合物与载剂、稀释剂、赋形剂和/或与如il-2等其他组分或其他细胞因子或细胞群组合施用。在特定实施方案中，药物组合物包括与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的一定量的经过基因修饰的t细胞。
[0508]
包含经修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白的基因组编辑的免疫效应细胞，诸如t细胞的药物组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。组合物优选配制用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。
[0509]
液体药物组合物，无论它们是溶液、悬浮液或其他类似形式，可包括以下的一种或多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠、可充当溶剂或悬浮介质的不挥发性油(诸如合成单甘油酯或双甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂，诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张度的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以装入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。
[0510]
在一个实施方案中，本文所涵盖的t细胞组合物在药学上可接受的细胞培养基中配制。此类组合物适于施用于人类受试者。在特定实施方案中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。
[0511]
无血清培养基相比于含有血清的培养基具有若干优点，包括组合物得到简化且得到更好定义、污染物程度得到减小、可能的传染剂来源得到消除以及成本降低。在各种实施方案中，无血清培养基是无动物的并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。“无动物”培养基是指其中组分源自非动物来源的培养基。重组蛋白替代无动物培养基中的天然动物蛋白质，并且营养物从合成的、植物或微生物来源获得。相比之下，“无蛋白质”培养基被定义为基本上不含蛋白质。
[0512]
特定实施方案中使用的无血清培养基的说明性实例包括但不限于qbsf-60(quality biological,inc.)、stempro-34(life technologies)和x-vivo 10。
[0513]
在一个优选实施方案中，包含本文所涵盖的免疫效应细胞的组合物在包含plasmalyte a的溶液中配制。
[0514]
在另一个优选实施方案中，包含本文所涵盖的免疫效应细胞的组合物在包含低温保存介质的溶液中配制。例如，可以使用具有低温保存药剂的低温保存培养基以在解冻后保持高细胞存活率结果。特定实施方案中使用的低温保存培养基的说明性实例包括但不限于cryostor cs10、cryostor cs5和cryostor cs2。
[0515]
在一个更优选的实施方案中，包含本文所涵盖的免疫效应细胞的组合物在包含50:50plasmalyte a:cryostor cs10的溶液中配制。
[0516]
在一个特定实施方案中，组合物包含有效量的基因组编辑的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞被修饰以单独或与一种或多种治疗剂组合表达抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白。因此，表达car的免疫效应细胞组合物可以单独或与其他已知的癌症治疗，例如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力学疗法等组合施用。所述组合物还可以与抗生素组合施用。本领域可接受这种治疗剂作为如本文所描述的如特定癌症等特定疾病状态的标准治疗。特定实施方案中所涵盖的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、nsaid、dmard、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗性抗体或其他活性剂和辅助剂。
[0517]
在某些实施方案中，包含基因组编辑的免疫效应细胞的组合物可以与任何数量的化学治疗剂一起施用，所述免疫效应细胞被修饰以表达抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白。
[0518]
多种其他治疗剂可以与本文所述的组合物结合使用。在一个实施方案中，包含基因组编辑的免疫效应细胞、抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白的组合物与抗炎剂一起施用。
[0519]
在一个实施方案中，包含基因组编辑的免疫效应细胞、抗cd79a car和抗cd20 ccr或编码抗cd79a car、2a自裂解多肽和抗cd20 ccr的融合蛋白的组合物与治疗性抗体一起施用。适合与特定实施方案中所涵盖的修饰car的t细胞组合的治疗性抗体的说明性实例包括但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、可那木单抗(conatumumab)、克唑替尼(crizotinib)、达雷木单抗(daratumumab)、杜利他单抗(duligotumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、度伐单抗(durvalumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(huluc63)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、因达妥昔单抗(indatuximab)、英妥珠单抗(inotuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)、卢卡珠单抗(lucatumumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、莫西姆单抗(moxetumomab)、纳武单抗(nivolumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、塞妥昔单抗(siltuximab)、替妥木单抗(teprotumumab)和乌妥昔单抗(ublituximab)。
[0520]
k.靶细胞和抗原
[0521]
在特定实施方案中提供了基因修饰的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞重定向至靶细胞，例如癌细胞，并且表达抗cd79a car和抗cd20 ccr，并且一个或多个包含pdcd-1和/或cblb，优选cblb中的基因组编辑。如本文所使用，术语“癌症”通常涉及异常细胞在没有控制的情况下分裂并且可能侵入附近组织的一类疾病或病状。
[0522]
如本文所使用，术语“恶性”是指一组肿瘤细胞显示出不受控制的生长(即，超出正常限度的分裂)、侵入(即，侵入和破坏相邻组织)和转移(即，经由淋巴或血液扩散到体内的其他位置)中的一种或多种的癌症。如本文所使用，术语“转移”是指癌症从身体的一个部位扩散到另一个部位。由已经扩散的细胞形成的肿瘤被称为“转移性肿瘤”或“转移”。转移性肿瘤含有与原始(原发性)肿瘤中的细胞相似的细胞。
[0523]
如本文所使用，术语“良性”或“非恶性”是指可以长得更大但不扩散到身体的其他部位的肿瘤。良性肿瘤是自限性的并且通常不会侵入或转移。
[0524]“癌细胞”是指癌性生长或组织的单个细胞。癌细胞包含实体癌和液体癌。“肿瘤”或“肿瘤细胞”通常是指由细胞的异常生长形成的肿胀或病变，所述肿胀或病变可以是良性的、恶化前的(pre-malignant)或恶性的。大多数癌症形成肿瘤，但液体癌例如白血病不一定形成肿瘤。对于形成肿瘤的那些癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。个体中肿瘤的量是可以测量为肿瘤的数目、体积或重量的“肿瘤负荷”。
[0525]
术语“复发”是指经过一段时间的改善或缓解后诊断出癌症重现或重现体征和症状。
[0526]“缓解”也被称为“临床缓解”并且包含部分缓解和完全缓解两者。在部分缓解中，一些但并非所有癌症体征和症状已经消失。在完全缓解中，所有癌症体征和症状均已消失，尽管癌可能仍在体内。
[0527]“难治”是指癌症对用特定治疗剂进行的疗法具有抗性或无应答。癌症可以在治疗开始时是难治的(即，对初始暴露于治疗剂无应答)，或者由于在第一治疗期内或在随后的治疗期期间对治疗剂产生抗性而是难治的。
[0528]
在一个实施方案中，靶细胞表达抗原，例如基本上不存在于其他正常(期望)细胞表面上的靶抗原。
[0529]
在一个实施方案中，靶细胞是骨肉瘤细胞或尤文氏肉瘤细胞。
[0530]
在一个实施方案中，靶细胞是造血细胞、淋巴细胞或髓样细胞。
[0531]
在某些实施方案中，靶细胞是血液、淋巴组织或髓样组织的一部分。
[0532]
在一个特定实施方案中，靶细胞是表达cd79a和/或cd20的癌细胞或癌症干细胞。在一个特定实施方案中，靶细胞是表达cd79a和cd20的癌细胞或癌症干细胞。在一个特定实施方案中，靶细胞是表达cd79a或cd20的癌细胞或癌症干细胞。
[0533]
在一个特定实施方案中，靶细胞是表达cd79a和/或cd20的液体癌细胞或血液癌细胞。在一个特定实施方案中，靶细胞是表达cd79a和cd20的液体癌细胞或血液癌细胞。在一个特定实施方案中，靶细胞是表达cd79a或cd20的液体癌细胞或血液癌细胞。
[0534]
可以用特定实施方案中所涵盖的组合物预防、治疗或改善的液体癌或血液癌的说明性实例包括但不限于：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0535]
可以由表达特定实施方案中所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞靶向的细胞的说明性实例包括但不限于以下白血病中的那些细胞：急性淋巴细胞性白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞、红白血病、毛细胞白血病(hcl)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和慢性髓性白血病(cml)、慢性骨髓单核细胞性白血病(cmml)和真性多细胞增多症。
[0536]
可以通过包含表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞的组合物和特定实
施例中涵盖的方法靶向的细胞的说明性实例包括但不限于以下淋巴瘤中的那些细胞：霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括但不限于b细胞非霍奇金淋巴瘤：伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤；以及t细胞非霍奇金淋巴瘤：蕈样肉芽肿病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里综合征和前体t淋巴母细胞性淋巴瘤。
[0537]
可以由表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞的组合物并通过特定实施例中涵盖的方法靶向的细胞的说明性实例包括但不限于以下多发性骨髓瘤的那些细胞：明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤(mgus)、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、igd骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。
[0538]
在优选实施方案中，表达cd79a和/或cd20的靶细胞是dlbcl癌细胞。在优选实施方案中，表达cd79a和cd20的靶细胞是dlbcl癌细胞。在优选实施方案中，表达cd79a或cd20的靶细胞是dlbcl癌细胞。
[0539]
l.治疗方法
[0540]
表达本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的基因修饰的免疫效应细胞提供了用于预防、治疗和改善表达cd79a和/或cd20的癌症，或用于预防、治疗或改善与表达cd79a和/或cd20的癌症相关的至少一种症状的过继免疫疗法的改进方法。
[0541]
在各种实施方案中，本文涵盖的基因修饰的免疫效应细胞提供了用于增加在受试者中表达cd79a和/或cd20的癌细胞中的细胞毒性，或用于减少受试者中表达cd79a和/或cd20的癌细胞数量的过继免疫疗法的改进方法。
[0542]
在特定实施方案中，通过用本文所涵盖的car对初级免疫效应细胞进行基因修饰，将初级免疫效应细胞的特异性重定向至表达cd79a和/或cd20的细胞，例如癌细胞。在各种实施方案中，病毒载体用于用编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的特定多核苷酸遗传修饰免疫效应细胞。
[0543]
在一个实施方案中，提供了一种细胞疗法，其中t细胞被遗传修饰以表达靶向表达cd79a和/或cd20的癌细胞的抗cd79a car和抗cd20 ccr，并且t细胞被输注至有需要的受体。输注的细胞能够杀死在受体中引起疾病的细胞。与抗体疗法不同，t细胞疗法能够在体内复制，导致可以导致持续癌症治疗的长期持久性。
[0544]
在一个实施方案中，表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞可经历稳健的体内t细胞扩增，且可持续延长的时间量。在另一个实施方案中，表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞演变成特异性记忆t细胞或干细胞记忆t细胞，其可以被再活化以抑制任何另外的肿瘤形成或生长。
[0545]
在特定实施方案中，包含表达本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞的组合物用于治疗与表达cd79a和/或cd20的癌细胞或癌症干细胞相关的病症。
[0546]
在特定实施例中考虑了使用表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞治疗、预防或改善的条件的说明性实例。
[0547]
在一个特定实施方案中，包含表达本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞的组合物用于治疗骨肉瘤或尤文氏肉瘤。
[0548]
在一个特定实施方案中，包含表达本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细
胞的组合物用于治疗液体癌或血液癌。
[0549]
在某些实施方案中，液体癌或血液癌选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0550]
在某些实施方案中，液体癌或血液癌选自由以下组成的组：急性淋巴细胞性白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、毛细胞白血病(hcl)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和慢性髓性白血病(cml)、慢性髓单核细胞性白血病(cmml)和真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型的霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里氏综合征、前体t淋巴母细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、igd骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。
[0551]
在某些实施方案中，液体癌或血液癌选自由以下组成的组：急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、毛细胞白血病(hcl)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓性白血病(aml)或慢性髓性白血病(cml)。
[0552]
在优选实施方案中，液体癌或血液癌是dlbcl。
[0553]
在优选实施方案中，液体癌或血液癌是复发性/难治性dlbcl。
[0554]
在特定实施方案中，提供了包括向有需要的患者单独或与一种或多种治疗剂组合施用治疗有效量的表达本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的免疫效应细胞或包含其的组合物的方法。在某些实施方案中，细胞用于治疗处于患有与表达cd79a和/或cd20的癌细胞相关的病症的风险的患者。因此，在特定实施方案中，本文涵盖用于治疗或预防或改善癌症的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的修饰的t细胞。
[0555]
如本文所使用，术语“个体”和“受试者”经常可互换使用并且是指展现出可以用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其他地方涵盖的方法治疗的疾病、病状或病症的症状的任何动物。在优选实施方案中，受试者包括表现出与可以用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其他地方涵盖的方法治疗的癌症相关的疾病、病症或病状的症状的任何动物。适合的受试者(例如，患者)包括实验用动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(如猫或狗)。包括非人灵长类和优选地人类患者。典型受试者包括患有表达cd79a和/或cd20的癌症、已被诊断患有表达cd79a和/或cd20的癌症、或处于患有表达cd79a和/或cd20的癌症，例如dlbcl的风险中的人类患者。
[0556]
如本文所使用，术语“患者”是指已经诊断为患有可以用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其他地方公开的方法治疗的特定疾病、病症或症状的受试者。
[0557]
如本文所使用，“治疗(treatment或treating)”包括对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益的或期望的效果并且甚至可以包括正在治疗的疾病或病状的一个或多个可测量标志物的最低限度的减少。治疗可以任选地涉及疾病或病状的减轻，或者疾病或病状的进展的延迟。“治疗”不一定指示完全根除或治愈疾病或病状或其相关症状。
[0558]
如本文所使用，“预防(prevent)”和诸如“预防(prevented/preventing)”等类似
词语指示用于预防、抑制或减少疾病或病症发生或复发的可能性。预防还是指延迟疾病或病症的发作或复发或者延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所使用，“预防(prevention)”和类似词语还包括在疾病或病症发作或复发之前减少疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。
[0559]
如本文所使用，短语“减轻
……
的至少一种症状”是指减少正在治疗的受试者的疾病或病症的一种或多种症状。在特定实施方案中，被治疗的疾病或病症是癌症，其中所减轻的一种或多种症状包括但不限于虚弱、疲劳、呼吸短促、容易挫伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹部肿胀或疼痛(由于腹部器官肿大)、骨骼或关节疼痛、骨折、意外体重减轻、食欲不振、盗汗、持续性轻度发烧以及排尿减少(由于肾功能受损)。
[0560]“增强”或“促进”或者“增加”或“扩增”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本文所涵盖的组合物，例如表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的基因修饰的t细胞能够产生、引发或引起更大的生理应答(即，下游效应)。可测量的生理应答可以包括t细胞扩增、活化、持续性的增加和/或癌细胞杀伤能力的增加以及从本领域的理解和本文中的描述中显而易见的其他方面。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量并且可以包括是由媒介物或对照组合物产生的应答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其间且在1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。
[0561]“减小”或“减弱”或“变少”或“减少”或“减轻”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本文所涵盖的组合物能够产生、引发或引起更少的应答(即，生理应答)。“减小的”或“减少的”量通常是“统计上显著”的量并且可以包括是由媒介物、对照组合物或特定细胞谱系中的应答产生的应答(参考应答)的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其间且在1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减小。
[0562]“维持(maintain或maintenance)”或“保持”或“无变化”或“无实质变化”或“无实质减小”通常是指与由媒介物、对照分子/组合物或特定细胞谱系中的应答引起的应答相比，本文所涵盖的组合物能够在细胞中产生、引发或引起类似的生理应答(即，下游效应)。相当的反应是与参考反应并无显著不同或可测量不同的反应。
[0563]
在一个实施方案中，治疗有需要的受试者的癌症的方法包括施用有效量，例如治疗有效量的包含本文所涵盖的基因修饰的免疫效应细胞的组合物。施用的数量和频率将由如患者的病状以及患者疾病的类型和严重性等因素确定，尽管适当的剂量可以通过临床试验确定。
[0564]
在一个实施方案中，向受试者施用的组合物中的免疫效应细胞(例如，表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞)的量为至少0.1
×
105个细胞、至少0.5
×
105个细胞、至少1
×
105个细胞、至少5
×
105个细胞、至少1
×
106个细胞、至少0.5
×
107个细胞、至少1
×
107个细胞、至少0.5
×
108个细胞、至少1
×
108个细胞、至少0.5
×
109个细胞、至少1
×
109个细胞、至少2
×
109个细胞、至少3
×
109个细胞、至少4
×
109个细胞、至少5
×
109个细胞或至少1
×
10
10
个细胞。
[0565]
在特定实施方案中，向受试者施用约1
×
107个t细胞至约1
×
109个t细胞、约2
×
107个t细胞至约0.9
×
109个t细胞、约3
×
107个t细胞至约0.8
×
109个t细胞、约4
×
107个t细胞
至约0.7
×
109个t细胞、约5
×
107个t细胞至约0.6
×
109个t细胞、或约5
×
107个t细胞至约0.5
×
109个t细胞。
[0566]
在一个实施方案中，向受试者施用的组合物中的免疫效应细胞(例如，表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞)的量为至少0.1
×
104个细胞/kg体重、至少0.5
×
104个细胞/kg体重、至少1
×
104个细胞/kg体重、至少5
×
104个细胞/kg体重、至少1
×
105个细胞/kg体重、至少0.5
×
106个细胞/kg体重、至少1
×
106个细胞/kg体重、至少0.5
×
107个细胞/kg体重、至少1
×
107个细胞/kg体重、至少0.5
×
108个细胞/kg体重、至少1
×
108个细胞/kg体重、至少2
×
108个细胞/kg体重、至少3
×
108个细胞/kg体重、至少4
×
108个细胞/kg体重、至少5
×
108个细胞/kg体重或至少1
×
109个细胞/kg体重。
[0567]
在特定实施方案中，向受试者施用约1
×
106个t细胞/kg体重至约1
×
108个t细胞/kg体重、约2
×
106个t细胞/kg体重至约0.9
×
108个t细胞/kg体重、约3
×
106个t细胞/kg体重至约0.8
×
108个t细胞/kg体重、约4
×
106个t细胞/kg体重至约0.7
×
108个t细胞/kg体重、约5
×
106个t细胞/kg体重至约0.6
×
108个t细胞/kg体重、或约5
×
106个t细胞/kg体重至约0.5
×
108个t细胞/kg体重。
[0568]
本领域普通技术人员将认识到，可能需要多次施用本文所涵盖的组合物以实现期望的疗法。例如，组合物可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间的跨度内施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。
[0569]
在某些实施方案中，可能希望向受试者施用活化的免疫效应细胞，并且随后重新抽血(或进行单采血液成分术)、从中活化免疫效应细胞并且向患者重新输注这些活化的和扩增的免疫效应细胞。可以每隔几周进行多次此过程。在某些实施方案中，可以抽取10cc到400cc的血来活化免疫效应细胞。在某些实施方案中，抽取20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或400cc或更多量的血来活化免疫效应细胞。不受理论束缚，使用该多次抽血/多次重新输注方案可以用于选出某些免疫效应细胞群。
[0570]
本文所涵盖的组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。在一个优选实施方案中，肠胃外施用组合物。如本文所施用，短语“肠胃外施用(parenteral administration)”和“肠胃外施用(administered parenterally)”是指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于血管内、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、瘤内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中，将本文所涵盖的组合物通过直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中而施用于受试者。
[0571]
在一个实施方案中，向有需要的受试者施用有效量的组合物以增加对受试者的b细胞相关病症的细胞免疫应答。免疫应答可包括由能够杀死感染细胞的细胞毒性t细胞、调节性t细胞和辅助性t细胞应答介导的细胞免疫应答。还可以诱导主要由能够活化b细胞从而导致抗体产生的辅助t细胞介导的体液免疫应答。多种技术可用于分析由组合物诱导的免疫应答的类型，所述组合物在本领域中得到充分描述；例如，current protocols in immunology，编辑人：john e.coligan,ada m.kruisbeek,david h.margulies,ethan m.shevach,warren strober(2001)john wiley&sons,ny,n.y。
[0572]
在一个实施方案中，提供一种治疗被诊断患有表达cd79a和/或cd20的癌症的受试者的方法，所述方法包括从受试者中除去免疫效应细胞，用包含编码本文所涵盖的抗cd79a car和抗cd20 ccr的核酸的载体基因修饰所述免疫效应细胞，从而产生修饰的免疫效应细胞群，并将修饰的免疫效应细胞群施用于同一受试者。在优选实施方案中，免疫效应细胞包括t细胞。
[0573]
在某些实施方案中，提供了用于刺激免疫效应细胞介导的对受试者的靶细胞群的免疫调节应答的方法，所述方法包括向受试者施用表达编码抗cd79a car和抗cd20 ccr的核酸构建体的免疫效应细胞群的步骤。
[0574]
特定实施方案中所涵盖的施用细胞组合物的方法包括有效导致离体再引入基因修饰的免疫效应细胞的任何方法，所述基因修饰的免疫效应细胞在受试者中直接表达抗cd79a car和抗cd20 ccr，或在再引入基因修饰的免疫效应细胞的祖细胞时，所述免疫效应细胞在引入受试者时分化成表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的成熟免疫效应细胞。一种方法包括用本文所涵盖的核酸构建体离体转导外周血t细胞，并将转导的细胞返回到受试者中。
[0575]
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和授权专利都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同特定且个别地指示每一个别出版物、专利申请或授权专利以引用的方式并入一般。
[0576]
尽管已经出于清楚理解的目的，通过说明和实例相当详细地描述了前述实施方案，但根据本文所涵盖的传授内容，本领域的普通技术人员将易于了解，可以在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其作出某些改变和修改。提供以下实例仅作为说明并且不具有限制性。本领域的技术人员将容易认识到多种可以被改变或修改以产生基本上类似的结果的非关键参数。
[0577]
实施例
[0578]
实施例1
[0579]
抗cd79a car-抗cd20 ccr双顺反子构建体的构建
[0580]
设计、构建并验证了包含双顺反子构建体的慢病毒载体，所述双顺反子构建体包括人源化抗cd79a car、t2a自裂解多肽和抗cd20 ccr。将包含可操作地连接至抗cd79a car；t2a自裂解多肽；以及抗cd20 ccr的mndu3启动子的构建体克隆到慢病毒载体中，所述抗cd79a car含有cd8α信号序列、抗cd79a scfv、cd8α铰链和跨膜结构域、cd137共刺激结构域和cd3ζ初级信号传导结构域，所述抗cd20 ccr含有抗cd20scfv、cd8α铰链和跨膜结构域、cd28共刺激结构域。示例性抗cd79a car/t2a/抗cd20 ccr多肽序列在seq id no:37和39中示出，并且示例性抗cd79a car/t2a/抗cd20 ccr多核苷酸序列在seq id no:38和40中示出。
[0581]
实施例2
[0582]
表达抗cd79a car和抗cd20 ccr两者的t细胞显示出抗原依赖性细胞因子释放
[0583]
从健康人供体收获外周血单核细胞(pbmc)，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar(seq id no:18)和抗cd20 ccr(seq id no:33)的多核苷酸。多核苷酸表达为融合蛋白(seq id no:37)，其中抗cd79a car和抗cd20 ccr由t2a病毒自裂解多肽分离。未转导(utd)细胞用作对照。在
转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天。
[0584]
在扩增后，使用与pe荧光染料缀合的重组fc-cd79a融合蛋白，通过流式细胞术评估转导和未转导的t细胞培养物的抗cd79a car表达。与未转导的对照t细胞相比，在用编码抗cd79a car的慢病毒载体转导的t细胞中观察到高表达。图1a.
[0585]
还评估了抗cd79a car-抗cd20 ccr t细胞功能。将未转导的t细胞或用编码抗cd79a car(seq id no:18)或编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的慢病毒载体转导的t细胞单独培养或以1:1的比率与缺乏靶抗原(rd；横纹肌肉瘤细胞系)的肿瘤细胞；并且与rd.79a细胞(经修饰以表达cd79a的rd)、rd.cd79a.cd20细胞(经修饰以表达cd79a和cd20的rd)和daudi细胞(伯基特淋巴瘤，其具有cd79a和cd20两者的高内源性表达)一起共培养。在共培养24小时之后，收集上清液，并使用luminex测定分析ifnγ和il-2细胞因子。抗cd79a car
–
抗cd20 ccr t细胞仅响应于表达cd79a的细胞系而不针对rd细胞产生ifnγ细胞因子。图1b.与抗cd79a car t细胞相比，抗cd79a car
ꢀ‑
抗cd20 ccr t细胞中的il-2产生增加，因为抗cd20 ccr通过其cd28共刺激结构域的活性诱导pi3k路径并促进il-2表达。图1c.图形显示了单个pbmc供体复制品的平均值 sem。
[0586]
实施例3
[0587]
表达抗cd79a car和抗cd20 ccr两者的t细胞应答表达cd20的靶细胞
[0588]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)或仅编码抗cd79a car(seq id no:18)的多核苷酸。未转导(utd)细胞用作对照。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天。在扩增后，将utd细胞、抗cd79a car t细胞和抗cd79a car-抗cd20 ccr t细胞以1:1的比率与cd20阴性rd细胞或rd.cd20细胞(经修饰以表达cd20的rd细胞)共培养。在共培养24小时后，收集上清液，并使用luminex分析ifnγ和il-2细胞因子。
[0589]
令人惊讶的是，抗cd79a car-抗cd20 ccrt细胞在与rd.cd20细胞共培养之后产生了ifnγ和il-2细胞因子。图2a和图2b.缺乏针对rd亲本系的活性表明针对cd20靶标的比活性。这些数据证实car抗原对ccr抗原表达细胞(缺乏car抗原)的非依赖性活性。该发现是非预期的，因为cd28信号传导通常放大t细胞受体信号传导，并且因此在不存在通过cd3ζ信号传导的car活性的情况下，预期car-ccr t细胞对仅表达ccr抗原的细胞将不具有活性。这些数据显示，抗cd79a car-抗cd20 ccr t细胞可能能够参与针对单一car或ccr阳性靶细胞以及双重car和ccr阳性靶细胞的细胞毒性活性。图形显示了单个pbmc供体复制品的平均值 sem。
[0590]
实施例4
[0591]
表达抗cd79a car和抗cd20 c
ar
的t细胞展示抗原依赖性细胞因子释放
[0592]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。活化的细胞用包含编码cd79a 41bb cd3ζcar、t2a自裂解多肽和抗cd20 cd28 cd3ζcar(seq id no:41)的多肽的抗慢病毒载体转导，或用包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a自裂解多肽和抗cd20 41bb cd3ζcar(seq id no:45)的多肽的慢病毒载体转导。未转导(utd)细胞用作对照。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天。
[0593]
在扩增后，使用与pe荧光染料缀合的重组fc-cd79a融合蛋白，通过流式细胞术评
估转导和未转导的t细胞培养物的抗cd79a car表达。与未转导的对照t细胞相比，在用编码抗cd79a car的慢病毒载体转导的t细胞中观察到表达。图3a.
[0594]
还评估了抗cd79a car
–
抗cd20 car t细胞功能性。将未转导的t细胞和用编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 cd28 cd3ζcar融合多肽(seq id no:41)或抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 41bb cd3ζcar融合多肽(seq id no:45)的慢病毒载体转导的t细胞单独培养或以1:1的比率与缺乏靶抗原(rd；横纹肌肉瘤细胞系)的肿瘤细胞并且与rd.79a、rd.cd20细胞和daudi细胞一起共培养。在共培养24小时之后，收集上清液，并且使用luminex测定分析ifnγ。尽管与cd79a car
–
cd20 ccr t细胞对任一抗原的应答相比，应答略微减弱，但两种双重cd79a-cd20 car t细胞均响应于仅表达任一靶抗原的rd细胞而产生ifnγ细胞因子。两种双重cd79a-cd20 car t细胞也显示出针对daudi细胞的强烈应答，但再次与cd79a car
–
cd20 ccr t细胞针对daudi细胞的应答相比，应答略微减弱。图3b.图形显示了单个pbmc供体复制品的平均值 sem。
[0595]
实施例5
[0596]
表达抗cd79a car和抗cd20 ccr两者的t细胞显示出抗原依赖性细胞因子释放
[0597]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar(seq id no:19)和抗cd20 ccr(seq id no:33)的多核苷酸。多核苷酸表达为融合蛋白(seq id no:39)，其中抗cd79a car和抗cd20 ccr由t2a病毒自裂解多肽分离。未转导(utd)细胞用作对照。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增12天。
[0598]
在扩增后，使用与pe荧光染料缀合的重组fc-cd79a融合蛋白，通过流式细胞术评估转导和未转导的t细胞培养物的抗cd79a car表达。与未转导的对照t细胞相比，在用编码抗cd79a car的慢病毒载体转导的t细胞中观察到高表达。图4a.
[0599]
还评估了抗cd79a car-抗cd20 ccr t细胞功能。将未转导的t细胞和用编码抗cd79a car(seq id no:19)或编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合多肽(seq id no:39)的慢病毒载体转导的t细胞单独培养或以1:1的比率与缺乏靶抗原(rd；横纹肌肉瘤细胞系)的肿瘤细胞；并且与rd.79a细胞(经修饰以表达cd79a的rd)、rd.cd79a.cd20细胞(经修饰以表达cd79a和cd20的rd)和rec1细胞(套细胞淋巴瘤，其具有cd79a和cd20两者的高内源性表达)一起共培养。在共培养24小时之后，收集上清液，并使用luminex测定分析ifnγ和il-2细胞因子。抗cd79a car
–
抗cd20 ccr t细胞仅响应于表达cd79a的细胞系而不针对rd细胞产生ifnγ细胞因子。图4b.与抗cd79a car t细胞相比，抗cd79a car-抗cd20 ccr t细胞中的il-2产生增加，因为抗cd20 ccr通过其cd28共刺激结构域的活性诱导pi3k路径并促进il-2表达。图4c。图形显示了单个pbmc供体复制品的平均值 sem。
[0600]
实施例6
[0601]
表达抗cd79a car和抗cd20 ccr两者的t细胞应答表达cd20的靶细胞
[0602]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:39)或仅编码抗cd79a car(seq id no:19)的多核苷酸。未转导(utd)细胞用作对照。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天。在扩增后，将utd细胞、抗cd79a car t细胞和抗cd79a car-抗cd20 ccr t细胞以1:1的比率与cd20阴性rd细胞或
rd.cd20细胞(经修饰以表达cd20的rd细胞)共培养。在共培养24小时后，收集上清液，并使用luminex分析ifnγ和il-2细胞因子。
[0603]
令人惊讶的是，抗cd79a car-抗cd20 ccrt细胞在与rd.cd20细胞共培养之后产生了ifnγ和il-2细胞因子。图5a和图5b.缺乏针对rd亲本系的活性表明针对cd20靶标的比活性。这些数据证实car抗原对ccr抗原表达细胞(缺乏car抗原)的非依赖性活性。该发现是非预期的，因为cd28信号传导通常放大t细胞受体信号传导，并且因此在不存在通过cd3ζ信号传导的car活性的情况下，预期car-ccr t细胞对仅表达ccr抗原的细胞将不具有活性。这些数据显示，抗cd79a car-抗cd20 ccr t细胞可能能够参与针对单一car或ccr阳性靶细胞以及双重car和ccr阳性靶细胞的细胞毒性活性。图形显示了单个pbmc供体复制品的平均值 sem。
[0604]
实施例7
[0605]
表达抗cd79a car和抗cd20 c
ar
的t细胞展示抗原依赖性细胞因子释放
[0606]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。活化的细胞用包含编码cd79a 41bb cd3ζcar、t2a自裂解多肽和抗cd20 cd28 cd3ζcar(seq id no:43)的多肽的抗慢病毒载体转导，或用包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a自裂解多肽和抗cd20 41bb cd3ζcar(seq id no:47)的多肽的慢病毒载体转导。未转导(utd)细胞用作对照。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天。
[0607]
在扩增后，使用与pe荧光染料缀合的重组fc-cd79a融合蛋白，通过流式细胞术评估转导和未转导的t细胞培养物的抗cd79a car表达。与未转导的对照t细胞相比，在用编码抗cd79a car的慢病毒载体转导的t细胞中观察到表达。图6a.
[0608]
还评估了抗cd79a car
–
抗cd20 car t细胞功能性。将未转导的t细胞和用编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 cd28 cd3ζcar融合多肽(seq id no:43)或抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 41bb cd3ζcar融合多肽(seq id no:47)的慢病毒载体转导的t细胞单独培养或以1:1的比率与缺乏靶抗原(rd；横纹肌肉瘤细胞系)的肿瘤细胞并且与rd.79a、rd.cd20细胞和daudi细胞一起共培养。在共培养24小时之后，收集上清液，并且使用luminex测定分析ifnγ。尽管与cd79a car
–
cd20 ccr t细胞对任一抗原的应答相比，应答略微减弱，但两种双重cd79a-cd20 car t细胞均响应于仅表达任一靶抗原的rd细胞而产生ifnγ细胞因子。两种双重cd79a-cd20 car t细胞也显示出针对daudi细胞的强烈应答，但再次与cd79a car
–
cd20 ccr t细胞针对daudi细胞的应答相比，应答略微减弱。图6b。图形显示了单个pbmc供体复制品的平均值 sem。
[0609]
实施例8
[0610]
表达抗cd79a c
ar
和抗cd20 ccr的t细胞有效杀伤
[0611]
表达cd79a或cd20的细胞系
[0612]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(例如seq id no:37或39)的多核苷酸。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天。
[0613]
在扩增后，通过xcelligence实时细胞分析(rtca)使用非侵入性电阻抗监测评价转导和未转导的t细胞培养物的体外细胞毒性功能。
[0614]
将utd t细胞和表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞以10:1、5:1和2.5:1的比率与rd(横纹肌肉瘤)细胞系或经工程化以表达cd79a(rd.cd79a)或cd20(rd.cd20)的rd细胞系共培养。在共培养6小时之后，通过celligence rtca mp上的非侵入性电阻抗测量细胞指数。通过将t细胞条件细胞指数归一化为单独的肿瘤对照细胞指数来计算细胞毒性百分比。缺乏针对rd母细胞的活性表明针对cd79a car靶标和cd20 ccr靶标的比活性。图7(左图)。转导的t细胞对rd.cd79a细胞(图7，中图)和rd.cd20细胞(图7，右图)均表现出细胞毒性。该图显示了单个pbmc供体的复制品在10:1、5:1、2.5:1的效应子:靶标比率下的平均 sd细胞毒性。
[0615]
表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞杀死cd79a和cd20单一阳性靶标的能力证明了这些细胞的新型双重靶向能力。不希望受任何特定理论的束缚，据信ccr介导的细胞毒性可以通过不依赖于car靶标的cd20接合而发生，并且是这些细胞的独特且创新特性。
[0616]
实施例9
[0617]
表达抗cd79a c
ar
和抗cd20 ccr的t细胞在
[0618]daudi
(伯基特淋巴瘤)肿瘤模型中是有效的
[0619]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0620]
体外。将utd t细胞或表达抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白的t细胞以1:1的比率与daudi肿瘤细胞(cd79a
、cd20
)共培养24小时，并且然后收集上清液并使用luminex分析ifnγ。图8(左图)显示了3个pbmc供体的重复测定的ifnγ细胞因子的平均值 sem。
[0621]
体内。将nsg小鼠注射2
×
106个表达荧光素酶的daudi肿瘤细胞。在13天后，将小鼠(5只)注射媒介物(培养基)、10
×
106个utd t细胞或10
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞。在20天后，仅cd79a car/cd20 ccr处理的小鼠清除肿瘤细胞，并维持清除直到研究第30天结束。图8(右图)显示了对于媒介物，n＝5只小鼠的平均值 sem，除第6天之后的时间点之外，其中n＝4，对于utd，n＝5，并且对于cd79a car/cd20 ccr，n＝5。*星号指示由于肿瘤大小和动物健康导致的动物处死。
[0622]
实施例10
[0623]
表达抗cd79a c
ar
和抗cd20 ccr的t细胞在
[0624]
nu-dul-1abc dlbcl肿瘤模型中是有效的
[0625]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0626]
体外。将utd t细胞或表达抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白的t细胞以1:1的比率与nu-dul-1abc细胞(cd79a
、cd20
)共培养24小时，并且然后收集上清液并使用luminex分析ifnγ。图9(左图)显示了3个pbmc供体的重复测定的ifnγ细胞因子的平均值 sem。
[0627]
体内。将nsg小鼠注射10
×
106个表达荧光素酶的nu-dul-1abc肿瘤细胞。在15天后，小鼠(5只)注射媒介物(培养基)、10
×
106个utd t细胞或5
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞。在该模型中仅cd79a car/cd20 ccr处理的小鼠引起肿瘤消退。图9(右图)显示了对于媒介物，n＝5只小鼠的平均值 sem，除第23天之后的时间点之外，其中n＝4，对于utd，n＝5，并且对于cd79a car/cd20 ccr，n＝5。*星号指示由于肿瘤大小和动物健康导致的动物处死。
[0628]
实施例11
[0629]
表达抗cd79a c
ar
和抗cd20 ccr的t细胞在
[0630]
t
oledo
生发中心b细胞(gcb)dlbcl肿瘤模型中是有效的
[0631]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在转导后，将细胞在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0632]
体外。将utd t细胞或表达抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白的t细胞以1:1的比率与toledo gcb dlbcl细胞(cd79a
低
、cd20
高
)共培养24小时，并且然后收集上清液并使用luminex分析ifnγ。图10(左图)显示了3个pbmc供体的重复测定的ifnγ细胞因子的平均值 sem。
[0633]
体内。将nsg小鼠注射50
×
106个表达荧光素酶的toledo gcb dlbcl肿瘤细胞。在16天后(肿瘤约100mm3)，小鼠(5只)注射媒介物(培养基)、20
×
106个utd t细胞或2.5
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞。仅cd79a car/cd20 ccr处理的小鼠清除了肿瘤细胞并维持清除直到研究第29天结束，3/5小鼠的肿瘤完全清除。图10(右图)显示了每种条件下n＝5只小鼠的平均值 sem。*星号指示由于肿瘤大小和动物健康导致的动物处死。
[0634]
实施例12
[0635]
表达抗cd79a c
ar
和抗cd20 ccr的cblb编辑的t细胞在t
oledo gcb dlbcl肿瘤模型中显示出增加的功效
[0636]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在活化后三天，将转导的细胞用编码裂解cblb基因(seq id no:54)的megatal的mrna电穿孔，并在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0637]
体外。将utd t细胞( /-cblb编辑)或表达抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白( /-cblb编辑)的t细胞以1:1的比率与toledo gcb dlbcl细胞(cd79a
低
，cd20
高
)共培养24小时，并且接着收集上清液并使用lumineex分析ifnγ。图11(左图)显示了3个pbmc供体的重复测定的ifnγ细胞因子的平均值 sem。
[0638]
体内。将nsg小鼠注射50
×
106个表达荧光素酶的toledo gcb dlbcl肿瘤细胞。在17天后(肿瘤约130mm3)，小鼠(5只)注射媒介物(培养基)、5
×
106个utd t细胞( /-cblb编辑)或1
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞( /-cblb编辑)。用表达cd79a car/cd20 ccr处理的小鼠的cblb编辑的t细胞材料的小鼠清除了肿瘤细胞并维持清除直到研究第21天结束，1/5小鼠的肿瘤完全清除。图11(右图)显示了对于媒介物n＝5只小鼠，除了第
17天之后的时间点，其中n＝3，对于cd79a car/cd20 ccr，n＝5，除了第21天之后的时间点，其中n＝4，并且对于cd79a car/cd20 ccr( cblb编辑)，n＝5。*星号指示由于肿瘤大小和动物健康导致的动物处死。
[0639]
实施例13
[0640]
表达抗cd79a c
ar
和抗cd20 ccr的cblb编辑的t细胞在d
audi cd20敲除肿瘤模型中显示出增加的功效
[0641]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在活化后三天，将转导的细胞用编码裂解cblb基因(seq id no:54)的megatal的mrna电穿孔，并在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0642]
体内。将nsg小鼠注射2
×
106个表达荧光素酶的daudi.cd20ko细胞(cd79a
、cd20-)。在14天后，小鼠(5只)注射媒介物(培养基)、20
×
106个utd t细胞( /-cblb编辑)或10
×
106个表达抗cd79a car和抗cd20 ccr( /-cblb编辑)的t细胞。用表达cd79a car/cd20 ccr的t细胞处理的小鼠显示出抗肿瘤活性。与所有其他条件相比，cblb编辑的表达cd79a car/cd20 ccr的t细胞显示出增强的抗肿瘤活性。图12示出了在所有条件下n＝5只小鼠的平均值 sem。*星号指示由于肿瘤大小和动物健康导致的动物处死。
[0643]
实施例14
[0644]
cblb编辑的t细胞中的细胞因子分泌
[0645]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在活化后三天，将转导的细胞用编码裂解cblb基因(seq id no:54)的megatal的mrna电穿孔，并在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0646]
将utd t细胞( /-cblb编辑)或表达抗cd79a car和抗cd20 ccr的t细胞( /-cblb编辑)以1
×
106个细胞/ml的浓度与缺乏外源il-2的t细胞生长培养基一起铺板于预先用cd3(1μg/ml至0.063μg/ml)和cd28(5μg/ml)单克隆抗体包被的96孔高结合板中。在24小时后，收获上清液，并经由luminex测量细胞因子检测。cblb编辑的utd t细胞和表达cd79a car/cd20 ccr的细胞显示出il-2(图13，左图)和ifnγ(图13，右图)产生增加。将udd t细胞条件以一式两份铺板，并将转导的t细胞条件以一式四份铺板。图13显示了n＝3个供体的平均值 sem。
[0647]
实施例15
[0648]
表达抗cd79a c
ar
和抗cd20 ccr的cblb编辑的t细胞在d
audi
肿瘤模型中显示出增加的il-2分泌
[0649]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在活化后三天，将转导的细胞用编码裂解cblb基因(seq id no:54)的megatal的mrna电穿孔，并在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0650]
将utd t细胞( /-cblb编辑)或表达抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白( /-cblb编辑)的t细胞以1:1的比率与daudi细胞共培养24小时，并且然后收集上清液并使用luminex分析il-2。与测试的所有其他条件相比，表达cd79a car/cd20 ccr的cblb编辑的t细胞产生了增加量的il-2。图14显示了单个pbmc供体中复制品产生的il-2细胞因子的平均值 sem。
[0651]
实施例16
[0652]
cblb编辑的t细胞的增殖
[0653]
从健康人供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在活化后三天，将转导的细胞用编码裂解cblb基因(seq id no:54)的megatal的mrna或编码失活tcrαmegatal(tcrα
dead
)的mrna电穿孔，并在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0654]
将表达gfp的daudi细胞以50,000个细胞/孔的密度接种于含有低水平il-2的t细胞生长培养基中的96孔板中。将daudi细胞与50,000个utd t细胞(tcrα
dead
)或表达抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(tcrα
dead
)的t细胞共培养。在四天后，去除一半t细胞生长培养基，并且用含有低水平il-2的新鲜培养基替换。三天后，将t细胞重悬浮并计数。然后将总共50,000个t细胞(来自每种病症)转移到含有50,000个daudi-gfp肿瘤细胞的新鲜96孔中板。四天后(第11天)，去除培养基，并且用含有低水平il-2的新鲜培养基替换。三天后(第14天)，将t细胞重悬浮并计数。然后将总共50,000个t细胞(utd或转导( /-编辑))转移到含有50,000个daudi-gfp肿瘤细胞的新鲜96孔板中。三天后(第17天)，去除培养基，并且用含有低水平il-2的新鲜培养基替换。三天后(第20天)，将t细胞重悬浮并计数。在第三轮肿瘤细胞刺激之后，与tcrα死亡对照处理的细胞相比，表达cd79 car/cd20 ccr的cblb编辑的t细胞显示出增殖增加。图15显示了每种条件下4个复制品的平均值 sd。
[0655]
实施例17
[0656]
表达抗cd79a c
ar
和抗cd20 ccr的cblb编辑的t细胞在t
oledo gcb dlbcl肿瘤模型中显示出增加的ifnγ
[0657]
从三个健康人供体和三个dlbcl患病供体收获pbmc，并使用抗cd3和抗cd28抗体活化。用慢病毒载体转导活化的细胞，所述慢病毒载体包含编码抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白(seq id no:37)的多核苷酸。在活化后三天，将转导的细胞用编码裂解cblb基因(seq id no:54)的megatal的mrna电穿孔，并在含有il-2的t细胞生长培养基中扩增10天，然后冷冻保存或评估其功能。
[0658]
将utd t细胞或表达抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白( /-cblb编辑)的t细胞与toledo gcb dlbcl细胞(cd79a低、cd20高)以1:1的比率共培养24小时，并且然后收集上清液并使用luminex分析ifnγ。在所有健康和dlbcl供体中，与表达utd或未编辑的cd79a car/cd20 ccr的t细胞相比，表达抗cd79a 41bb cd3ζcar、t2a、抗cd20 ccr融合蛋白的cblb编辑的t细胞响应于肿瘤细胞产生更多的ifnγ细胞因子。图16(左图)显示了所有供体中两次重复测定的ifnγ细胞因子的平均值 sem。
[0659]
通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，而是应被解释为包含所有可能的实施方案连同这
些权利要求所要求的等效物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
