一种TaqDNA聚合酶与核酸内切酶嵌合体及其制备方法与应用与流程

一种taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.实时荧光定量pcr(real
‑
time quantitative pcr，qpcr)技术是在传统聚合酶链式反应(pcr)技术的基础上引入荧光化学物质，以达到实时监测pcr反应过程的目的，弥补了普通pcr只能采用终点法观察及无法定量分析模板的缺陷，成为了当今基因研究的重要工具。taqman探针法qpcr因其污染小、实时监测、定量线性范围广、特异性强、灵敏度高等特点，已经广泛应用于生物医学、农业科学、环境科学、食品安全等众多领域。
3.快速和精准一直是当今检测领域发展的需求及目标。传统的taqman探针法qpcr技术需对样本进行核酸提取，此过程不仅耗时长，且易造成样本间核酸交叉污染和损失。而直扩型taqman探针法qpcr技术省去了核酸提取步骤，缩短检测时间的同时不会因提取而造成核酸损失，大大提高检测结果的准确性。使用具有抑制剂耐受性的耐热dna聚合酶是实现pcr直扩的关键。taq dna聚合酶作为所有耐热dna聚合酶种类中发现并应用最早，同时也是抑制剂耐受性研究较为成熟的一类dna聚合酶，对其采用化学修饰实现热启动是一种可逆封闭dna聚合酶活性的方法。热启动dna聚合酶的使用能有效优化扩增的目标产物，同时抑制非特异性产物的生成，是目前taqman探针法qpcr试剂中的核心组分。尽管近年来涌现了多种具有耐受抑制剂能力的dna聚合酶，然而这些dna聚合酶大多数因缺少5
’‑3’
核酸外切酶活性而不能水解taqman探针，因此无法应用在直扩型taqman探针法qpcr中。
4.综上所述，亟需研究开发一种兼具抑制剂耐受能力强和高5
’‑3’
核酸外切酶活性的热启动dna聚合酶，以在直扩型taqman探针法qpcr检测中进行应用。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体。
6.本发明的另一目的在于提供上述taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的制备方法。
7.本发明的再一目的在于提供上述taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的应用。
8.本发明的目的通过如下技术方案实现：
9.一种taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体，命名为pfen1
‑
staq，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.所述的嵌合体与氨基酸序列如seq id no.2所示的野生型taq dna聚合酶(ncbi登录号为p19821.1)相比，具有以下特点：1～289位氨基酸缺失；626位谷氨酸(glu)突变为精氨酸(arg)；707位异亮氨酸(ile)突变为苏氨酸(thr)；708位谷氨酸(glu)突变为谷氨酰胺
(gln)；742位谷氨酸(glu)突变为赖氨酸(lys)；且n末端融合了双链dna结合蛋白，在双链dna结合蛋白的n末端再融合了氨基酸序列如seq id no.5所示的瓣状核酸内切酶1片段。
11.所述的双链结合蛋白优选为氨基酸序列如seq id no.3所示的sso7d(ncbi登录号为wp_009990119.1)。双链结合蛋白可以显著提高dna聚合酶对模板dna的亲和力。
12.所述的瓣状核酸内切酶1片段与氨基酸序列如seq id no.6所示的野生型瓣状核酸内切酶1(ncbi登录号为wp_011012561.1)相比，具有以下特点：328～340位氨基酸缺失。与野生型taq dna聚合酶相比，瓣状核酸内切酶1有着更强的5
’‑3’
核酸外切酶活性。瓣状核酸内切酶1可以使融合后的蛋白获得5
’‑3’
核酸外切酶活性，能够水解taqman探针。
13.所述的双链dna结合蛋白的c末端与经改造后taq dna聚合酶的n末端通过氨基酸序列如seq id no.4所示的连接子连接；所述的瓣状核酸内切酶1结构域的c末端与所述的双链dna结合蛋白的n末端通过氨基酸序列如seq id no.7所示的连接子连接。
14.编码上述taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的dna分子。
15.所述的dna分子的核苷酸序列如seq id no.8所示。该序列是根据大肠杆菌表达系统特点进行密码子优化而得，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。
16.一种重组表达载体，是将编码上述taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的dna分子克隆入表达载体得到。
17.所述的表达载体优选为原核表达载体；更优选为pet系列载体；最优选为pet
‑
28a。
18.一种重组工程细胞株，是将上述重组表达载体转化入工程细胞得到。
19.所述的工程细胞优选为大肠杆菌细胞；更优选为大肠杆菌t7 express
‑
lysy/iq。
20.上述taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体可通过化学合成方法得到，或是通过重组工程细胞株诱导表达、纯化制备得到。从成本考虑，优选为通过重组工程细胞株诱导表达、纯化制备得到；具体包括如下步骤：
21.1)取上述重组工程细胞株，接种于sb培养基中，培养，得到种子液；
22.2)取所得种子液接种于sb培养基中，培养，得到菌液；
23.3)向所得菌液中加入iptg至终浓度为0.1～0.5mmol/l，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀；
24.4)向所得菌体沉淀中加入裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎菌体，离心取上清液；
25.5)所得上清液75℃孵育20～30min，冰浴10～20min，离心，0.22μm微孔滤膜过滤，取上清液；
26.6)通过镍离子亲和层析收集含有目的蛋白的样品洗脱液，即获得所述的嵌合体。
27.优选地，步骤1)和步骤2)中所述的sb培养基均含50μg/ml卡那霉素。
28.优选地，步骤1)中所述的培养的条件为37℃，150～200r/min振荡培养。
29.优选地，步骤2)中所述的培养的条件为37℃，150～200r/min振荡培养至od
600
＝0.6～0.8。
30.优选地，步骤2)中所述的种子液按1:100的体积比接种于sb培养基。
31.优选地，步骤3)中所述的诱导的条件为18℃诱导12～16h。
32.优选地，步骤3)所述的离心的条件为4℃以12000rpm的转速离心20～30min。
33.优选地，步骤4)中所述的裂解缓冲液的用量按每克菌体沉淀中加入5ml计。
34.优选地，步骤4)中所述的超声的条件为功率250w，超声5.5s，间隔5.5s，持续
30min。
35.优选地，步骤4)和步骤5)中所述的离心的条件为4℃以12000rpm的转速离心10～20min。
36.优选地，步骤4)中所述的裂解缓冲液的组分为：50mmol/l tris
‑
hcl、50mmol/l nacl、5％(v/v)甘油，ph9.0。
37.优选地，步骤6)中所述的镍离子亲和层析所用的结合缓冲液(buffer a)的组分为：50mmol/l tris
‑
hcl、50mmol/l nacl、5％(v/v)甘油，ph9.0；所用的洗脱缓冲液(buffer b)的组分为：50mmol/l tris
‑
hcl、50mmol/l nacl、500mmol/l咪唑、5％(v/v)甘油，ph9.0。
38.一种热启动dna聚合酶，是上述嵌合体的聚合酶活性位点赖氨酸侧链氨基上经特异性结合酸酐类化合物得到。该热启动dna聚合酶通过可逆的封闭其聚合酶活性，以实现所述嵌合体的热启动修饰。
39.所述的酸酐类化合物优选为马来酸酐或柠康酸酐；更优选为柠康酸酐。经酸酐修饰的聚合酶，大大降低了pcr反应过程中非特异性产物扩增和引物二聚体形成的可能性。
40.上述热启动dna聚合酶的制备方法，包括如下步骤：
41.(1)将所述的嵌合体透析到tris
‑
hcl缓冲液中；
42.(2)加入酸酐类化合物，混合均匀，反应；
43.(3)将反应后的混合液透析到储存缓冲液中，即获得稳定的热启动dna聚合酶。经该方法制得的热启动dna聚合酶具有优异的热启动性能，在80℃，孵育10min仍无聚合酶活性释放；在95℃热激，8～10min才可释放活性。
44.所述的tris
‑
hcl缓冲液优选浓度为10～50mmol/l、ph＝9～10的tris
‑
hcl缓冲液。
45.所述的嵌合体与酸酐类化合物的配比优选为摩尔比1:2500～1:3500。
46.所述的反应的条件优选为温度37℃～42℃、时间3～4h。
47.所述的储存缓冲液的配方优选为：20mmol/l tris
‑
hcl，100mmol/l kcl，0.1mmol/l edta，50％甘油，1mmol/ldtt，0.5％(v/v)tween
‑
20，ph7.4。
48.一种直扩pcr试剂盒，包含pcr用水、pcr反应缓冲液、引物、dntps中的至少一种，和上述嵌合体或热启动dna聚合酶。
49.优选地，所述的pcr反应缓冲液的组成如下：20～50mmol/l tris
‑
hcl、10～30mmol/l kcl、5～20mmol/l(nh4)2so4、3～6mmol/l mgso4、0.05～0.10％(v/v)triton x
‑
100、0.1～0.3mol/l海藻糖、0.1～0.2mol/l l
‑
肉毒碱、0.1～0.4％(v/v)np
‑
40，ph值为8.0～9.0。
50.优选地，所述的嵌合体或热启动dna聚合酶在体系中的酶活力单位为1.25～2.5u/μl。
51.优选地，所述的dntps在体系中的浓度为100～300μmol/l。
52.优选地，所述的引物在体系中的浓度为0.2～0.4μmol/l。
53.一种直扩qpcr试剂盒，包含qpcr用水、qpcr反应缓冲液、引物、探针和dntps中的至少一种，和上述热启动dna聚合酶。
54.优选地，所述的qpcr反应缓冲液的组成如下：10～30mmol/l tris
‑
hcl、10～30mmol/lkcl、5～20mmol/l(nh4)2so4、3～6mmol/l mgso4、0.05～0.10％(v/v)triton x
‑
100、ph值为8.0～9.0。
55.优选地，所述的热启动dna聚合酶在体系中的酶活力单位为1.25～2.5u/μl。
56.优选地，所述的dntps在体系中的浓度为100～300μmol/l。
57.优选地，所述的引物在体系中的浓度为0.2～0.4μmol/l，所述的探针在体系中的浓度为0.3～0.4μmol/l。
58.上述直扩qpcr试剂盒在直扩型探针法qpcr中的应用。
59.所述的应用的具体操作为：采用所述直扩qpcr试剂盒对生物样本直接进行扩增(无需核酸提取)，获得靶基因产物。
60.上述嵌合体，或上述热启动dna聚合酶，或上述直扩pcr试剂盒，或上述直扩qpcr试剂盒在生物样本扩增和/或检测的应用。
61.所述的生物样本来源不受限制，包括但不限于全血。
62.本发明相较于现有技术具有如下的优点和有益效果：
63.1、本发明所述taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体(pfen1
‑
staq)，与野生型taq dna聚合酶相比，有更高的耐受抑制剂的能力；同时在其n端融合的瓣状核酸内切酶1相较于野生型taq dna聚合酶，有更高的5
’‑3’
核酸外切酶活性。
64.2、本发明所述热启动dna聚合酶(hot
‑
startpfen1
‑
staq)，在80℃及以下温度完全没有活性释放，降低了qpcr反应过程中非特异性产物扩增的可能性，提高了qpcr反应的特异性和灵敏度。
65.3、本发明所述嵌合体或热启动dna聚合酶，直扩pcr至少可耐受40％(v/v)的全血，直扩taqman探针法qpcr至少可耐受8％(v/v)的全血，对血液等样品中存在的pcr抑制剂的抗性明显提高，无需经过复杂的基因组dna提取和纯化步骤，不仅节约时间成本和物料设备成本，而且能够避免操作时发生样本间的交叉污染，使得检测更加方便、快捷、准确。同时，还为不能直接进行基因组dna提取的珍贵微量血样中的dna检测提供了一种可选择的方法。
附图说明
66.图1为taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的可溶性分析结果图；其中，泳道m为(10
‑
180kda)宽范围蛋白上样marker，泳道1为诱导表达前菌体细胞破碎液，泳道2为诱导表达后菌体细胞破碎液，泳道3为细胞破碎后离心处理所得的上清液，泳道4为破碎液上清75℃加热30min离心处理后上清液。
67.图2为taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的纯化结果图；其中，泳道m为(10
‑
180kda)宽范围蛋白上样marker，泳道1为诱导表达后菌体细胞破碎液，泳道2为细胞破碎后离心处理所得的上清液，泳道3为破碎液上清75℃加热30min离心处理后上清液，泳道4为层析流出组分，泳道5
‑
14为层析洗脱组分。
68.图3为本发明嵌合体与市售野生型taq dna聚合酶的全血pcr直扩对比结果图；其中，泳道1以50ng从血液样本提纯的基因组dna为模板，泳道2
‑
6分别以5％(v/v)、10％(v/v)、20％(v/v)、30％(v/v)、40％(v/v)全血样本为模板。
69.图4为本发明热启动dna聚合酶在不同信号通道下的qpcr扩增曲线结果图；其中，图a为fam信号，图b为rox信号、图c为hex信号。
70.图5为本发明热启动dna聚合酶在不同全血含量中的qpcr扩增对比结果图；其中，图a为全血含量0％(v/v)、图b为全血含量2％(v/v)、图c为全血含量4％(v/v)、图d为全血含
量6％(v/v)、图e为全血含量8％(v/v)。
71.图6为本发明热启动dna聚合酶在8％全血含量中qpcr扩增的重复结果图。
具体实施方式
72.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
73.除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
74.实施例1构建含编码嵌合体的核苷酸序列的重组载体
75.(1)根据所述taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的氨基酸序列(seq id no.1)，进行大肠杆菌表达系统的密码子优化后，获得能在大肠杆菌中进行高效表达的dna分子，利用重叠延伸pcr的方法，人工合成编码所述嵌合体的dna分子，具体如seq id no.8所示。
76.(2)将编码taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的dna分子与表达载体pet
‑
28a进行同源重组。嵌合体扩增引物序列如下：
77.taq
‑
fp：5'
‑
ccgcgcggcagccatatgggcgtgccgatcggtga
‑
3'(seq id no.9)；
78.taq
‑
rp：5'
‑
gacggagctcgaattttattccttcgcagataacc
‑
3'(seq id no.10)。
79.pet
‑
28a线性化引物序列如下：
80.pet
‑
28a
‑
fp：5'
‑
aattcgagctccgtcgacaa
‑
3'(seq id no.11)；
81.pet
‑
28a
‑
rp：5'
‑
atatggctgccgcgcggcac
‑
3'(seq id no.12)。
82.分别以人工合成编码所述嵌合体的dna分子及pet
‑
28a空载为模板，加入25μl 2
×
pfu max hifi pcr promix(广州英赞生物科技有限公司，货号p217a)、各1μl(10μmol/l)上下游引物以及适量的灭菌水，进行pcr扩增。嵌合体dna分子的扩增条件为：98℃30s；98℃10s、58℃30s、68℃1.5min，共25个循环；68℃5min。质粒线性化pcr扩增程序为：98℃30s；98℃10s、58℃30s、68℃2.5min，共25个循环；68℃5min。琼脂糖凝胶电泳回收全长约3kb的嵌合体dna基因片段，以及约5kb线性化的pet
‑
28a载体。将回收产物进行同源重组，体系为5μl 2
×
hipro dnaassembly mix(广州英赞生物科技有限公司，k001a)、回收产物各加50ng，补水至10μl，50℃孵育15min。孵育完后将重组产物转化至dh5a感受态细胞中。
83.(3)挑取单菌落进行菌落pcr鉴定，并将阳性单克隆送往测序公司测序验证，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为含有编码所述嵌合体的dna分子的重组载体。
84.实施例2表达taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的转化体制备
85.将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞e.colit7 express
‑
lysy/iq中，挑取单菌落，接种至液体sb(含50μg/ml的硫酸卡那霉素)培养基培养至od
600
为0.8，加入iptg至终浓度为0.1mmol/l，18℃诱导16h，收集菌体超声破碎，sds
‑
page电泳检测目的蛋白的表达，发现所制备的转化体能够高效表达嵌合体。
86.实施例3taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体在重组大肠杆菌中的表达
87.将实施例2获得的能够表达嵌合体的阳性转化体菌种，接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的60ml sb培养基中，放置于37℃摇床中震荡培养过夜；取过夜培养的种子液，按体积
比1:100接种至1l含有50μg/ml硫酸卡那霉素的sb培养基中，37℃摇床中震荡培养至od
600
为0.8；向摇瓶中加入iptg至终浓度为0.1mmol/l，18℃继续震荡诱导16h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重，储存于
‑
20℃。
88.实施例4taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体的纯化
89.1、诱导表达菌体超声破碎
90.取
‑
20℃冻存的诱导表达菌体，根据实施例3记录的菌体湿重，按每克菌体加入5ml裂解缓冲液(50mmol/l tris
‑
hcl、50mmol/l nacl、5％(v/v)甘油，ph9.0)重悬菌体，用超声波细胞破碎仪裂解菌体，超声条件为：功率250w，超声5.5s，停5.5s，持续30min。将裂解后菌体放入高速冷冻离心机，4℃下20000r/min离心20min，取上清液至250ml灭菌玻璃瓶中。上清液于75℃恒温水浴锅孵育30min，4℃下20000r/min离心15min，0.22μm微孔滤膜过滤，取上清液至250ml灭菌玻璃瓶。各取样20μl，以诱导表达前菌体细胞破碎液作为对照，sds
‑
page蛋白电泳检测，结果如图1所示。
91.2、镍离子亲和层析纯化
92.选用的层析柱是histrap
tm hp 5ml(购自ge healthcare)，结合缓冲液为缓冲液a：50mmol/l tris
‑
hcl、50mmol/l nacl、5％(v/v)甘油，ph9.0；洗脱缓冲液为缓冲液b：50mmol/ltris
‑
hcl、50mmol/l nacl、500mmol/l咪唑、5％(v/v)甘油，ph9.0，0.22μm滤膜过滤备用。
93.将histrap
tm hp 5ml接入快速蛋白质纯化仪柱位阀中，后用超纯水清洗系统和柱子，再用缓冲液a平衡柱子，然后用样品泵将步骤1所述上清液进行上样，上样结束后，先用缓冲液a清洗柱子，再用缓冲液b进行10％的梯度洗脱和10～60％的线性洗脱，并收集洗脱组分。洗脱峰取样20μl，sds
‑
page蛋白电泳检测，结果如图2(泳道5
‑
14)所示。
94.实施例5嵌合体的dna聚合酶活性和热稳定性测试
95.取实施例4制备的taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体，按照以下方法测定dna聚合酶活性。74℃下，以活性化的大马哈鱼精子dna作为模板/引物，在200μmol/l dntps、50mmol/l tris
‑
hcl、2mmol/l mgcl2、5mmol/l(nh4)2so4、50mmol/l kcl、0.1～0.4mg/l bsa、0.1％tween
‑
20、4％dmso组成的ph 8.0的反应体系中进行酶催化反应，30min内，催化10nmoldntps掺入到dna的酶量定义为1u。结果显示嵌合体的聚合酶活性浓度为80u/μl。
96.将嵌合体稀释至聚合酶活性浓度为1u/μl，按下述方法测试嵌合体的热稳定性。将稀释后的酶于95℃分别孵育0、1、2、3、4、5h后，分别取样进行dna聚合酶活性测定，结果显示嵌合体具有较高的热稳定性，其在95℃下的半衰期为3h。
97.实施例6嵌合体在pcr检测中全血耐受性研究
98.以健康人自愿捐赠的血液样本为模板，在反应体系中的添加量分别为5％(v/v)、10％(v/v)、20％(v/v)、30％(v/v)、40％(v/v)，同时设立不加入全血的对照组别，以50ng从血液样本提纯的基因组dna为模板，用本发明中的taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体和市售野生型taq dna聚合酶(neb，货号m0273s)同时扩增基因，扩增引物和具体操作如下：
99.β
‑
actin
‑
fp：5
’‑
cagcggaaccgctcattgccaatgg
‑3’
(seq id no.13)；
100.β
‑
actin
‑
rp：5
’‑
tcacccacactgtgcccatctacga
‑3’
(seq id no.14)。
101.其中嵌合体25μl pcr反应体系为：20mmol/l tris
‑
hcl、10mmol/lkcl、10mmol/l(nh4)2so4，5mmol/l mgso4、0.05％triton x
‑
100、0.3mol/l海藻糖、0.2mol/l l
‑
肉毒碱、
0.4％np
‑
40、200μmol/l dntps、0.2μmol/l上下游引物、1.25u嵌合体，ph 8.8；所述市售野生型taq dna聚合酶反应体系参考商品说明书进行配制。pcr反应程序如下：95℃3min；95℃15s、60℃30s、68℃1min，35个循环；68℃5min。将嵌合体和市售野生型taq dna聚合酶所得pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。结果显示所述市售野生型taq dna聚合酶几乎没有耐受全血的能力，taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体在pcr反应中至少可耐受40％(v/v)全血，其全血耐受能力与野生型taq dna聚合酶相比提高了约40倍(图3)。
102.实施例7热启动dna聚合酶的制备及测活
103.将高纯度的taq dna聚合酶与核酸内切酶嵌合体过夜透析到10～50mmol/ltris
‑
hcl(ph为9.0～10.0)缓冲溶液中。并用bca的方法测定蛋白浓度，后与柠槺酸酐按摩尔比为1:2500混匀，并于37℃反应4h，得到经柠槺酸酐修饰可逆封闭酶活性的热启动dna聚合酶。
104.将得到的热启动dna聚合酶透析到储存缓冲液(20mmol/l tris
‑
hcl、100mmol/l kcl、0.1mmol/l edta、50％(v/v)甘油，1mmol/l dtt，0.5％(v/v)tween
‑
20，ph7.4)中，95℃，热激10min后按实施例5的测活方法测定热启动dna聚合酶的dna聚合酶活性。结果表明，热启动dna聚合酶的聚合酶活性浓度为5u/μl。
105.实施例8热启动dna聚合酶在qpcr检测中的标准曲线建立
106.分别以拷贝数浓度为1
×
108‑1×
103copies/μl的新型冠状病毒序列上的特异性基因片段ncov
‑
orf1ab(基因的ncbi登录号为43740578)重组质粒(pmd
‑
18t
‑
ncov
‑
orf1ab，ncov
‑
orf1ab插入的位置为限制性酶切位点ecor
ⅴ
)、新型冠状病毒核壳蛋白基因ncov
‑
e(基因的ncbi登录号为43740570)重组质粒(pmd
‑
18t
‑
ncov
‑
e，ncov
‑
e插入的位置为限制性酶切位点ecor
ⅴ
)和新型冠状病毒核壳蛋白基因片段ncov
‑
n(基因的ncbi登录号为43740575)重组质粒(pmd
‑
18t
‑
ncov
‑
n，ncov
‑
n插入的位置为限制性酶切位点ecor
ⅴ
)为模板，用本发明中的热启动dna聚合酶扩增基因，扩增引物探针和具体操作如下：
107.orf1ab
‑
fp：5
’‑
ccctgtgggttttacacttaa
‑3’
(seq id no.15)；
108.orf1ab
‑
rp：5
’‑
acgattgtgcatcagctga
‑3’
(seq id no.16)
109.orf1ab
‑
probe：5
’‑
fam
‑
ccgtctgcggtatgtggaaaggttatgg
‑
bhq1
‑3’
(seq id no.17)
110.e
‑
fp：5
’‑
acaggtacgttaatagttaatagcgt
‑3’
(seq id no.18)；
111.e
‑
rp：5
’‑
atattgcagcagtacgcacaca
ꢀ‑3’
(seq id no.19)；
112.e
‑
probe：5
’‑
rox
‑
acactagccatccttactgcgcttcg
‑
bhq1
‑3’
(seq id no.20)
113.n
‑
fp：5
’‑
ggggaacttctcctgctagaat
‑3’
(seq id no.21)；
114.n
‑
rp：5
’‑
cagacattttgctctcaagctg
‑3’
(seq id no.22)；
115.n
‑
probe：5
’‑
hex
‑
ttgctgctgcttgacagatt
‑
bhq1
‑3’
(seq id no.23)。
116.其中热启动dna聚合酶25μlqpcr反应体系为：10mmol/l tris
‑
hcl、20mmol/lkcl、5mmol/l(nh4)2so4，6mmol/l mgso4、0.05％triton x
‑
100、200μmol/l dntps、0.2μmol/l上下游引物、0.3μmol/l探针、2.5u热启动dna聚合酶，ph 8.3。qpcr反应程序如下：95℃10min；95℃10s、60℃30s，45个循环。结果显示所述热启动dna聚合酶的扩增效率近乎100％，可实现不同信号通道下普通样本的定性和定量检测(图4)。
117.实施例9热启动dna聚合酶在qpcr检测中全血耐受性研究
118.以拷贝数浓度为1
×
108‑1×
103copies/μl的新型冠状病毒核壳蛋白基因ncov
‑
e重
组质粒(pmd
‑
18t
‑
ncov
‑
e，ncov
‑
e插入的位置为限制性酶切位点ecor
ⅴ
)为模板，全血样本在反应体系中的添加量分别为0％(v/v)、2％(v/v)、4％(v/v)、6％(v/v)、8％(v/v)，用本发明中的热启动dna聚合酶扩增基因，扩增引物探针和具体操作如下：
119.e
‑
fp：5
’‑
acaggtacgttaatagttaatagcgt
‑3’
；
120.e
‑
rp：5
’‑
atattgcagcagtacgcacaca
‑3’
；
121.e
‑
probe：5
’‑
rox
‑
acactagccatccttactgcgcttcg
‑
bhq1
‑3’
。
122.其中热启动dna聚合酶25μlqpcr反应体系为：10mmol/l tris
‑
hcl、20mmol/lkcl、5mmol/l(nh4)2so4，6mmol/l mgso4、0.05％triton x
‑
100、200μmol/l dntps、0.2μmol/l上下游引物、0.3μmol/l探针、2.5u热启动dna聚合酶，ph 8.3。qpcr反应程序如下：95℃10min；95℃10s、60℃30s，45个循环。结果显示所述热启动dna聚合酶在qpcr反应中至少可耐受8％(v/v)全血，同时扩增效率近乎100％，可实现全血直扩qpcr中对模板的定量分析(图5)。
123.实施例10全血直扩qpcr的重复性检测及最低检测限
124.以拷贝数浓度为1
×
107copies/μl、1
×
105copies/μl、1
×
103copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
101copies/μl、1
×
100copies/μl的新型冠状病毒胞膜蛋白基因ncov
‑
e重组质粒(pmd
‑
18t
‑
ncov
‑
e，ncov
‑
e插入的位置为限制性酶切位点ecor
ⅴ
)为模板，每个浓度设置3个平行实验作为组内重复性检测，再将该实验重复3次作为组间重复性检测。全血样本在反应体系中的添加量为8％(v/v)，用本发明中的热启动dna聚合酶扩增基因，扩增引物探针和具体操作如下：
125.e
‑
fp：5
’‑
acaggtacgttaatagttaatagcgt
‑3’
；
126.e
‑
rp：5
’‑
atattgcagcagtacgcacaca
ꢀ‑3’
；
127.e
‑
probe：5
’‑
rox
‑
acactagccatccttactgcgcttcg
‑
bhq1
‑3’
。
128.其中热启动dna聚合酶25μlqpcr反应体系为：10mmol/l tris
‑
hcl、20mmol/lkcl、5mmol/l(nh4)2so4，6mmol/l mgso4、0.05％triton x
‑
100、200μmol/l dntps、0.2μmol/l上下游引物、0.3μmol/l探针、2.5u热启动dna聚合酶，ph 8.3。qpcr反应程序如下：95℃10min；95℃10s、60℃30s，45个循环。结果显示1
×
107‑1×
101copies/μl浓度条件下的组内重复和组间重复的变异系数均小于1.0％，所述热启动dna聚合酶在8％(v/v)全血qpcr反应中有良好的重复性(图6)，最低检测限为每ul样本中10
‑
100copies的模板。
129.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。