用非洛昔洛韦抑制腺病毒的制作方法

infectious diseases,59(7):962
–
968(2014))。没有抗病毒药物被批准用于治疗腺病毒。先前的报道显示，在细胞培养和动物模型中，许多核苷类似物具有特异性抗病毒活性，包括利巴韦林、更昔洛韦(gcv)、西多福韦(cdv)及其前药布立西多福韦(bcdv)(hartline等人,the journal of infectious diseases,191(3):396
–
399(2005)；naesens等人,antimicrobial agents and chemotherapy,49(3):1010
–
1016(2005)；ying等人,antimicrobial agents and chemotherapy,58(12):7171
–
7181(2014)；toth等人,antiviral research,153:1
–
9(2018)；toth等人,proc.nat.acad.sci.usa,105(20):7293
–
7297(2008))。利巴韦林具有致畸作用，会导致溶血性贫血，并且仅对c组腺病毒有效(feld等人,liver international,37(1):5
–
18(2017)；morfin等人,antiviral therapy,10(2):225
–
229(2005))。利巴韦林治疗免疫功能低下宿主中的腺病毒感染产生了不同的结果，这可能与其血清型特异性相关(ljungman,p.,eur.j.clin.microbiol.infect.dis.,23(8):583
–
588(2004)；lankester等人,clinical infectious diseases,38(11):1521
–
1525(2004))。gcv对adv5的效力非常保守(ic50＝66
±
15.1μm)，并且没有对照试验表明使用gcv的临床疗效(kinchington et al,the journal of antimicrobial chemotherapy,55(4):424
–
429(2005))。长期使用cdv与肾毒性和cns副作用有关(bhadri等人,transplant infectious disease,11(4):373
–
379(2009)；vora等人,journal of the pediatric infectious diseases society,6(4):399
–
402(2017))。布西多福韦(bcdv)是cdv的脂连接衍生物，具有口服生物利用度，在体外高度强力，目前正在进行临床试验(hartline等人2005,见上文；waye,m.m.y.和sing,c.w.,pharmaceuticals,3(10):3343
–
3354(2010))。然而，这些试验仅显示出对adv疾病或病毒血症的适中益处(lopez等人,current opinion in organ transplantation,23(4):395
–
399(2018))。在最近的一项随机安慰剂对照的2期试验中，用bcdv对adv感染的先发制人的治疗(pre-emptive treatment)表明可以迅速降低病毒载量(grimley等人,biology of blood and marrow transplantation,23(3):512
–
521(2017))。然而，报道了实体器官移植(sot)患者中gi毒性和急性肾损伤和造血细胞移植(hsct)患者中的移植物抗宿主病(detweiler等人,journal of pediatric hematology/oncology,40(6):e364
–
e368(2018)；faure等人,medicine,95(44):e5226(2016))。几年前完成了两项3期adv试验(nct01143181、nct02087306)，但该公司尚未寻求批准。由于在3期观察到的严重不良事件(主要是移植物抗宿主病)的频率和24周全因死亡率的增加，针对hcmv的bcdv开发已停止(marty等人,biology of blood and marrow transplantation,25(20:369-381(2018))。此外，最近终止了肾移植患者中cdv的两项3期临床试验(nct02439957、nct02439970)。这些安全问题令人质疑该药物是否可以在任何人群中安全地施用。
4.目前还没有批准用于预防或治疗腺病毒感染的药物，而且开发最远的药物存在安全问题，可能会阻碍其发展。因此，存在对用于治疗和/或预防腺病毒感染的方法中使用的安全有效的抗腺病毒药物的迫切且未满足的医学需求。


技术实现要素：

5.本发明涉及经由施用小分子抑制剂治疗或预防腺病毒(adv)感染的方法。具体地，本发明涉及通过施用非洛昔洛韦(fcv)治疗或预防腺病毒感染的方法。本文所述的方法适
用于治疗和/或预防哺乳动物中特别是人类中的腺病毒感染。
6.具体地，本方法涉及治疗或预防特异性腺病毒株的感染。因此，在一个实施方式中，本发明涉及通过施用包括非洛昔洛韦或其药学上可接受的盐的组合物治疗或预防哺乳动物中腺病毒5(adv5)感染的方法。在优选的实施方式中，哺乳动物是人。
7.在另一个实施方式中，本发明涉及通过施用包括非洛昔洛韦或其药学上可接受的盐的组合物治疗或预防哺乳动物中腺病毒6(adv6)感染的方法。在优选的实施方式中，哺乳动物是人。
8.在另一个实施方式中，本发明涉及通过施用包括非洛昔洛韦或其药学上可接受的盐的组合物治疗或预防哺乳动物中腺病毒8(adv8)感染的方法。在优选的实施方式中，哺乳动物是人。
9.在另一个实施方式中，本发明涉及非洛昔洛韦在制备用于治疗或预防哺乳动物中腺病毒感染的药物中的用途。在优选的实施方式中，本发明涉及非洛昔洛韦在制备治疗或预防adv5、adv6和/或adv8感染的药物中的用途。
10.还公开了包括治疗有效量的非洛昔洛韦或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物适用于所公开的用于治疗或预防哺乳动物中特别是人类中的腺病毒感染的方法。药物组合物可以被配制用于肠胃外和/或非肠胃外施用至其有需要的受试者或患者。
11.在另一个实施方式中，非洛昔洛韦可以任选地与一种或多种已知的抗病毒剂组合施用至其有需要的受试者。另外的一种或多种抗病毒剂可以在非洛昔洛韦施用之前、同时或之后施用。
12.在优选的实施方式中，本发明的非洛昔洛韦化合物/组合物对腺病毒感染的抑制浓度≤10μm，并且细胞毒性(cc
50
)≥100-150μm。
13.定义
14.本文中描述为“包括”(或“包含”)一个或多个命名的元件或步骤的组合物或方法是开放式的，意味着命名的元件或步骤是必不可少的，但其他元件或步骤可以添加到组合物或方法的范围内。为避免冗长，还应理解，描述为“包括”一个或多个命名的元件或步骤的任何组合物或方法还描述了“基本上由相同命名的元件或步骤组成”(或“基本上由相同命名的元件或步骤构成”)的相应的、更有限的组合物或方法，意味着组合物或方法包括命名的基本元件，并且还可能包括不会实质性影响组合物或方法的一个或多个基本和新颖特性的另外的元件或步骤。还应理解，本文中描述为“包括”一个或多个命名的元件或步骤或“基本上由一个或多个命名的元件或步骤组成”的任何组合物或方法也描述了“由命名的元件或步骤组成”(或“由命名的元件或步骤构成")的相应的、更有限的和封闭式的组合物和方法，以排除任何其他元件或步骤。在本文所公开的任何组合物或方法中，任何命名的基本元件或步骤的已知或公开的等同物可分别替代该元件或步骤。
15.非洛昔洛韦(也称为环丙他韦(cyclopropavir)，2-氨基-9-{(z)-[2,2-双(羟甲基)环亚丙基]甲基}-3,9-二氢-6h-嘌呤-6-酮)和其盐，是由以下结构表示的亚甲基环丙烷核苷类似物：
[0016][0017]
如本文所用，术语“受试者”可以是人、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。“患者”或“其有需要的受试者”是指患有疾病或障碍的哺乳动物。术语“患者”包括人和兽医受试者。
[0018]
例如“肠胃外”、“肠胃外的”等术语是指化合物或组合物对个体的施用途径或方式不是沿着消化道。肠胃外施用途径的实例包括但不限于皮下的(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、动脉内(i.a.)、腹膜内(i.p.)、经皮的(通过皮肤或真皮层吸收)、鼻腔(“鼻内”；通过鼻粘膜吸收)或肺部(例如，吸入以通过肺组织吸收)、阴道、直接注射或输注到消化道以外的体腔或器官中，以及通过进入体内的多种装置中的任一种植入(例如，允许化合物或组合物主动或被动释放到体内的组合物、贮库(depot)或装置)。
[0019]
术语“非肠胃外”、“非肠胃外地”、“肠内”、“肠内地”、“口服”、“口服地”等，是指通过沿消化道的途径或方式向个体施用化合物或组合物。肠内施用途径的实例包括但不限于口服，如吞咽固体(例如，片剂)或液体(例如，糖浆)剂型、舌下(通过口腔底部的粘膜吸收，例如在舌下方)、口腔(通过面颊的粘膜吸收)、鼻空肠管或胃造口管(递送到胃中)、十二指肠内施用以及直肠施用(例如，用于将药物组合物释放到消化道的下肠道和通过其吸收的的栓剂)。
附图说明
[0020]
图1是剂量反应曲线，其显示了非洛昔洛韦对腺病毒5(adv5)的抗病毒活性(实心符号)和细胞毒性(空心符号)。
[0021]
图2是剂量反应曲线，其显示了非洛昔洛韦对腺病毒6(adv6)的抗病毒活性和细胞毒性。
[0022]
图3是感染腺病毒5并用非洛昔洛韦处理的a549细胞的免疫荧光测定。
[0023]
图4是感染腺病毒6并用非洛昔洛韦处理的a549细胞的免疫荧光测定。
[0024]
图5显示了对仓鼠口服(po)或静脉内(iv)施用非洛昔洛韦的生物利用度。
[0025]
图6a和6b显示了感染adv6并用10mg/kg、30mg/kg、60mg/kg或100mg/kg非洛昔洛韦处理的叙利亚仓鼠的存活率百分比(6a)和平均体重变化(6b)。6a：存活率。adv6 载体对比adv6 10mg/kg或30mg/kg非洛昔洛韦(p＝0.0124)(对数秩)。6b：平均体重变化。显示了组平均值和平均值的标准误差。在从组中杀死垂死的动物后，没有计算该组的平均值。adv6 载体对比adv6 10mg/kg或30mg/kg非洛昔洛韦(p《0.0001((双因素方差分析)；adv6 10mg/kg非洛昔洛韦对比载体 载体或adv6 30mg/kg非洛昔洛韦(p＝0.0286)。
[0026]
图7显示了攻击后5天叙利亚仓鼠的转氨酶(alt)水平。用非洛昔洛韦处理减轻肝脏病理。符号表示来自个体动物的值；水平条代表几何平均值。adv6 载体组中的空符号表示从垂死动物中收集的样品。
[0027]
图8显示了攻击后5天叙利亚仓鼠肝脏中的adv负荷水平。用非洛昔洛韦处理抑制
了肝脏中的adv6复制。符号表示来自个体动物的值；水平条代表几何平均值。nq：不可量化；nd：不可检测。
[0028]
图9a和9b显示了感染adv6并用1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg非洛昔洛韦处理的叙利亚仓鼠的存活率百分比(9a)和平均体重变化(9b)。非洛昔洛韦在3和10mg/kg q.d.p.o.剂量水平时完全防止了死亡，并在1mg/kg p.o.q.d.剂量水平具有中等但明显(p＝0.0449)的效果。(参见图9a)。非洛昔洛韦在10mg/kg时完全阻止体重减轻，在3mg/kg时中等有效，在1mg/kg时无效。(参见，图9b)。在非洛昔洛韦处理的仓鼠中未观察到毒性作用。符号代表组平均值；误差线表示标准偏差。给定组的体重数据仅显示到未发生计划外死亡的时间点。
[0029]
图10显示了攻击后5天叙利亚仓鼠的血清丙氨酸氨基转移酶(alt)水平。非洛昔洛韦在3和10mg/kg q.d.p.o.剂量水平下减轻了由静脉内注射adv6引起的病理学，而在1mg/kg p.o.q.d.剂量水平下无效。符号代表从个体仓鼠收集的数据；水平条表示组平均值。对于adv6 载体和adv6 1mg/kg非洛昔洛韦组，空符号表示样品是从提前于计划处死的仓鼠中收集的。(*：p＝0.0415；***：p＝0.0005)(单尾曼-惠特尼(mann-whitney u)检验)。
[0030]
图11显示了攻击后5天叙利亚仓鼠肝脏中的adv负荷水平。用1、3或10mg/kg非洛昔洛韦处理抑制了肝脏中的adv6复制。符号表示来自个体仓鼠的值；水平条代表几何平均值。nq：不可量化；nd：不可检测。
[0031]
图12a和12b显示了用10mg/kg非洛昔洛韦延迟处理对仓鼠中的adv6感染有效的效果。12a.存活率。adv6 载体对比adv6 非洛昔洛韦，第-1天；adv6 非洛昔洛韦，第 1天；adv6 非洛昔洛韦，第 2天；或adv6 非洛昔洛韦，第 3天(p＝0.0005)；和adv6 载体对比adv6 非洛昔洛韦，第 4天(p＝0.0023)(对数秩检验)；12b.体重变化。符号代表组平均值；误差条表示平均值的标准误差。
[0032]
图13显示了用10mg/kg非洛昔洛韦处理攻击后1、2、3和4天的叙利亚仓鼠的转氨酶(alt)水平。攻击后多至4天用10mg/kg非洛昔洛韦处理减轻了肝脏病理。adv6 载体对比adv6 非洛昔洛韦，第-1天或adv6 非洛昔洛韦，第 1天(p＝0.0018)；adv6 载体对比adv6 非洛昔洛韦，第 2天(p＝0.0087)；adv6 载体对比adv6 非洛昔洛韦，第 3天(p＝0.0032)；和adv6 载体对比adv6 非洛昔洛韦，第 4天(p＝0.1452)(双尾曼-惠特尼检验)。符号表示来自个体动物的值；水平条代表几何平均值。adv6 载体组中的空符号表示从垂死动物中收集的样品。
[0033]
图14显示了用10mg/kg非洛昔洛韦处理的攻击后1、2、3和4天的叙利亚仓鼠肝脏中的adv负荷水平。攻击后4天用10mg/kg非洛昔洛韦处理抑制了肝脏中的adv6复制。符号表示来自个体动物的值；水平条代表几何平均值。nq：不可量化；nd：不可检测。
具体实施方式
[0034]
人类腺病毒属于腺病毒科，其与疱疹病毒科不同。例如，腺病毒是双链dna病毒，但与疱疹病毒不同，它们没有被二十面体核衣壳包裹，并在其外表面上携带细长的纤维蛋白。腺病毒分为七种，被指定为人腺病毒a至g。这些病毒主要感染上呼吸道或下呼吸道、结膜或胃肠道，引起一系列不同于由疱疹病毒引起的那些的临床表现。大多数感染发生在儿童和免疫功能低下的个体中。已知腺病毒不是编码病毒编码的激酶，这暗示了非洛昔洛韦活化的新机制。
[0035]
adv感染的其他罕见临床表现包括肝炎，以及泌尿生殖系统和神经症状(khanal等人，2018，见上文)。控制adv感染的选择非常有限。口服活疫苗可降低呼吸道疾病的风险，并被美国军方常规使用，但目前平民无法使用并且仅提供针对4型和7型的保护(radin等人，2014，见上文)。没有抗病毒药物被批准用于治疗腺病毒。
[0036]
在本文中，我们描述了通过施用小分子抑制剂非洛昔洛韦(fcv)治疗和/或预防哺乳动物中腺病毒感染的新方法的发现。我们的结果表明，非洛昔洛韦在用于治疗或预防腺病毒感染的方法中出乎意料地有效，并且在治疗或预防腺病毒感染方面比以前已知的治疗更有效。
[0037]
本发明用于使用非洛昔洛韦治疗或预防腺病毒感染的方法对多种腺病毒株特别有效，包括但不限于腺病毒3(adv3)、腺病毒4(adv4)、腺病毒5(adv5)、腺病毒6(adv6)、腺病毒7(adv7)、腺病毒8(adv8)、腺病毒19(adv19)和腺病毒34(adv37)。
[0038]
本发明的用于使用非洛昔洛韦治疗腺病毒感染的方法尤其适用于治疗或预防涉及上呼吸道的腺病毒感染以及眼睛的腺病毒感染，例如结膜炎，并特别涉及眼睛的眼睛表面的角膜结膜炎。
[0039]
因此，本发明提供了涉及用于治疗或预防哺乳动物细胞中腺病毒感染的抗腺病毒疗法的新方法。具体地，本发明涉及使用非洛昔洛韦治疗或预防哺乳动物受试者中腺病毒感染。在优选的实施方式中，哺乳动物是人。
[0040]
本文所述的数据表明，非洛昔洛韦是有效的泛腺病毒治疗剂；因此，非洛昔洛韦的治疗性施用可有效地治疗或预防多株腺病毒感染。如下所述，使用几种测定法，证明了非洛昔洛韦是许多腺病毒株的强力、安全且有效的抑制剂。例如，如实施例1中所述，我们使用细胞病变效应(cpe)降低测定来证明，与许多其他已知病毒抑制剂(包括西多福韦和更昔洛韦)相比，非洛昔洛韦是一种更有效的腺病毒5抑制剂(参见表1和图1)。
[0041]
接下来，我们使用中性红存活测定来证明非洛昔洛韦可有效降低腺病毒6的细胞毒性作用。结果如图2所示。本质上，健康细胞能够经由主动转运吸收中性红染料进入它们的溶酶体内，而感染病毒的细胞不能吸收中性红染料。图2中所示的结果表明，低至10-1
μm的非洛昔洛韦浓度可有效提高adv6感染的细胞的活力，即表明中性红染料主动转运到adv6感染细胞的溶酶体中。
[0042]
如实施例3中所述，免疫荧光染色测定用于证明非洛昔洛韦在抑制感染的人a549细胞中adv的“晚期”复制。在该测定中，以adv5或adv6感染细胞或模拟感染。1小时后，加入非洛昔洛韦至终浓度为0、4、10或40μm。结果示于图3和图4中。如图3和4所示，非洛昔洛韦处理对adv5和adv6感染的结果相同。如通过缺乏六邻体蛋白(一种在腺病毒复制周期晚期产生的病毒外壳蛋白)所证明的，非洛昔洛韦在防止晚期感染方面非常有效。在40μm非洛昔洛韦处理的孔中未观察到六邻体阳性细胞，而在10μm非洛昔洛韦处理的孔中几乎没有六邻体阳性细胞。在4μm非洛昔洛韦处理的孔中可以看到一些六邻体阳性细胞，但与对照(无药物)孔相比，4μm孔的感染程度实质上较低(如dbp染色模式和细胞核的大小和形状所示)。
[0043]
使用如实施例4-7中所示的腺病毒感染的叙利亚仓鼠模型，证明了当口服和静脉内施用时非洛昔洛韦表现出有利的生物利用度(参见图5)并且在感染adv5或adv6后，用10mg/kg-100mg/kg范围内的非洛昔洛韦剂量处理免疫功能低下的仓鼠防止了发病率和死亡率(参见图6)、减轻了肝脏损伤(参见图7)，并抑制了adv病毒复制(参见图8)。
[0044]
在实施例6中，使用上述相同的叙利亚仓鼠模型，我们还证明了在adv感染后，即使是低剂量的非洛昔洛韦(3mg/kg和10mg/kg)也能有效防止发病率和死亡率(图9)、减轻肝脏损伤(图10)，并抑制adv病毒复制(图11)。
[0045]
在实施例7中，显示晚期施用非洛昔洛韦(10mg/kg)，例如，攻击后多至4天，可有效防止发病率和死亡率(参见图12)、减轻肝脏损伤(参见图13)，并在感染adv6的叙利亚仓鼠中抑制adv病毒复制(参见图14)。
[0046]
因此，在一个实施方式中，本发明涉及非洛昔洛韦在治疗或预防腺病毒5(adv5)感染哺乳动物的方法中的用途。
[0047]
在另一个实施方式中，本发明涉及非洛昔洛韦在治疗或预防腺病毒6(adv6)感染哺乳动物的方法中的用途。
[0048]
在另一个实施方式中，本发明涉及非洛昔洛韦在治疗或预防腺病毒7(adv7)感染哺乳动物的方法中的用途。
[0049]
在仍另一个实施方式中，本发明涉及非洛昔洛韦在治疗或预防腺病毒8(adv8)感染哺乳动物的方法中的用途。
[0050]
结果还表明，非洛昔洛韦可有效治疗或预防哺乳动物被腺病毒3(adv3)、腺病毒4(adv4)、腺病毒19(adv19)和腺病毒37(adv37)感染(数据未显示)。
[0051]
在优选的实施方式中，哺乳动物是人。
[0052]
本发明进一步涉及非洛昔洛韦在制备用于治疗或预防哺乳动物(例如人类)中的腺病毒感染的药物的方法中的用途，其包括将非洛昔洛韦或包含非洛昔洛韦的组合物与药学上可接受的载体或稀释剂组合。因此，一方面，本发明涉及制造药物的方法，该方法包括将根据本发明的至少一种所公开的化合物，例如非洛昔洛韦，或至少一种所公开的产品与药学上可接受的载体或稀释剂组合。
[0053]
施用至受试者的个体剂量需求将由护理者确定，例如医生、初级保健医生或护士。
[0054]
如本文所述，已经证明了非洛昔洛韦表现出对腺病毒感染的剂量依赖性抑制，其中ic
50
值≤5μm和优选地最小哺乳动物细胞毒性(cc
50
)≥100-150μm。
[0055]
非洛昔洛韦可以作为药学上可接受的盐施用。这种药学上可接受的盐包括葡糖酸盐、乳酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、马来酸盐、硼酸盐、硝酸盐、硫酸盐和盐酸盐。例如，可以通过使碱化合物与所需酸在溶液中反应来制备本文所述的化合物的盐。在反应完成后，通过加入盐在其中不溶的适量的溶剂，使盐从溶液中结晶出来。在一些实施方式中，通过将氯化氢气体通过游离碱的乙醇溶液中来制备盐酸盐。
[0056]
在另一个实施方式中，将化合物配制到药学上可接受的载体或赋形剂中以施用至其有需要的受试者。在另一个实施方式中，将化合物可以配制成药物制剂并且进一步包括另外的抗病毒化合物。在另一个实施方式中，可以将药物制剂配制成口服、肠胃外或局部施用。
[0057]
优选开发口服活性治疗剂，因为这是在大流行的情况下向大量暴露人群施用药物的最方便和最快速的方法。目前，用于防止血清型4和7的活口服腺病毒疫苗已被军方使用，但平民群体无法获得。然而，还预期如本文所述的非洛昔洛韦将适用于静脉内(i.v.)施用，因为可以预见，在自然爆发的情况下，受感染的患者可能需要i.v.施用。因此，本文所述的方法将为任何新出现的一种或多种腺病毒大流行株提供有效、安全和容易的治疗选择。
[0058]
本公开的主题的方法可用于治疗这些病症，因为它们抑制病症的发作、生长或扩散，引起病症的消退，治愈病症，或以其他方式改善患有这种病症或有患这种病症风险的受试者的总体幸福感。因此，根据本公开的主题，术语“处理”、“治疗”及其语法变体以及短语“治疗方法”旨在涵盖任何所需的治疗干预，包括但不限于治疗受试者中现有腺病毒感染的方法，以及预防(即防止)腺病毒感染的方法，例如在已经暴露于如本文所公开的病毒或预期暴露于如本文所公开的病毒的受试者中。
[0059]
根据本发明的药物组合物包括如本文所述的腺病毒抑制剂非洛昔洛韦或其药学上可接受的盐作为
‘
活性成分’和药学上可接受的载体(或
‘
介质’)，该载体其可以是液体、固体、无定形的或半固体化合物。
[0060]
在一些实施方式中，本公开的主题涉及治疗或预防其需要治疗的受试者中的腺病毒感染的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的包括非洛昔洛韦的组合物。非洛昔洛韦可以单独施用或任选地与一种或多种另外的抗病毒剂组合施用。
[0061]
在另一个实施方式中，可以将非洛昔洛韦配制到药学上可接受的载体中并通过注射(包括但不限于皮内、经皮、肌肉内、腹膜内和静脉内)向有需要的受试者应用/施用。根据本发明的另一个实施方式，施用是口服的，并且化合物可以例如以片剂的形式存在或包在明胶胶囊或微胶囊中，这简化了口服应用。这些施用形式的生产在技术专家的一般知识范围内。为本文所述的方法设想了多种施用途径，并且可以轻松实现高成本效益的生产策略。
[0062]
在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包括非洛昔洛韦或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或多晶型物以及药学上可接受的载体。
[0063]
在进一步的方面，药物组合物是选自胶囊、片剂、丸剂、粉末、颗粒、泡腾颗粒、凝胶剂、糊剂、糖锭和锭剂的固体剂型。在仍进一步方面，药物组合物是选自乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂的液体剂型。
[0064]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。当本发明化合物为酸性时，其相应的盐可以方便地由药学上可接受的无毒碱制备，包括无机碱和有机碱。从这些无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜(铜和亚铜)、铁、亚铁、锂、镁、锰(锰和亚锰)、钾、钠、锌等盐。从药学上可接受的有机无毒碱衍生的盐包括伯胺、仲胺和叔胺，以及环胺和取代胺(例如天然存在和合成的取代胺)的盐。可形成盐的其他药学上可接受的有机无毒碱包括离子交换树脂，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺和氨丁三醇(tromethamine)等。
[0065]
如本文所用，术语“药学上可接受的无毒酸”包括无机酸、有机酸和由其制备的盐，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、帕莫酸(pamoic)、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。
[0066]
在制备用于口服剂型的组合物时，可以使用任何方便的药物介质。例如，水、二元醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制剂，如混悬剂、酏剂和溶液剂；
而载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等可用于形成口服固体制剂如粉末、胶囊和片剂。由于其易于施用，片剂和胶囊是优选的口服剂量单位，其中使用固体药物载体。任选地，片剂可以通过标准的水性或非水性技术进行包衣。
[0067]
含有本发明组合物的片剂可以通过压制或模制来制备，任选地与一种或多种辅助成分或佐剂一起。压制片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分来制备，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合。模制的片剂可通过在合适的机器中模制以惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。
[0068]
适用于肠胃外施用的本发明药物组合物可以制备为活性化合物(例如由活性化合物的冻干样品制备)在水中的溶液剂或混悬剂。可以包括合适的表面活性剂，例如羟丙基纤维素。分散剂也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备。进一步地，可以包括防腐剂以防止微生物的有害生长。
[0069]
适用于注射用途的本发明药物组合物包括无菌水溶液剂、乳剂或分散剂。进一步地，组合物可以是用于临时制备这种无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末形式。在所有情况下，最终的可注射形式必须是无菌的并且必须是有效的流体以便于注射。药物组合物在制备和储存条件下必须稳定；因此，优选地应当防止微生物如细菌和真菌的污染作用而保存。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油及其合适混合物的溶剂或分散介质。
[0070]
本发明的药物组合物可以是适合局部使用的形式，例如气雾剂、乳膏、软膏、洗剂、喷粉、漱口水、漱口剂等。进一步地，组合物可以是适用于经皮装置的形式。这些制剂可以使用本发明的化合物或其药学上可接受的盐经由常规加工方法制备。例如，通过将亲水性材料和水以及约5wt％至约10wt％的化合物混合以产生具有期望稠度的乳膏或软膏来制备乳膏或软膏。
[0071]
本发明的药物组合物可以是适合直肠施用的形式，其中载体是固体。优选的是混合物形成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和本领域常用的其他材料。通过首先将组合物与软化或熔化的(一种或多种)载体混合，然后在模具中冷却和成型，可以方便地形成栓剂。
[0072]
除上述载体成分外，上述药物制剂可酌情地包括一种或多种另外的载体成分，例如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。此外，可以包括其他佐剂以使制剂与预期接受者的血液等渗。含有本发明化合物和/或其药学上可接受的盐的组合物也可以以粉末或液体浓缩物形式制备。
[0073]
一方面，本发明涉及试剂盒，该试剂盒至少包括根据本发明的非洛昔洛韦或其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物；以及以下一项或多项：
[0074]
a)任选地至少一种已知具有抗病毒活性的另外的药剂；
[0075]
b)用于治疗腺病毒相关疾病的说明书；
[0076]
c)用于施用与治疗腺病毒感染有关的化合物的说明书；和/或
[0077]
d)用于将化合物与至少一种已知治疗腺病毒相关疾病的药剂一起施用的说明书。
[0078]
试剂盒还可包括与其他组分共同包装、共同配制和/或共同递送的化合物和/或产品。例如，药品制造商、药品经销商、医生、配药店(compounding shop)或药剂师可以提供包括本发明所公开的化合物和/或产品以及用于递送给患者的另一个组分的试剂盒。
[0079]
在进一步的方面，试剂盒进一步包括多个剂型，该多个剂型包括一个或多个剂量；其中每个剂量包括一定量的化合物和已知具有抗病毒活性的药剂。在另一个方面，试剂盒进一步包括多个剂型，该多个剂型包括一个或多个剂量；其中每个剂量包含有效量的化合物和已知具有抗病毒活性的药剂。
[0080]
在进一步的方面，有效量是治疗有效量。在仍进一步的方面，有效量是预防有效量。
[0081]
实施例
[0082]
已包括以下实施例以说明本公开主题的模式。根据本公开内容和本领域技术人员的一般水平，技术人员将理解，以下实施例仅旨在是示例性的，并且在不脱离本公开的发明的情况下可以采用多种改变、修改和变更。
[0083]
实施例1.细胞病变效应(cpe)减少测定以测量非洛昔洛韦对腺病毒5(adv5)的抑制
[0084]
人包皮成纤维(hff)细胞的制备和培养
[0085]
人包皮组织是从位于伯明翰的阿拉巴马大学(university of alabama)组织获取设施(tissue procurement facility)获得的，并获得机构审查委员会(institutional review board)的批准。将组织储存在4℃的细胞培养基中，该培养基由补充有10％胎牛血清(fbs；hyclone,inc.,logan,ut)的含有earle盐的最低必需培养基(mem)，和标准浓度的l-谷氨酰胺、两性霉素b(fungizone)和万古霉素组成。然后将组织放入磷酸盐缓冲盐水溶液中，切碎并冲洗以去除红细胞。然后将组织碎片重新悬浮在胰蛋白酶-edta溶液中，并在37℃下温育以分散细胞，然后通过离心收集细胞。然后将细胞沉淀重悬于4ml培养基中，置于25cm2的组织培养瓶中，并在37℃下培养24小时。然后用新鲜培养基替换培养基并每天监测细胞的状况直到形成汇合的细胞单层。然后将hff细胞在含有earle盐的mem标准生长培养基中连续传代扩增，该培养基补充有10％fbs、l-谷氨酰胺、青霉素和庆大霉素。确认每批细胞没有支原体感染，并在第10代或之前进行常规传代或用于测定。
[0086]
抗病毒测定
[0087]
每种病毒的抗病毒和细胞毒性数据是在一系列三到五次独立实验中获得的，以提供抗病毒活性的准确估计和统计数据。每个测定包括阳性和阴性对照化合物以及感染和未感染的对照，以确保实验的完整性。使用相同数量的细胞和等效水平的化合物暴露在每个测定板中同时进行细胞毒性评估，使得可以获得准确的选择指数(si)值。所有液体处理步骤均在biomek 4000上进行，并显著提高了测定效率和减少了分析人员的手动操作时间。
[0088]
cpe减少测定在384孔板的测定培养基中的单层人包皮成纤维(hff)细胞(5000个/孔)中进行，该测定培养基由含有earle盐的mem，2％fbs和标准浓度的l-谷氨酰胺、青霉素和庆大霉素组成。将5000个细胞接种在384孔微量滴定板中，并在37℃下在湿润的5％co2温育箱中培养24小时，以形成汇合的单层。抗病毒测试化合物(包括非洛昔洛韦)的稀释物直接在平板中以5倍系列稀释在重复孔中制备，以产生最终浓度范围为0.1μm至300μm或0.003μm至10μm，从而允许化合物浓度较大的动态范围以促进检测具有弱或强抗病毒活性的未知化合物的抗病毒活性。
[0089]
用包括adv5的病毒株以大约0.005pfu/细胞的感染复数(moi)感染细胞单层。感染的细胞在37℃下温育，直到在病毒对照孔中观察到100％cpe。通过添加试
剂(promega,madison,wi)来确定细胞病理学。使用excel中的标准方法从实验数据中插入足以将cpe降低50％(ec
50
)的抗病毒测试化合物的浓度。细胞毒性还使用发光细胞活力测定法(luminescent cell viability assay)(promega,madison,wi)进行确定，从数据计算使细胞活力降低50％(cc
50
)的测试化合物浓度，并计算选择指数(si)值为cc
50
/ec
50
以作为抗病毒活性的量度。结果如下表1和图1所示。
[0090]
表1—多种抗病毒化合物对腺病毒5的细胞毒性
[0091][0092][0093]a显示的值代表来自五个独立实验的平均ec
50
和cc
50
值(μm)和sd。
[0094]
缩写：
[0095]
cdx—西多福韦；pfa—膦甲酸；gcv—更昔洛韦；acv—阿昔洛韦；pcv—喷昔洛韦；fiau—氟碘阿拉伯糖腺嘌呤(fluoroiodoarabinosyl adenine)；idu—碘苷；bdcrb—溴二氯核糖基苯并咪唑(bromodichlororibobenzimidazole)；cmx001—布西多福韦；azt—叠氮胸苷；fcv—非洛昔洛韦；4-硫-idu—4-硫代碘苷；n-mct—n-亚甲基卡巴胸苷(methanocarbathymidine)；l-bhdu—l-溴乙烯基-羟甲基-二氧戊环尿嘧啶；pmea—阿德福韦
[0096]
表1中显示的结果表明，与所有其他测试化合物相比，非洛昔洛韦(fcv)表现出对腺病毒5的明显改善的抑制活性(si＝43)，并且其至少是第二个最有效的抗病毒药物西多福韦(cdv)(si＝24)效力的两倍，且明显优于更昔洛韦(gcv)(si≥1.5)。
[0097]
adv5复制减少百分比随非洛昔洛韦浓度范围从0.01到100μm的变化如图1所示。图1中的结果表明，低至0.2μm的非洛昔洛韦浓度可有效减少adv复制。
[0098]
用非洛昔洛韦对腺病毒6、腺病毒7和腺病毒8进行了类似的实验。结果如下表2所示。非洛昔洛韦对腺病毒8表现出强力抑制(si≥61)。
[0099]
表2—非洛昔洛韦的细胞毒性
[0100][0101][0102]
实施例2.中性红存活测定以测量非洛昔洛韦对腺病毒6(adv6)的抑制
[0103]
中性红细胞细胞毒性测定用于检测细胞活力或药物细胞毒性。该测定的原理基于经由吸收染料中性红来检测活细胞。中性红是二氨吖嗪(eurhodine)染料，可染色活细胞中的溶酶体。活细胞可以经由主动转运吸收中性红并将染料掺入其溶酶体，但非活细胞不能吸收这种发色团。因此，在洗涤后，活细胞可以在酸化提取条件下释放掺入的染料。释放的染料量可以量化并用于确定活细胞的总数或药物的细胞毒性。因此，细胞毒性表示为暴露于所研究的化合物后中性红的吸收的浓度依赖性降低。
[0104]
中性红存活测定以96孔格式进行。简而言之，在感染前一天，将a549腺癌人肺泡基底上皮细胞以每孔6
×
103个细胞的浓度接种。以每孔5
×
103pfu进行adv6感染(感染时估计为0.5pfu/细胞)。非洛昔洛韦在单独的96孔板上以1：3的比例连续稀释，其中最后一行没有药物，作为对照。adv6感染对每个药物浓度进行9个重复孔，每个药物浓度有3个未感染的药物对照孔。在用adv6感染之前立即将非洛昔洛韦稀释液加入细胞板。在感染后第6天(当病毒感染的病毒细胞病变效应达到70-90％时，无药孔)，加入中性红持续1小时，然后用pbs洗板3次以去除未附着的细胞，使用50％乙醇/1％冰醋酸从剩余细胞中提取中性红。读取非洛昔洛韦板，并使用graphpad prism绘图和统计软件(graphpad software,san diego,ca)绘制结果图。
[0105]
结果如图2所示。如图2所示，低至10-1
μm的非洛昔洛韦浓度可有效改善感染adv6的细胞的活力。
[0106]
实施例3.非洛昔洛韦处理的adv5或adv6感染的人a549细胞的免疫荧光测定
[0107]
用adv5或adv6以5pfu/细胞的moi感染或模拟感染6孔板中玻璃盖玻片上的人a549细胞。在1小时后，加入非洛昔洛韦至终浓度为0、4、10或40μm。感染后27小时，将a549细胞固定在多聚甲醛(pbs中3.7％)中，并用甲醇进行透化。对细胞进行腺病毒dna结合蛋白和腺病毒六邻体染色。在adv感染的早期(在adv dna复制之前)，dbp染色将是抗核和均匀的。随着感染的进展，dbp与复制中心相关联。复制中心最初是小的“点”(每个点都来自一个进入的adv基因组)。随着dna复制的发生，复制中心将扩增和“繁殖”。随着感染的进展，细胞核会变大和变形。adv六邻体是adv病毒衣壳中最丰富的组分，其直到dna复制发生后才会表达，因此被认为是“晚期”adv蛋白。结果如图3和图4所示。
[0108]
如图3和图4所示，非洛昔洛韦处理对adv5和adv6感染的结果相同。非洛昔洛韦在
防止晚期感染方面非常有效(如六邻体染色所示的)。在40μm非洛昔洛韦孔中未观察到六邻体阳性细胞，在10μm非洛昔洛韦孔中观察到极少数六邻体阳性细胞。在4μm非洛昔洛韦孔可以看到一些六邻体阳性细胞，但与对照(无药物)孔相比，4μm孔显示出实质上更低的感染程度(如dbp染色模式和细胞核的大小和形状所示)。
[0109]
结果表明，非洛昔洛韦是人腺病毒5(adv5)、adv6和adv8的强力抑制剂。该活性水平与西多福韦(cdv)相似，远优于更昔洛韦(gcv)，后者对adv5的ic
50
值为66μm。(参见表1)到目前为止测试的adv血清型范围表明，fcv有可能被开发为强力的泛腺病毒抑制剂。
[0110]
实施例4.非洛昔洛韦的药代动力学
[0111]
为了测试非洛昔洛韦的药代动力学，我们使用了腺病毒感染的叙利亚雄性仓鼠模型。给叙利亚仓鼠口服(p.o.50mg/kg)给予或静脉内(i.v.10mg/kg)给予非洛昔洛韦剂量。结果如图5所示，证明在po或iv施用后6小时仍可检测到非洛昔洛韦。
[0112]
叙利亚仓鼠adv模型
[0113]
叙利亚雄性仓鼠模型尤其有利，因为它模拟了人类患者中所见的病理，并且可用于测试抗病毒化合物的疗效(在wold,w.s.m.和toth,k.,advances in cancer research,115:69
–
92(2012)中综述)。叙利亚仓鼠是允许adv的c种感染(1、2、5和6型)的两种啮齿动物物种之一(另一种是棉鼠)。
[0114]
使用该模型，可以进行受控的体内实验以测试抗腺病毒化合物的疗效(ying等人,antimicrobial agents and chemotherapy,58(12):7171
–
7181(2014)；toth等人,proc.natl.acad.sci.usa,105(20):7293
–
7297(2008)；tollefson等人2014；toth等人,viruses,7(3):1409
–
1428(2015))。
[0115]
在这些实验中，年轻仓鼠用环磷酰胺(cp)进行免疫抑制，环磷酰胺是经常用作人类移植接受者预处理方案(conditioning regimen)的一部分的药剂。在达到所期望的免疫抑制程度后，以adv5静脉内(iv)感染仓鼠，导致adv5在大多数器官中复制，最突出的是在肝脏中(toth等人2008见上文)。
[0116]
药物制剂
[0117]
对于p.o.施用，将非洛昔洛韦以5mg/ml悬浮在0.4％羧甲基纤维素(sigma c5678)中，并超声处理至目测均匀。对于i.v.施用，将非洛昔洛韦溶解在dmso(sigma d2650)中，然后用水稀释至非洛昔洛韦的终浓度为5mg/ml和75％dmso。在使用前一天制备给药溶液并储存在4℃。
[0118]
实验设计
[0119]
雄性叙利亚仓鼠购自envigo(hackensack,nj)，体重约100克。所有仓鼠都使用环磷酰胺(cp)以140mg/kg的剂量腹膜内施用，然后以100mg/kg的剂量每周两次施用。在施用非洛昔洛韦之前，动物接受了3次cp注射。两组动物(12只仓鼠/组)用于两种施用途径。此外，三只未经处理的动物(用于两种途径的相同三只仓鼠)作为模拟对照。p.o.和i.v.实验连续两天进行。由于仓鼠重大约100克( /-10％)，因此它们在p.o.和i.v.途径中分别施用1ml和0.2ml以达到所期望的剂量。对于这两种途径，在给药后0.5、1、3和6小时处死3只仓鼠。
[0120]
收集所有动物的血浆和肝脏样本并储存在-80℃直至通过如下lc ms分析：
[0121]
·
所有样品和标准品均在冰上处理；
[0122]
·
标准曲线是用真正的化合物(新鲜粉末dmso重新配制的加入“空白”仓鼠血浆中)和加入500ng/ml的卡马西平(carbamazepine)(内标)的所有样品构建；
[0123]
·
早期时间点样品在“空白”仓鼠血浆中稀释(尝试达到标准曲线上的浓度)；
[0124]
·
使用0.1％甲酸铵的甲醇溶液(即30μl样品 60μl 0.1％甲酸铵的甲醇溶液)以2倍样品体积提取样品；
[0125]
·
提取的样品在微量离心机中以最大设置离心；
[0126]
·
使用自定义方法通过lc/ms/ms动态多反应监测(dynamic multiple reaction monitoring)(dmrm)分析上清液。
[0127]
实施例5.确定高剂量非洛昔洛韦对免疫抑制的雄性叙利亚仓鼠中静脉施用的人adv6的治疗疗效
[0128]
如上所述，已确定非洛昔洛韦是有效的对一些体外腺病毒株复制的抑制剂，并在仓鼠中显示出良好的口服生物利用度。
[0129]
接下来，我们评估了非洛昔洛韦是否对adv6静脉内(i.v.)感染免疫抑制的叙利亚仓鼠表现出抗腺病毒疗效。测试了四种剂量水平：10、30、60和100mg/kg p.o.q.d。基于大鼠毒理学数据确定最高剂量。
[0130]
实验设计
[0131]
使用环磷酰胺(cp)对所有仓鼠进行免疫抑制。以140mg/kg的剂量腹膜内施用cp，然后以100mg/kg的剂量每周施用两次。
[0132]
将粉末形式的非洛昔洛韦以1、3、6和10mg/ml的浓度悬浮在0.4％羧甲基纤维素(sigma c5678)中，并超声处理至目测均匀，并在4℃下储存等分试样。在给药前使等分试样平衡至室温。对于10、30、60和100mg/kg的剂量水平，以1ml体积的适当混悬剂向体重大约100g的仓鼠给药。提及“载体”是指0.4％羧甲基纤维素
[0133]
仓鼠被分成8组，每组15只仓鼠(第2组除外，其只有5只仓鼠；见表3)，免疫抑制，然后i.v.注射载体(第1-2组)或2
×
10
10
pfu/kg的adv6(第5-9组)。第1组和第3组接受药物载体(p.o.q.d.)，第4组接受10mg/kg非洛昔洛韦(p.o.q.d.)，第5组接受30mg/kg非洛昔洛韦(p.o.q.d.)，第6组接受60mg/kg非洛昔洛韦(p.o.q.d.)，第2组和第7组接受100mg/kg非洛昔洛韦(p.o.q.d.)，第8组接受西多福韦(20mg/kg，每周3次)。对于所有组，在攻击前1天开始施用药物，并在研究期间按照上述时间表继续。
[0134]
每天记录动物的体重和任何发病迹象。在攻击后第5天，每组(第2组除外)处死5只仓鼠(在实验开始时指定)，并进行大体病理观察。收集血清和肝脏样品，通过tcid50测定确定肝脏中的病毒负荷，并分析血清的转氨酶水平。在攻击后14天处死剩余的10只仓鼠。根据需要处死在第14天之前变得视觉上垂死的仓鼠。除了观察到垂死的仓鼠外，所有损失其原始体重20％以上的仓鼠也被处死。对于在实验结束时处死的仓鼠和那些因为垂死而处死的仓鼠，收集血清和肝脏组织并分组，用于可能确定肝脏中的血清转氨酶水平和病毒负荷。肝组织保存在福尔马林中用于可能的组织病理学检查。
[0135]
表3非洛昔洛韦的治疗窗口研究-感染adv6的雄性动物
[0136][0137][0138]1从研究中去除
[0139]
结果
[0140]
在生命中观察
[0141]
实验中有5例与处理相关的死亡，均在adv6 载体组中(图6a)。10mg/kg或30mg/kg非洛昔洛韦防止死亡(图6a)。最初，感染adv6组中的所有动物都损失了体重；这通过用10mg/kg或30mg/kg非洛昔洛韦处理而逆转(图6b)。adv6 10mg/kg非洛昔洛韦组中动物的体
重增加略低于未感染动物和adv6 30mg/kg非洛昔洛韦组中的动物。较高剂量的非洛昔洛韦，具体是100mg/kg剂量，对感染adv6的动物有毒(未显示)；这些组被从研究中删除。
[0142][0143]
尸检
[0144]
在第5天(d5)处死时，在adv6 60mg/kg和100mg/kg非洛昔洛韦组中观察到动物出现广泛的肾脏病理学。
[0145]
血清转氨酶水平
[0146]
在攻击后第5天，从每组5只动物收集血清并分析转氨酶水平。adv6 载体组中的两只仓鼠具有高转氨酶水平，而经非洛昔洛韦或cdv处理的动物均未有升高的转氨酶水平(图7；示出丙氨酸氨基转移酶[alt])。
[0147]
肝脏中的病毒负荷
[0148]
在攻击后第5天，未经处理的感染adv6的仓鼠在其肝脏中具有高病毒负荷(图8)。用30mg/kg非洛昔洛韦处理将adv6复制抑制到不可检测的水平(图8)。adv6 10mg/kg非洛昔洛韦组中有一只动物具有非常低的肝脏病毒负荷，而我们在该组中任何其他动物的肝脏中均未检测到adv6(图8)。cdv处理将病毒复制降低至非常低的无法量化的水平(图8)。
[0149]
结论
[0150]
两种较低剂量的非洛昔洛韦(10mg/kg和30mg/kg)的数据是有利的。用这两种剂量中的任何一种进行处理都抑制了病毒复制(图8)，减轻了肝脏损伤(图7)，并防止了发病率和死亡率(图6)。10mg/kg非洛昔洛韦剂量的疗效略低于30mg/kg剂量的疗效(参见图6中略微降低的体重增加和图8中略高的肝脏病毒负荷)。60mg/kg和100mg/kg非洛昔洛韦剂量对感染adv6的仓鼠有毒；从研究中去除这两个组和载体 100mg/kg组。
[0151]
实施例6.确定低剂量非洛昔洛韦对免疫抑制的雄性叙利亚仓鼠中静脉内施用的人adv6的治疗疗效
[0152]
接下来，我们评估了低剂量的非洛昔洛韦是否对adv6静脉内(i.v.)感染免疫抑制的叙利亚仓鼠表现出抗腺病毒疗效。测试了三种剂量水平：1、3和10mg/kg p.o.q.d。
[0153]
以140mg/kg的剂量使用腹膜内施用的环磷酰胺(cp)免疫抑制所有仓鼠，然后以100mg/kg的剂量每周两次免疫抑制。将粉末形式的非洛昔洛韦以0.1、0.3和1.0mg/ml的浓度悬浮在0.4％羧甲基纤维素(sigma c5678)中，并超声处理至目测均匀。每周配制一次非洛昔洛韦，等分试样成每日份，并在4℃下储存。在给药前使等分试样平衡至室温。
[0154]
仓鼠被分成7组，15只仓鼠/组(见表4)，如上所述进行免疫抑制，并i.v.注射载体(第1-2组)或4
×
10
10
pfu/kg的adv6(第3-7组)。第1组和第3组接受药物载体(p.o.q.d.)，第2组和第6组接受10mg/kg非洛昔洛韦(p.o.q.d.)，第4组接受3mg/kg非洛昔洛韦(p.o.q.d.)，第5组接受1mg/kg非洛昔洛韦(p.o.q.d.)，第7组接受西多福韦(一剂量37mg/kg，然后每周3次的20mg/kg剂量)。对于所有组，在攻击前1天开始药物施用，并在研究期间按照上述时间表继续施用。
[0155]
表4非洛昔洛韦的预防性剂量递增研究-感染adv6的雄性动物
[0156][0157]
每天监测和记录动物的体重和任何发病迹象。在攻击后第5天，每组处死5只仓鼠(在实验开始时指定)，并进行大体病理学观察。收集血清和肝脏，通过tcid50测定确定肝脏中的病毒负荷，并分析血清的转氨酶水平。在攻击后第14天处死剩余的10只仓鼠。根据需要处死在第14天之前变垂死的仓鼠。除了通过观察判断为垂死的动物外，我们还处死了所有失去其原始体重20％以上的仓鼠。对于所有动物，肝组织保存在福尔马林中用于组织病理学检查。
[0158]
结果
[0159]
在生命中观察
[0160]
本次实验中有14例与处理相关的死亡；adv6 载体组中9个和adv6 1mg/kg非洛昔洛韦治疗组中5个(图9a)。最初，所有感染adv6的仓鼠都体重损失，但用10mg/kg非洛昔洛韦处理完全逆转，用3mg/kg非洛昔洛韦处理部分逆转。1mg/kg非洛昔洛韦不能减轻体重损失(图9b)。西多福韦(cdv)处理完全逆转了体重损失(图9b)。以10mg/kg非洛昔洛韦处理未感染的仓鼠未导致体重损失(图9a)。
[0161]
尸检
[0162]
在第5天处死时，adv6 载体组中的4只仓鼠和adv6 1mg/kg非洛昔洛韦组中的3只仓鼠具有斑驳的肝脏和扩大的胆囊(腺病毒病理学的迹象)。由于垂死而处死动物中也记录
了类似的发现。在第14天处死时没有记录其他重要发现。
[0163]
血清化学
[0164]
如血清转氨酶水平确定的，10mg/kg非洛昔洛韦q.d.剂量可防止adv6诱导的肝脏损伤，而在1mg/kg非洛昔洛韦q.d水平时很大程度上无效(图10，显示alt)。用3mg/kg非洛昔洛韦处理具有中等但明显的效果(p＝0.0419)(图10)。cdv完全阻止了adv6诱导的肝脏病理学(图10)。
[0165]
肝脏中的病毒负荷
[0166]
10mg/kg非洛昔洛韦q.d.剂量抑制肝脏中的adv6复制，而在1mg/kg q.d剂量时无效(图11)。3mg/kg非洛昔洛韦q.d.p.o.剂量将病毒复制抑制到中等水平。cdv完全阻止了肝脏中的adv6复制(图11)。
[0167]
结论
[0168]
数据表明10mg/kg非洛昔洛韦p.o.q.d.剂量可有效的防止由免疫抑制的仓鼠的静脉内感染引起的病理学，其中3mg/kg非洛昔洛韦有中等效果，而1mg/kg非洛昔洛韦是无效的。
[0169]
实施例7.确定免疫抑制的雄性叙利亚仓鼠在adv攻击后用10mg/kg非洛昔洛韦延迟处理的治疗疗效
[0170]
实验设计
[0171]
通过腹膜内施用140mg/kg剂量的环磷酰胺(cp)，然后是100mg/kg剂量每周两次，对60g至80g的雄性叙利亚仓鼠(envigo,hackensack,nj)进行免疫抑制。
[0172]
将粉末形式的非洛昔洛韦以1mg/ml悬浮在0.4％羧甲基纤维素(sigma c5678)中，并超声处理至目测均匀。每周配制一次非洛昔洛韦，等分试样成每日份，并在4℃下储存。在给药前使等分试样平衡至室温。
[0173]
仓鼠被分成8组，每组15只仓鼠(表5)，如上所述进行免疫抑制，然后i.v.注射载体或每kg 4
×
10
10
菌斑形成单位(pfu)的adv6。在adv6注射前一天或adv6注射后1、2、3或4天开始以10mg/kg q.d.p.o.施用非洛昔洛韦。未接受非洛昔洛韦的感染adv6组和仅接受病毒载体和药物载体或病毒载体加药物(在攻击前一天开始)的组用作对照。
[0174]
表5—非洛昔洛韦的治疗窗口研究
[0175][0176][0177]
每天记录仓鼠的体重和任何发病迹象。在攻击后第7天，每组处死5只仓鼠(在实验开始时指定)，并进行大体病理观察。收集血清和肝脏，通过tcid50测定确定肝脏中的病毒负荷，并分析血清的转氨酶水平。在攻击后第14天处死剩余的10只仓鼠。根据需要处死在第14天之前变垂死的仓鼠。除了通过观察确定为垂死的仓鼠外，我们还处死了所有失去其原始体重20％以上的仓鼠。
[0178]
结果
[0179]
在生命中观察
[0180]
本次实验中有14例与处理相关的死亡；adv6 载体组中9个和adv6 1mg/kg非洛昔洛韦组中5个(图12a)。最初，所有感染adv6的仓鼠体重损失，然而，用10mg/kg非洛昔洛韦处理完全逆转，用3mg/kg非洛昔洛韦处理部分逆转。然而，1mg/kg非洛昔洛韦不能减轻体重损
失(图12b)。cdv处理完全逆转了体重损失(图12b)。用10mg/kg非洛昔洛韦处理未感染的动物没有导致体重损失(图12b)。
[0181]
尸检
[0182]
在第5天处死时，adv6 载体组中的4只仓鼠和adv6 1mg/kg非洛昔洛韦组中的3只具有斑驳的肝脏和扩大的胆囊(腺病毒病理学的迹象)。由于垂死而处理的仓鼠中也记录了类似的发现。没有记录其他重要发现。在第14天处死时没有记录明显的发现。
[0183]
血清化学
[0184]
如血清转氨酶水平确定的，10mg/kg q.d.非洛昔洛韦剂量可防止adv6诱导的肝脏损伤，然而，非洛昔洛韦在1mg/kg q.d剂量水平时很大程度上无效(图13，显示alt)。用3mg/kg非洛昔洛韦处理具有中等但明显的效果(p＝0.0419)(图13)。cdv完全阻止了adv6诱导的肝脏病理学(图13)。
[0185]
肝脏中的病毒负荷
[0186]
10mg/kg q.d.非洛昔洛韦剂量抑制肝脏中的adv6复制，而在1mg/kg q.d时无效(图14)。3mg/kg q.d.p.o.非洛昔洛韦剂量将病毒复制抑制到中等水平。cdv完全阻止了肝脏中的adv6复制(图14)。
[0187]
结论
[0188]
数据表明10mg/kg非洛昔洛韦p.o.q.d.剂量可安全和有效地防止感染后多至4天的免疫抑制仓鼠的adv6静脉感染引起的病理。1mg/kg非洛昔洛韦剂量是无效的，而3mg/kg非洛昔洛韦剂量有中等效果。
[0189]
对上述数据的考虑表明，非洛昔洛韦是用于抑制多种腺病毒类型的有效抗病毒剂，从而得出结论，非洛昔洛韦可用作泛腺病毒治疗剂。
[0190]
本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他文件均通过引用以其整体并入。上述实施例仅是说明性的而不是限制性的。鉴于上述公开内容，本领域技术人员对本发明的所公开的方法和的可选实施方式的明显变化将是显而易见的。所有这些明显的变体和替代都被认为在如本文所述的本发明的范围内。