用于治疗与缺氧、低血糖和/或高血糖相关的神经元病理的包括甾醇衍生物的组合物的制作方法

1.本发明涉及与葡萄糖和/或氧剥夺相关的神经元病理领域。更具体地，本发明涉及包括衍生自式(i)的甾醇的化合物或这样的化合物的药学上可接受的盐的组合物，其用于治疗和/或预防由：卒中、颅脑创伤、脑病变、糖尿病相关低血糖、高血糖或尤其由细菌或由病毒感染引起的呼吸问题引起的脑缺血。


背景技术：

2.缺血是向器官的血液供应减少；因此，脑缺血是向至少一部分脑的血液供应减少。因此，缺血引起氧气供应、营养物诸如葡萄糖供应以及因缺氧代谢而产生的有毒分子清除的同时中断。
3.脑缺血尤其涉及卒中，通常称为“脑攻击”和颅脑创伤。
4.卒中是仅次于心血管疾病和癌症的第三最常见死亡率因。然而，它们是严重残疾的最常见原因，并且是整个西方世界痴呆的第二最常见原因。脑的血液灌流中断是卒中的原因。接近85％的卒中本质上是缺血性的，换言之是由血栓阻塞血管引起，从而降低了脑区域的血液灌流。血栓可能在小动脉局部形成，也可能来自心脏或来自颈部大动脉之一的壁的病变。因此，这样的阻塞阻碍了满足中枢神经系统的新陈代谢和能量需求的氧气和代谢物诸如葡萄糖的充足供应，并引起脑缺血。后果更为严重，因为脑无法从有氧代谢转换为无氧代谢以产生所需的能量。因此，脑的某些细胞可能会死亡。
5.卒中的后果取决于许多因素：重新建立血液供应的速度，剥夺氧和/或代谢物诸如葡萄糖的持续时间，和/或卒中的脑位置。根据受影响区的不同，临床表现会导致或多或少的广泛瘫痪、演说或语言损失，或者昏迷，具有使人衰弱的后效风险。
6.另外，尤其是由于细菌或病毒感染引起的呼吸功能不全也可以导致脑缺血。例如，当血管炎症(血管炎)或感染(例如由单纯疱疹病毒)使供应脑的血管变窄时，就会触发缺血性卒中。越来越多的元素也倾向于证明，例如，covid-19对神经系统有负面影响。事实上，各种研究表明，covid-19感染与味觉和嗅觉损失、意识错乱、头痛、头昏甚至卒中、脑病或其他脊髓炎之间存在相关性(ling mao et al.,neurogical manifestations of hospitalized patients with covid-19in wuhan,china:a retrospective case series study and neo poyiadji et al covid-19
–
associated acute hemorrhagic necrotizing encephalopathy:ct and mri,《doi:https://doi.org/10.1101/2020.02.22.20026500》)。事实上，病毒似乎能够经由鼻前庭和嗅球进入神经系统。此外，在肺中大量发现的covid-19受体也在血脑屏障和神经末梢中发现。一旦病毒在神经系统中，它就有可能破坏负责正确呼吸功能的神经元。延髓中存在的自主神经系统神经元的破坏导致和/或恶化患者中的呼吸窘迫。相反，此外由于患有covid-19的患者的急性呼吸症状，血液中的低水平的氧本身可能是神经学问题的原因。由于神经元对氧的缺失非常敏感，血液氧水平的长期且显著降低会损害神经元，最终导致死亡。
7.脑缺血的另一原因也是颅脑创伤，其可能是良性的或严重的，具有所有可能的中间体状态。其严重性取决于脑内病变的存在或脑外血肿的存在，出血位于颅骨和脑之间。颅脑创伤可能伴有挫伤、神经元病变、水肿、脑出血和/或缺血。
8.脑缺血是对受创伤的脑的功能和解剖结果造成影响的主要威胁。它是一种弥漫性或多中心的整体缺血，其影响脑皮层，就像缺氧或心脏骤停一样。缺血影响到所有灰质，即具有最大代谢氧和葡萄糖需求的中枢神经系统的组织的部分。因此，所有脑功能都受到威胁。细胞损失也可能是巨大的，并且由可见的脑萎缩为标志。
9.缺血可以采取另一更局部的形式。位于以挫伤或出血病为焦点的周围的组织的微循环受到血管收缩、组织压迫作用、毛细管微血栓或其他细胞代谢疾患的威胁。由于细胞的氧化新陈代谢已被破坏，它的能量产生受到损害。释放有毒产物诸如自由基。然后，最轻微的呼吸或循环事件会使细胞沉淀至低于生存力阈值。
10.颅脑创伤的后果可以是身体攻击，诸如截瘫、偏瘫、视力问题等。也可能是影响记忆、注意力和沟通能力的神经心理攻击。最后，它们改变了受伤个体的行为和个性，以及所述个体的日常生活，并且还改变了与所述个体关系密切者的日常生活。
11.糖尿病的一些病例呈现低血糖结合缺氧，其后果对受影响患者有害。
12.低血糖是用胰岛素治疗糖尿病患者日常管理中最普遍的临床并发症，并且仍然是糖尿病的血糖管理的限制因素。严重低血糖影响40％的用胰岛素治疗的糖尿病，并可以导致脑病变，尤其是皮质和海马的脆弱神经元。例如，学习和记忆缺乏是由严重低血糖引起的这种海马体神经元病变的直接后果。
13.众所周知，高血糖是揭示糖尿病的症状之一。事实上，糖尿病系统地导致高血糖。另外，也存在与糖尿病无关的高血糖，并且所讨论的事实各不相同；例如，摄入含糖的食物或饮料或药物的副作用。与糖尿病相关或无关的高血糖在神经系统水平上诱导有害作用。
14.此外，糖尿病和高血糖的组合使中枢神经系统受到其他形式的攻击诸如卒中之后的神经元损伤恶化。已经公布了证明高血糖、糖尿病和神经元损伤之间关系的几项研究，尤其是yazi li et al.("autophagy impairment mediated by s-nitrosation of atg4b leads to neurotoxicity in response to hyperglycemia",《doi:https://doi.org/10.1080/15548627.2017.1320467》)，ruchi sharma et al.("hyperglycemia induces oxidative stress and impairs axonal transport rates in mice",published october 18,2010)和wenjuan zhou et al.("tigar attenuates high glucose-induced neuronal apoptosis via an autophagy pathway",《doi:https://doi.org/10.3389/fnmol.2019.00193》)。
15.目前，为治疗卒中而开发的技术是非常快速的干预，在卒中后4小时至5小时内，经由重组组织纤溶酶原激活物、rtpa来化学地消除血栓，或通过血栓切除术机械地清除血栓以允许再灌注。然而，面对卒中的这两种干预途径并没有表现出最佳疗效，并且受到相当严格的患者纳入标准的影响。
16.包括在药学上可接受的载体中的至少一种式(i)的化合物的组合物，用于预防受试者的听力损失或用于获得在治疗前具有听功能降低的治疗的受试者的听力的至少部分恢复，其从文件wo 2016/016518 a2中得知。
17.灵芝总甾醇(gs)及其主要组分(gs1)对暴露于缺氧/再氧合的大鼠皮层神经元培
养物的作用也从以下文件中得知：zhao h-b et al.("ganoderma total sterol(gs)and gs1 protect rat cerebral cortical neurons from hypoxia/reoxygenation injury",《doi:https://doi.org/10.1016/j.lfs.2004.08.013》)。
18.从以下文件中进一步得知通过靶向胆固醇内稳态来对抗听力损失的方法：brigitte malgrange et al.("targeting cholesterol homeostasis to fight hearing loss:a new perspective",《doi:10.3389/fnagi.2015.00003》)。另外，指示了胆固醇及其代谢物的作用尚不明确。
19.上述三份文件既未公开也未建议包括至少一种式(i)的化合物的组合物用于治疗受试者的神经元病理的用途，所述神经元病理与影响中枢神经系统细胞的缺氧和/或低血糖相关。
20.因此，需要开发化合物，使其能够治疗已经经受由例如脑缺血、低血糖或缺氧引起的氧和/或葡萄糖剥夺的患者成为可能。


技术实现要素：

21.形成本发明基础的一个想法是提供用于治疗影响尤其涉及缺氧、低血糖和/或高血糖的中枢神经系统的神经元的神经学疾病的预防性和/或治疗性组合物。
22.为此，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括至少一种式(i)的化合物和/或至少一种式(i)的化合物的至少一种药学上可接受的盐：
[0023][0024]
式，其中
[0025]
r1＝oh、f、oc
nh2n 1
、r-coo、r-ocoo、rhn-coo或opo(or)2，以及r＝h或c
nh2n 1
，以及n≤16；
[0026]
r2＝h或oh；
[0027]
r3＝
–
nr5r6，
[0028]
r5为h或
–
(ch2)3nh2，以及
[0029]
r6选自由以下组成的组：
–
(ch2)3nh(ch2)4nhr7；
–
(ch2)4nh(ch2)3nhr7；
–
(ch2)3nh(ch2)4nh(ch2)3nhr7；
–
(ch2)3nhr7；
–
(ch2)4nhr7，其中r7＝h或coch3；-(ch2)
2-吲哚-4-基；
–
(ch2)
2-吲哚-3-基；并且
[0030]
在位置20、22、24、25、26或27处，r4＝h或oh，被定位成使得产生构型r或s的不对称
中心；
[0031]
z1和z2各自代表碳原子c7和c8以及c22和c23之间的双键数目(0或1)；t1、t2和t3＝h或ch3彼此独立；t4＝h、ch3、c2h5，被定位成使得在位置24处获得构型r或s的不对称中心；
[0032]
其用于治疗受试者的神经元病理的用途，所述神经病理与影响所述中枢神经系统细胞的缺氧和/或低血糖相关。
[0033]
式(i)的化合物，并且被限定为：z1＝z2＝0；r1＝r2＝oh；r4＝h；r5＝h；r6＝
–
(ch2)
3-ncooc(ch3)
3-(ch2)
4-nhcooc(ch3)3；t1＝t2＝t3＝t4＝h，称为dx243boc，在表1中所示。
[0034]
cooc(ch3)3取代基也称为叔丁氧基羰基或boc官能团。
[0035]
式(i)的化合物属于甾体族。因此式(i)的化合物的碳原子的数目遵循由iupac在以下中定义的命名法：pure&appl.chem.,vol.61,no.10,pp.1783-1822,1989。根据iupac，属于甾体族的化合物的碳原子数目如下所示：
[0036]
用于制备式(i)的化合物的方法已经预先描述，并且尤其是在以下中描述:de medina,p.et al.,synthesis of new alkylaminooxysterols with potent cell differentiating activities:identification of leads for the treatment of cancer and neurodegenerative diseases.journal of medicinal chemistry,52(23),2009,pp.7765-7777。
[0037]
另外，该组合物可以具有一种或多种以下特征，独立或组合考虑。
[0038]
根据一种实施方式，所述式(i)的化合物限定为z2＝0；r1＝r4＝h；r2＝oh；r5＝h；以及t1＝t2＝t3＝t4＝h。
[0039]
根据一种实施方式，式(i)的化合物限定为z1＝0和r5＝h。
[0040]
根据一种实施方式，式(i)的化合物限定为r6＝-(ch2)4nh(ch2)3nhr7以及r7＝coch3。
[0041]
根据一种实施方式，式(i)的化合物限定为r6＝
–
(ch2)
2-咪唑-4-基。
[0042]
根据一种实施方式，式(i)的化合物限定为r6＝-(ch2)3nh(ch2)4nhr7、
–
(ch2)4nh(ch2)3nhr7、
–
(ch2)3nh(ch2)4nh(ch2)3nhr7；或
–
(ch2)4nhr7；以及r7＝h。
[0043]
根据一种实施方式，式(i)的化合物限定为z1＝1和r5＝h。
[0044]
根据一种实施方式，式(i)的化合物限定为：
[0045]
r1＝f、oc
nh2n 1
、r-coo、r-ocoo、rhn-coo或opo(or)2，其中
[0046]
r＝h或c
nh2n 1
，以及n≤16；
[0047]
r2＝oh；
[0048]
r5＝h；
[0049]
r6＝
–
(ch2)4nh(ch2)3nhr7、
–
(ch2)3nh(ch2)4nhr7、
–
(ch2)3nh(ch2)4nh(ch2)3nhr7；
–
(ch2)4nhr7；
[0050]
z1＝0或z1＝1；
[0051]
z2＝0。
[0052]
根据一种实施方式，式(i)的化合物限定为r6＝-(ch2)3nh(ch2)4nhr7；
–
(ch2)4nh(ch2)3nhr7；或
–
(ch2)3nh(ch2)4nh(ch2)3nhr7；以及r7＝h。
[0053]
根据一种实施方式，至少一种式(i)的化合物限定为z1＝z2＝0；r1＝r4＝h；r2＝oh；r5＝h；r6＝(ch2)3nh(ch2)4nh2；t1＝t2＝t3＝t4＝h。在这种实施方式中，所述化合物称为dx243。用这种化合物获得的结果是特别有利的。实际上，在非常低的浓度下观察到这种化合物对缺氧、低血糖和/或高血糖的病理生理现象的疗效。
[0054]
根据一种实施方式，至少一种式(i)的化合物限定为z1＝z2＝0；r1＝r4＝h；r2＝oh；r5＝h；r6＝(ch2)4nh(ch2)3nh2；t1＝t2＝t3＝t4＝h。在这种实施方式中，所述化合物称为dx245。用这种化合物获得的结果是特别有利的。实际上，观察到这种化合物对缺氧、低血糖和/或高血糖的病理生理现象的疗效比dx243更高。
[0055]
根据一种实施方式，至少一种式(i)的化合物限定为z1＝1；z2＝0；r1＝r4＝h；r2＝oh；r5＝h；r6＝(ch2)3nh(ch2)4nh2；t1＝t2＝t3＝t4＝h。在这种实施方式中，所述化合物称为dx242。用这种化合物获得的结果是特别有利的。实际上，观察到这种化合物对缺氧、低血糖和/或高血糖的病理生理现象的疗效比dx243更高。
[0056]
根据一种实施方式，至少一种式(i)的化合物限定为z1＝1；z2＝0；r1＝r4＝h；r2＝oh；r5＝h；r6＝(ch2)4nh(ch2)3nh2；t1＝t2＝t3＝t4＝h。在这种实施方式中，所述化合物称为dx244。用这种化合物获得的结果是特别有利的。实际上，观察到这种化合物对缺氧、低血糖和/或高血糖的病理生理现象的疗效比dx243更高。
[0057]
根据一种实施方式，中枢神经系统的神经元病理取自由脑创伤和卒中组成的组。
[0058]
根据一种实施方式，中枢神经系统的神经元病理是由于缺血引起的脑病变。
[0059]
根据一种实施方式，中枢神经系统的神经元病理是由于呼吸功能不全引起的脑病变。术语“呼吸功能不全”旨在意指阻塞性呼吸功能不全和限制性呼吸功能不全。所述呼吸功能不全可以源自例如细菌或病毒来源的肺部感染，例如在冠状病毒感染之后。
[0060]
根据一种实施方式，低血糖是由于糖尿病引起的。
[0061]
根据一种实施方式，高血糖是由于糖尿病引起的。
[0062]
根据一种实施方式，本发明还提供了一种组合物，所述组合物用于治疗受试者的神经元病理，所述神经元病理与影响中枢神经系统细胞的缺氧、低血糖和/或高血糖相关，所述组合物是水性溶液的形式并且具有的式(i)化合物的浓度：在1pmol.l-1
至1mmol.l-1
之间、优选10pmol.l-1
至0,1mmol.l-1
之间、更优选0,1nmol.l-1
至1μmol.l-1
之间。例如，式(i)的化合物的浓度在1nmol.l-1
至150nmol.l-1
之间。
附图说明
[0063]
在对本发明的若干个特定实施方式的以下描述中，将更清楚地理解本发明，并将更清楚地显示其他目的、细节、特征和优点，仅借助于不限制说明的方式给出，并参考附图。
[0064]
[图1]图1示意性地呈现了用于研究式(i)的化合物，尤其是dx243对缺血体外模型
的功效的方案。
[0065]
[图2]图2图示了在dx243存在下缺血/再灌注体外模型中为了评价神经元存活率的免疫细胞化学测试的结果。
[0066]
[图3]图3图示了在dx243存在下缺血/再灌注体外模型中mtt神经元存活率评价测试的结果。
[0067]
[图4]图4图示了在dx243存在下缺血/再灌注体外模型中，经由锥虫蓝评价神经元存活率的测试结果。
[0068]
[图5]图5图示了在表1的式(i)的化合物(dx243除外)的存在下缺血/再灌注体外模型中，经由锥虫蓝评价神经元存活率的测试结果。
[0069]
[图6]图6图示了在表1化合物的存在下缺血/再灌注体外模型中mtt神经元存活率评价测试的结果。
[0070]
[图7]图7图示了在表1的式(i)化合物的存在下缺血/再灌注体外模型中，经由锥虫蓝评价神经元存活率的第二个测试的结果。
[0071]
[图8]图8图示了小鼠中体内卒中测试的结果，以评价已经经历的卒中后随后用dx243治疗再灌注后的神经元存活率。
[0072]
[图9]图9是图示小鼠中体内卒中测试结果的一组图表，以评价已经经历的卒中后随后用dx243治疗再灌注后的神经元存活率。
[0073]
在图2至4、6和7中，星号指示结果的统计功效。一颗星指示95％确信结果不是随机的。2颗星号的存在意指99％确信结果不是随机的，以及3颗星号的存在指示99.9％确信结果不是随机的。
具体实施方式
[0074]
下面将描述证明表1中指示的式(i)的化合物(包括化合物dx243)针对缺氧和低血糖的保护作用的几个实验方案。
[0075]
化合物的浓度或摩尔浓度，以摩尔每升表示，其符号为mol.l-1
或m。
[0076]
实施例1：获得皮层神经元
[0077]
参考图1，用于研究式(i)的化合物，尤其是表1中指示的化合物的神经保护作用的方案的第一步骤在于获得被置于适当培养条件下，取自野生型小鼠胚胎脑的细胞的皮层神经元的原代培养物(步骤1)。更具体地说，将采集的细胞在已添加l-谷氨酰胺和b27补充剂50x(参考17504044thermofisher scientific)的neurobasal
tm
培养基(参考21103049thermofisher scientific)中生长(步骤2)。然后分离和纯化来自原代培养物的神经元。应当注意，正是培养条件本身使得有可能从胚胎皮层的解离中获得纯化的神经元培养物。然后对这些神经元进行氧和葡萄糖剥夺(ogd)(步骤3)，以尽可能接近地模拟卒中期间体内发生的情况，换言之由于对于细胞中的血液灌注减少引起的氧和葡萄糖供应减少。为了进行模拟缺血的这种氧和葡萄糖剥夺，将神经元置于以下的培养箱中培养4h：该培养箱的气氛具有大约1％的氧含量，并且其中用无葡萄糖培养基代替培养基(步骤3)。由于缺血模型是“缺血/再灌注”模型，因此然后将神经元在缺血步骤后，在常氧条件下置于包含葡萄糖的培养基中持续培养24h(步骤4)。神经元组a是在ogd和再灌注期间已经用式(i)的化合物的溶液处理的神经元组，换言之在开始氧和葡萄糖剥夺(步骤3)时立即将表1的分子
添加至无葡萄糖培养基中。称为dx243的式(i)的化合物在无葡萄糖培养基中的浓度为1nmol.l-1
至1μmol.l-1
之间。表1中其他分子在无葡萄糖培养基中的浓度为100nmol.l-1
。神经元组b是仅在再灌注期间(步骤4)已经用dx243溶液治疗的神经元组，以接近临床发生的情况，即仅在常规治疗数小时后才进行可能的治疗。将dx243溶液在再灌注开始(步骤4)时立即添加至无葡萄糖培养基中。dx243浓度在无葡萄糖培养基中的浓度在1nmol.l-1
至1μmol.l-1
之间。
[0078]
阴性对照由以下的组组成：神经元经历ogd(步骤3)，随后再灌注(步骤4)而不存在dx243。此组神经元在图2中称为“对照”。正常对照由以下的组组成：来自原代培养物的神经元置于常氧条件下28h。正常对照在图2至图4中称为“常氧(normox)”。阳性对照由以下的组组成：来自原代培养物的神经元，在roscovitine(一种细胞周期抑制剂)存在下已经经历ogd持续4h(步骤3)，导致神经元保护，随后再灌注24h(步骤4)。阳性对照在图2至4中称为“rosco”。
[0079]
在ogd后的24小时再灌注(步骤4)结束时，借助于以下三种不同的测试来评价神经元的存活率：免疫细胞化学测试5、mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)测试6以及经由使用锥虫蓝基于细胞膜完整性的测试7。然后将结果与三个对照组存活率测试的结果进行比较。
[0080]
实施例2：在使用dx243的情况下神经元存活率的免疫细胞化学测试
[0081]
图2呈现了在使用dx243的情况下第一个神经元存活率测试的结果。图表a和c是组a获得的结果的表示；y轴代表相对于常氧组的活细胞比例。图表b和d是组b获得的结果的表示；y轴代表相对于常氧组经历凋亡的细胞的比例。第一个测试是免疫细胞化学测试，其使得证明活细胞和死细胞成为可能。
[0082]
第一系列图像是用荧光的化学标记获取的。这种标记是用dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行的，它能够与dna的腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)碱基强烈结合。它使得检测活细胞成为可能。第二系列图像是使用cc3抗体通过荧光标记获取的。cc3抗体使得检测活化的胱天蛋白酶3成为可能，并因此检测处于凋亡状态的细胞。
[0083]
为了可视化各种培养条件中健康神经元的比例，使用了tuj1抗体。tuj1与β-微管蛋白iii(一种结构蛋白)发生反应，微管蛋白由该结构蛋白制成，并且对神经元具有特异性。β-微管蛋白iii被广泛用作区分神经元与其他细胞类型的标志物。
[0084]
基于这些图像，通过确定活细胞数量与细胞总数目的比例来计算活细胞的比例(细胞存活率)。使用由cc3抗体检测到的细胞数目与细胞总数目的比率来确定经历凋亡的细胞的比例。获得的值与常氧组获得的值相关。
[0085]
在图2的图表a和b上观察到ogd诱导对照组中的活细胞比例降低，并且在图2的图表c和d的对照组中经历凋亡的细胞比例增加。另一方面，在ogd和再灌注期间用dx243治疗以及仅在再灌注期间用dx243治疗两者都部分保护神经元免受死亡。事实上，与对照组相比，在用dx243治疗后，观察到活细胞比例增加和经历凋亡的细胞比例减少。1nmol.l-1
至100nmol.l-1
之间的dx243浓度对应于最大化神经保护作用的理想浓度范围。
[0086]
此外，在ogd后用dx243治疗24h似乎甚至更有效地保护神经元。
[0087]
实施例3：在使用dx243的情况下mtt神经元存活率评价测试
[0088]
为了证实用dx243获得的结果，进行了基于神经元的代谢活性的测试，以便以另一
途径评价神经元存活率。此测试基于四唑盐mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯溴化四氮唑)的使用。四氮唑被活性活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为甲臜(一种紫色沉淀物)。形成沉淀物的量与活细胞的量成比例，但也与每个细胞的代谢活性成比例。因此，通过光谱术在550nm处的光密度的简单测定，使得确定活细胞和代谢活性细胞的相对数量成为可能。由于活细胞数目越多，比色强度越大，因此比色强度也随之量化，并与在常氧条件下观察到的强度相关联。获得以下结果：对于组a，在图3的图表a中报告，以及对于组b，在图3的图表b中报告。
[0089]
在图3的图表a和b中，可以观察到ogd导致对照组中代谢活性细胞显著减少。另一方面，在ogd后用dx243治疗神经元，部分保护神经元免受存活率的下降。如图3的组b示出，仅在再灌注24h期间已经受益于dx243的神经元组的这一作用是最为明显的。在这两张图表上，包括10nmol.l-1
至100nmol.l-1
之间的浓度的治疗似乎是最有效的。
[0090]
实施例4：在使用dx243的情况下经由锥虫蓝评价神经元存活率的测试
[0091]
在使用dx243的情况下，进行了基于细胞膜完整性的第三个细胞存活率测试，该细胞膜完整性在死细胞中是破裂的。后者的测试使用将死细胞染成蓝色的锥虫蓝。因此，通过计算蓝色和非蓝色细胞的比例来进行活细胞百分比的计算，并与在常氧组中观察到的活细胞百分比相关联。获得以下结果：对于组a，在图4的图表a中报告，以及对于组b，在图4的图表b中报告。
[0092]
观察到，无论是图4的图表a还是图4的图表b，ogd都会诱导保留细胞膜完整性的细胞数目的显著减少。用dx243治疗神经元，使活细胞百分比恢复到的水平与在常氧组中观察到的水平接近，主要用在1nmol.l-1
至100nmol.l-1
之间的浓度。
[0093]
因此，dx243在1nmol.l-1
至1μmol.l-1
之间的浓度下是有效的。对于10nmol.l-1
至100nmol.l-1
之间的的dx243浓度，结果更稳定，并且dx243的保护作用在统计学上更大。这可以用原代培养物在其自然环境之外的脆弱性解释。
[0094]
实施例5：在使用表1的分子的情况下经由锥虫蓝的神经元存活率评价测试
[0095]
对于表i中除组a中使用的dx243外的所有分子，进行第三个细胞存活率测试。获得的结果报告在图5的图表中，其中包括用dx243获得的结果。符号nt意指未处理。非阴影线条nt对应于源自原代培养物的神经元的组，在常氧条件下放置28h。阴影线条代表一组源自已经经历ogd和再灌注的原代培养物的神经元组，或是未使用表1的分子(阴影线条称为nt)，或是存在表1的分子。通过计算蓝色和非蓝色细胞的比例来进行活细胞百分比的计算，并与在常氧条件下nt组(换言之没有经历ogd的nt组(未呈现))中观察到的活细胞百分比相关联。
[0096]
除dx243boc外，所有测试的化合物，神经元组存活率均比已经经历ogd和再灌注的nt神经元组(阴影线条nt)更高；因此，它们因此表现出神经保护作用。尤其，应当注意，dx245、dx244和dx242具有的存活率比dx243具有的存活率更高。
[0097]
就其本身而言，用dx243boc治疗组的存活率比用dx243治疗组和已经经历ogd和再灌注的nt组的存活率更低，因此证明r3基团在式(i)的化合物活性中的重要性。
[0098]
实施例6：在使用表1的分子的情况下mtt神经元存活率评价测试
[0099]
在图6的图表中，进行了与图3图表a类似的测试，换言之mtt测试，以评价在已经经历ogd的4h时期处理并且然后再灌注24h后分子的神经保护作用。该测试还基于获得上文给
出的实施例1的皮层神经元的方案。与图3a的实施例不同，用地佐环平(mk801)阳性对照代替roscovitine阳性对照。这种阳性对照还由以下的组组成：源自原代培养物的神经元，在地佐环平存在下已经经历ogd持续4h，随后再灌注24h。阳性对照在图6和7中称为“mk801”。图6和7的y轴图示了处理的活细胞相对于常氧条件下的活细胞的比率(作为百分比)，因为常氧条件下的活细胞的比率等于100％故未在图表中呈现。mk801是非竞争性n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂，并且已知具有神经保护作用。测试表1中的所有化合物。在图6中，用100nm的dx243和dx245治疗，观察到显著的神经元保护。该测试观察了dx101、dx242、dx244、dx301、dx302、dx401、dx249的神经保护作用。
[0100]
对于该实施例中测试的所有化合物，神经元组的存活率比nt神经元组的存活率更高；它们因此表现出神经保护作用。
[0101]
实施例7：在使用表1的分子的情况下经由锥虫蓝的神经元存活率评价测试
[0102]
对表1的各种化合物进行进一步的细胞存活率测试，并且结果在图7中呈现。该测试类似于图4中进行的测试。它是基于细胞膜的完整性，其在死细胞中是破裂的。该测试使用将死细胞染成蓝色的锥虫蓝。它以类似于图4a中的测试的方式，换言之基于上文给出的实施例1的用于获得皮层神经元的方案来进行。与图4a的实施例不同，用地佐环平(mk801)阳性对照代替roscovitine阳性对照。该测试的目的是评价该分子在已经经历ogd的4h时期的处理并且然后再灌注24h之后(换言之总计28h的实验)的神经保护作用。测试表1中的所有化合物若干次。另外，以图7指示的各种量测试dx243和dx245。
[0103]
在此实验结束时，用以100nmd的dx245和1至100nm浓度范围的dx243处理，观察到显著的神经保护。用10nm的dx245、1000nm的dx245、1000nm的dx243、dx242和244的测试，也观察到了神经保护作用。
[0104]
因此，预计在包括式(i)的化合物的药学上可接受的水性溶液中，以下的式(i)的化合物的浓度将有效：10nmol.l-1
至1mmol.l-1
之间、优选10nmol.l-1
至1μmol.l-1
之间、更优选10nmol.l-1
至100nmol.l-1
之间。
[0105]
实施例8：体内鼠模型中神经保护作用的研究
[0106]
在体内进行了一项研究，以证明dx243分子在图8中所示的称为大脑中动脉闭塞(mcao)的卒中雄性小鼠模型中的神经保护作用，所述雄性小鼠体重大约20.5克(g)至22g。这种体内模型通常用于研究分子对卒中的作用，该模型由以下组成：在前扣带回皮层(acc)中放置导管，在颈动脉(cca)水平处插入细丝，并将细丝推进穿过颈总动脉，通过颈内动脉(ica)直至大脑中动脉(mca)，导致由该动脉灌流的该大脑区8中血流量显著减少(》80％)(estelle rousselet et al.,mod
è
le murin d'mcao intraluminale:infarctus c
éré
bral par coloration au violet de cr
é
syl[murine model of intraluminal mcao:evaluation of cerebral infarction by cresyl violet staining],journal of visualized experiments and carl zeiss)。1h的时间段后，取下细丝，使得以允许再灌注和添加dx243治疗。注射的dx243在水性溶液中稀释，并且浓度为50mg/kg。
[0107]
无论所述后果是组织后果(以红色标记活组织的氯化三苯基四氮唑(ttc))还是行为后果(神经评分(neuroscore))，在插入细丝直至大脑中动脉后24h观察到这些后果。神经评分是对小鼠神经学上缺陷的评价，允许评价mcao的成功与否。使用的级别包括5个分数：
[0108]
0：正常状态
[0109]
1：有或没有不一致旋转的轻微环绕行为，当它被尾部控制时，《50％的尝试朝向对侧的旋转。
[0110]
2：轻微且恒定的回转，》50％的尝试朝向对侧旋转。
[0111]
3：进行规律、有力的、即时的转圈，小鼠保持旋转的姿势大于1至2秒以上，它的鼻子几乎触及到它的尾巴。
[0112]
4：严重旋转向滚动过度方面发展，损失行走反射或站立反射。
[0113]
5：昏迷或濒死的。
[0114]
dx243神经保护作用的体内结果在图8和9中呈现。图8(a)中观察到ttc染色的两张图像，示出死亡组织的白色区域，并且表示用dx243治疗小鼠中的梗塞区域的减少。图9中的图表b表示治疗或未治疗(对照)小鼠之间梗塞区域百分比的减少；沿y轴指示的是梗塞区域相对于小鼠脑的总大小的百分比。图表c图示了治疗小鼠中的行为改进(神经评分)。图表d呈现了用dx243治疗的小鼠中死亡小鼠的百分比的减少。图表e和f呈现了dx243治疗后血流量减少与组织学和行为后果之间的相关性消失。通过激光多普勒血流仪(ldf)测量血流量的减少。图9中已经证明，用dx243治疗使得其在24h内改进小鼠卒中的后果成为可能。实际上，在用dx243治疗小鼠的组中，图d中可见死亡小鼠的百分比的减少。图b同样图示了病变(梗塞区域)的大小的减少，以及图c图示了活体小鼠行为缺陷(神经评分)的减少。另外，经由激光多普勒观察到，其结果呈现在图e和f中，血流量减少越多，缺陷越显著。另一方面，在治疗的小鼠中，血流量减少与卒中后果之间似乎没有任何相关性。这些体内结果证明根据本发明的分子的观察到的神经保护作用。
[0115]
所有这些结果指示，表1中的化合物dx101、dx243、dx242、dx245、dx244、dx249、dx301、dx302和dx401针对脑缺血并且因此针对与缺氧、低血糖和/或高血糖相关的神经元病理诸如脑创伤和卒中具有神经保护作用。
[0116]
虽然是用十种不同的式(i)的化合物进行的本实验，但很明显，除了表1中的化合物外，对于式(i)的化合物，预计会有类似的结果。
[0117]
另外，在单纯缺氧或单纯低血糖的情况下，观察到凋亡的神经元死亡组分，如在以下中所述：在kato,et al.("recurrent short-term hypoglycemia and hyperglycemia induce apoptosis and oxidative stress via the er stress response in immortalized adult mouse schwann(inms32)cells".neuroscience research,13november 2018中，其来源于《https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0168010218304371？via％3dihub》《doi:https://doi.org/10.1016/j.neures.2018.11.004》)，在sendoel a.,et al.("apoptotic cell death under hypoxia".physiology,29,pp.168-176,2014)中，或者在xu,y.et al.("protective effect of lithium chloride against hypoglycemia-induced apoptosis in neuronal pc12 cell".neuroscience,330,25august 2016,pp.100-108)中。因此，上文在缺血/再灌注模型中观察到的结果示出，由于式(i)的化合物面对这种凋亡组分具有保护。此外，低血糖能够在神经元细胞中诱导氧化应激，这种氧化应激存在于氧和葡萄糖剥夺的情况下，并且是诱导神经元死亡的主要组分。因此，诱导神经元死亡的共同机制存在于由低血糖和缺氧、单独由低血糖和单独由缺氧诱导的神经元死亡诸如凋亡的情况中。总之，根据本发明的
式(i)的化合物的神经保护作用延伸至单独缺氧或单独低血糖的情况。
[0118]
动词“包含(contain)”、“包括(comprise)”或“包括(include)”及其成对形式的使用并不排除除权利要求中所述以外的元素或步骤的存在。
[0119]
在权利要求中，括号之间的任何参考符号都不能解释为对权利要求的限制。
[0120]
表1：
[0121]