用于促进头发生长的水飞蓟瘦果提取物的制作方法

1.本发明涉及水飞蓟(silybum marianum(l.)gaertn.)瘦果(akenes)提取物以及含有该提取物的组合物在美容和皮肤病学领域中促进头发生长的应用。


背景技术：

2.头发护理(不仅是美容用途也是为了防止脱发以及使头发再生)一直激励着人们的研究精神。许多理论都试图阐明秃顶、脱发、秃斑等情况下脱发的病因学，将其归结为颅内组织张力增加、血液供应减少或某些内分泌或神经疾病。
3.头发毛囊是固定在皮肤中直至皮下组织的微型器官，其主要作用是生产毛干。头发毛囊的分布是在子宫内生长过程中建立的，并且其数量是由遗传决定的。头发毛囊是在组织生长和重塑周期过程中产生头发的动态结构。这个周期可以分为三个期：
[0004]-生长期(生长期(anag
è
ne))，毛乳头(papille dermique)细胞(成纤维细胞)向毛球(bulbe)的干细胞传递信号，使其增殖。细胞将转化并包覆毛乳头以形成头发的硫基质。它们分裂并分化成负责头发结构的毛囊角质细胞。为了使头发结构良好，这些角质细胞需要硫蛋白、维生素b6和各种矿物质，如锌和镁。这个期的持续时间决定了头发的长度，并取决于毛囊底部基质的细胞的增殖和分化。
[0005]-退化期(退化期(catag
è
ne))，基质死亡，并且因此毛乳头不再接触到该基质。细胞之间不再有交流。毛囊和毛乳头向上移动到表皮。
[0006]-休止期(静止期(t
é
log
è
ne))，毛乳头和毛球的细胞完好无损但无活性。头发脱落。为了长出新头发，必须重新开始该周期。
[0007]
因此，头发不断地更新，在头部头发的100,000至150,000根头发中，大部分处于生长期。对于健康的头发而言，正常和生理性脱发的范围是每天60至100根。超过此数，无论脱落是偶发的还是既定的，都认为脱发是病理性的。
[0008]
术语脱发症(alop
é
cie)是指头部部分或普遍缺乏头发的情况。脱发(effluvium)是指过量的头发脱落。
[0009]
许多因素可能与脱发症有关，例如，如遗传因素、年龄、性别、疾病、压力、激素问题、药物的副作用、疤痕。可以区分几种形式的脱发症：
[0010]-遗传性雄性激素性脱发症，最常见；过早脱发发生在有遗传因素的受试者中，并且特别影响男性。它表现为发量减少，甚至秃顶，影响50％的50岁以上的男性。
[0011]-绝经后脱发症是女性秃顶的最常见原因。与男性相比，女性脱发更为弥散和广泛。弥漫性女性脱发症是一种常常在更年期开始的疾病，影响到大约40％的70岁以上妇女。术语弥漫性说明脱发均匀地影响到整个头皮，与男性不同。
[0012]-急性或反应性脱发症，其可能与药物治疗(包括癌症治疗)、压力、分娩、严重的饮食缺乏、缺铁、激素紊乱有关，这是一种同时发生的和弥漫性的大量脱发。
[0013]-瘢痕性脱发症，可能由皮肤问题(肿瘤、烧伤、秃斑)、急性辐射、红斑狼疮或寄生虫(癣菌病、苔藓病)引起。
[0014]-斑形脱发症(alop
é
cia areata)，似乎是由自身免疫引起的，其特点涉及在一个或多个地方出现或多或少的大斑块。
[0015]-先天性脱发症，很少见，其对应没有发根或头发异常(突变)。
[0016]
术语脱发症还涵盖全部类型的头发毛囊损伤，其最终后果是永久性、部分的或一般性脱发。
[0017]
我们可以区分弥漫性脱发和局部脱发。
[0018]
弥漫性脱发：普通脱发症，休止期脱发，生长期脱发，秃斑。在弥漫性脱发中，最常见的是普通脱发症(男性和女性雄激素性脱发症)和休止期脱发(高烧、怀孕、服药或严重饮食缺乏后)。
[0019]
局部脱发：雄激素性脱发症，秃斑，瘢痕性脱发症，肿瘤。在男性雄激素性脱发症(鬓角、全秃)、秃斑、拉拽引起的脱发症(拔毛癖、编发和拉直)或瘢痕性脱发症(中央集中(centrifuge)瘢痕性脱发症、绝经后前额纤维化脱发症)的情况下观察到局部脱发。我们还可以列举炎症性瘢痕性脱发症，特别是毛囊炎，其中有剥脱性毛囊炎(folliculite diss
é
quante)和脱发性毛囊炎(folliculite d
é
calvante)。肿瘤和皮肤生长也伴有局部脱发(皮脂腺错构瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌)。
[0020]
脱发症本质上与头发更新中断有关，这最初导致周期频率加快，代价先是头发的质量，然后是头发的数量。最常见的现象是与细胞增殖停止相关的生长期(生长期)的持续时间减少。结果是过早地诱导了退化期，导致大量的头发毛囊处于静止期从而导致更多脱发。因此为了对抗脱发症，有必要重启头发周期，例如通过激活生长期。
[0021]
迄今为止，已经推出多种产品来对抗脱发，特别是用于诱导或刺激头发生长。大多数产品组合可对脱发涉及的生物参数产生有益作用的几种活性成分。在最常见的活性成分中，我们可以举例列举：维生素，如维生素a、e、b5、b6、c、h和pp；微量元素，如锌、铜、镁、硅；蛋白质衍生物，例如肽、含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸或衍生物类型)；亲脂性或亲水性的植物源的精油或提取物，该清单并未穷举；抗真菌剂，例如吡罗克酮醇胺、十一碳烯衍生物、环丙唑胺；合成化学分子，已知其特异性作用于雄激素受体或5-α还原酶活性上。米诺地尔或2,4-二氨基-6-哌啶基嘧啶3-氧化物现在是治疗雄激素性脱发的标准。虽然对其作用机制提出许多理论，但仍不清楚。此外，其疗效仍然是有限的，因为虽然在许多临床病例中脱发得到稳定，但是我们看到一旦停止治疗，脱发过程就重新开始。其限制在每日使用，可能导致在长期使用的患者中观察到不想要的副作用，例如局部的皮肤反应或全身作用。此外，在头发再生方面建议包含非常多活性剂的组合物，这些活性剂可能是2,4-二氨基嘧啶3-氧化物的衍生物，如专利申请ep0522964中描述的那些。临床研究表明，pgf2α类似物具有诱导人和动物毛发和睫毛生长的特性(johnstone，am j opht，124(4)，544
–
547，1997)。在人类中，头皮上的测试表明前列腺素e2类似物(维前列醇(viprostol))具有增加头发密度的特性。申请wo98/33497描述了用于促进头发生长的含有前列腺素或前列腺素衍生物的药物组合物。
[0022]
因此，尽管目前有许多选择，消费者仍然需要新产品来促进头发再生，这些产品既天然又环境友好，同时与活性化合物一样有效。
[0023]
研究头发周期生物学的最新进展涉及早期和晚期干细胞(mesler等人，cell reports 19，809
–
821,2017)。此外，这些早期干细胞与子代细胞一样产生具有防脱发的基
本功能特性的某些角蛋白。在这些角蛋白中，k75最先产生，并且其在人类中的遗传缺陷会导致病理性脱发。该蛋白质是形成毛囊根部内鞘的伴生层的细胞的特征(gu和coulombe j invest dermatol，2007，127(5)：1061-73)。在sperling等人(j cutan pathol 2010，37：243
–
248)描述的研究中，表明在毛囊根部内鞘的早期剥离过程中，k75的表达大幅减少。由于这种剥离是脱发症的组织学标志物，因此发现这种k75蛋白无疑在脱发症机制中起关键作用。
[0024]
科学名称水飞蓟(silybum marianum(l.)gaertn.)指一年生或二年生的菊科植物，茎粗壮，高度可超过一米。它大而有光泽的互生叶没有托叶，呈白色斑驳状，边缘有坚硬的尖刺。花集中在端部的头状花序中，通常是单生的。花被大而带刺且末端非常锋利的苞片包围。花是管状的、五裂的、呈略带紫色-深红色。果实是有光泽的瘦果，黑色或黄色斑纹的，顶部有冠，底部有环形的细齿状刷毛。这种植物的俗名是奶蓟草(chardon marie)。
[0025]
水飞蓟的瘦果(在文献中经常被误称为种子)及其制剂传统上用于口服，用于肝源性功能性消化障碍的对症治疗。
[0026]
水飞蓟的瘦果中的主要活性成分是水飞蓟素(silymarine)，其是若干种黄酮木脂素(flavonolignanes)(主要是水飞蓟宾(silybine)、异水飞蓟宾(isosilybine)、水飞蓟亭(silychristine)和水飞蓟宁(silydianine))的混合物。瘦果含有以重量计多至3％的水飞蓟素。瘦果还由油(以重量计20-30％)、植物粘液和蛋白质组成。
[0027]
水飞蓟素已成为众多研究(体外、体内和临床)的对象，已证明其具有抗氧化、保肝、助消化甚至抗炎特性。
[0028]
目前，以水飞蓟素滴定的水飞蓟瘦果提取物存在于一些用于治疗各种肝脏和胆汁疾病的药物制剂中，如
[0029]
水飞蓟宾(主要的水飞蓟素黄酮类)也是最近在头发生长研究中的对象(cheon等人，j microbiol biotech 29(2)，321-329，2019)，其通过akt wnt/β
–
连环蛋白进行信号传导。
[0030]
富含欧米伽6和维生素e的来自水飞蓟的油主要用于烹饪。它通常通过冷压从瘦果获得。然而，已经对大鼠或小鼠通过口服施用，进行对这种奶蓟草油的抗氧化和肝保护特性的体内研究(zhu等人，pharmacogn mag，10(增刊1)s92
–
s99，2014)。申请wo2018/002338描述贫水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，其具有治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻或脂溢性皮炎的感兴趣的特性。
[0031]
因此，到目前为止，没有参考文献资料提到贫水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物可具有头发再生活性，因此可用于预防和/或治疗脱发症。


技术实现要素：

[0032]
申请人以出人意料和意想不到的方式证明，贫水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物在治疗和/或预防以对抗脱发的领域具有感兴趣的药理学活性，尤其是通过促进头发生长。
[0033]
事实上，发明人已经证明贫水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物诱导毛囊中蛋白质角蛋白75的表达增加。因此，贫水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物有助于延缓和预防脱发从而延长头发的生命周期。
[0034]
根据第一方面，本发明涉及一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，
优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，其用于促进头发生长，特别是用于治疗或预防脱发症的用途，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症、或斑形脱发症或者甚至瘢痕性脱发症，尤其是毛囊炎，优选剥脱性毛囊炎。
[0035]
本发明还涉及一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物用于促进头发生长，特别是用于治疗或预防脱发症的用途，尤其是美容或皮肤病学用途，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症、或斑形脱发症、或者甚至瘢痕性脱发症，尤其是毛囊炎，优选剥脱性毛囊炎。
[0036]
本发明还涉及包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物在制备美容或皮肤病学组合物中的用途，所述组合物旨在促进头发生长，特别旨在治疗或预防脱发症，所述脱发症(如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症、或斑形脱发症、或者甚至瘢痕性脱发症，尤其是毛囊炎，优选剥脱性毛囊炎。
[0037]
本发明还涉及用于促进头发生长，特别是用于治疗或预防脱发症的方法，尤其是美容或皮肤病学方法，所述方法包括向需要其的个人施用有效量的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症、或斑形脱发症，尤其是毛囊炎，优选剥脱性毛囊炎。
[0038]
根据第二方面，本发明涉及一种皮肤病学或美容组合物，其用于促进头发生长，特别是用于治疗或预防脱发症的用途，所述皮肤病学或美容组合物含有至少一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症、或斑形脱发症、或者甚至瘢痕性脱发症，尤其是毛囊炎，优选剥脱性毛囊炎。
[0039]
本发明还涉及皮肤病学或美容组合物用于促进头发生长，特别是用于治疗或预防脱发症的用途，所述皮肤病学或美容组合物含有至少一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症、或斑形脱发症、或者甚至瘢痕性脱发症，尤其是毛囊炎，优选剥脱性毛囊炎。
[0040]
本发明还涉及皮肤病学或美容组合物在制备旨在促进头发生长，特别旨在治疗或预防脱发症的医药产品中的用途，所述皮肤病学或美容组合物含有至少一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症、或斑形脱发症、或者甚至瘢痕性脱发症，尤其是毛囊炎，优选剥脱性毛囊炎。
[0041]
本发明还涉及用于促进头发生长，特别是用于治疗或预防脱发症的方法，尤其是美容或皮肤病学方法，所述方法包括向需要其的个人施用有效量的皮肤病学或美容组合物，所述组合物含有至少一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症、或斑形脱发症、或者甚至瘢痕性脱发症，尤其是毛囊炎，优选剥脱性毛囊炎。
[0042]
根据第三方面，本发明涉及对没有头发的头皮区域进行皮肤病学治疗的方法，包
括在头发移植或头皮医疗(例如，用富血小板血浆或毛细血管中胚层疗法治疗)之前或同时，向没有头发的头皮区域局部施用水飞蓟瘦果提取物或皮肤病学组合物，所述水飞蓟瘦果提取物包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素，所述皮肤病学组合物含有至少一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物以及至少一种皮肤病学上可接受的赋形剂。
具体实施方式
[0043]
定义
[0044]
在本说明中，植物水飞蓟(silybum marianum(l.)gaertn.)缩写形式可指定为术语水飞蓟(silybum marianum)。
[0045]“水飞蓟素”在本发明的含义是指水飞蓟瘦果的纯化的提取物，其主要包含(以重量计至少95％)以下四种黄酮木脂素的混合物：水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭和水飞蓟宁(kuki等人，chromatographia75：175
–
180，2012)。因此，以重量计小于0.2％的水飞蓟素含量意味着水飞蓟素成分的总量以重量计小于0.2％。这种含量特别可以通过hplc(高效液相色谱法)或uplc(超高效液相色谱法)来测定：通过计算与水飞蓟素所有成分对应的峰的总面积，特别通过使用水飞蓟素的参考样品(例如，可以从sigma aldrich获得)测定这些峰的位置。
[0046]“水飞蓟宾(silybine)”在本领域也称为水飞蓟宾(silibinine)，在本发明的含义是指四种非对映异构体水飞蓟宾a、水飞蓟宾b、2,3-顺-水飞蓟宾a和2,3-顺-水飞蓟宾b。
[0047]
在本发明的含义内，“异水飞蓟宾”是指两种非对映异构体异水飞蓟宾a和异水飞蓟宾b。
[0048]
在本发明的含义内，“水飞蓟亭”是指两种非对映异构体水飞蓟亭a和水飞蓟亭b。
[0049]
在本说明书中，“大约”是指有关数值可能小于或大于所指定的数值的10％，特别是5％，特别是2％，更特别是1％。
[0050]
出于本发明的目的，术语“干提取物”应理解为指不含或仅以非显著的痕量形式包含提取溶剂或载剂(support)的提取物。因此，这种干提取物只含源自水飞蓟的物质。它还可含有非显著的痕量的提取溶剂。
[0051]
在本发明的含义中，“与获自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂”是指不能或只能部分与获自从水飞蓟瘦果的油混合的有机溶剂，这样有机溶剂和获自水飞蓟瘦果的油的混合物会产生异质性混合物，其中可以观察到至少两个不同的相。
[0052]
在本发明的含义中，“脂肪酸”是指羧酸r1
–
co2h，其链r1是直链或支链烃链，饱和的或包含c＝c双键，该羧酸包含16至22个碳原子(包括羧酸官能团的碳原子)。
[0053]
在本发明的含义中，“游离”脂肪酸(包括亚油酸)是指未与其他分子结合的脂肪酸(例如，与甘油或其衍生物结合以得到甘油酯，或与醇结合以得到脂肪酸酯)。
[0054]
在本发明的含义中，“生育酚”是指α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。
[0055]
在本发明的含义中，“c1至c3醇”是指r2-oh醇，其中r2链是包含1至3个碳原子的饱和直链或支链的烃链。其可以是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇，特别是甲醇、乙醇或异丙醇。优选地，其将是乙醇或异丙醇，特别是乙醇。
[0056]
在本发明的含义中，“室温”是指15至40℃的温度，优选20至30℃，特别是约25℃。
[0057]“头发和体毛”是指头发、体毛、眉毛、睫毛和/或被毛(pelage)，优选头发。
[0058]“毛发生长(croissance capillaire)”是指如上定义的头发和/或体毛的生长，优选头发。
[0059]“脱发症(alop
é
cie)”是指头发和/或体毛的全部或部分脱落，例如，与毛发生长减少和/或头发和/或体毛脱落加快相关。该术语包括但不限于雄激素性脱发症、绝经后脱发症、反应性脱发症、瘢痕性脱发症、斑形脱发症和先天性脱发症。优选地，其将是雄性激素性脱发症、绝经后脱发症、反应性脱发症或斑形脱发症。脱发症的后果是暂时的或永久的，以及部分或完全没有头发和/或体毛。
[0060]“秃斑(pelade)”是指头发斑块式的大量脱落，最常见的是在头皮上。受影响的个体有没头发的斑块，多为圆形或椭圆形。另一方面，头皮不受影响也没有疤痕。
[0061]“没有头发的头皮区域”是指头皮的区域，无论其大小都没头发，或者没有足够的头发生长来覆盖所讨论的区域。它可以是秃斑、或部分或全部脱发症。
[0062]“毛囊炎”是指一个或多个头发毛囊的形成丘疹脓疱的炎症。因此，它可以发生在有头发的任何地方。它可以是细菌、真菌、病毒源的或非传染源的。毛囊炎可以是浅表性的、骨毛囊炎(ostio-folliculite)性的或深层的。有不同形式毛囊炎，例如，剥脱性毛囊炎或脱发性毛囊炎。头皮的剥脱性毛囊炎是一种慢性且罕见的头皮化脓性皮肤病。它呈现出许多疼痛的毛囊和毛囊周围的炎性结节、脓疱和脓肿的形式，这些通过窦道相互连接，最终导致瘢痕性脱发。坎科氏脱发性毛囊炎(folliculite d
é
calvante de quinquaud)也是发生在中年人身上的慢性且罕见的头皮的炎症性瘢痕性脱发症，其特征是缓慢延展的并且主要集中在头皮顶部和枕区的脱发斑块，以及与之相关的毛囊周围红斑、脓疱和出血性结痂发生。
[0063]
术语“治疗”脱发症理解为指停止脱发、减少脱发和/或减缓脱发。因此，“治疗”脱发症包括限制头发和/或体毛脱落和/或促进头发和/或体毛生长，增加头发毛囊密度和/或调节头发毛囊周期。
[0064]
术语“预防”脱发症理解为在易患脱发症的哺乳动物，优选人中减少发生脱发的风险，或减缓脱发的进展。
[0065]
术语“限制”理解为放慢、减少、降低和/或停止。
[0066]
术语“促进”理解为增加、促进、放大和/或加速。
[0067]
在本发明中，术语“美容学或皮肤病学可接受的”旨在表示其用于制备美容或皮肤病学组合物，其通常是安全的、无毒的并且无生物学上或其他方面不期望的，以及其对于美容或皮肤病学用途是可接受的，特别是局部施用在头发和/或头皮上。
[0068]“局部施用”是指施用于皮肤，特别是头皮、黏膜、头发和/或体毛，特别是头发和/或头皮。
[0069]
根据本发明的提取物
[0070]
根据本发明的提取物是包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物。
[0071]
根据一个特别的实施方案，根据本发明的提取物含有相对于干提取物的重量以重量计至少3％，优选以重量计至少4％的游离亚油酸。特别地，根据本发明的提取物含有相对于干提取物的重量，以重量计在3％至25％之间，例如以重量计在3至15％之间，尤其以重量
计在4％至10％之间，特别是以重量计在4％至6％之间，例如以重量计约5％的游离亚油酸。根据本发明的提取物的水飞蓟素/游离亚油酸质量比特别是可以小于0.07，特别是小于0.05以及特别是小于0.01。
[0072]
根据本发明的提取物还可以包含相对于干提取物的重量以重量计在10％至70％之间，特别是在10％至50％之间，更特别是在10％至30％之间，特别是在15％至25％之间的游离脂肪酸。
[0073]
根据一个特别的实施方案，根据本发明的提取物含有相对于干提取物的重量以重量计至少为0.01％，尤其是以重量计0.05％的生育酚。特别地，根据本发明的提取物含有相对于干提取物的重量，以重量计在0.01％至2％之间，更特别是以重量计在0.01％至1％之间，甚至更特别是以重量计在0.01％至0.5％之间，特别是以重量计在0.05％至0.2％之间，例如以重量计约0.1％的生育酚。根据本发明的提取物中的水飞蓟素/生育酚质量比特别地可以小于1，特别地小于0.1。
[0074]
根据另一个特别的实施方案，根据本发明的提取物含有相对于干提取物的重量以重量计在3％至25％之间，例如以重量计在3至20％之间，特别是以重量计在3％至15％之间，特别是以重量计在4％至10％之间，特别是以重量计在4％至6％之间，例如以重量计约5％的游离亚油酸；以及相对于干提取物的重量以重量计在0.01％至2％之间，特别是以重量计在0.01％至1％之间，甚至更特别是以重量计在0.01％至0.5％之间，特别是以重量计在0.05％至0.2％之间，例如以重量计约0.1％的生育酚。特别地，根据本发明的提取物的水飞蓟素/游离亚油酸质量比特别可以小于0.07，特别小于0.01，以及根据本发明的提取物的水飞蓟素/生育酚质量比特别可以小于1，特别是小于0.1。
[0075]
优选地，根据本发明的提取物将是干提取物。
[0076]
根据一个优选的实施方案，根据本发明的提取物可通过下文描述的根据本发明的方法获得。
[0077]
制备根据本发明的提取物的方法
[0078]
制备根据本发明的提取物的方法特别包括通过提取溶剂提取从水飞蓟的瘦果获得的油的步骤，所述提取溶剂包括(特别由其组成)：水性亲水性溶液、亚临界水或任选地与水混合的与获自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂。
[0079]
根据一个特别的实施方案，提取溶剂包括(特别由其组成)任选地与水混合的与获自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂。
[0080]
与获自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂特别可以是c1至c3醇。
[0081]
提取溶剂特别可以是任选地与水混合的c1至c3醇。
[0082]
与获自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂，特别是c1至c3醇，如甲醇、乙醇或异丙醇，特别是乙醇或异丙醇，优选是乙醇，其可以与水混合用作混合物，特别地，有机溶剂/水的体积比为70/30至100/0，特别是80/20至100/0，例如约80/20或90/10。
[0083]
提取溶剂特别可以选自甲醇、甲醇/水混合物、乙醇、乙醇/水混合物、异丙醇和异丙醇/水混合物，特别是乙醇/水混合物或异丙醇/水混合物，优选是乙醇/水混合物。
[0084]
根据一个特别的实施方案，提取溶剂将是甲醇，体积比为约80/20或90/10的乙醇/水混合物，或体积比为约90/10的异丙醇/水混合物。
[0085]
特别地，通过将获自水飞蓟瘦果的油与提取溶剂混合1至12小时，并且特别是在15
至25℃的温度，尤其是在20℃左右进行来自水飞蓟瘦果的油的提取步骤。对于每1g获自水飞蓟瘦果的油，进行这种提取所使用的提取溶剂的量有利地将是0.5至3g，特别是1至3g。
[0086]
然后在该提取结束时获得提取相和脂质相。提取相有利地与脂质相分离，部分或全部回收，然后特别是通过蒸发提取溶剂，特别是在真空下干燥，以便或多或少地除去提取溶剂并获得干提取物(如果溶剂被完全去除)或在残留溶剂中稀释的浓缩的提取物。
[0087]
获自水飞蓟瘦果的油可有利地通过提取水飞蓟瘦果获得(瘦果可以是完整的或碎片)，特别是通过压榨，有利地是通过在室温下冷压(即不加热)。
[0088]
根据本发明的一个实施方案，根据本发明的方法将包括以下两个连续步骤：
[0089]
(i)从水飞蓟瘦果提取油，和
[0090]
(ii)用提取溶剂提取从水飞蓟瘦果获得的油，所述提取溶剂包括(特别由其组成)水性亲水性溶液、亚临界水或任选地与水混合的与获自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂。
[0091]
根据本发明的一个优选的实施方案，根据本发明的方法将包括以下连续的步骤：
[0092]
(i)任选地从水飞蓟瘦果提取油，
[0093]
(ii)用提取溶剂提取从水飞蓟瘦果获得的油，所述提取溶剂包括(特别由其组成)水性亲水性溶液、亚临界水或任选地与水混合的与获自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂，
[0094]
(iii)回收在步骤(ii)中获得的提取相，和
[0095]
(iv)部分或全部干燥提取相以得到根据本发明的浓缩的或干提取物。
[0096]
步骤(i)将有利地通过冷压水飞蓟瘦果(完整的或碎片的)进行。
[0097]
步骤(ii)将有利地使用如上定义的提取溶剂进行，并且特别选自甲醇、甲醇/水混合物、乙醇、乙醇/水混合物、异丙醇和异丙醇/水混合物。
[0098]
提取溶剂特别可以是与获自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂，特别是c1至c3醇，如甲醇、乙醇或异丙醇，其任选地与水的混合物，特别是体积比在80/20至100/0之间，特别是在85/15至95/5之间，特别是约90/10的有机溶剂/水的混合物。有利的提取溶剂是体积比为约90/10的异丙醇/水混合物。
[0099]
通过将获自水飞蓟瘦果的油与提取溶剂混合1至12小时，并且特别是在15至25℃的温度，尤其是在20℃左右可以进行提取步骤(ii)。对于每1g的获自水飞蓟瘦果的油，进行该提取所使用的提取溶剂的量有利地将是从0.5至3g，特别是从1至3g。
[0100]
该提取步骤(ii)使得能够在最后获得感兴趣的提取相和脂质相。
[0101]
步骤(iii)有利地通过将提取相与脂质相分离来进行。
[0102]
步骤(iv)有利地在真空下进行。
[0103]
美容和皮肤病学应用
[0104]
根据第一方面，本发明涉及一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，其用于促进头发生长的用途。
[0105]
本发明还涉及一种根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，其用于治疗或预防脱发症或甚至用于治疗剥脱性毛囊炎的用途，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症或斑形脱发症。
[0106]
根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物可与头发移植结合使用，特别是在毛囊单位的微移植期间结合使用。毛囊单位表示头皮中以小束的形式自然聚集在一起的一组头发，其可以包含一至四根头发。包含相对于根据本发明的干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物的使用特别在与激光头发移植相结合中是完全合适的。
[0107]
根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物也可以与基于富含血小板血浆(prp)的治疗结合使用。这是一种可注射进头皮的血小板浓缩物(因而富含生长因子)。
[0108]
根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物还可与毛细血管中胚层疗法结合使用。这是医学和美学领域常用的技术，其包括将各种复合维生素注入头皮真皮层以深入滋养头发毛囊，使得能够在治疗头发的同时改善头皮的血液循环。一般来说，两个月的治疗足以使脱发回归正常，有时还能增加头发的密度。
[0109]
因此，根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物可用于在头发移植或头皮医疗(例如，用富含血小板血浆的治疗或毛细血管中胚层疗法)之前或同时使用。
[0110]
根据第二方面，本发明涉及一种皮肤病学或美容组合物，其用于促进头发生长的用途，所述组合物含有至少一种根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂。
[0111]
本发明还涉及一种皮肤病学或美容组合物，其用于治疗或预防脱发症或甚至用于治疗剥脱性毛囊炎的用途，所述组合物含有至少一种根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂，所述脱发症如雄激素性脱发症、反应性脱发症、绝经后脱发症或斑形脱发症。
[0112]
含有至少一种根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂的皮肤病学或美容组合物，可与头发移植，尤其是激光头发移植结合使用。
[0113]
含有至少一种根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂的皮肤病学或美容组合物，可与基于富含血小板血浆(prp)的治疗结合使用。
[0114]
含有至少一种根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂的皮肤病学或美容组合物，还可与毛细血管中胚层疗法结合使用。
[0115]
因此，含有至少一种根据本发明的包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，以及至少一种皮肤病学或美容学可接受的赋形剂的皮肤病学或美容组合物，可在头发移植或头皮医疗(例如，用富含血小板血浆的治疗，或毛细血管中胚层疗法)之前或同时使用。
[0116]
有利地，在皮肤病学或美容组合物中包含的提取物如上所述。
[0117]
根据第三方面，本发明涉及一种对没有头发的头皮区域进行皮肤病学治疗的方法，包括在头发移植或头皮医疗(例如，用富含血小板血浆的治疗或毛细血管中胚层疗法)之前或同时，向没有头发的头皮区域局部施用根据本发明的水飞蓟瘦果提取物或者根据本发明的皮肤病学组合物，所述水飞蓟瘦果提取物包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素，所述皮肤病学组合物含有至少一种包含相对于干提取物的重量以重量计小于0.2％，优选小于0.1％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，以及至少一种皮肤病学可接受的赋形剂。
[0118]
优选地，根据本发明的这种皮肤病学治疗在头发移植之前，尤其是激光移植之前。
[0119]
根据本发明的一个特别的实施方案，根据本发明的皮肤病学治疗的方法是在头发移植或头皮医疗(例如，富含血小板血浆的治疗或毛细血管中胚层疗法)之前进行1至6周，优选1至4周，甚至更优选2至4周。
[0120]
优选地，本发明旨在根据本发明的提取物和美容或皮肤病学组合物，其以其自身形式和适合于局部应用，特别是应用至头皮和/或头发的形式提供。
[0121]
因此，根据本发明的美容或皮肤病学组合物可以是通常公知的用于局部施用的形式，即，特别是洗剂、洗发剂、香膏剂、泡沫剂、凝胶剂、分散剂、乳剂、喷雾剂、精华、膜剂或霜剂，其含有特别是可渗透以改善活性成分的特性和可及性的赋形剂。
[0122]
有利的是，根据本发明的组合物可以是通常公知的用于头发和头皮局部施用的形式，即特别是洗发剂、护发素、发膏、头发洗剂、发膜剂或喷雾剂，特别是不需要冲洗。
[0123]
因此，区分出可冲洗的制剂产品和不需要冲洗的制剂产品。
[0124]
优选地，根据本发明的组合物具有轻盈的质地，进一步允许最佳渗透，并且不会使头发和/或体毛或头皮变油。
[0125]
这些组合物通常除了包含根据本发明的提取物之外，还包含生理学可接受的介质，其通常基于水或溶剂，例如醇、醚或二醇。它们还可包含表面活性剂、络合剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂、湿润剂、软化剂、微量元素、精油、香料、着色剂、保湿剂等。
[0126]
根据一个特别的实施方案，根据本发明的组合物包含异丙醇、聚乙二醇(peg)或这些的混合物作为美容学或皮肤病学可接受的赋形剂。因此，有利地，根据本发明的组合物将包含(特别是由其组成)根据本发明的提取物、异丙醇和peg。异丙醇/peg的质量比有利地将在1/2至2/1之间，特别是在1/1.5至1.5/1之间，特别是在1/1左右。
[0127]
peg可以特别地具有在200至600g/mol之间，特别是在200至500g/mol之间，特别是在200至400g/mol之间，例如在250至350g/mol之间，特别是约300g/mol的数均分子量。这特别可以是peg 300。
[0128]
在本发明的另一个特别的实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于它是以适合口服施用的形式。
[0129]
然后，根据本发明的组合物可以是通常公知的用于口服施用的形式，即特别是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂和口服溶液剂或混悬剂。当制备片剂形式的固体组合物时，主要活性成分可以与美容或皮肤病学载体混合，如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯树胶、二氧化硅等。可以用蔗糖或其他合适的材料包衣片剂，或者可以对片剂进行加工，以使其具有延长的、或延迟的活性并持续释放预定量的活性成分。可以通过将活性成分与稀释剂混合，并将所得混合物倒入软或硬胶囊中来获得胶囊制剂。
[0130]
有利地，根据本发明的组合物包含相对于组合物的总体积以重量计在0.01至15％之间，优选在0.1至10％之间的根据本发明的提取物。
[0131]
实施例
[0132]
实施例1：提取物的制备
[0133]
得到含有低水飞蓟素含量的异丙醇90提取物(提取物i)的根据本发明的方法。
[0134]-冷压水飞蓟瘦果以获得获自从水飞蓟瘦果的油，
[0135]-在20℃用异丙醇/水混合物(90/10v/v)提取获自水飞蓟瘦果的油2小时，对每克油使用1克的异丙醇/水混合物，
[0136]-回收异丙醇相，和
[0137]-蒸发溶剂。
[0138]
通过分别用甲醇和乙醇/水混合物(90/10v/v)替代异丙醇/水混合物(90/10v/v)以类似方式获得甲醇提取物(提取物m)和乙醇提取物(提取物e)。分别用3倍体积的甲醇和3倍体积的乙醇/水混合物(90/10v/v)在20℃对获自水飞蓟瘦果的油(1倍体积的油)提取2小时。
[0139]
根据下文详述的操作方案，通过uplc(超高效液相色谱法)或gc-mc(气相色谱偶联质谱法)表征这些不同的提取物。
[0140]
评估所获提取物的操作方案
[0141]
操作方案1：通过uplc评估水飞蓟素含量
[0142]
制备样品和对照：
[0143]-水飞蓟素对照：制备5mg水飞蓟素在10ml甲醇/水混合物(60：40)(v/v)中的溶液。
[0144]-样品：在35℃在搅拌下将待分析的干提取物(提取物m、e或i)加热，直至得到均匀且澄清的溶液。准确称取200mg的提取物，将其溶解在10ml的甲醇/二氯甲烷混合物中，使提取物完全溶解并使溶液均匀化。该混合物的范围从甲醇/二氯甲烷(1：1)比例(v/v)到纯甲醇。
[0145]
分析条件：
[0146]
柱：acquity beh shield c18 150mm
×
2.1mm-1.7μm(waters)
[0147]
流动相：
[0148]-a：水 0.1％甲酸
[0149]-b：乙腈 0.1％甲酸
[0150]
根据下表1的梯度：
[0151]
[表1]
[0152]
t(min)a(％)b(％)0901015604020010039.50100409010459010
[0153]
柱温：40℃
[0154]
流速：0.4ml/min
[0155]
检测：287nm
[0156]
进样体积：1μl。
[0157]
操作方案2：通过uplc评估亚油酸含量
[0158]
制备样品和对照：
[0159]-亚油酸对照：制备10mg亚油酸在10ml甲醇/二氯甲烷(1:1)(v/v)混合物中的溶液。
[0160]-样品：在35℃在搅拌下将待分析的干提取物(提取物m、e或i)加热，直至得到均匀且澄清的溶液。准确称取50mg的提取物，将其溶解在1ml的甲醇/二氯甲烷混合物中，使提取物完全溶解并使溶液均匀化。该混合物的范围从甲醇/二氯甲烷(1：1)比例(v/v)到纯甲醇。
[0161]
分析条件：
[0162]
柱：acquity beh shield c18 150mm
×
2.1mm-1.7μm(waters)
[0163]
流动相：
[0164]-a：水 0.1％甲酸
[0165]-b：乙腈 0.1％甲酸
[0166]
梯度根据下表2：
[0167]
[表2]
[0168]
t(min)a(％)b(％)050501505010010015010015.55050205050
[0169]
柱温：40℃
[0170]
流速：0.4ml/min
[0171]
检测：215nm
[0172]
进样体积：1μl。
[0173]
操作方案3：通过gc
–
ms评估脂肪酸含量
[0174]
制备样品：
[0175]
在搅拌下将待分析的干提取物加热至35℃，直至得到澄清均匀的液体。
[0176]
将20mg的提取物溶解在800μl的甲醇/二氯甲烷(1：1)(v/v)混合物中。
[0177]
添加200μl的衍生物n,o
–
双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa) 三甲基氯硅烷(tmcs)(99：1)(supelco
–
sigma alrich)。
[0178]
涡旋1分钟。
[0179]
气相色谱(cpg)条件：
[0180]
柱：db
–
5ms(agilent technologies)；30m
×
0.25mm；0.25μm
[0181]
进样：t＝300℃；模式＝分流；分流比＝100:1
[0182]
炉：温度梯度(℃)
[0183]-初始温度＝150℃
[0184]-梯度＝以7℃/分钟上升至最终温度＝340℃
[0185]-在340℃保持10分钟
[0186]
载气流速：1ml/min
[0187]
检测：ms-ei，t＝300℃，扫描时间＝0.2秒；全扫描开始质量(full scan start mass)＝40；全扫描结束质量(full scan end mass)＝600。
[0188]
进样体积：1μl。
[0189]
结果
[0190]
根据本发明的贫水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物i主要含有通过uplc保留时间在13至30分钟之间的物质。
[0191]
在用商业水飞蓟素(sigma aldrich)的对照溶液校准后，通过uplc测定提取物i的水飞蓟素含量。
[0192]
提取物i含有以质量计为0.06％的水飞蓟素。
[0193]
通过uplc和cpg测定提取物i中的游离脂肪酸含量，以及更特别是亚油酸的含量，列于下表3
[0194]
[表3]
[0195][0196]
本发明人能够证明通过甲醇提取(提取物m)、乙醇90提取(提取物e)和异丙醇90提取(提取物i)获得的3种根据本发明的瘦果提取物的uplc和cpg谱是相似的。
[0197]
通过uplc和gc-ms进行的各种分析，可以证明以下特征：
[0198]-根据本发明的瘦果的异丙醇90提取物(提取物i)几乎不含水飞蓟素，特别是极性的黄酮木脂素。
[0199]-通过甲醇提取、乙醇90提取和异丙醇90提取获得的3种根据本发明的瘦果的提取物的uplc和cpg谱非常相似。
[0200]
实施例2：人受试者前额毛囊中的蛋白质角蛋白75的定量
[0201]
该实施例的目的是评估包含以重量计小于0.2％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物对人角蛋白75蛋白表达的作用。事实上，这种药理学活性在脱发的治疗和/或预防领域是有意义的，尤其是通过促进头发生长。
[0202]
方法
[0203]
将实施例1中制备的提取物i的局部用制剂以1.75％或7.0％(w/v)的干提取物配制在异丙醇/peg 300(1：1)混合物中(w/w)，然后放入喷雾剂中，在治疗期间每天施用两次。
[0204]
根据他们的可用性，对13名健康志愿者进行了4至12周的随访。本研究根据赫尔辛基宣言(d
é
claration d’helsinki)进行，并获得每位受试者的书面同意。这是一项纵向的观察性单中心研究。在整个研究过程中，受试者在私人诊所接受同一工作人员的密切监督，并辅以与受试者永久的数字联系和交流。已安装基于数字装置的每周监控。每次就诊时提
取毛囊样品。
[0205]
根据pi
é
rard等人(scientific world journal，2014id 463634，2014)，使用一滴粘附在玻璃显微镜载玻片上的2-乙基氰基丙烯酸酯，从受试者的前额取氰基丙烯酸酯毛囊样品。
[0206]
蛋白质提取：
[0207]
从玻璃载玻片上分离活检组织，在蒸馏水中在室温30分钟，切成小块，然后在2mm tris-hcl提取缓冲液，ph 6.8，3％sds、10mm焦磷酸钠、5mm edta和2mm钒酸钠中均质化。将样本在50℃加热3小时。提取物在10,000rpm离心10分钟。按照bradford的方法(anal biochem 72：248
–
254,1976)，使用bio-rad试剂(cressier，瑞士)测定上清液中的蛋白质。用pbs缓冲液洗涤皮脂腺细胞培养物，然后在特定的缓冲液(tris
–
hcl 50mm ph 7.4，nacl 150mm，edta1mm，triton
tm x
–
100 1％)中裂解细胞。使悬浮液通过超声波仪，然后用bradford方法进行分析。
[0208]
使用标准程序和以下抗体通过蛋白印迹(western blot)分析蛋白质样品：多克隆兔抗人igg k75，稀释度1：5000(fisher scientific，reinach，瑞士)。
[0209]
通过电泳(sds-page)进行蛋白质组学分析，然后进行考马斯染色。收获染色的蛋白质条带并在日内瓦大学的蛋白质组学平台上进行分析。
[0210]
结果
[0211]
在用根据本发明的提取物治疗之前和之后的人受试者的前额头发毛囊中，k75蛋白的表达水平(蛋白印迹条带的密度单位)显示在下表4中。
[0212]
[表4]
[0213][0214]
本发明人清楚地表明，用根据本发明的提取物的治疗诱导k75蛋白表达统计学显
著增加(p《0.001)。值得注意的是，无论测试的浓度或所进行的治疗的持续时间如何，在所有患者中都观察到了这种增加。事实上，在治疗4周后，k75蛋白的表达似乎已经非常明显得增加。
[0215]
实施例3：在秃斑患者的头皮中的蛋白质角蛋白75的水平的定量
[0216]
在这种严重的头发疾病中，观察到k75的表达非常低。用浓度为7％的相同提取物并且使用与实施例2相同的方式治疗患者。得到的结果，即在用根据本发明的提取物治疗之前和之后，在秃斑患者的头发毛囊中k75蛋白的表达水平(蛋白印迹条带的密度单位)显示在下表5中。
[0217]
[表5]
[0218][0219]
本发明人因此证明，包含根据本发明的提取物的治疗能够显著增加在秃斑患者中k75的表达水平。值得注意的是，在治疗结束时可以观察到头发再生。
[0220]
所有这些结果使得发明人可以强调，含有以重量计小于0.2％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物对促进头发再生的益处。
[0221]
实施例4：在秃斑的头皮和头发再生的头皮中的角蛋白75水平的定量
[0222]
在这种严重的头发疾病中，发现k75的表达非常低。用相同的7％浓度的提取物并且使用与实施例2相同的方式治疗两名患有秃斑的患者(针对两块或三块秃斑)四周。k75蛋白密度和头发密度的结果(共5块秃斑)在下表6给出。
[0223]
[表6]
[0224][0225]
因此，本发明人清楚地证明，包含根据本发明的提取物的治疗能够显著增加两名秃斑患者中的k75的表达水平。这种增加与头发再生有关。事实上，在应用根据本发明的提取物后，头发密度增加了一倍以上。
[0226]
因此，向头皮上局部应用根据本发明的提取物能够创造有利于头发再生的条件。因此，本发明人清楚地证明，可应用这种提取物以用于防止头发移植或医疗治疗，例如prp或中胚层疗法等。
[0227]
实施例5：水飞蓟瘦果提取物对毛乳头细胞中egfr和pdgfrβ受体磷酸化的特定作用
[0228]
本研究的目的是证明，测试的30μg/ml的水飞蓟瘦果提取物特异性地诱导具有酪氨酸激酶活性的受体的酪氨酸的磷酸化(phospho-rtk)和各种信号传导通路的激酶的磷酸
化(phospho-kinases)，与测试的0.06μg/ml的水飞蓟素(sigma)相反。用二甲亚砜(dmso)处理对照，所述dmso作为水飞蓟提取物和水飞蓟素的溶剂使用。
[0229]
该研究是在毛乳头细胞上进行的，这些细胞是从人头发毛囊中分离出来并在培养皿中培养48小时。然后，在水飞蓟提取物或水飞蓟素存在下刺激毛乳头细胞1小时。然后，制备总细胞裂解物并测试各种生物靶标的磷酸化。借助于两种抗体阵列试剂盒获得这些靶标的映像，所述试剂盒使用在其上印有抗体以检测感兴趣的蛋白的存在的纤维素膜(proteome profiler human array kit，r&d systems)。这些测试中筛选出的药理学靶标的列表如下，可在线获取：
[0230]
·
49种具有酪氨酸激酶活性的磷酸化受体
[0231]
(https://www.rndsystems.com/products/proteome
–
profiler
–
human
–
phospho
–
rtk
–
array
–
kit_ary001b)
[0232]
·
43种信号传导的磷酸化激酶
[0233]
(https://www.rndsystems.com/products/proteome
–
profiler
–
human phospho-kinase
–
array
–
kit_ary003b#product
–
datasheets).
[0234]
然后，使用光密度计(chemidoc，biorad)检测化学发光信号，并通过image j 1.52软件使用微阵列图谱插件进行定量。数据分析能够确定每个实验条件下像素的平均强度，并测量相对于dmso对照的比率。最后，对两个独立的毛乳头细胞的供体进行测试，并且一式两份。
[0235]
光-受体结果显示在下表7中。
[0236]
[表7]
[0237]
组别磷酸化的egfr磷酸化的pdgfrβ比率：水飞蓟提取物/对照1.912.77比率：水飞蓟素/对照1.020.76
[0238]
这些结果表明，作为对治疗一小时的响应，水飞蓟提取物显著增加这两种受体的酪氨酸磷酸化，比率分别为1.91和2.77。另一方面，在与水飞蓟素一起温育后比率依然接近1，对于egfr和pdgfrβ而言比率分别为1.02和0.76。这些数据表明，30μg/ml的水飞蓟瘦果提取物对靶标egfr和pdgfrβ有特定作用，并且这两种受体的磷酸化不受浓度为0.06μg/ml的水飞蓟素调节。
[0239]
此外，信号传导磷酸化激酶的筛选结果在下表8中给出，其显示水飞蓟瘦果提取物诱导了信号传导激酶的酪氨酸的磷酸化，该值是水飞蓟提取物/对照的比率。
[0240]
[表8]
[0241]
pdgfrβerk 1/2gsk 3a/bakt 1/2/3stat5astat5a/bb-连环蛋白1.941.231.512.001.741.601.72
[0242]
这些实验结果能够证实，pdgfrβ实际上在y751残基上被酪氨酸化以响应水飞蓟的提取物(比率为1.94)。此外，该提取物激活了已知的egfr和pdgfrβ信号传导通路，即：erk 1/2(t202/y204，t185/y187)；gsk3 a/b(s21/s9)；akt 1/2/3(s473)；stat 5a(y694)；stat 5a/b(y694/y699)和总b-连环蛋白。
[0243]
总之，该实施例的一系列结果表明，水飞蓟瘦果提取物特异性地激活(不依赖于水飞蓟素的存在)egfr和pdgfrβ酪氨酸的磷酸化，以及激活其在毛乳头细胞中的信号传导通路。