制备视网膜色素上皮细胞的自动化方法与流程

1.本发明涉及从多能干细胞(pluripotent stem cells,psc)制备视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,rpe)细胞的方法。更具体地，本发明涉及依次组合三种分化剂以使得人多能干细胞定向分化为rpe细胞的自动化方法。


背景技术：

2.视网膜色素上皮(rpe)是位于神经视网膜和脉络膜之间的单层色素细胞。
3.rpe细胞在视网膜及其光感受器的维护和功能中发挥作用。这些作用包括血-视网膜屏障的形成、光吸收和抗光氧化保护、神经视网膜的转运、视觉色素的再生以及脱落的光感受器膜的吞噬作用。
4.人多能干细胞(hpsc)，包括人胚胎干细胞(hesc)和人类诱导多能干细胞(hipscs)，其特征在于无限的自我更新和它们分化成任何细胞类型的能力。由于这些特性，本领域已经进行了广泛的努力来将它们用作细胞疗法的源材料以修复受损组织。在细胞治疗的最前沿，视网膜色素上皮的替代起到概念的证明作用。rpe细胞在视觉中起着至关重要的作用，它们的功能障碍或丧失可能会导致光感受器的继发性丧失。rpe细胞在5-6％的视网膜色素变性病例和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,amd)中发生改变。amd是发达国家失明的主要原因，全世界有超过1.5亿人受到影响，这一数字在未来几年还会增加。基于脉络膜新生血管化的存在，amd可分为干性(萎缩性)或湿性(渗出性)两类。
5.对于干性amd和大多数视网膜色素变性，仍然没有治疗方法。
6.因此，移植源自人多能干细胞的rpe细胞(hpsc-rpe)代表了治疗视网膜退行性疾病的有吸引力的策略。
7.从培养基中去除用于维持多能性状态的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)后，hpsc自发分化为rpe细胞。rpe细胞独特的鹅卵石形态及其色素沉着允许手动收集在hpsc分化时出现的色素区域，以获得纯的hpsc-rpe细胞群。这种rpe细胞生产方法被用作正在进行和计划的临床试验中的细胞替代材料。然而，这种自发的方法仍然繁琐、低效和耗时(8到12周的hpsc分化)，使其与治疗潜在数百万患者所需的工业化大规模生产不兼容。
8.在过去的十年中，一些团队通过组合使用越来越多的基于发育研究获得的结果选择的细胞因子和小分子，开发了改进的分化方案。最快和最有效的方案之一发表在出版物“经典/β-连环蛋白wnt通路激活改善从人胚胎干细胞的视网膜色素上皮细胞衍生”(canonical/β-catenin wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.)invest.ophthalmol.vis.sci.56,1002
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1013(2015)中。根据数据表明rpe和神经视网膜祖细胞(neural retina progenitor,nrp)具有相同胚胎起源的数据，他们还将允许nrp有效分化的方案与先前描述的rpe诱导因子(例如烟酰胺、激活素a以及许多其它包括bfgf、noggin、dkk1(dickkopf wnt信号通路抑制剂1)、胰岛素样生长因子1(igf-1)在内的因子相
结合。先前的方案被改进为从第8天到第14天包括chir99021和su5402。
9.使用这种方法，他们在分化14天后获得了表达色素沉着标记pmel17的细胞，从而可以绕过色素沉着细胞的手动富集。
10.背景技术还包括wo2017021973和wo2008129554，其公开了产生视网膜色素上皮(rpe)细胞的两步方法，包括在烟酰胺存在下培养人多能干细胞群；并在激活素a存在下并且在有或没有烟酰胺的情况下进一步使细胞进入另一个分化阶段。
11.尽管hpsc向rpe细胞的分化在过去几年变得更加有效，但它仍然是一个漫长而费力的过程，需要从hpsc解冻到hpscrpe细胞库的细致操作。许多细胞培养参数，例如接种均匀性、细胞在孵化器外花费的时间或用于分离色素团块的方法，都可能影响hpsc的增殖和分化。因此，手动处理意味着操作员之间的可变性、hpsc的质量及其分化为rpe细胞的效率在目前来说高度依赖于技术技能。在这方面，自动化不仅应该允许扩大hpsc-rpe细胞的生产，而且还应该提高生产的稳健性。它可以为临床和疾病建模应用提供更大、更可靠的细胞生产。
12.直到最近，手动富集以获得纯hpsc-rpe细胞群的要求阻碍了使用这些自动化系统用于这种细胞类型的分化。
13.因此，需要开发一种允许大规模生产hpsc-rpe细胞的全自动过程。
14.除了使过程相当复杂之外，还考虑到大规模使用多种生长因子和小分子非常昂贵，尤其是对于需要大量死体积的自动化过程，申请人通过提供适用于自动化的简化的rpe分化方案来满足这一需求。


技术实现要素：

15.根据第一实施例，本发明提供了适用于自动化的方案的用途，该方案依次组合三种分化剂以使hpsc定向分化为rpe细胞。这种与使用细胞培养机器人相关的新型分化方案在保持高细胞纯度和功能的同时，为大批量hpsc-rpe细胞的生产开辟了新的可能性。
16.因此，本发明的一个目的是提供用于大规模自动化生产源自(人)多能干细胞的rpe细胞的方法。
17.本文公开的方法的培养系统中的hpsc是分化中的hpsc，即基本上处于未分化状态的hpsc群，或其中至少部分所述细胞已被诱导经历定向分化的初始阶段，大多数所述细胞已被诱导经历定向分化的初始阶段。根据一个实施例，分化的初始阶段是通过以下来实现的：将细胞暴露于第一分化剂，特别是至少一种烟酰胺(na)模拟化合物，然后暴露于第二分化剂，特别是转化生长因子-β(tgfβ)超家族的至少一种成员，最后暴露于第三种分化剂，特别是至少一种wnt经典途径激活剂。
18.发明详述
19.在下面的描述和权利要求中，将使用各种术语，这些术语的含义应根据本教导解释如下：
20.术语“模拟物”是指具有与另一种已知化合物或该已知化合物的特定片段类似的功能和/或结构特性的化合物，例如生物来源的已知化合物，例如多肽或其片段。
21.如本文所用，“未分化的”是指当群体中相当大比例(至少20％，并且可能超过50％或80％)的细胞及其衍生物显示将它们与胚胎或成体来源的分化的细胞区分开来的未分化
细胞的特征性标记和形态特征时的培养细胞。当细胞在至少3周的培养期内经历至少1次群体倍增，同时在所述培养期后保留至少约50％或相同比例的带有未分化细胞的特征标记或形态特征的细胞时，细胞被认为在未分化状态下增殖。
22.为了本发明的目的，术语多能干细胞旨在包括具有自我更新能力和分化成一种或多种其它细胞类型的潜力的任何细胞。
23.如本文所用，“多能hsc”是指具有形成任何成体细胞的能力的人类来源的前体细胞。此类细胞是真正的细胞系，因为它们：(i)能够在体外以未分化状态广泛增殖；并且(ii)甚至在经过长时间的培养后也能够分化为所有三个胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物。人胚胎干细胞(hesc)衍生自不到一周大(在卵裂或囊胚阶段)的受精胚胎或通过具有等效特征的人工方式(例如通过核移植)产生。其它多能hsc包括但不限于多能成体祖细胞(map)、诱导多能干细胞(ips细胞)和羊水干细胞。
24.可使用众所周知的细胞培养方法获得hpsc。例如，可从卵裂期或桑椹期人胚胎的单个卵裂球、卵裂阶段和桑椹人胚胎和人胚泡中分离hesc。人类胚胎可以从体内植入前胚胎获得，或更典型地从体外受精(ivf)胚胎获得。或者，未受精的人类卵母细胞可以被孤雌生殖激活以分裂并发育到囊胚阶段。此外，单细胞人类胚胎可扩展到囊胚阶段。为了从胚泡中分离hesc，去除透明带并通过免疫手术分离内细胞团(inner cell mass,icm)，其中使滋养外胚层细胞裂解并通过轻柔移液从完整的icm中去除。然后将icm接种在含有适当培养基以使其生长的组织培养瓶中。9到15天后，icm衍生的生长物通过机械解离或酶消化解离成团块，然后将细胞重新接种在新鲜的组织培养基中。显示未分化形态的菌落通过微量移液器单独挑出，机械分离成团块，并重新接种。然后每1-2周常规分离产生的胚胎干细胞。有关hesc制备方法的更多详细信息，参见thomson等人[u.s.pat.no.5,843,780；science282:1145,1998]。
[0025]
在本发明中，es细胞不限于从内细胞团收集的原代细胞系，也可是已建立的es细胞系。这种已建立的es细胞系的例子包括：由通过允许已建立的es细胞系生长获得的细胞群提供的细胞系；以及将冷冻干燥的细胞系解冻后进行培养而获得的es细胞系。这种已建立的es细胞系无需经过分解受精卵的步骤即可获得。
[0026]
另外，本发明中使用的es细胞可在囊胚期之前的卵裂期从单个胚胎卵裂球建立，而不损害胚胎的生成能力。可以在不破坏受精卵的情况下获得此类es细胞(klimanskaya i.等人，(2006)nature 444：481-485；和chung y等人，(2008)cell stem cell 2：113-117)。
[0027]
根据本发明也可以使用市售的hpsc。hpsc可以从例如英国干细胞银行(uk stem cell banks)或美国国立卫生研究院(nih)人胚胎干细胞登记处购买。市售胚胎干细胞系的非限制性实例是bg01、bg02、bg03、bg04、cy12、cy30、cy92、cy10、te03和te32。
[0028]
出于伦理原因，本发明优选不涉及可能被认为违反“公共秩序”或道德的客体。因此，在本发明的上下文中，术语“人胚胎干细胞”优选地指其分离不涉及破坏胚胎的人胚胎干细胞。换言之，术语“人胚胎干细胞”优选排除通过涉及破坏胚胎的技术分离的人胚胎干细胞。
[0029]
在本发明的上下文中，应当理解可使用不涉及破坏胚胎的任何技术，包括本文未描述的那些。
[0030]
此外，在本发明的上下文中，用于获得人胚胎干细胞的胚胎优选地是不能产生人类的胚胎，例如在体外受精(ivf)后注定要被丢弃的胚胎和仅为干细胞研究的目的创造的胚胎。
[0031]
因此，在又一个优选的实施例中，术语“人胚胎干细胞”(hesc)优选地是指从丢弃的胚胎、研究胚胎中分离的人胚胎干细胞，或优选地通过不涉及破坏胚胎的技术分离的人胚胎干细胞。
[0032]
本发明中的“诱导性多能干细胞”是指通过公知的方法等对体细胞进行重编程而被诱导从而具有多能性的细胞。具体而言，可以提及通过表达选自包括oct3/4、sox2、klf4、myc(c-myc、n-myc、l-myc)、glis1、nanog、sall4、lin28、esrrb等的重编程基因构成的群组的多个基因的组合，对例如成纤维细胞、外周血单个核细胞等的已分化体细胞进行重编程而被诱导从而具有多能性的细胞。重编程因子的优选组合的实例包括(1)oct3/4、sox2、klf4和myc(c-myc或l-myc)，和(2)oct3/4、sox2、klf4、lin28和l-myc。
[0033]
2006年yamanaka等人在小鼠细胞中建立了诱导多能干细胞。2007年又从人成纤维细胞中建立了诱导性多能干细胞，其具有与胚胎干细胞相似的多能性和自我更新能力。
[0034]
如本文所用，术语“分化”、“分化中”或“其衍生物”表示未特化或相对较少特化的细胞变得相对更特化的过程。在细胞个体发育的情境中，形容词“分化”是一个相对术语。因此，“分化的细胞”是比与之比较的细胞沿着特定发育途径进一步发育的细胞。相对更特化的细胞可以在一个或多个可证明的表型特征方面与未特化或相对较少特化的细胞不同，例如，如rna、蛋白质或其它物质的特定细胞组分或产物的存在、不存在或表达水平、某些生化途径的活性、形态学外观、增殖能力和/或动力学、分化潜能和/或对分化信号的反应等，其中这些特征表示向相对更特化的细胞分化的进程。
[0035]
在本发明的上下文中，本发明的方法导致(人)多能干细胞的逐渐分化和使细胞向rpe细胞的分化。因此，如本文所用，使细胞向rpe细胞分化的术语“分化”可被认为与术语从分化的细胞中“获得”rpe细胞同义。
[0036]
根据本发明，使用至少两种、更优选三种分化剂对(人)多能干细胞进行定向分化。
[0037]
如本文所用，“细胞标记物”是指细胞的可用于表征细胞或将其与其它细胞类型区分开的任何表型特征。标记物可以是蛋白质(包括分泌的、细胞表面的或内部的蛋白质；既可以是合成的，也可以是被细胞吸收的蛋白质)；核酸(例如mrna，或具有酶活性的核酸分子)或多糖。包括可通过对感兴趣的细胞类型的标记物具有特异性的抗体、凝集素、探针或核酸扩增反应检测的任何此类细胞组分的决定簇。标记物也可以通过生物化学或酶测定或依赖于基因产物功能的生物反应来鉴定。与每个标记物相关的是编码转录物的基因，以及导致标记物表达的事件。如果标记物的表达水平比可接受的对照至少高出50％(就抗体或pcr测定中测量的总基因产物而言)或以30％的更高频率表达(就群体中的阳性细胞而言)，则称该标记物优先在未分化或分化的细胞群中表达。
[0038]
可通过本身已知的方法例如视网膜祖细胞标志物的表达来确定获得的细胞是否是视网膜祖细胞或rpe细胞。作为视网膜祖细胞标志物的实例，可以提及pax6(神经视网膜祖细胞、视网膜色素上皮祖细胞)、rax(神经视网膜祖细胞)和mitf(视网膜色素上皮祖细胞)。
[0039]
在一个实施例中，可使用免疫学技术检测组织/细胞特异性标志物。实例包括但不
fibroblast,pmef)、小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,mef)、小鼠胎儿成纤维细胞(murine fetal fibroblast,mff)、人胚胎成纤维细胞(human embryonic fibroblast,hef)、从人胚胎干细胞的分化中获得的人成纤维细胞、人胎儿肌肉细胞(human fetal muscle,hfm)、人胎儿皮肤细胞(human fetalskin cell,hfs)、人成人皮肤细胞、人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast,hff)、从脐带或胎盘中获得的人类细胞、人成人输卵管上皮细胞(human adult fallopian tubal epithelial cell,haft)和人骨髓基质细胞(human marrow stromal cell,hmsc)。通过将细胞从饲养层或细胞外基质分离以形成细胞悬浮液，从贴壁细胞培养物中获得(人)多能干细胞簇。hpsc的悬浮液包括自由漂浮的簇或从中长出成簇细胞以形成细胞簇的基本单细胞悬浮液。
[0055]
在一个实施例中，该方法的步骤a)进行至少3天，优选3至10天，更优选7天。
[0056]
在一个实施例中，人多能干细胞在至少一种例如浓度在0.01-100mm、0.1-100mm、0.1-50mm、5-50mm、或5-20mm中，优选10mm的烟酰胺(na)模拟化合物的存在下培养3至10天或7天。
[0057]
根据一个具体实施例，烟酰胺(na)模拟化合物是烟酰胺衍生物或烟酰胺模拟化合物。如本文所用，术语“烟酰胺(na)衍生物”表示作为天然na的化学修饰衍生物的化合物。
[0058]
因此，本发明的烟酰胺包括取代或未取代的烟酰胺。在另一个实施例中，化学修饰可以是单个基团的缺失或替换，例如形成na的硫代苯甲酰胺类似物，所有这些都为精通有机化学的人所理解。本发明上下文中的衍生物还包括na的核苷衍生物(例如烟酰胺腺嘌呤)。多种na衍生物被记载，一些还与pde4酶的抑制活性有关(wo03/068233)，或作为vegf受体酪氨酸激酶抑制剂(wo01/55114)。例如，制备4-芳基-烟酰胺衍生物的方法(wo05/014549)。wo01/55114和ep2128244中公开了其它示例性烟酰胺衍生物。
[0059]
烟酰胺模拟化合物包括烟酰胺的修饰形式和烟酰胺的化学类似物，它们概括了烟酰胺在rpe细胞从多能细胞分化和成熟中的作用。示例性的烟酰胺模拟化合物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸和6-氨基烟酰胺。另一类可用作烟酰胺模拟化合物的化合物是聚(adp-核糖)聚合酶(parp)的抑制剂。示例性的parp抑制剂包括3-氨基苯甲酰胺、伊尼帕尼(iniparib,bsi 201)、奥拉帕尼(olaparib,azd-2281)、卢卡帕尼(rucaparib,ag014699,pf-01367338)、维利帕尼(veliparib,abt-888)、cep 9722、mk 4827以及bmn-673。
[0060]
在一个实施例中，烟酰胺(na)模拟化合物是本方法的第一分化剂。
[0061]
在一个优选的实施例中，烟酰胺(na)模拟化合物是烟酰胺。
[0062]
在一个优选的实施例中，烟酰胺的浓度为约10mm。
[0063]
在一个实施例中，该方法的步骤b)进行至少3天，优选3至10天，更优选7天。
[0064]
根据一个实施例，该方法包括在存在至少一种烟酰胺(na)模拟化合物的情况下培养hpsc之后，用tgfβ生长因子超家族的至少一种成员处理在步骤a)中获得的分化的细胞。
[0065]
不受理论的束缚，据信至少一种烟酰胺(na)模拟化合物充当分化诱导剂/促进剂，并且类似地，tgfβ超家族的至少一种成员充当rpe分化促进因子。此外，不受理论束缚，据信hpsc预先暴露于至少一种烟酰胺模拟化合物，为分化的细胞提供了使它们能够响应tgfβ超家族的至少一种成员的rpe分化促进作用的特性。
[0066]
在一个实施例中，所述转化生长因子-β(tgfβ)超家族的至少一个成员选自带有tgfβ亚家族、激活素(activin)、nodal和一些生长和分化因子(gdf)的转化生长因子样
(tgf-like)组和带有bmp、gdf和抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone,amh)的骨形态发生蛋白样(bmp-like)组构成的组。
[0067]
在一个实施例中，转化生长因子-β(tgfβ)超家族生长因子是例如tgfβ1、tgfβ2和tgfβ3亚型的转化生长因子-β蛋白，以及包括激活素例如激活素a、激活素b和激活素ab的同源配体。
[0068]
在一个实施例中，转化生长因子-β(tgfβ)超家族生长因子是nodal、抗苗勒管激素(amh)、一些骨形态发生蛋白(bmp)，例如bmp2、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6和bmp7，以及生长分化因子(gdf)。
[0069]
在一个优选的实施例中，转化生长因子β(tgfβ)超家族的至少一个成员是激活素a。
[0070]
在一个实施例中，在本发明方法的步骤b)中产生的细胞包含其中至少部分或至少大部分人多能干细胞已开始分化的细胞群。
[0071]
关于补充生长因子的tgfβ超家族的至少一个成员，所述成员以可溶形式存在或附着或结合到添加到培养体系的基质或细胞上，或者该组分可以结合或复合其它物质。
[0072]
在另一个实施例中，培养基中所述tgfβ超家族成员的量小于20ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或甚至小于0.1ng/ml。
[0073]
在一个实施例中，激活素a的浓度为约10ng/ml。
[0074]
在一个实施例中，步骤(b)中的培养基基本上或完全不含有本方法的步骤a)中使用的第一分化剂(至少一种烟酰胺(na)模拟化合物)。
[0075]
在一个实施例中，该方法的步骤c)进行至少20至50天，优选20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天，更优选28天。
[0076]
在一个实施例中，所述至少一种wnt经典途径激活剂是选自由3f8,1-azakenpaullone,10z-humenialdisine,阿特波龙(alsterpaullone),al 070722,ar-a014418,azd1080,azd2858,bikinin,bio,卡保罗酮(cazpaullone),ct98014,ct98023,ct99021(chir99021),chir98014,二溴坎萨林(dibromocantharelline),gskj2,hmk-32,2,5-乙炔二醇(hymenialdesine),靛玉红(indirubin),靛玉红-3'-单肟(indirubin-3'-omime),im-12,kenpauuone,l803,l803-mts,碳酸锂,ly2090314,曼扎明(manzamine)a,美迪宁(meridianin),ncs693868,np031115,帕利林(palinurine),sb216763,sb415286,tcs21311,tc-g-24,tcs2002,tdzd-8,替德格斯(tideglusib),曲卡汀(tricantine)以及tws119构成的组的gsk-3抑制剂。
[0077]
在一个优选的实施例中，wnt经典途径的至少一种激活剂是chir99021。
[0078]
在一实施例中，chir99021的浓度为约10ng/ml。
[0079]
在一个实施例中，步骤(c)中的培养基基本上或完全不含有本方法的步骤a)和b)中使用的所述第一分化剂和所述第二分化剂。
[0080]
在一个优选的实施例中，步骤(c)中的培养基基本上或完全不含有分别在步骤a)和步骤b)中使用的至少一种烟酰胺(na)模拟化合物和转化生长因子β(tgfβ)超家族的至少一种化合物。
[0081]
在一个实施例中，向培养基中添加所述第二分化剂或所述第三分化剂的时间没有
特别限制，只要可以通过本领域技术人员已知的任何技术测量或估计渐进的分化效果即可。例如，可通过检测表达rax、pax6、mitf或vsx2的细胞的存在来确认分化中的细胞(即视网膜祖细胞)或rpe细胞的存在。
[0082]
所述技术人员能够跟踪细胞分化的进程，并且能够确定添加所述第二分化剂和所述第三分化剂的合适时间。
[0083]
在一个实施例中，培养在步骤a)中获得的分化的细胞的步骤产生包括至少50％、60％或优选70％的分化的细胞的分化中的细胞群。
[0084]
在一个实施例中，培养步骤b)中获得的分化中的细胞的步骤产生包含超过50％、60％或优选70％或80％的分化的细胞的分化中的细胞群。
[0085]
在一个实施例中，促进人多能干细胞定向分化为视网膜色素上皮(rpe)细胞的自动化方法依次包括或由以下步骤依次构成：
[0086]
(a)在补充有烟酰胺的培养基中培养人多能干细胞以产生分化中的细胞；
[0087]
(b)在补充有激活素a的培养基中培养在步骤a)中获得的所述分化中的细胞以进一步分化所述分化中的细胞；
[0088]
(c)在补充有chir99021的培养基中培养在步骤b)中获得的所述进一步分化中的细胞以诱导所述进一步分化中的细胞分化为rpe细胞。
[0089]
在一个实施例中，在分化阶段(即在步骤a)至c))期间，每2至3天更换一次培养基。
[0090]
在一个实施例中，该方法还包括以下步骤：
[0091]
(d)处理在步骤c)中获得的细胞群以去除未带有色素的细胞。
[0092]
不受理论的束缚，在步骤c)中获得的细胞群包含rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞。
[0093]
hpsc衍生的rpe细胞在培养中形成粘性上皮，需要与酶解试剂长时间孵育才能触发细胞脱离，以便进一步重新接种和扩增。该特性用于通过执行两步酶解程序来丰富rpe细胞的培养物，该程序包括或由以下构成：清洗(第一次短孵育时间)以去除贴壁弱的非rpe细胞，然后进行酶处理(第二次孵育)以产生均一的rpe细胞群。
[0094]
因此，在一个优选的实施例中，该方法的步骤d)是两步解离程序，包括或由以下构成：清洗和以酶促方式处理细胞。
[0095]
在一个实施例中，这是以酶促方式进行的。
[0096]
在一个优选的实施例中，酶处理是用胰蛋白酶、tryple胰蛋白酶-edta或进行的。
[0097]
在另一个实施例中，步骤d)可以包括机械、酶促和化学处理的组合——例如使用细胞刮刀或edta。
[0098]
该方法的自动化过程如图3所示。
[0099]
在手动培养方法中，酶解和非酶解试剂通常在细胞转移到新鲜培养基容器之前通过离心去除。然而，在本发明的自动化方法中，优选传代不包括离心步骤。这部分是由于将离心机集成到自动化细胞培养系统中的难度和相当大的费用。一个优点是避免将细胞暴露于离心产生的剪切力。
[0100]
在一个实施例中，所述方法还包括以下步骤：
[0101]
(e)将步骤d)中获得的细胞扩增至少两代。
[0102]
rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞的扩增可以在细胞外基质例如明胶、胶原蛋白i、胶原蛋白iv、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白521)、纤连蛋白和聚d-赖氨酸上实现。对于扩增，细胞可以在无血清kom、含血清培养基(例如含有4％人血清的dmem)或nutristem培养基中培养。在这些培养条件下在合适的条件下传代后，色素细胞：非色素细胞的比例增加，从而获得纯化的rpe细胞群。这些细胞显示出rpe细胞的特征多边形形态和色素沉着。
[0103]
rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞可以在悬浮液或单层中扩增。rpe细胞在单层培养物中的扩增可以通过本领域技术人员公知的方法修改为生物反应器中的大规模扩增。
[0104]
根据本发明的这个方面，在该方法的步骤d)中，将分化中的细胞和/或rpe细胞从培养容器中取出。
[0105]
根据一个实施例，所述扩增阶段进行至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周，至少9周或甚至10周。优选地，所述扩增阶段进行1周-10周，更优选2周-10周，更优选3周-10周，更优选4周-10周，或4周-8周。
[0106]
在一个优选实施例中，在扩增阶段，培养基每2-3天更换一次。
[0107]
在不同实施例中选择的精确比例和频率将取决于培养的细胞类型、培养基、培养容器的类型和其它培养参数，并且可由用户容易地确定。
[0108]
根据又一个实施例，rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞在扩增阶段传代至少1次、在扩增阶段传代至少2次、在扩增阶段传代至少3次、在扩增阶段传代至少4次、在扩增阶段传代至少5次或在扩增阶段传代至少6次。
[0109]
rpe细胞和/或分化中的细胞的扩增群体的收获可使用本领域已知的方法(例如使用例如胰蛋白酶的酶，或使用edta以化学方式)来实现。
[0110]
在一个实施例中，传代需要分化中的细胞的解离，通过向第一培养容器中加入细胞解离试剂来方便地进行解离。细胞解离试剂可以是酶促细胞解离试剂，例如胰蛋白酶-edta，或accutase，或非酶促细胞解离试剂。
[0111]
在一个实施例中，所述传代包括对从第一培养容器转移的细胞进行计数，优选使用形成为机器人细胞培养设备的一部分的自动细胞计数装置。计数后，将预定数量的细胞转移到每个另外的培养容器中。
[0112]
在其它实施例中，不计算从第一培养容器转移的细胞的实际数量。相反，细胞数量是基于正在使用的特定培养方案下的培养容器的大小和rpe细胞和/或分化中的细胞的生长特征来估计的。因此，传代可包括基于以下一项或多项计算从第一培养容器转移的细胞数量：(i)第一培养容器中rpe细胞和/或分化中的细胞的初始数量，(ii)rpe细胞和/或分化中的细胞的群体倍增时间，(iii)第一个培养容器的培养面积和(iv)培养体积或表面。应当理解，在计算给定培养时间后获得的贴壁rpe细胞和/或分化中的细胞的数量时，第一个培养容器的培养面积尤其相关，而在计算悬浮生长的rpe细胞数时，培养体积或表面将尤其相关。
[0113]
或者，可以选择使细胞传代，以便来自第一个培养容器的细胞在预定数量的其它培养容器之间进行分配。例如，在本发明的优选实施例中，rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞和/或分化中的细胞以1:2至1:10，优选1:2至1:5的分传比(split ratio)传
代。
[0114]
在本发明的进一步实施例中，当第一培养容器中的rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞达到预定百分比汇合(或者，在悬浮细胞的情况下，达到预定细胞密度)时进行传代。通常，当第一培养容器中的rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞50至100％汇合，优选60至90％汇合，更优选70至80％汇合时进行传代。在一个优选的实施例中，当第一培养容器中的rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％汇合时进行传代。
[0115]
在本发明的自动化方法中，希望的是计算汇合百分比而不是在每次传代之前由操作者确定。因此，在优选的实施例中，基于以下一项或多项计算汇合百分比：(i)培养容器中最初存在的rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞的数量，(ii)rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞的群体倍增时间，(iii)第一个培养容器的培养面积以及(iv)培养体积或表面。在其它实施例中，汇合被自动记录和/或估计。
[0116]
在一个优选的实施例中，所述传代包括(i)在第一容器中解离rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞以形成悬浮液；(ii)将rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞转移至至少两个另外的培养容器；以及(iii)培养rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞直到rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞50％至100％汇合，其中所述传代不包括离心步骤。
[0117]
优选地，重复所述传代直到已经生产预定数量的含有rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞的培养容器或预定数量的rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞。在一些实施例中，将基于rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞的生长特征以及先前的工艺步骤(例如传代数)预估已经生产预定数量的rpe细胞的时间点。还可以通过计算每个培养容器的产量，并将该值乘以含有已经生产的rpe细胞和/或向rpe细胞分化的分化中的细胞的培养容器的数量，来计算获得的分化中的细胞或rpe细胞的数量。
[0118]
根据本发明的另一个实施例，hpsc在其中分化的培养基是本领域已知的用于支持体外细胞生长的任何已知细胞培养基，通常是包含确定的碱溶液的培养基，其包括盐、糖、氨基酸和培养物中维持细胞处于存活状态所需的任何其它营养物质。
[0119]
根据本发明的优选实施例，所述培养基不是条件培养基。根据本发明可使用的市售基础培养基的非限制性实例包括nutristem(不含用于esc分化的bfgf和tgfp，具有用于esc扩增的bfgf和tgfp)、neurobasal
tm
、ko-dmem、dmem、dmem/f12、cellgro
tm
干细胞生长培养基或x-vivo
tm
。基础培养基可补充有本领域已知的处理细胞培养物的多种试剂。
[0120]
在一个实施例中，用于本方法的培养基是含血清培养基或无血清培养基。
[0121]
在一个实施例中，用于本方法的培养基是含有敲除血清替代物(kosr)的培养基。
[0122]
为了避免化学上不确定成分的污染，在本发明中优选使用无血清培养基。为避免复杂的制备，例如，优选使用补充有适量市售血清替代品如ksr等的无血清培养基(例如，imdm和f-12的1:1混合物培养基，其中补充有10％ksr、450μm 1-单硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物(chemically defined lipid concentrate)，或补充有5％-20％ksr、neaa，丙酮酸，2-巯基乙醇的gmem培养基)。在人多能干细胞的情况下，ksr添加至无血清培养基的量通常为约1％至约30％，优选约2％至约20％(例如，约5％、约10％).
[0123]
在一个实施例中，在该方法的步骤a)中，dmem培养基补充有20％ksr。
[0124]
在一个实施例中，在该方法的步骤b)中，dmem培养基补充有20％ksr。
[0125]
在一个实施例中，在该方法的步骤c)中，dmem培养基补充有20％ksr。
[0126]
在一个实施例中，在该方法的步骤e)中，dmem培养基补充有4％ksr。
[0127]
根据本技术的一些实施例，该方法的步骤(a)、(b)、(c)和(e)包括定期更换全部或部分培养基。例如，可通过移液或通过将用过的培养基倾倒到废物处中来从培养容器中去除全部或一部分培养基，然后可添加新鲜培养基。如果要通过移液去除培养基，可定位培养容器以帮助去除培养基。
[0128]
替换或添加的培养基体积的比例在本发明的不同实施例之间会有所不同，并且可以是培养基体积或表面的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
[0129]
本发明的方法可适用于任何类型的培养容器，包括组织培养烧瓶、培养皿和多孔板。然而，在生产大量rpe细胞时使用烧瓶很方便，因为这有利于减少获得给定数量细胞所需的处理步骤数量，从而降低处理过程中细胞损伤的可能性。
[0130]
在一个实施例中，使用t75或t175组织培养容器。
[0131]
在另一个实施例中，使用培养室(例如)。
[0132]
根据一个实施例，步骤a)至e)中的细胞在正常大气氧条件下在贴壁基质上培养。
[0133]
贴壁基质的实例包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、聚d-赖氨酸、胶原蛋白和明胶。
[0134]
根据本发明的优选实施例，增殖/生长培养基不含异种污染物，即不含动物来源的成分，例如血清、动物来源的生长因子和白蛋白。
[0135]
收获后，可任选地使用本领域已知的方法冷冻保存扩增的rpe细胞群和/或分化中的细胞。适用于冷冻保存的培养基的实例包括但不限于90％人血清/10％dmso、cryostor 10％、5％和2％，以及干细胞冻存液(stem cell banker)。
[0136]
细胞的表征
[0137]
在一个实施例中，在整个过程中使用位于自动化细胞培养平台的受控环境内的自动化活细胞成像系统监测人多能干细胞向rpe细胞的分化。这种非侵入性细胞成像系统可实时提供细胞汇合度度量和已处理培养容器的相差图像。因此，对分化方案的每个步骤进行监控，以防止偏离规格限制。
[0138]
在电子显微镜(em)分析中，rpe细胞显示出成熟rpe细胞的形态特征如顶端绒毛(apical villi)、紧密连接和基底膜，这些特征在源自自发分化的hpsc的rpe样细胞中没有表现出来。通过本公开的方法产生的rpe细胞可用于此类细胞的大规模和/或长期培养。为此，本发明的方法将在适合大规模生产细胞的生物反应器或机器人细胞系统中进行，并且其中将根据本发明培养未分化的hpsc。在生物反应器中培养细胞的一般要求是本领域技术人员所熟知的。
[0139]
根据本文所述的方法产生的rpe细胞群根据许多不同的参数进行表征。例如，获得的rpe细胞是多边形和带有色素的(pigmented)。
[0140]
应当理解，本文公开的细胞群没有未分化的hpsc。根据一个实施例，例如通过facs测量，小于1:250,000的细胞是oct4 tra-1-60 细胞。
[0141]
本发明该方面的rpe细胞不表达多能干细胞标志物。所述一种或多种胚胎干细胞标志物可以包括oct-4、nanog、rex-1、碱性磷酸酶、sox2、tdgf-β、ssea-3、ssea-4、tra-1-60
和/或tra-1-81。
[0142]
相对于非rpe细胞，rpe制备物可以是基本上纯化的，包括至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％rpe细胞。
[0143]
表征本文公开的细胞群的另一种方式是通过标记物表达。因此，例如，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、90％、95％或100％的所述细胞表达bestrophin 1。根据一个实施例，80-100％的所述细胞表达bestrophin 1。
[0144]
根据另一个实施例，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的所述细胞表达小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,mitf)。例如，80-100％的所述细胞表达mitf。
[0145]
根据另一个实施例，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的所述细胞表达小眼畸形相关转录因子(mitf)和bestrophin 1。例如，80-100％的所述细胞共表达mitf和bestrophin 1。
[0146]
根据另一个实施例，如通过免疫染色或facs所测量的，至少50％、60％、70％、80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的所述细胞表达配对盒基因6(paired box gene 6,pax-6)。
[0147]
根据另一个实施例，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达细胞视黄醛结合蛋白(cellular retinaldehyde binding protein,cralbp)。例如，85-100％的所述细胞表达cralbp。
[0148]
根据另一个实施例，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的所述细胞表达视网膜色素上皮细胞特异性蛋白65抗体(retinal pigment epithelium-specific protein 65kda,rpe65)。例如，80-100％的所述细胞表达rpe65。
[0149]
rpe细胞通常共表达指示终末分化的标志物，例如bestrophin 1、cralbp和/或rpe65。
[0150]
在扩增阶段之后获得包括rpe细胞的细胞群，由此至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79、80％、81％、82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％甚至100％是cralbp 、pmel17 。
[0151]
在一些实施例中，该方法进一步包括以下步骤：
[0152]
(f)收获和储存rpe细胞。
[0153]
仪器说明
[0154]
用于实施本发明方法的装置选自多种可用的用于细胞培养的自动化平台中的任一种，并适用于大规模生产干细胞或源自干细胞的分化的细胞。
[0155]
申请人使用由sartorius制造的compact平台获得了良好的结果，但是应当理解，其它系统可以适用于提供根据本发明的设备，并能够用于执行本发明的方法。
[0156]
在一个实施例中，本发明提供适用于或布置用于实施本发明的方法的设备。因此，本发明提供一种用于大规模自动化生产细胞的设备，所述设备包括：a)用于处理培养容器的机器人装置；b)用于将细胞接种到培养物中的装置；c)用于改变或添加培养基到培养物中的装置；以及d)可编程控制装置；其中该设备适用于hpsc向rpe细胞定向分化的阶段和细胞传代的阶段。
disease)、视网膜脱离、回旋状萎缩、无脉络膜症、图案状营养不良(pattern dystrophy)以及rpe的其它营养不良、斯塔加特病(stargardt disease)以及由于光损伤、激光损伤、炎症、感染、辐射、新生血管或外伤中的任何一种造成的损伤导致的rpe和视网膜损伤。
[0170]
可以将如本文所述产生的rpe细胞移植到受试者眼睛内或其它位置(例如脑中)内的各种靶位点。根据一个实施例，将rpe细胞移植到眼睛的视网膜下间隙，这是rpe的正常解剖位置(在感光器外节段和脉络膜之间)。此外，根据细胞的迁移能力和/或正向旁分泌作用，可以考虑移植到额外的眼部隔室中，包括玻璃体空间、内部或外部视网膜、视网膜周边和脉络膜内。
[0171]
可以向受试者施用的活细胞的数量通常在每次注射50,000个-5x106个之间。
[0172]
细胞通常配制在载体(例如等渗溶液和/或生理盐水)中，例如bss plus
tm
。其它考虑的解决方案包括冷冻保存的解决方案，例如cryostor 5或cryostor2。
[0173]
可以通过本领域已知的各种技术进行移植。例如，美国专利号5,962,027、6,045,791和5,941,250中描述了进行rpe移植的方法。
[0174]
施用步骤可以包括将rpe细胞眼内施用到有需要的眼中。眼内施用可包括将rpe细胞注射到视网膜下空间。
[0175]
根据一个实施例，通过玻璃体切除术进行移植，然后将细胞通过小的视网膜开口输送到视网膜下空间或直接注射。
[0176]
本发明提供一种药物组合物，其含有有效量的视网膜组织或视网膜细胞(例如，视网膜祖细胞、视网膜层特异性神经细胞)，该视网膜组织或视网膜细胞是通过本发明的制备方法制备的。
[0177]
该药物组合物含有有效量的通过本发明的制备方法制备的视网膜组织或视网膜细胞(例如，视网膜祖细胞、视网膜层特异性神经细胞)和药学上可接受的载体。
附图说明
[0178]
图1:(a)视网膜发育的示意图。h，下丘脑；ov，视泡；l，晶状体；nr，神经视网膜；rpe，视网膜色素上皮；os，视杆。(b)实时pcr，在na存在下分析rpe标记物的表达。通过rt-qpcr量化相对基因表达，并在第0天将其标准化为mrna表达(n＝3，平均值
±
sd)。控制条件对应于rpe 20％ksr培养基。
[0179]
图2：定向分化方案改善了rpe分化。(a)定向分化方案的示意图(黑星：细胞污染物)。
[0180]
图3：使用compact select自动化平台对hesc-rpe细胞进行自动传代的流程图。
[0181]
图4：无需手动选择即可自动分化和扩增纯hesc-rpe细胞群。(a)培养21天后第2代rpe标记物mitf和pax6的代表性免疫荧光和定量。细胞核被dapi染色。(b)通过rt-qpcr量化的rpe标记物的相对基因表达(n＝3,平均值
±
sd)。(c)色素沉着标记tyrp1的代表性流式细胞术直方图。
[0182]
图5：在开始emt之前，通过自动分化获得的hesc-rpe细胞可以培养至第3代。(a)第21天第3、4和5代hesc-rpe细胞的光学显微镜图像。(b)通过rt-qpcr量化的emt(lum和fn1)和rpe(mitf和best)标记物的相对基因表达(n＝3，平均值
±
标准差)。
[0183]
图6：自动化hescrpe细胞生产过程的示意图。可以使用compact selectet系统自
动化平台执行步骤2到5，可以使用自动冷冻管归档系统fill it和受控速率冷冻系统cryomed执行步骤6。
[0184]
图7：compact平台概述：(a)烧瓶转盘培养器，(b)平板培养器，(c)培养基泵，(d)开盖装置，(e)机械臂，(f)移液器头以及(g)incucyte活细胞分析系统。
具体实施方式
[0185]
实施例：
[0186]
方法
[0187]
人工hesc培养和rpe细胞分化
[0188]
使用mtesr
tm
培养基(stemcell technologies)和hesc合格基质胶(corning)在无饲养层条件下使用和培养临床级hesc系rc-0913。在第36代储存细胞并用于第38代和第45代之间的rpe分化。所述细胞以5
×
104个细胞/cm2铺板并生长直至达到80％汇合，然后切换到由dulbecco改良eagle培养基(dulbecco's modified eagle medium,高葡萄糖，thermo fisher scientific)组成的分化培养基，该培养基补充有50μmβ-巯基乙醇、1
×
最低必需培养基—非必需氨基酸(thermo fisher scientific)和20％(第0天-第42天)或4％(传1代后)的敲除血清替代品(ksr，thermo fisher scientific)。在所有分化过程中，每2、3天更换一次培养基。
[0189]
通过hesc的自发分化获得hesc-rpe细胞。简而言之，hesc生长至汇合并切换到缺乏bfgf的培养基中。然后在立体显微镜下用精细的15度眼科刀切开色素斑块，并铺到涂有hesc合格基质胶(corning)的培养皿上。
[0190]
对于所提到的“定向分化”方案，在特定时间点依次添加10mm烟酰胺(sigma)，100ng/ml激活素a(peprotech)和3μm chir99021(tocris)到基础分化培养基中(图2a)。
[0191]
分化的rpe的表征
[0192]
实时定量聚合酶链反应
[0193]
使用rnaeasy plus mini试剂盒(qiagen)提取总rna，使用superscript iii(invitrogen)合成cdna。使用带有higreen qpcr master mix(thermo fisher scientific)的quant studio 12k flex(applied biosystems)进行实时定量rt-pcr。引物序列列于表1中。每个板至少进行三个技术重复实验，将表达水平标准化为18s。通过计算2-δδct确定与hesc基因表达水平相比的相对表达。
[0194]
[0195][0196]
表1：定量逆转录聚合酶链反应(qrt pcr)引物列表。
[0197]
免疫染色
[0198]
hesc-rpe细胞在基质胶包被的96或24孔板上生长。在室温(rt)下，贴壁细胞在4％pfa中固定10分钟，并用pbs冲洗3次。在室温下在封闭溶液(0.1％triton pbs中10％fbs)中放置30分钟后，将细胞与一抗在4℃下孵育过夜(抗体列于表2)。在pbs中清洗3次后，在存在dapi(invitrogen)的情况下，在室温下以1:500加入适当的alexa fluor偶联二抗(invitrogen)1小时。
[0199]
[0200][0201]
表2：一抗列表。
[0202]
图像采集与分析
[0203]
使用带有hamamatsu orca-flash 4.0相机和转盘单元(yokogawa csu-x1-a1n-e；camera eve，emccd 512)的axio observer z1显微镜(zeiss)通过metamorph软件，或使用lsm-800共聚焦显微镜(zeiss)通过zen软件获取图像。使用fiji软件导出、分析和处理图像。对于zx图像，覆盖细胞宽度的xy stack(0.33μm z步长)在zx中重新切片。在使用fiji软件手动划定培养皿区域后，对着色区域进行量化。然后使用固定强度阈值将图片二值化为8位图像，并测量黑色区域百分比(此处未显示)。
[0204]
流式细胞术
[0205]
将细胞与培养板分离，在室温下在4％pfa中固定10分钟，然后用含有0.1％triton的pbs透化30分钟，然后在室温下用tyrp1抗体标记1小时。在4℃下对新鲜解离的细胞进行15分钟细胞表面标志物tra-1-81和ssea4的标记。然后将细胞与荧光染料偶联一抗在室温下孵育30分钟，并用pbs冲洗两次。使用的抗体及其工作稀释度列在补充表2中。使用细胞macsquant分析仪(miltenyibiotec)分析细胞。根据荧光减一(fmo)对照或用同型对照抗体标记的样品绘制门。使用flowjo软件(tree star,ashland,or)分析数据。
[0206]
吞噬作用测定
[0207]
将hesc-rpe细胞暴露于纯化的fitc标记的猪的光感受器外段(e.nandrot博士的礼物)中24小时。用pbs清洗后，将细胞固定在冷甲醇中并用dapi标记。用lsm-800共聚焦显微镜(zeiss)拍摄图像。将源自hesc的rpe细胞也在37℃下暴露于phrodotm green zymosan bioparticlestm(thermo fisher scientific)过夜。这些颗粒对ph敏感，并在细胞进入和吞噬体形成后发出荧光。作为阴性对照，在4℃下进行吞噬作用测定以阻断吞噬过程。然后使用酶标仪(clariostar-bmg labtech)读板，并将值标准化为dapi强度。
[0208]
通过elisa测定对vegf进行定量
[0209]
根据制造商的说明，使用人vegf quantikine elisa试剂盒(r&dsystem)一式三份进行vegf测量。
[0210]
统计分析
[0211]
所有实验一式三份进行。在xlstat软件中进行汇总统计分析。使用未配对t检验进行实验之间的比较，统计显著性确定为*p《0.05，**p《0.01。
[0212]
结果
[0213]
连续使用烟酰胺、激活素a和chir99021通过概括视网膜发育的主要步骤来改善rpe分化
[0214]
为了简化以前的定向分化方案以进行自动化，评估了依次简单使用烟酰胺、激活素a和chir99021(称为“定向方案”)是否能改善贴壁hesc的rpe细胞分化而足以绕过手动富
集。“定向方案”的效率与经典的自发分化之一进行了比较。
[0215]
通过评估早期眼区(eye field)阶段、视泡阶段和未成熟rpe细胞在分化过程中的不同时间点的标志物的表达，检查了nic、激活素a和chir99021的顺序使用是否可以概括视网膜发育的主要步骤(图1a)。与自发方案相比，在分化的前7天使用烟酰胺显著增强了早期眼区转录因子six同源框3(six3)和视网膜同源框(rax)的瞬时表达，同时使多能性标记nanog的mrna表达水平显著降低(p《0.01；图1b)。通过在烟酰胺处理后的第7天，大多数细胞共表达lim同源框2(lhx2)和配对框6(pax6)蛋白(86.8％
±
4.3％，n＝3)，而只有44.3％(
±
2.2％,n＝3)的未处理细胞表达这两种标记，在蛋白水平确认了该眼区特化(eye field specification)。总体而言，这些数据表明，添加烟酰胺7天可促进hesc从其多能状态向眼区谱系的退出，其效率高于自发分化。
[0216]
与自发分化相比，从第7天到第14天，连续使用激活素a显著增加了两种参与视泡图案形成(optic vesicle patterning)的转录因子的mrna水平表达，即视觉系统同源框2基因(vsx2，也称为chx10)和黑素细胞诱导转录因子(mitf)(图1b，p≤0.05)，vsx2在第14天出现表达峰值。同时，发现rax和six3 mrna水平均降低。通过免疫荧光测定证实了视泡标志物vsx2和mitf的诱导。在第10天观察到共表达这两种蛋白质的细胞簇。相比之下，在第14天，表达vsx2的细胞与表达mitf的细胞不同，表明这两种基因的快速共抑制。
[0217]
最后，从第14天到第35-42天，从vsx2 mrna表达水平的急性降低(图1b)和mitf表达的持续增加所见，通过chir99021处理激活经典wnt信号通路诱导rpe定型(commitment)。与自发方案相比，mitf表达在第14天和第30天之间显著上调(p《0.01)。免疫染色分析证实，第21天没有vsx2阳性细胞，mitf 细胞数量增加(87.5％
±
12.5％)。在这个阶段，推定的rpe前体mitf阳性细胞出现并组织围绕于不表达mitf和vsx2的3d结构。
[0218]
确定分化6周后rpe细胞诱导的效率。在第42天，具有暴露于定向方案的细胞的培养皿大部分(培养区域的72.96％
±
1.94％，n＝3)被色素细胞覆盖。相比之下，自发方案只可见个别的色素沉着斑块(生长面积的3.481％
±
1.12％，p《0.01)。重要的是，在使用定向方案进行分化42天后绝大多数细胞获得了rpe细胞的两个标志物，共表达的pax6和mitf(82.2％
±
3.2％，n＝3)。
[0219]
综上所述，这些结果表明，与自发分化相比，连续使用烟酰胺、激活素a和chir99021概括了视网膜发育的主要步骤，并在42天内有效地使hpsc定向分化为高度富集的rpe群。因此，通过定向方案分化的细胞可以直接放大，而自发方案需要事先手动选择rpe簇。
[0220]
在第42天，将细胞与tryple试剂(thermo fisher scientific)孵育10分钟以去除细胞污染物，然后用pbs清洗并与tryple试剂重新孵育35分钟以允许rpe解离。然后将细胞以1/5的最终稀释度接种在涂有hesc合格基质胶(corning)的培养皿中。
[0221]
成熟的hesc-rpe细胞在第1代或第2代被分离并使用cryostor cs10培养基(stemcell technologies)在液氮蒸气中冷冻保存。
[0222]
自动rpe分化过程
[0223]
compact(sartorius)是一种全自动细胞培养平台，允许在受控环境中扩增和分化大批量贴壁细胞(图7)。该系统允许实现培养基更换和细胞传代的自动化以及使用自动化活细胞成像系统incucyte(sartorius)对培养容器的进行监测。与手动方案相
反，细胞在解离后不离心，而是直接接种到具有足够培养基的新烧瓶中，以确保子烧瓶中试剂的最终浓度不超过5％。自动化过程如图3所示。
[0224]
定向方案允许获得纯的hesc-rpe细胞群，无需手动富集，并且可以实现分化的自动化。
[0225]
使用“定向分化”方案，通过使用compact自动化平台执行培养基更换和酶传代，建立了一个完全自动化的过程。这种自动化细胞培养平台由一个培养器、以条形码标记用于细胞过程跟踪的烧瓶、用于分配培养基的多个连接泵、一个六轴拟人机械臂和一个活细胞成像系统(incucyte)组成(图3和图7)。
[0226]
自动化从将hpsc接种到75cm2烧瓶开始。然后，在机器人中通过培养基切换启动细胞增殖和分化，直到第42天。在这个阶段，hesc-rpe细胞在培养中形成粘性上皮，需要与解离试剂长时间孵育以触发细胞脱离以进一步重新接种和扩增。为了最大限度地消除细胞污染物，其通过使用进行差异解离处理(differential dissociation treatment)来利用这一特性(图3)。
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在第42天，通过使用express进行10分钟的第一次短时间孵育，然后冲洗，能够去除绝大多数对烧瓶贴壁性低于rpe细胞的无色素细胞。
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然后进行35分钟的第二次酶孵育，使rpe细胞脱离和解离。
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由于自动化系统不包括任何离心机，因此无法去除用于分离rpe细胞的tryple。因此，评估传代后残留在培养基中的最后5％的是否不影响细胞的重新贴壁和生长。观察到在5％存在下或离心步骤后重新铺板的细胞之间没有差异(数据未显示)。还检查了稀释的的存在不影响rpe的特性，并且同样没有检测到rpe基因表达在酶传代有无离心之间的差异(数据未显示)。
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在2次自动传代后，94.7％
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0.2％(n＝3)的细胞共表达两种转录因子pax6和mitf，表明hesc-rpe细胞群与手动富集后获得的细胞群相当。rtqpcr还检测到晚期rpe标记物(如rpe65和cralbp)的基因表达水平与手动自发分化方案获得的细胞相似(图4b)。通过流式细胞术进一步表征细胞群，发现96.8％
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1.9(n＝3)的细胞在第2代表达色素沉着标记酪氨酸酶相关蛋白1(tyrp1)(图4c)。
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所有这些数据都表明我们能够在自动化系统中获得纯正的hesc-rpe细胞，且其质量与通过广泛使用的自发分化方法获得的细胞相似。
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通过自动分化获得的hesc-rpe细胞是成熟的和功能性的。
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与从hpsc分化的细胞有关的重要问题是它们的成熟度和功能。作为上皮成熟度的指标，评估了特定rpe标记物的顶端——基底极化。正如预期的那样，hesc-rpe细胞在它们的顶端膜均匀表达微绒毛蛋白ezrin(95.0％
±
2.8％,n＝3)、紧密连接标记物zonula occludens-1(zo-1,99.3％
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0.4％,n＝3)和mer原癌基因酪氨酸激酶受体(mertk,97.1％
±
1.1％,n＝3)，而将钙激活的氯通道，bestrophin(best,89.4％
±
3.9％,n＝3)位于基底-横向隔间。
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rpe细胞最重要的功能之一是吞噬光感受器脱落的外部节段。为了确定在自动细胞培养平台上根据此定向方案分化的细胞是否有功能，我们评估了它们吞噬猪异硫氰酸荧
光素(fitc)标记的光感受器外段的能力，并量化了ph敏感颗粒的荧光信号，这些颗粒在细胞进入和吞噬体形成后发出荧光。如顶端极限ezrin阳性下fitc信号的细胞质定位所示，hesc-rpe细胞能够吞噬fitc标记的光感受器外段。与在4℃(抑制吞噬过程的温度)下孵育的细胞相比，在37℃下用ph敏感颗粒孵育的hesc-rpe细胞的荧光强度高22.2倍。rpe功能的另一个指标是分泌多种生长因子的能力，所述生长因子包括血管内皮生长因子(vegf)。培养几周后对vegf的分泌进行定量，从培养2周开始观察到vegf分泌逐渐增加。
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所有这些结果表明，使用全自动方案从hpsc分化的rpe细胞在体外是有功能的。通过自动化分化的hesc-rpe细胞可以被放大直到第3代以产生大细胞库。
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先前的研究表明，hesc-rpe细胞在经历上皮间质转化(emt)之前具有有限的扩增潜力。与这些研究一致，尽管维持了rpe标记物mitf和best的基因表达，但通过自动化过程获得的hesc-rpe细胞从第4代开始采用间充质表型(图5b)。事实上，细胞从经典的鹅卵石组织转变为细长的细胞形态。与第3代和第4代相比，从第5代开始，这种显微观察与两种细胞外基质蛋白，间充质标记物lumican(lum)和fibronectin 1(fn1)的表达升高相关(p《0.01；图5b)。
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这表明hesc-rpe细胞发生了emt转变，但仍保持rpe的特性。因此，决定在第2代使用自动细胞库系统(fill-it，sartorius)将这些细胞储存起来，以便解冻后在第3代获得真正的hesc-rpe细胞。
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结论
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在该申请中证明，大多数这些细胞因子和补充剂对于触发有效和纯rpe细胞分化不是必需的。实际上，仅依次使用3种化合物(烟酰胺、激活素a和chir99021)就可以获得纯rpe细胞群，而无需在分化过程中进行3维培养和人工解剖色素灶。因此，这种优化的分化可适用于自动化。
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使用本技术中描述的自动分化过程，每批次可在第2代时产生约160亿个hesc-rpe细胞。这种大小的库比之前描述的范围从0.05到0.8
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109个细胞的库大得多，并且可以由监督机器人的单个操作员生产。此外，使用生长面积为1720cm2(与本研究中使用的75cm2烧瓶相比)的(corning)甚至可以显著增加每批生产的细胞数量。增加库规模的另一种方法是推迟emt。事实上，没有emt的传代次数可能会像先前描述的那样通过在培养基中添加rock抑制剂来延长。
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hpsc-rpe细胞已经以细胞悬液或极化上皮细胞的形式移植到amd患者中，这些细胞位于合成基底膜上。细胞悬浮液配方的使用大大简化了后勤和手术程序，但在动物模型中进行的几项研究表明，当细胞移植为上皮组织而不是作为细胞悬液时，rpe细胞的存活率和动物的视觉效果得到改善。在人类中，这两种方法都显示出令人满意的安全性结果和有希望的疗效结果，即使移植受者视力改善的程度和原因仍然不明确。尽管如此，考虑到目前使用1
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105hesc-rpe细胞通过这两种方法移植人眼，这里介绍的自动化过程应该允许产生足够的细胞来治疗数千名视网膜变性患者，即使某些生产步骤，例如同时储存大量冷冻管，仍然具有挑战性。
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总之，在先前公布的使用compact自动化扩增hpsc之后，描述了从hpsc解冻到分化细胞库的全自动rpe细胞分化过程。这种自动化过程是rpe分化的放大和工业化的一步，这对于治疗大量患者来说是必要的。最后，任何不需要3d培养或手动选择的分化方
案理论上都可以适应这种自动化培养系统，为从hpsc分化的许多细胞类型的生产规模化和工业化开辟了新的视角。
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该方案概括了视网膜发育的主要步骤，足以在没有手动富集的情况下获得纯rpe细胞群。一个培养机器人被编程来自动化这个方案，以升级生产过程。现在只需一轮生产，即可在12周内生产160亿个成熟且具有功能的rpe细胞。这种高效且可重复的自动化方案应该用于治疗数百万受rpe相关视网膜变性影响的患者。用于制备rpe细胞的自动化培养系统预计符合良好生产规范(good manufacturing practices，gmp)(例如，制备符合gmp)和/或当前的人体细胞组织优良操作规范(good tissue practices，gtp)(例如，制备可能符合gtp)。