PEG化的合成KL4肽、其组合物和方法与流程

peg化的合成kl4肽、其组合物和方法
1.1.领域
2.本公开内容涉及mrna作为吸入干粉制剂的肺部递送和包含所述mrna的组合物。还提供了使用和制备所述组合物的方法。
3.2.背景
4.使用核酸来操作基因表达是用于治疗许多疾病的强效治疗策略。一个实例是利用信使rna(mrna)在体内产生治疗性蛋白质[1]。在20世纪90年代首次报道了体外转录mrna技术用于在动物中生产蛋白质的成功用途[2,3]，但是，由于对mrna不稳定性、先天免疫原性的风险和体内递送低效的担心，这些早期有前景的结果并没有立即转化成临床益处。由于近十年中生物技术创新的进步，现在可以产生与未修饰的mrna相比具有增强的稳定性和降低的免疫原性以及增加的蛋白质表达的化学修饰的mrna[4,5]。然而，安全且有效的体内递送仍然是mrna治疗剂开发中的主要障碍。
[0005]
由于其非侵入性质、增加的局部药物浓度和减少的全身性副作用，由此改善治疗功效，因此通过吸入来局部给予mrna用于治疗肺部疾病是值得期望的。特别地，干粉制剂对于肺部递送是非常值得期望的。虽然液体气雾剂可以通过雾化被递送至患者的肺，但是核酸的干粉制剂提供了若干另外的优点，诸如优越的稳定性、更好的无菌性和更长的保质期[9]。然而，mrna的干粉气雾剂的制剂是非常困难的。粉末必须是高度可分散的，并且展现出用于有效的肺沉积的良好的空气动力学性质。考虑到长单链mrna分子是脆性的并且容易被热应力和剪切应力降解，在干燥过程期间必须保持mrna的完整性和生物活性[13,14]。尽管有少量文章报道mrna的液体气雾剂制剂[8,15,16]，但是迄今为止尚未报道产生用于肺部递送的治疗性蛋白质的mrna的吸入干粉制剂。由于序列中存在疏水性亮氨酸残基，kl4肽作为递送载体的临床应用受到其溶解性差的阻碍。需要提供稳定且有效的mrna递送载体。
[0006]
3.概述
[0007]
肺部递送信使rna(mrna)以产生治疗性蛋白质作为对于多种肺部疾病的疗法或疫苗具有相当大的潜力。mrna的吸入干粉制剂是特别有吸引力的，因为它具有优异的稳定性并且干粉吸入器易于使用。需要安全且有效的mrna递送载体和合适的粉体工程方法以生产可呼吸的并且在肺中介导稳健转染的制剂。
[0008]
本文提供了一种新颖的rna递送载体。在一个实施方案中，该rna递送载体是peg
12
kl4。在一个实施方案中，合成的阳离子kl4肽连接至12聚体的单分散线性聚乙二醇(peg)。在某些实施方案中，peg
12
kl4与mrna以10:1的比率(重量/重量)形成纳米尺寸的复合物，并介导对人肺上皮细胞的有效转染。在某些实施方案中，本文提供了通过喷雾干燥(sd)和喷雾冷冻干燥(sfd)技术配制成干粉的peg
12
kl4/mrna复合物。在某些实施方案中，sd和sfd粉末均展现出令人满意的用于吸入的气雾剂性质，具有分别为4.5μm和1.5μm的质量中值空气动力学直径(mmad)。在某些实施方案中，干燥之后，保持peg
12
kl4/mrna复合物的生物活性。在一个实施方案中，使用荧光素酶mrna，以5μg mrna的剂量气管内给予peg
12
kl4/mrna复合物的液体或粉末气雾剂导致转染后24h时小鼠的肺深部区域中的荧光素酶表达。转染效率优于其中荧光素酶表达更弱且仅限于气管区域的裸mrna或脂质体(lipoplexes)
(lipofectamine 2000)。单次气管内给药之后，peg
12
kl4/mrna复合物没有免疫原性或毒性的迹象。
[0009]
本文提供了一种用于肺部递送的mrna转染剂。本文还提供了具有良好体内转染效率的可吸入的干粉mrna制剂的制备。
[0010]
本文提供用于mrna递送的kl4肽系统。在一个实施方案中，亲水性聚乙二醇(peg)共价连接至kl4肽。
[0011]
此外，本文提供了两种粉体工程技术，即喷雾干燥(sd)和喷雾冷冻干燥(sfd)，以生产mrna的吸入粉末制剂。彻底评价了制剂的物理化学性质、气雾剂性能、转染效率和安全性特性。总体目标是开发安全、稳定且可靠的用于在气道中的稳健的mrna转染的递送平台，其可以应用于治疗多种呼吸道疾病或mrna疫苗。
[0012]
本文提供了一种包含阳离子kl4肽和包含6-24个单元的单分散线性peg的聚乙二醇化肽。在一个实施方案中，该肽包含12个peg单元，该肽是peg
12
kl4。在一个实施方案中，peg
12
kl4/mrna复合物包含peg
12
kl4肽和mrna。在一个实施方案中，peg
12
kl4与mrna的比率是10:1。
[0013]
本文提供了一种组合物，其包含肽、mrna和填充剂。在一个实施方案中，该填充剂是甘露醇。在一个实施方案中，该组合物呈干粉制剂。在一个实施方案中，该干粉制剂具有低于5μm的粉末尺寸。在一个实施方案中，在阶式碰撞取样器研究中，粉末具有细粒子分数》40％的分散性质。
[0014]
本文提供了一种向受试者递送mrna的方法，其包括经由吸入或经鼻给药向受试者给予peg
12
kl4/mrna复合物的步骤。在一个实施方案中，mrna被递送至受试者的肺上皮细胞。
[0015]
本文提供了一种治疗肺部疾病或提供疫苗接种的方法，所述方法包括经由吸入或经鼻给药来给予peg
12
kl4/mrna复合物的步骤。在一个实施方案中，肺部疾病是囊性纤维化或肺炎性疾病。在一个实施方案中，疫苗接种是抗流行性感冒的。
[0016]
本文提供了一种生产干粉制剂的方法，其包括以下步骤：
[0017]
(i)提供包含peg
12
kl4、mrna和填充剂的溶液；和
[0018]
(ii)喷雾干燥或喷雾冷冻干燥步骤(i)中的溶液。
[0019]
在一个实施方案中，使用喷雾干燥方法，质量中值空气动力学直径是约4.5μm。在一个实施方案中，使用喷雾冷冻干燥方法，质量中值空气动力学直径是约1.5μm。
[0020]
本文提供了一种peg
6-24
kl4/dna复合物，其包含peg
6-24
kl4肽和dna。在一个实施方案中，该peg
6-24
kl4/dna复合物是peg
12
kl4/dna复合物。在一个实施方案中，peg
12
kl4与dna的比率是10:1、15:1、或20:1。
[0021]
本文提供了一种组合物，其包含肽、dna和填充剂。在一个实施方案中，该填充剂是甘露醇。在一个实施方案中，该组合物呈干粉制剂。在一个实施方案中，该干粉制剂具有约5μm的粉末尺寸。在一个实施方案中，在阶式碰撞取样器研究中，粉末具有细粒子分数》40％的分散性质。
[0022]
本文提供了一种向受试者递送dna的方法，其包括经由吸入或经鼻给药向受试者给予peg
6-24
kl4/dna复合物的步骤。在一个实施方案中，该peg
6-24
kl4/dna复合物是peg
12
kl4/dna复合物。在一个实施方案中，dna被递送至受试者的肺上皮细胞。
[0023]
本文提供了一种治疗肺部疾病或提供疫苗接种的方法，所述方法包括经由吸入或
经鼻给药来给予peg
6-24
kl4/dna复合物的步骤。在一个实施方案中，该peg
6-24
kl4/dna复合物是peg
12
kl4/dna复合物。在一个实施方案中，肺部疾病是囊性纤维化或肺炎性疾病。在一个实施方案中，疫苗接种是抗流行性感冒的。
[0024]
本文提供了一种生产干粉制剂的方法，其包括以下步骤：
[0025]
(i)提供包含peg
6-24
kl4、dna和填充剂的溶液；和
[0026]
(ii)喷雾干燥或喷雾冷冻干燥步骤(i)中的溶液。
[0027]
在一个实施方案中，该peg
6-24
kl4是peg
12
kl4。在一个实施方案中，使用喷雾干燥方法，质量中值空气动力学直径是约4.5μm。在一个实施方案中，使用喷雾冷冻干燥方法，质量中值空气动力学直径是约1.5μm。
4.附图说明
[0028]
图1.(a)mrna结合和(b)mrna释放的凝胶阻滞分析。对于mrna结合，以0.5:1至10:1的比率(重量/重量)制备kl4/mrna复合物和peg
12
kl4/mrna复合物。对于mrna释放，以10:1比率(重量/重量)制备复合物，并添加1至8mm的十二烷基硫酸钠(sds)溶液以使复合物解离。未结合的mrna作为对照被包括在内。
[0029]
图2.对(a)a549细胞和(b)beas-2b细胞的荧光素酶mrna转染。在24-孔板中用1μg的mrna以5:1至30:1比率(重量/重量)制备kl4/mrna复合物或peg
12
kl4/mrna复合物。未处理的细胞、裸mrna和lipofectamine 2000(lipo2k)/mrna复合物(2:1体积/重量)作为对照被包括在内。在转染后24h时测量荧光素酶表达。数据表示为每mg的蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差(n＝3)。通过非配对双尾student氏t检验(student’s t-test)分析数据。以相同比率制备的kl4/mrna与peg
12
kl4/mrna复合物之间，*p《0.05，**p《0.01。
[0030]
图3.使用流式细胞术和共聚焦显微术进行细胞摄取研究。用裸mrna、以10:1比率(重量/重量)用花菁-5标记的mrna制备的kl4/mrna和peg
12
kl4/mrna处理a549细胞。在转染后4h时使用流式细胞术检查细胞
–
(a)显示与未处理的对照(蓝色)相比花菁-5阳性细胞(红色)的群的代表性直方图；(b)具有mrna摄取的细胞的百分比；和(c)细胞的中值荧光强度。数值是平均值
±
标准偏差。通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001(n＝3)。(d)用花菁-5(红色)标记的mrna转染的细胞和egfp(绿色)表达的共聚焦图像；细胞核(蓝色)用hoechst染色。比例尺＝20μm。
[0031]
图4.mrna转染之后，(a)a549细胞和(b)thp-1细胞中促炎细胞因子的释放。在24-孔板中以每孔0.25至2μg mrna用以10:1比率(重量/重量)制备的peg
12
kl4/mrna复合物转染细胞。未处理的细胞和用lps处理的细胞分别用作阴性和阳性对照。在转染后24h时测量从细胞释放的mcp-1、tnf-α和il-8的水平。与阴性对照相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验分析数据。*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001。数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0032]
图5.peg
12
kl4/mrna复合物的不同的喷雾干燥(sd)和喷雾冻干(sfd)制剂的扫描电子显微镜(sem)图像。仅含有甘露醇的制剂被包括在内用于比较。以
×
10000放大倍数(比例尺＝5μm)拍摄sd制剂的图像，并以
×
2000放大倍数(比例尺＝20μm)拍摄sfd制剂的图像。
[0033]
图6.通过下一代碰撞取样器(ngi)评价喷雾干燥(sd)和喷雾冻干(sfd)粉末的雾化性能。(a)排出分数(ef)和(b)细粒子分数(fpf)表示为甘露醇的质量相对于回收质量的
百分比。通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据。与通过相同干燥方法制备的仅有甘露醇的制剂相比，**p《0.01，***p《0.001。在相同mrna浓度的sd与sfd制剂之间比较，
##
p《0.01，
###
p《0.001，
####
p《0.0001。数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0034]
图7.用具有(a)0.1％mrna制剂和(b)0.5％mrna制剂的干粉制剂对a549细胞的荧光素酶mrna转染。重构干粉并在24-孔板中以每孔0.5或1μg mrna添加至细胞。使用裸mrna、lipofectamine 2000(lipo2k)/mrna复合物(2:1体积/重量比率)和含有1μg mrna的新鲜制备的peg
12
kl4/mrna复合物(10:1重量/重量比率)作为对照。在转染后24h时测量荧光素酶表达。通过非配对双尾student氏t检验(student’s t-test)分析数据。比较干燥之前与之后的样品，*p《0.05。相对光单位(rlu)/mg蛋白质显示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0035]
图8.具有不同转染剂的mrna制剂的肺部递送。向balb/c小鼠(～20g)气管内给予(i)裸mrna；(ii)10:1比率(重量/重量)的peg
12
kl4/mrna复合物；和(iii)2:1比率(体积/重量)的lipofectamine 2000(lipo2k)/mrna复合物。每只小鼠接受在最终体积为75μl的pbs中的10μg的mrna。给药后24h时，(a)分离肺用于生物发光成像；(b)测量肺组织的荧光素酶蛋白质表达，并将数据表示为每mg蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差(n＝4)。通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据，*p《0.05。
[0036]
图9.具有不同mrna剂量的mrna制剂的肺部递送。向balb/c小鼠(～20g)气管内给予10:1比率(重量/重量)的peg
12-kl4/mrna复合物，其在最终体积为75μl的pbs中含有(i)5μg或(ii)10μg的mrna。给药后24h时，(a)分离肺用于生物发光成像；(b)测量肺组织的荧光素酶蛋白质表达，并将数据表示为每mg蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差。(c)在给药之前和给药之后24h监测小鼠的体重，并将数据表示为体重变化百分比的平均值
±
标准偏差(n＝7-8)。通过非配对双尾student氏t检验(student’s t-test)分析数据，*p《0.05，****p《0.0001。
[0037]
图10.作为粉末气雾剂或重构液体气雾剂的mrna制剂的肺部递送。向balb/c小鼠(～20g)气管内给予(i)作为粉末气雾剂的sd-0.5％mrna制剂(1mg)；(ii)作为粉末气雾剂的sfd-0.5％mrna制剂(1mg)；(iii)作为液体气雾剂重构的sd-0.5％mrna制剂(1mg，在75μl pbs中)；(iv)作为液体气雾剂重构的sfd-0.5％mrna制剂(1mg，在75μl pbs中)。每只小鼠接受5μg剂量的mrna。给药后24h时，(a)分离肺用于生物发光成像；(b)测量肺组织的荧光素酶蛋白质表达，并将数据表示为每mg蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差(n＝4)。通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据，**p《0.01。
[0038]
图11.肺部递送mrna制剂后促炎细胞因子的水平。向balb/c小鼠气管内给予(i)作为对照的pbs；(ii)裸mrna l(5μg的低剂量)；(iii)裸mrna h(10μg的高剂量)；(iv)peg
12
kl4/mrna l(5μg的低剂量)；(v)peg
12
kl4/mrna h(10μg的高剂量)；和(vi)lps(10μg)，全部在最终体积为75μl的pbs中。给药后24h时，通过elisa检测(a)支气管肺泡灌洗液(balf)和(b)肺匀浆中的细胞因子水平。数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝4-6)。与对照相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验进行统计分析。**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0039]
图12.在肺部递送mrna制剂后balb/c小鼠肺的组织学
–
(a)未处理的对照；向小鼠气管内给予(b)pbs(75μl)；(c)lps(10μg，在25μl pbs中)；(d)mrna(5μg，在75μl pbs中)；(e)新鲜制备的peg
12
kl4/mnra复合物(在75μl pbs中的5μg mrna)；(f)sfd-0.5％mrna粉末
(1mg)；和(g)sd-0.5％mrna粉末(1mg)。使用正置显微镜以20
×
放大倍数观察载玻片(比例尺＝100μm)。
[0040]
图13a-b对a549细胞的sirna转染。kl4、peg6kl4、peg
12
kl4和peg
24
kl4用于以10:1、15:1和20:1比率(重量/重量)与sirna形成复合物。将含有50pmol的gapdh sirna( )或阴性对照乱序sirna(scramble sirna)(-)的复合物添加至六-孔板中的细胞中。未处理的细胞和2:1(体积/重量)比率的lipofectamine 2000(lipo2k)/sirna被包括在内用于比较。在转染后72h时进行gapdh的蛋白质印迹分析(左)，β-肌动蛋白用作内部对照。密度测定结果(右侧)显示为与阴性sirna对照(n＝1)相比的剩余gapdh表达。在所有测试比率下，peg
12
kl4在介导sirna转染方面优于kl4。
[0041]
图14.体内免疫原性研究。使用balb/c小鼠(～20g)和乱序sirna。在75μl pbs中的lps(10μg)、peg12-kl4/sirna(100μg/10μg)或kl4/sirna(100μg/10μg)通过气管内途径使用微喷雾器(microsprayer)(penn century)向小鼠给药。给药后24h时，通过elisa检测balf和肺匀浆中的细胞因子和趋化因子水平。数据表示为每组6-7只小鼠的平均值
±
sd。通过单因素方差分析(图基(tukey)事后检验)进行统计分析。相对于用pbs处理的对照组，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001；相对于peg12-kl4/sirna组，#p《0.05。对照组与peg12kl4/sirna组之间没有显著差异。
[0042]
图15.体重变化。使用balb/c小鼠(～20g)和乱序sirna。在75μl pbs中的lps(10μg)、peg
12-kl4/sirna(100μg/10μg)或kl4/sirna(100μg/10μg)通过气管内途径使用微喷雾器气雾器(microsprayer aerosolizer)(penn century)向小鼠给药。在给药前和给药后24h测量小鼠的体重。计算体重的百分比。数据表示为每组4-7只小鼠的平均值
±
sd。在用peg化的kl4肽/sirna复合物处理的小鼠中没有显著的体重损失。
[0043]
图16.以不同比率制备的peg
12
kl4/mrna复合物的肺部递送。向balb/c小鼠(～20g)气管内给予以2.5:1、5:1和10:1比率重量/重量制备的peg
12
kl4/mrna复合物，其具有在最终体积为75μl的pbs中的10μg mrna。用pbs处理的小鼠作为对照被包括在内。给药后24h时，(a)分离肺用于生物发光成像；(b)测量肺组织的荧光素酶蛋白质表达，并将数据表示为每mg蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0044]
图17.在不同时间点的mrna制剂的肺部递送。向balb/c小鼠(～20g)气管内给予(i)作为对照的pbs；(ii)裸mrna(10μg mrna)；(iii)10:1比率的peg12-kl4/mrna复合物(10μg mrna)，全部在最终体积为75μl的pbs中。给药后4h和24h时，(a)分离肺用于生物发光成像；(b)测量肺组织的荧光素酶蛋白质表达，并将数据表示为每mg蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差(n＝3)。与对照相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验进行统计分析。*p《0.05，***p《0.001。
[0045]
图18.花菁-5标记的mrna制剂的生物分布。向balb/c小鼠(～20g)气管内给予(i)裸mrna；(ii)10:1比率(重量/重量)的peg
12-kl4/mrna复合物；和(iii)2:1比率(重量/重量)的lipofectamine 2000/mrna，全部含有在75μl pbs中的10μg mrna。给药后4h时，分离肺、肝、肾和脾组织并测量组织的花菁5荧光信号(n＝2)。
[0046]
图19.peg12-kl4/mrna复合物与荧光素酶的mrna制剂的生物分布。向balb/c小鼠(～20g)气管内给予(i)作为对照的pbs；(ii)作为液体气雾剂的以10:1比率(重量/重量)制备的peg12-kl4/mrna复合物；(iii)作为液体气雾剂的重构后的sfd-0.5％mrna制剂；(iv)
作为液体气雾剂的重构后的sd-0.5％mrna制剂；(v)作为粉末气雾剂的sfd-0.5％mrna制剂；(vi)作为粉末气雾剂的sd-0.5％mrna制剂。所有样品(除了pbs)含有5μg的mrna。给药后24h时，分离肺、肝、肾和脾组织并测量组织的荧光素酶蛋白质表达，并将数据表示为每mg蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差(n＝4-7)。
[0047]
图20.给予mrna制剂之后balb/c小鼠的体重变化百分比。向balb/c小鼠气管内给予(i)作为对照的pbs；(ii)裸mrna l(5μg的低剂量)；(iii)裸mrna h(10μg的高剂量)；(iv)peg
12
kl4/mrna l(5μg的低剂量)；(v)peg
12
kl4/mrna h(10μg的高剂量)；(vi)lps(10μg)，在最终体积为75μl的pbs中。在给药前和给药后24h测量小鼠的体重。数据是％体重变化，表示为平均值
±
标准偏差(n＝4-6)。与对照相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验进行统计分析。****p《0.0001。
[0048]
图21.在6℃至94℃的不同温度下测量kl4、peg6kl4、peg
12
kl4和peg
24
kl4肽的远-uv cd光谱。在5mm tris-hcl缓冲液中制备样品。使用0.5mm路径长度记录190至260nm的光谱，并使用chirascan软件处理，其中减去无肽溶液的光谱并应用savitzkygorlay平滑化。
[0049]
图22.使用荧光置换分析的kl4、peg6kl4、peg
12
kl4和peg
24
kl4肽的sirna结合亲和力。(a)将肽滴定至在tris-乙酸盐-edta(tae)缓冲液中的gold混合物，导致萤光强度降低。在滴定(n＝3)后，将荧光强度绘制为相对于肽与sirna比率(重量/重量)的百分比。通过双因素方差分析、随后sidak事后检验分析数据。除peg6kl4和peg
12
kl4外，所有组彼此间均显示出统计学差异。(b)在荧光染料的存在下以10:1比率(重量/重量)形成肽/sirna复合物。滴定肝素以使复合物解离并释放sirna，导致荧光强度增加。在滴定(n＝3)后，将荧光强度绘制为相对于肝素的量的百分比。将数据拟合为四参数逻辑斯蒂s形曲线，并计算ic
50
和坡度。
[0050]
图23.在磷酸盐缓冲盐水(pbs)的存在下，kl4/sirna、peg6kl4/sirna、peg
12
kl4/sirna和peg
24
kl4/sirna复合物的粒度的变化。首先以比率10:1(重量/重量)在水中形成肽/sirna复合物。向复合物中添加pbs至最终磷酸盐缓冲液浓度为10mm。孵育30min之后通过动态光散射测量粒度。数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0051]
图24.以10:1比率(重量/重量)制备的kl4/sirna、peg6kl4/sirna、peg
12
kl4/sirna和peg
24
kl4/sirna复合物的透射电子显微镜(tem)图像。在成像之前将复合物用4％(重量/体积)乙酸双氧铀染色。(a)比例尺＝200nm和(b)比例尺＝50nm。
[0052]
图25.对a549细胞的sirna转染。以5:1至20:1(重量/重量)的不同比率制备kl4/sirna、peg6kl4/sirna、peg
12
kl4/sirna和peg
24
kl4/sirna复合物，在六-孔板(50nm的sirna)中每孔50pmol的gapdh sirna( )或阴性对照sirna(-)。将2:1(重量/重量)比率的lipofectamine 2000(lipo2k)/sirna用作阳性对照，并将optimem中的细胞用作阴性对照。(a)在转染后72h时进行gapdh蛋白质的蛋白质印迹分析，β-肌动蛋白用作内部对照。(b)密度测定结果显示为三次独立重复(n＝3)的平均值
±
标准偏差。与lipo2k相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验分析数据，***p《0.001。
[0053]
图26.对calu-3细胞的sirna转染。以5:1至20:1(重量/重量)的不同比率制备kl4/sirna、peg6kl4/sirna、peg
12
kl4/sirna和peg
24
kl4/sirna复合物，在六-孔板(50nm的sirna)中每孔50pmol的gapdh sirna( )或阴性对照sirna(-)。将2:1(重量/重量)比率的lipofectamine 2000(lipo2k)/sirna用作阳性对照，并将optimem中的细胞用作阴性对照。
(a)在转染后72h时进行gapdh蛋白质的蛋白质印迹分析，β-肌动蛋白用作内部对照。(b)密度测定结果显示为三次独立重复(n＝3)的平均值
±
标准偏差。与lipo2k相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验分析数据，*p《0.05。**p《0.01，***p《0.001。
[0054]
图27.对beas-2b细胞的sirna转染。以5:1至20:1(重量/重量)的不同比率制备kl4/sirna、peg6kl4/sirna、peg
12
kl4/sirna和peg
24
kl4/sirna复合物，在六-孔板(50nm的sirna)中每孔50pmol的gapdh sirna( )或阴性对照sirna(-)。将2:1(重量/重量)比率的lipofectamine 2000(lipo2k)/sirna用作阳性对照，并将optimem中的细胞用作阴性对照。(a)在转染后72h时进行gapdh蛋白质的蛋白质印迹分析，β-肌动蛋白用作内部对照。(b)密度测定结果显示为三次独立重复(n＝3)的平均值
±
标准偏差。与lipo2k相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验分析数据，*p《0.05。
[0055]
图28.对a549细胞以各种sirna浓度的sirna转染。以10:1比率(重量/重量)制备kl4/sirna、peg6kl4/sirna、peg
12
kl4/sirna和peg
24
kl4/sirna复合物，以2:1比率(体积/重量)制备lipofectamine 2000(lipo 2k)/sirna复合物。gapdh sirna( )或阴性对照sirna(-)用于以每孔6pmol至100pmol(6nm至100nm)转染。(a)在转染后72h时进行gapdh蛋白质的蛋白质印迹分析，β-肌动蛋白用作内部对照。(b)密度测定结果显示为三个独立地重复的实验(n＝3)的平均值。通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0056]
图29.使用流式细胞术的kl4/sirna、peg6kl4/sirna、peg
12
kl4/sirna和peg
24
kl4/sirna复合物的细胞摄取研究。将(a&b)a549细胞和(c&d)calu-3细胞用10:1比率(重量/重量)的肽/sirna复合物处理，在optimem中在六-孔板中每孔含有150pmol荧光标记的sirna。用0.04％(重量/体积)台盼蓝溶液淬灭细胞外荧光信号，并在转染后4h时测量细胞的荧光强度。(a&c)具有sirna摄取的细胞的百分比。(b&d)细胞的中值荧光强度。数值是平均值
±
标准偏差。通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据，**p《0.01，****p《0.0001(n＝3)。
[0057]
图30.肺部递送sirna后促炎细胞因子的水平。向balb/c小鼠气管内给予作为对照的pbs；lps(10μg)；peg
12
kl4/sirna(100μg/10μg)或kl4/sirna(100μg/10μg)，除了lps在25μl的pbs中制备外，全部都在最终体积为75μl pbs中。给药后24h时，通过elisa检测(a)支气管肺泡灌洗液(balf)和(b)肺匀浆中的细胞因子和趋化因子水平。数据表示为平均值
±
sd(n＝6-7)。通过单因素方差分析(图基(tukey’s)事后检验)进行统计分析。与用pbs处理的对照组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001；与peg
12
kl4/sirna组相比的，#p《0.05。
[0058]
图31.小鼠的体重变化。向balb/c小鼠气管内给予作为对照的pbs；lps(10μg)；peg
12
kl4/sirna(100μg/10μg)或kl4/sirna(100μg/10μg)，除了lps在25μl的pbs中制备外，全部都在最终体积为75μl的pbs中。在给药前和给药后24h监测小鼠的体重。数据表示为体重变化百分比的平均值
±
标准偏差(n＝4-7)。
[0059]
图32.以0.5mg/ml制备的kl4、peg6kl4、peg
12
kl4和peg
24
kl4肽的透射电子显微镜(tem)图像。在成像之前将复合物用4％(重量/体积)乙酸双氧铀染色。比例尺＝200nm(上图)和50nm(下图)。
[0060]
图33.对(a)a549细胞；和(b)jawsii细胞的mrna(荧光素酶)转染。在24-孔板中用1
μg的mrna以5:1至30:1比率(重量/重量)制备kl4/mrna、peg6kl4/mrna、peg
12
kl4/mrna和peg
24
kl4/mrna复合物。未处理的细胞、裸mrna和lipofectamine 2000(lipo2k)/mrna复合物(2:1重量/重量)用作对照。在转染后24h时测量荧光素酶表达。数据表示为每mg蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差(n＝3)。与lipo2k相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验分析数据，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0061]
图34.以不同的肽与mrna比率制备的相同肽内的mrna转染效率的比较，和以相同的肽与mrna比率制备的不同肽之间的比较。通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据，n.s.不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0062]
图35.使用流式细胞术的细胞摄取研究。用裸mrna、用花青-5标记的mrna以10:1比率(重量/重量)制备的peg6kl4/mrna、peg
12
kl4/mrna和peg
24
kl4/mrna复合物处理a549细胞。在转染后4h时使用流式细胞术检查细胞
–
(a)具有mrna摄取的细胞的百分比；和(b)细胞的中值荧光强度。数值是平均值
±
标准偏差。通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001(n＝3)。
[0063]
图36.以10:1比率(重量/重量)制备的kl4/mrna、peg6kl4/mrna、peg
12
kl4/mrna和peg
24
kl4/mrna复合物的透射电子显微镜(tem)图像。在成像之前将复合物用4％(重量/体积)乙酸双氧铀染色。比例尺＝100nm。
[0064]
图37.peg
12
kl4/mrna复合物的长期体内安全性。使用微喷雾器(microsprayer)(penn century)向balb/c小鼠气管内给予peg
12
kl4/mrna复合物，所述peg
12
kl4/mrna复合物是在75μl含有5μg或10μg的mrna的pbs中以10:1比率(重量/重量)制备的，每只小鼠一次或两次(间隔3周)。pbs用作对照。在给药前和给药后21天时监测小鼠的体重。数据表示为体重变化百分比的平均值
±
标准偏差(n＝4-8)。
[0065]
图38.对a549细胞的dna(荧光素酶)转染。在24-孔板中用1μg的dna以5:1至30:1比率(重量/重量)制备kl4/dna和peg
12
kl4/dna复合物。未处理的细胞、裸dna和lipofectamine 2000(lipo2k)/dna复合物(2:1重量/重量)、rnaimax/dna复合物(2:1重量/重量)用作对照。在转染后24h时测量荧光素酶表达。
[0066]
图39.重构mrna干粉并在24-孔板中以每孔1μg mrna添加至细胞。裸mrna、lipofectamine 2000(lipo2k)/mrna复合物(2:1重量/重量比率)和新鲜制备的peg
12
kl4/mrna复合物(10:1重量/重量比率)用作对照。在转染后24h时测量荧光素酶表达。数据表示为每mg蛋白质的相对光单位(rlu)的平均值
±
标准偏差(n＝3)。通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验分析数据，与新鲜制备的peg
12
kl4/mrna复合物相比，*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001。
[0067]
5.详述
[0068]
用于治疗肺部疾病的mrna治疗剂的翻译受到缺乏用于肺部递送的具有良好稳定性的、安全且有效的mrna递送系统的阻碍。本文提供了mrna的可吸入干粉制剂。在一个实施方案中，将mrna的干粉气雾剂制剂直接给予至肺以诱导体内靶蛋白的表达。在一个实施方案中，制剂包含：(i)作为填充剂的甘露醇；(ii)作为转染剂的合成的peg化kl4肽；和(iii)用于蛋白质表达的mrna。在某些实施方案中，制备干粉制剂的方法包括喷雾干燥或喷雾冷冻干燥。干粉制剂适合吸入，同时mrna的生物活性得以成功保持。mrna的干粉制剂的另一个优点是比液体气雾剂更好的稳定性。
[0069]
在一个实施方案中，本文提供了一种干粉制剂，其包含：(i)peg化kl4肽，其是介导体内有效mrna转染的合成肽；(ii)使用喷雾干燥或喷雾冷冻干燥技术以产生可吸入粉末制剂以改善制剂稳定性。kl4肽的peg化可以提高肽的水溶性并降低肽的免疫原性，使其成为安全且有效的核酸递送剂。
[0070]
在一个实施方案中，本文提供了一种新颖的rna递送载体peg
12
kl4肽，其中合成的阳离子kl4肽连接至12聚体的单分散线性peg。在一个实施方案中，peg
12
kl4与mrna以10:1比率(重量/重量)通过静电相互作用形成纳米尺寸的复合物，并介导对人肺上皮细胞的有效转染。
[0071]
在某些实施方案中，通过喷雾干燥(sd)和喷雾冷冻干燥(sfd)技术将peg
12
kl4/mrna复合物配制成干粉。sd和sfd粉末均展现出令人满意的用于吸入的气雾剂性质，具有分别为4.5μm和1.5μm的质量中值空气动力学直径(mmad)。在某些实施方案中，干燥之后，保持peg
12
kl4/mrna复合物的生物活性。在一个实施方案中，干粉气雾剂制剂包含：(i)作为填充剂的甘露醇；(ii)作为转染剂的peg
12
kl4；和(iii)用于蛋白质表达的mrna。
[0072]
在某些实施方案中，喷雾干燥和喷雾冷冻干燥技术用于生成peg化kl4/mrna系统的可吸入粉末制剂。所生成的粉末在对于有效肺沉积(空气动力学直径《5μm)和良好粉末分散性质(在阶式碰撞取样器研究中细粒子分数》40％)合适的空气动力学直径范围内。在一个实施方案中，用于peg化的peg的长度是约5-10、10-15、15-20、20-25、25-30个peg单元。在某些实施方案中，peg的长度是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个peg单元。在一个实施方案中，peg是单分散的。在一个实施方案中，peg的长度是12个单元。在一个实施方案中，peg是约600da。在某些实施方案中，当前公开的递送系统用于mrna疫苗(例如流行性感冒)递送。在某些实施方案中，当前的mrna递送系统用于治疗肺部疾病(例如囊性纤维化、肺炎性疾病)。在某些实施方案中，递送系统经由吸入或经鼻给予来给药。
[0073]
6.实施例：材料和方法
[0074]
6.1材料
[0075]
kl4肽(kllllkllllkllllkllllk-nh2)购自chinapeptides(上海，中国)。peg
12
kl4肽(具有单分散的十二乙二醇，peg
12
)购自ezbiolab(carmel，新泽西，美国)，纯度》90％。在1％(体积/体积)dmso中以1mg/ml制备kl4肽储备溶液。在蒸馏水中以2mg/ml制备peg
12
kl4储备溶液。萤火虫荧光素酶mrna和花菁-5egfp mrna购自trilink bio technologies(san diego，加利福尼亚州，美国)。在1mm柠檬酸钠缓冲液中以1mg/ml制备荧光素酶mrna储备溶液。杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)(dmem)、角化细胞-sfm、洛斯维
·
帕克纪念研究所(roswell park memorial institute)(rpmi)1640、optimem i血清减少的培养基、胰蛋白酶-edta(0.25％)、胎牛血清(fbs)、抗生素-抗真菌剂(100
×
)、lipofectamine 2000、dna凝胶负载染料(6
×
)、hoechst 33258购自thermo-fisher scientific)(waltham，马萨诸塞州，美国)。gelred核酸染色剂购自biotium(hayward，加利福尼亚州，美国)。荧光素酶分析系统和甲虫荧光素钾盐购自promega(madison，威斯康星州，美国)。小鼠肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)和白细胞介素-6(il-6)elisa试剂盒购自r&d systems(minneapolis，明尼苏达州，美国)。甘露醇(pearlitol 160c)获得自roquette(lestrem，法国)。来自大肠杆菌o111:b4
(e.coli o111:b4)的脂多糖(lps)购自sigma-aldrich(st.louis，密苏里州，美国)。其他试剂获得自sigma-aldrich(st.louis，密苏里州，美国)，为分析级或更纯。
[0076]
6.2凝胶阻滞分析
[0077]
进行凝胶阻滞分析以检验kl4和peg
12
kl4肽的mrna结合亲和力。kl4/mrna复合物和peg
12
kl4/mrna复合物均以0.5:1至10:1的肽与mrna比率(重量/重量)制备，在10μl的tae缓冲液中含有1μg的mrna。将复合物在室温下孵育30min，随后添加2μl的凝胶负载染料。将复合物负载到用gelred染色的2％(重量/体积)琼脂糖凝胶中。在125v下在tae缓冲液中运行电泳25min。在uv照射下使凝胶显现。对于mrna释放研究，以10:1比率(重量/重量)制备kl4/mrna复合物和peg
12
kl4/mrna复合物。在复合物形成之后30min时，添加1mm至8mm的不同浓度的十二烷基磺酸钠(sds)溶液，并将混合物在室温下孵育30min。将样品负载到琼脂糖凝胶中并如以上所描述的进行电泳。
[0078]
6.3粒度和ζ电势测量
[0079]
对于粒度测量，kl4/mrna复合物和peg
12
kl4/mrna复合物以10:1比率(重量/重量)用4μg的mrna在100μl的超纯水中制备。在复合物形成之后30min时，通过动态光散射(delsa
tm
nano c，beckman coulter，加利福尼亚州，美国)测量流体动力学尺寸。对于ζ电势测量，kl4/mrna和peg
12
kl4/mrna复合物以10:1比率(重量/重量)用20μg的mrna在500μl的2％pbs中制备。在复合物形成之后30min时，使用电泳光散射(delsa
tm
nano c，beckman coulter，加利福尼亚州，美国)在流动池中测量ζ电势。还在重构之后测量sd和sfd粉末制剂中peg
12
kl4/mrna复合物的尺寸和ζ电势。
[0080]
6.4细胞培养
[0081]
a549细胞(人肺泡上皮腺癌)、beas-2b细胞(人支气管上皮细胞)和thp-1细胞(人单核细胞)获得自atcc(manassas，弗吉尼亚州，美国)。在补充有10％(体积/体积)fbs和1％(体积/体积)抗生素-抗真菌剂的dmem中培养a549细胞。在补充有人重组表皮生长因子(regf)、牛垂体提取物(bpe)和1％(体积/体积)抗生素-抗真菌剂的角化细胞-sfm中培养beas-2b细胞。在补充有10％(体积/体积)fbs和1％(体积/体积)抗生素-抗真菌剂的rpmi-1640中培养thp-1细胞。将所有细胞维持在5％co2、37℃下，并根据atcc说明进行传代培养。
[0082]
6.5体外mrna转染
[0083]
将a549细胞和beas-2b细胞分别以0.5
×
105和1
×
105个细胞/孔的密度接种在24-孔板中，过夜。将在optimem i血清减少的培养基中以5:1至30:1比率(重量/重量)形成的kl4/mrna复合物和peg
12
kl4/mrna复合物以每孔0.5或1μg mrna添加至细胞。裸mrna和脂质体复合物(lipofectamine 2000/mrna复合物)用作对照。孵育4h之后，用补充了血清的细胞培养基替换转染培养基。转染后24h时，洗涤细胞并用报告细胞裂解缓冲液裂解。使用荧光素酶分析系统根据制造商的方案检测荧光素酶表达。用光度计(spectramax l酶标仪，molecular devices，加利福尼亚州，美国)测量发光，并通过bradford蛋白质分析定量细胞裂解物的蛋白质浓度。结果表示为每mg总蛋白质的相对光单位(rlu)。为了研究sd和sfd粉末制剂中peg
12
kl4/mrna的转染效率，在添加至细胞中之前重构粉末。如以上所描述的，在转染后24h时检测荧光素酶表达。
[0084]
6.6细胞摄取研究
[0085]
通过流式细胞术和共聚焦显微术研究mrna的细胞摄取。对于流式细胞术研究，在
实验前一天将a549细胞以0.5
×
105个细胞/孔的密度接种在24-孔板中。在optimem i血清减少的培养基中用裸mrna、10:1比率(重量/重量)的kl4/mrna复合物和peg
12
kl4/mrna复合物转染细胞，每孔含有1μg的花菁-5标记的egfp mrna。孵育4h之后，洗涤细胞并使其胰蛋白酶化。将来自相同处理的三个分开的孔的细胞合并，并悬浮在培养基中。用0.04％(重量/体积)台盼蓝溶液淬灭细胞外荧光信号。2min之后，将细胞洗涤、再悬浮于300μl的pbs中并用无菌40μm细胞过滤器(bd biosciences，加利福尼亚州，美国)筛分。通过流式细胞术(bd facscantoii分析仪，bd biosciences，加利福尼亚州，美国)分析荧光强度。每个样品分析至少1
×
104个单细胞。对于共聚焦研究，在成像前一天将a549细胞以1
×
105个细胞/孔的密度接种在35mm mattek玻璃底培养皿(mattek corp.，ashland，马萨诸塞州，美国)中。在每培养皿具有2μg花菁-5标记的mrna的opti-mem i血清减少的培养基中制备裸mrna、10:1比率(重量/重量)的kl4/mrna复合物和peg
12
kl4/mrna复合物。与细胞孵育3.5h之后，移除转染培养基并用新鲜培养基替换。向细胞中添加hoechst染色剂(5μg/ml)用于细胞核染色。孵育30min之后，洗涤细胞并在转染后4h时通过共聚焦激光扫描显微镜(zeiss lsm 780倒置显微镜，jena，德国)使细胞显现。
[0086]
6.7体外免疫原性研究
[0087]
将thp-1细胞以2
×
105个细胞/孔接种在24-孔板中。用100nm佛波醇12肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)使细胞分化(成为巨噬细胞样细胞)48h。将a549细胞以1
×
105个细胞/孔接种在24-孔板中。在实验之前，将细胞用补充有1％fbs的新鲜培养基饥饿过夜。然后将细胞与以10:1比率(重量/重量)制备的peg
12
kl4/mrna复合物在optimem i血清减少的培养基中孵育，每孔含有0.25至2μg mrna。转染后24h时，通过elisa测量细胞培养基中分泌的tnf-α、mcp-1和il-8的水平。未处理的细胞和用lps处理的细胞(对于thp-1细胞以10和100ng/ml；对于a549细胞以10和100μg/ml)分别用作阴性对照和阳性对照。
[0088]
6.8干粉制剂的制备
[0089]
在超纯水中以10:1比率(重量/重量)制备peg
12
kl4/mrna复合物。将甘露醇(作为填充赋形剂)溶解在水中，并在孵育30min之后添加至复合物中。分别以1.5％和3％(重量/体积)溶质浓度制备sd和sfd制剂，具有0.1％或0.5％(重量/重量)的mrna浓度。制备仅甘露醇制剂用于比较。在我们先前的研究[19,20]中优化了sd和sfd的操作参数。为了制备sd粉末，使用实验室规模的具有抽吸模式和闭环配置的高性能旋风分离器的喷雾干燥器(微型喷雾干燥器b-290和除湿器b-296；b
ü
chi labortechnik，flawil，瑞士)，在以下操作条件下将溶液喷雾干燥：进口温度80℃(出口温度约50℃)，抽吸速率90％(约35m3/h)，液体进料速率1.4ml/min和压缩空气雾化流速742l/h。使用具有0.7mm内径的双流体喷嘴(b
ü
chi不锈钢双流体喷嘴，瑞士)。为了制备sfd粉末，将溶液转移到注射器中并通过双流体喷嘴以601l/h的氮气流速雾化。通过注射泵将液体进料速率控制在1.5ml/min。将雾化的液滴冷冻并收集在液氮中，并使样品经受冷冻干燥(具有加塞盘式干燥器的6升台式冷冻干燥系统，labconco corporation，密苏里州，美国)，将样品在其中在-25℃下在真空(腔室压力低于0.133mbar)下保持40h，随后在20℃下二次干燥20h。将所有干燥的粉末收集在玻璃小瓶中并在环境温度下储存在具有硅胶的干燥器中直至进一步分析。为每种制剂制备一批粉末。对所有干粉制剂的干燥方法、组成和生产收率的总结显示于表1中。
[0090]
表1.peg
12
kl4/mrna复合物(10:1比率)的喷雾干燥(sd)和喷雾冷冻干燥(sfd)制剂
research)(culatr)批准。
[0098]
6.12气管内给药
[0099]
在气管内给药之前，采用腹膜内注射麻醉剂(在pbs中的80mg/kg氯胺酮和4.5mg/kg甲苯噻嗪)使小鼠麻醉，并在气管内轻轻地插入导引套管。将液体或干粉制剂通过导引套管向小鼠气管内给药。对于液体气雾剂给药，将样品负载入高压注射器(型号fmj-250；penn century inc.，wyndmoor，宾夕法尼亚州，美国)中，并通过气雾器(型号ia-1c；penn century inc.，wyndmoor，宾夕法尼亚州，美国)产生液体气雾剂。对于粉末制剂，将样品负载入通过如先前所描述的三通旋塞阀[22]连接至1ml注射器的200μl凝胶负载移液管尖端中，并用来自注射器的0.6ml的空气分散粉末。
[0100]
6.13体内mrna转染
[0101]
用液体或粉末气雾剂在balb/c小鼠中进行peg
12
kl4/mrna复合物的体内mrna转染。对于液体制剂，将以10:1比率(重量/重量)制备的、在最终体积75μl的pbs中含有5或10μg mrna的peg
12
kl4/mrna复合物作为单剂量给药。将均含有10μg mrna的裸mrna或脂质体复合物(以2:1比率体积/重量的lipofectamine 2000/mrna复合物)用作对照，用于比较。对于粉末制剂，将约1mg的sd-0.5％粉末或sfd-0.5％粉末(均含有5μg mrna)作为单剂量给药。在给药后24h时，将萤光素溶液以150mg/kg体重的剂量在致死剂量的苯巴比妥下向小鼠腹膜内给药。在荧光素注射之后10min收获肺，并用ivis spectrum体内成像系统(perkinelmer，美国)进行肺的生物发光成像。然后将肺组织匀浆并在报告细胞裂解缓冲液中裂解。将样品在1500g和4℃下离心10min。使用如以上所提及的荧光素酶分析系统检测上清液中的荧光素酶表达。结果表示为每mg总蛋白质的rlu。
[0102]
6.14免疫原性分析和组织学研究
[0103]
对于免疫原性研究，小鼠被气管内给予作为对照的pbs、lps(10μg)、裸mrna(5或10μg)和比率10:1(重量/重量)的peg
12
kl4/mrna复合物(5或10μg mrna)。所有样品在75μl的pbs中制备并通过气雾器分散，除了lps在25μl的pbs中制备并通过微量移液器递送。在给药后24h时，小鼠被腹膜内注射致死剂量的戊巴比妥。收集支气管肺泡灌洗液(balf)和肺组织。通过elisa测量tnf-α、mcp-1、kc和il-6在balf和肺匀浆中的表达。对于组织学研究，小鼠被气管内给予pbs、lps(10μg)、裸mrna(5μg)、比率10:1(重量/重量)的peg
12
kl4/mrna复合物(5μg mrna)、sd-0.5％mrna粉末(1mg)和sfd-0.5％mrna粉末(1mg)。未经任何处理的天然小鼠也被包括在内，用于比较。在给药后24h时，小鼠被腹膜内注射致死剂量的戊巴比妥。收集肺并用4％缓冲福尔马林轻轻使之膨胀，然后在福尔马林中固定24h。将肺左叶转移至80％的乙醇中直至它们被包埋在石蜡块中。将包埋组织的切片固定在载玻片上并用苏木精和曙红(h&e)染色。使用uplanfi 20x/0.5物镜用正置显微镜(olympus bx50，东京，日本)观察载玻片。通过数码相机(sony nex-6，东京，日本)拍摄图像。
[0104]
6.15统计分析
[0105]
除非指明，均使用prism软件版本6(graphpad software inc.，san diego，加利福尼亚州，美国)进行统计学检验，并通过单因素方差分析(anova)、随后图基(tukey’s)或邓尼特(dunnett’s)事后检验分析。差异在p《0.05时被认为是统计学显著的。
[0106]
6.16肺部sirna递送的背景
[0107]
rna干扰(rnai)是内源性转录后基因调节机制。它涉及小干扰rna(sirna)与靶信使rna(mrna)之间通过互补结合的相互作用，导致特异性基因表达的抑制。sirna在治疗呼吸系统疾病，诸如哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、肺部感染和癌症中具有治疗潜力。适合肺部递送的sirna制剂的开发是其临床翻译的关键。尽管先前已经证明kl4肽介导对人肺上皮细胞的sirna转染，但其临床应用受到其水溶性差和触发免疫原性应答的限制。通过kl4肽的peg化，提高了肽的溶解度。由peg-kl4介导的sirna转染(体外)优于kl4介导的sirna转染。此外，在小鼠中气管内给药后，peg-kl4/sirna复合物的免疫原性和毒性(体内)更低/可忽略，表明peg-kl4是临床应用中肺部sirna递送的有前景的候选物。
[0108]
6.17材料
[0109]
peg6kl4、peg
12
kl4和peg
24
kl4肽购自ezbiolab(carmel，新泽西州，美国)，纯度》90％。在蒸馏水中以2mg/ml制备peg化kl4储备溶液。silencer select gapdh阳性对照和silencer select阴性对照sirna购自thermofisher scientific(waltham，马萨诸塞州，美国)。在超纯水中以1mg/ml制备sirna储备溶液。
[0110]
6.18体外sirna转染
[0111]
在转染前一天将a549细胞以1.5
×
105个细胞/孔的密度接种在6-孔板中。用肽/sirna复合物转染细胞，每孔含有50pmol的gapdh sirna或阴性对照sirna(50nm)。以10:1、15:1和20:1比率(重量/重量)在optimem i血清减少的培养基中制备复合物。使用lipofectamine 2000作为对照。将复合物添加至细胞中并在5％co2、37℃下孵育4h，然后用pbs洗涤。移除转染培养基并用补充了血清的细胞培养基替换。转染后72h时，洗涤细胞并用细胞裂解缓冲液裂解。进行蛋白质印迹分析以分析gapdh蛋白质的水平。使用image j软件通过蛋白质印迹的密度测定法分析gapdh表达。剩余的gapdh表达是阳性对照的gapdh条带(用相应样品的β-肌动蛋白归一化)的密度除以阴性对照的gapdh条带(用相应样品的β肌动蛋白条带归一化)。
[0112]
6.19体内sirna复合物的免疫原性分析和毒性
[0113]
使用具有8至9周的平均年龄和18至22g的体重的雌性balb/c小鼠。小鼠被气管内给予作为对照的pbs、lps(10μg)、peg
12
kl4/sirna复合物(10:1重量/重量)和kl4/sirna复合物(10:1重量/重量)。使用阴性对照sirna。所有样品在75μl的pbs中制备并通过气雾器分散，除了lps在25μl的pbs中制备并通过微量移液器递送。在给药后24h时，收集支气管肺泡灌洗液(balf)和肺组织。通过elisa测量tnf-α、mcp-1、kc和il-6在balf和肺匀浆中的表达。在给药前和给药后24h时监测小鼠的体重。
[0114]
7.结果
[0115]
7.1肽/mrna复合物的物理化学性质
[0116]
通过凝胶阻滞分析评价肽的mrna结合(图1)。mrna条带强度随着肽与mrna比率(重量/重量)增加而降低。对于peg
12
kl4，在2.5:1的比率下观察到完全结合，在此比例下mrna条带不再可见。与其中以略微更低的比率2:1实现完全结合的kl4肽相比，peg化对mrna结合没有重大影响。通过使用sds以使复合物解离并通过竞争性结合置换mrna来进一步研究结合亲和力。peg
12
kl4/mrna复合物被2mm的sds解离，而kl4/mrna复合物的解离需要4mm的更高浓度的sds，表明mrna与kl4之间更强的结合。测量以10:1比率(重量/重量)制备的kl4/mrna和peg
12
kl4/mrna复合物的粒度和ζ电势(由于该比率的peg
12
kl4/mrna的有效体外转染)(表
2)。新鲜制备的peg
12
kl4/mrna复合物的流体动力学直径是约468nm，这与重构之后的sd-0.5％mrna粉末制剂中的为约432nm的复合物相似。重构的sfd-0.5％mrna粉末制剂的粒度是约375nm，其显著小于新鲜制备的复合物。另外，新鲜制备的peg
12
kl4/mrna复合物显著大于kl4/mrna复合物。所有样品的多分散性指数(pdi)相似，为0.24至0.30。kl4/mrna和peg
12
kl4/mrna复合物的ζ电势分别是约 26mv和 27mv，两者彼此高度相似。在重构sd-0.5％mrna和sfd-0.5％mrna粉末制剂之后，发现复合物的ζ电势分别是 28mv和 31mv，其也类似于新鲜制备的复合物，尽管稍有增加。结果表明，两种干燥方法对peg
12
kl4/mrna复合物的物理化学性质没有显著影响。
[0117]
表2.kl4/mrna和peg
12
kl4/mrna复合物的粒度和ζ电势。以10:1比率(重量/重量)制备复合物。在测量前，重构喷雾干燥(sd)样品和喷雾冷冻干燥(sfd)样品。与新鲜制备的复合物相比，通过单因素方差分析、随后邓尼特(dunnett’s)事后检验分析数据。***p《0.001，****p《0.0001。数据准备为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0118][0119]
7.2体内mrna转染、细胞摄取和免疫原性研究
[0120]
在两种人肺上皮细胞系a549和beas-2b细胞上研究peg
12
kl4肽的mrna转染效率(图2)。将结果与kl4肽和商业转染剂lipofectamine 2000进行比较。在两种细胞系上观察到相似的趋势。对于peg
12
kl4肽，当肽与mrna比率从5:1增加至10:1时，转染效率提高，但是当比率继续增加时，没有注意到进一步的提高。不同比率之间无统计学显著差异。通常，peg
12
kl4肽在它们各个的比率下表现显著好于kl4肽，观察到荧光素酶表达增加1至2个对数，表明peg化确实提高了kl4肽的mrna转染效率。另外，peg
12
kl4肽的mrna转染效率与lipofectamine 2000的mrna转染效率相当。为了进一步比较kl4/mrna和peg
12
kl4/mrna复合物的细胞摄取效率，对a549细胞进行共聚焦成像和流式细胞术研究(图3)。超过60％的细胞显示由peg
12
kl4介导的mrna摄取，而仅有15％的细胞显示由kl4介导的mrna摄取。peg
12
kl4/mrna的细胞摄取百分比和中值荧光强度均显著高于裸mrna和kl4/mrna复合物的细胞摄取百分比和中值荧光强度。共聚焦图像显示裸mrna不能如预期那样进入细胞。如由细胞内红色荧光信号所证明的，peg
12
kl4/mrna和kl4/mrna复合物均被细胞摄取。绿色荧光仅存在于peg
12
kl4/mrna转染的细胞中，但不存在于kl4/mrna转染的细胞中，表明peg
12
kl4在介导mrna的细胞摄取和转染中更有效。在a549和thp-1细胞上检查peg
12
kl4肽的体外免疫原性(图4)。从转染的细胞释放的包括mcp-1、tnf-α和il-6的细胞因子的水平与阴性对照的细胞因子的水平相似(无显著差异)，并且显著低于lps处理的样品的细胞因子的水平，表明peg
12
kl4肽/mrna复合物在体外不诱导免疫原性应答。
[0121]
7.3粉末制剂的形貌、气雾剂性能和体外mrna转染
[0122]
用sem检查peg
12
kl4/mrna干粉制剂的形貌(图5)。所有sd制剂在形状上看起来是球
形的，并且粒子的几何尺寸远低于5μm。sd-0.1％mrna与sd-0.5％mrna制剂之间在外观上没有显著差异，尽管两种含有mrna的粒子的表面看起来比仅甘露醇(sd-甘露醇)制剂更粗糙。由sfd制备的粒子在尺寸上大得多，直径超过10μm。这些粒子是高度多孔的，在sem图像中观察到少量的碎片。仅含有甘露醇的粒子(sfd-甘露醇)高度聚集并在一起结块。另一方面，sfd-0.5％mrna制剂的粒子看起来更离散且是球形的。肽/mrna复合物的存在看起来增加了sfd粒子的物理稳健性。通过ngi评价干粉制剂的气雾剂性能，并以ef和fpf对其进行表示(图6)。指示成功离开吸入器的粉末的量的ef对于所有制剂是令人满意的，具有至少75％或更高的值。fpf表示粉末的呼吸分数。对于sd制剂，肽/mrna复合物的存在降低了粉末的气雾剂性能，与sd-甘露醇制剂相比fpf显著降低。sd-甘露醇制剂的fpf是60％，并且对于sd-0.1％mrna和sd-0.5％mrna制剂，该值分别降至36％和41％。用sfd制剂观察到相反的趋势。sfd-甘露醇的fpf是44％，并且对于sfd-0.1％mrna和sfd-0.5％mrna制剂，该值分别显著增至62％和68％。总之，就fpf而言，肽/mrna复合物的sfd制剂比它们的sd对应物表现得显著更好。基于ngi数据计算质量中值空气动力学直径(mmad)和几何标准偏差(gsd)(表3)。所有制剂的mmad小于6μm，gsd小于5μm。对于两种干燥方法，与通过相同方法制备的0.1％mrna制剂相比，0.5％mrna制剂展现出更小的mmad和更高的fpf，表明含有更高量的peg
12
kl4/mrna复合物的制剂展现出更好的用于吸入的气雾剂特性。
[0123]
表3.喷雾干燥(sd)和喷雾冷冻干燥(sfd)粉末制剂的质量中值空气动力学直径(mmad)和几何标准偏差(gsd)。基于下一代碰撞取样器(ngi)数据计算数值。数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0124][0125]
为了检查干燥之后mrna的完整性，用sd和sfd制剂对a549细胞进行体外转染(图7)。成功地证明了所有干粉制剂的转染效率。新鲜制备的复合物以及sd前和sd后的样品之间没有显著差异，表明mrna保持完整并且sd过程不损害它们的生物活性。另一方面，当使用每孔0.5μg的mrna时，干燥之后sfd-0.5％mrna制剂的转染效率显著低于干燥之前的其转染效率，表明在sfd工艺期间可能存在一些少量的mrna降解。然而，采用sfd-0.1％mrna制剂在干燥前和干燥后没有观察到显著差异，在转染中使用每孔1μg的mrna时也没有观察到显著差异。
[0126]
7.4体内mrna转染
[0127]
最初，采用不同的肽与mrna比率(2.5:1、5:1和10:1重量/重量)和在小鼠中作为液体气雾剂气管内给药后的不同时间点(4h和24h)评价peg
12
kl4/mrna复合物的体内mrna转染效率。采用以10:1比率形成的复合物观察到最高的荧光素酶表达(图16)，这也与体外转染研究一致。因此，在随后的体内研究以及干粉制剂的制备中采用10:1比率。在给药后24h时
发现肺中的荧光素酶表达更高(图17)，其用于随后的体内研究。在用裸mrna处理的小鼠的肺中显示出荧光素酶表达(图8)，但发光仅局限于气管区域。另一方面，在用peg
12
kl4/mrna复合物处理的小鼠的肺叶中观察到荧光素酶表达，并且肺组织中的荧光素酶表达比裸mrna组高得多。尽管用脂质体复合物处理的组也证明荧光素酶表达，但与裸mrna组相似，表达仅限于气管，并且表达水平甚至低于裸mrna组的表达水平。在给药后4h时进行生物分布研究，使用花菁-5标记的mrna定位气管内给药后肺中气雾剂沉积的位点(图18)。在所有三个处理组中，可以在肺叶中观察到荧光信号，表明气雾剂确实可以到达肺深部区域，但仅peg
12
kl4/mrna复合物可以成功转染以在肺深部中表达荧光素酶，如生物发光图像中所示出的。另外，发现在气管内给予作为液体气雾剂或粉末气雾剂的peg
12
kl4/mrna复合物后，在给药后24h时，荧光素酶mrna的表达集中定位在肺中，但未集中定位在其他器官中(图19)。在体内进一步研究了液体气雾剂中不同浓度的peg
12
kl4/mrna复合物的转染效率(图9)。将含有5或10μg mrna(即50或100μg peg
12
kl4)的复合物气管内递送至小鼠。在两个处理组中均观察到肺中的荧光素酶表达，其中5μg mrna处理组显示出显著更高的荧光素酶表达。此外，较低剂量在给药后24h时不引起任何显著的体重变化，而较高剂量导致约6％的体重损失。因此，在此得出结论，5μg的mrna剂量可以同时实现高转染效率和低体内毒性。最后，sd-0.5％mrna和sfd-0.5％mrna制剂作为重构液体气雾剂或粉末气雾剂被递送至小鼠(图10)。液体和粉末气雾剂均可以在给药后24h时表达荧光素酶，但前者显示出显著更高的转染效率。sd制剂也比sfd制剂表现更好，表明sd方法可以比sfd方法更好地保持mrna的完整性和因此保持mrna的生物活性，这与体外转染结果一致。
[0128]
7.5安全性特性
[0129]
通过测量balf和肺匀浆中促炎细胞因子的水平来研究peg
12
kl4/mrna复合物对小鼠的免疫原性(图11)。mcp-1、tnf-α、kc和il-6的表达在balf和肺匀浆中都被lps显著诱导，但在5和10μg mrna剂量下不受裸mrna和peg
12
kl4/mrna的影响，除了10μg mrna剂量的peg
12
kl4/mrna显著诱导了balf中的mcp-1表达。还监测小鼠的体重。与用对照组处理的小鼠相比，仅lps处理组在给药后24h时引起显著的体重损失(图20)。当以10μg mrna剂量给药时，裸mrna和peg
12
kl4/mrna复合物也引起一些体重损失，但与对照组相比，变化不具有统计学显著性。将用peg
12
kl4/mrna复合物(5μg mrna)的液体和粉末气雾剂处理的肺的组织学特征与未处理的对照、pbs处理的组和lps处理的组进行比较(图12)。未经任何处理或用pbs处理的肺显示出健康表现，而用10μg的lps气管内处理的肺显示出空气空间的不规则分布和炎性细胞浸润到间质和肺泡空间中。用作为液体或粉末气雾剂的peg
12
kl4/mrna复合物处理的肺未显示出炎症迹象。总之，每只小鼠5μg mrna剂量的peg
12
kl4/mrna的单次剂量在肺中未显示出任何炎症和毒性的迹象。
[0130]
8.讨论
[0131]
基于核酸的疗法的临床翻译要克服的最重要障碍之一是递送[23]。在真正实现有效的体内核酸治疗之前，必须解决该问题。作为sp-b的模拟物，最初采用合成的kl4来剖析表面活性物质对核酸递送的作用。在此研究mrna的递送，因为(i)单链mrna由于其不稳定的性质因而是难以递送的分子；(ii)缺乏探索mrna的吸入干粉制剂的研究(更多关于sirna的研究)[27,28]；(iii)mrna以mrna疫苗的形式对于许多肺部疾病的治疗以及疾病的预防具有巨大的治疗潜力[29,30]；和(iv)在不建立疾病模型的情况下，采用报告基因定量mrna的
表达相对容易。
[0132]
富含亮氨酸的kl4肽的水溶性差，限制了其作为非病毒载体的应用。如细胞摄取和转染研究中所证实的，peg
12
kl4在将mrna递送至细胞中比kl4更有效。peg的存在可以通过促进细胞进入以及mrna在细胞中的释放来改善mrna转染，更有效地用于发生蛋白质翻译。
[0133]
采用两种粉体工程技术sd和sfd以生产mrna的吸入干粉制剂。重要的是，肽/mrna复合物的完整性可以在干燥之后保持，而粉末对于有效的肺沉积展现出良好的空气动力学性质。sd是单步骤操作，其通过将液体雾化成立即与干燥腔室内的热干燥气流接触的细滴而将进料液体转化成干燥粒子。在该工艺期间，分子暴露于升高的温度和剪切应力，增加了rna降解的风险[35]。然而，该干燥方法易于在工业上放大用于大规模生产。sfd是多步骤方法，其涉及将液体雾化到冷冻剂(通常为液氮)中，在其中粒子瞬时冷冻，随后在冷冻干燥期间溶剂升华。sfd更适合不耐热的生物分子，并且多孔粒子的形成通常展现出良好的气雾剂性质，但是生产时间更长并且放大更复杂。根据物理化学表征，peg
12
kl4/mrna复合物在干燥前和干燥后在粒度和ζ电势方面表现相似，表明所采用的干燥条件对peg
12
kl4/mrna复合物的性质没有重大影响。在体外和体内转染研究中，sd制剂的转染效率均优于sfd制剂，表明在sfd工艺期间mrna的完整性可能部分受损。一个有趣的观察结果是，重构的sfd制剂的ζ电势稍微高于新鲜制备的复合物以及重构的sd制剂，这表明一些带负电荷的mrna可能在sfd工艺期间降解，改变peg
12
kl4肽与mrna的比率，使得复合物变得更具正电性。mrna的损伤可能是由喷雾冷冻步骤中极低温度的突然暴露或者冷冻干燥工艺期间的物理冲击，诸如升华或相分离期间的驱动力引起的[36]。然而，在sfd制剂中仍保留有相当数量的完整mrna以使得成功的转染发生。
[0134]
sd和sfd粉末制剂均展现出用于吸入所期望的气雾剂性质。尽管sfd制剂的粒子在物理上更大，但它们的气雾剂性能确实优于sd制剂，这由更高的fpf值反映。这可能归因于sfd粉末的多孔性质。已知sfd可以通过在冷冻干燥步骤期间溶剂的升华产生具有低密度的多孔粒子[37]。空气动力学直径与物理尺寸和密度成比例。通过使粒子变得多孔，可以减小空气动力学直径，如通过sd-0.5％mrna制剂中4.5μm的mmad和相应sfd制剂中1.5μm的mmad所证明的。与仅甘露醇的粉末相比，sd制剂中包含peg
12
kl4/mrna复合物对气雾剂性能具有负面影响，导致更低的fpf。然而，当mrna的量从0.1％增加到0.5％时，两者之间的fpf没有显著差异。相反，peg
12
kl4/mrna复合物的存在改善了sfd制剂的气雾剂性能。
[0135]
体内研究证明peg
12
kl4肽对于肺部递送是安全的，在显示在肺中的有效转染效率(5μg/小鼠)的mrna剂量下具有低免疫原性和毒性，尽管需要重复剂量以证明其长期安全性。在气管内给药后也观察到裸mrna和脂质体复合物的转染，但是荧光素酶表达限于气管，并且它们未在肺的更深区域中转染。相反，peg
12
kl4可以介导肺深部区域的有效mrna表达。裸mrna和脂质体复合物不能渗透粘液和肺表面活性物质屏障以到达更深的肺区域中的上皮细胞，导致转染差[39]。虽然其他人已经使用不同类型的聚合物显示出了肺中的mrna转染[15]，但是他们中没有人报道用于吸入的干粉制剂。
[0136]
根据peg
12
kl4/mrna复合物的体内转染研究的更密切考察，尽管递送了相同的mrna剂量，与粉末气雾剂相比，液体气雾剂在肺中产生更好的mrna表达。这可能归因于气管内给药期间的次优粉末吹入，这是具有挑战性的过程[40]，导致粉末在动物肺中不完全分散。事实上，阶式碰撞取样器研究是评价粉末制剂的粉末分散性和气雾剂性能的更合适的且相关
的方法。最重要的是，重构粉末能够介导动物肺中良好的mrna转染。当在sd与sfd方法之间比较时，前者一致地显示出更好的转染效率，这可能是由于在sd工艺期间更好地保持mrna完整性，尽管sfd制剂由于其具有低密度的多孔结构而显示出更好的气雾剂性能。为了进一步改善mrna干粉制剂，sd粉末的气雾剂性能可以通过减小粒子的尺寸或密度、或者在制剂中包括分散增强剂，诸如亮氨酸而优化，而在sfd制剂中可以使用掺入冷冻保护剂，诸如海藻糖。
[0137]
本文提供了用于肺部递送的可吸入干粉mrna制剂的首次报道。通过peg化修饰kl4肽导致溶解性以及转染效率的提高。通过sd和sfd技术所制备的peg
12
kl4/mrna的干粉制剂适合吸入，其中sd方法在保持mrna完整性方面是优越的。当peg
12
kl4/mrna复合物作为液体或粉末气雾剂被气管内给予小鼠中时，观察到在肺中的有效转染，免疫原性和毒性的风险低。本文提供了用于治疗以及疫苗应用的呈干粉形式的用于mrna肺部递送的非病毒载体peg
12
kl4。
[0138]
9.peg化对由kl4肽介导的sirna转染的影响的研究
[0139]
9.1引言
[0140]
小干扰rna(sirna)的肺部递送是用于治疗各种呼吸系统疾病的有前景的治疗策略。需要载体用于将sirna有效递送至肺中的细胞。我们先前的研究证明阳离子kl4肽在肺上皮细胞中介导稳健的sirna转染中是有效的。然而，由于高疏水性亮氨酸含量，其低水溶性限制了其作为递送载体的应用。为了解决该问题，在此研究了peg化策略以提高kl4肽的溶解度。将具有在6至24个单体之间变化的长度的单分散聚乙二醇(peg)共价连接至kl4肽。所有peg化kl4肽都可以与sirna结合并形成纳米尺寸的复合物，但是随着peg链长度的增加，sirna与肽之间的相互作用变得更弱。在三种人肺上皮细胞系，包括a549细胞、calu-3细胞和beas-2b细胞上研究转染效率。所有peg化kl4肽在所有细胞系上均展现出令人满意的转染效率。在所有肽之中，因为其良好的水溶性、稳健的转染效率和在肺上皮细胞中的高细胞摄取，含有12个peg单体的peg
12
kl4肽被认为对于sirna递送是最佳的。还证实了肺部给药后体内炎症反应和毒性的风险低。
[0141]
rna干扰(rnai)是强有力的基因沉默过程，在许多疾病的治疗中具有巨大的潜力[41]。自其数十年前被发现以来，rnai分子，诸如短发夹rna(shrna)、小干扰rna(sirna)和微小rna(mirna)的应用一直局限于研究工具。当迄今第一种rnai药物(patisiran)，即抗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的sirna，于2018年被fda批准时，该情况已经发生了变化[42,43]。在该批准后不久，用于患有急性肝卟啉症的成人的另一种基于sirna的药物(givosiran)于2019年也获得fda批准[44,45]。随着这种从实验室到临床的转变的成功，预期在未来几年更多的sirna治疗剂将出现在市场上。
[0142]
sirna的肺部递送非常有前景用于治疗呼吸系统疾病，诸如肺癌、炎性肺部疾病、呼吸道感染和肺纤维化[46-49]。有效的递送载体对于促进sirna的细胞摄取是必需的。据报道肺表面活性物质中的表面活性蛋白b(sp-b)增强蛋白脂质包覆的纳米凝胶制剂的sirna递送[50]，受其启发，我们的小组使用sp-b模拟物kl4肽开发了非病毒载体[17]。kl4是具有21个氨基酸的阳离子合成肽，含有重复的kllll序列。它介导有效的体外sirna转染而没有显著的细胞毒性迹象。然而，kl4肽的高亮氨酸含量使其难溶于水。
[0143]
为了克服溶解性问题，一种普遍的策略是peg化。研究已经表明，亲水性聚乙二醇
(peg)与蛋白质和肽的连接可以有效地改善溶解性、物理稳定性、循环时间和降低免疫原性应答[51-54]。peg化已经被广泛研究，用于使用聚合物、脂质和肽的sirna递送[55,56]。peg化比率和peg链长度可以影响递送系统的尺寸分布、稳定性、细胞摄取和转染效率。然而，peg化如何影响sirna递送存在矛盾的结果。一些研究表明，peg化比率的增加对sirna转染效率具有负面影响，因为sirna的细胞摄取或内体逃逸减少[57,58]。其他研究显示，当递送系统中包括靶向配体时，作为间隔物的peg的掺入通过促进配体与受体之间的结合而提高了sirna转染效率，或者peg化仅促进sirna从载体释放，从而增强转染效率[59,60]。此外，这些研究中的大多数使用经受批次间变化的多分散peg聚合物。与多分散peg相比，由于其均匀性和高再现性，使其更易于化学表征和纯度控制，因此具有精确和离散分子量的单分散peg是优选的[61]。然而，有限的研究在sirna递送中使用单分散peg[62-65]，可能是由于相对高的生产成本。peg聚合物可以直接与sirna缀合或其用于修饰递送载体以改善生物相容性。例如，wagner等人使用peg
24
(具有24个单体的peg)以屏蔽低聚物的表面并使血液中的非特异性相互作用最小化，用于dna和sirna递送[65]。
[0144]
在该研究中，研究并比较了三种具有在6至24个单体之间变化的单分散peg链长的peg化kl4肽。该研究的目的是了解peg化对sirna转染效率的影响，并通过研究肽/sirna复合物的肽构象、sirna结合亲和力、物理化学性质，复合物的细胞摄取、毒性和炎症反应来识别最佳候选物。
[0145]
9.2材料和方法
[0146]
材料
[0147]
kl4肽购自chinapeptides(上海，中国)，并且具有各种peg长度的peg化kl4肽购自ezbiolab(carmel，新泽西州，美国)，纯度》90％(表4)。在1％(体积/体积)dmso中以1mg/ml制备kl4和peg6kl4储备溶液。在蒸馏水中以2mg/ml制备peg
12
kl4和peg
24
kl4储备溶液。荧光标记的sirna(siglo亲环蛋白b对照sirna)购自ge dharmacon(lafayette，科罗拉多州，美国)。沉默子选择gapdh阳性对照sirna(silencer select gapdh positive control sirna)、沉默子选择阴性对照sirna(silencer select negative control sirna)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)(dmem)、角化细胞-sfm、optimem i血清减少的培养基、胰蛋白酶-edta(0.25％)、胎牛血清(fbs)、抗生素-抗真菌剂(100
×
)、lipofectamine 2000购自thermofisher scientific(waltham，马萨诸塞州，美国)。在超纯depc-处理的水中以0.5-1mg/ml制备sirna储备溶液。gelred核酸染色剂购自biotium(hayward，加利福尼亚州，美国)。抗-gapdh和抗-β-肌动蛋白抗体购自abcam(cambridge，英国)。二次抗体和amersham ecl蛋白质印迹检测试剂购自ge healthcare(amersham，英国)。小鼠肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)、角化细胞衍生趋化因子(kc)和白细胞介素-6(il-6)elisa试剂盒购自r&d systems(minneapolis，明尼苏达州，美国)。肝素钠购自leo pharmaceutical ltd(ballerup，丹麦)。来自大肠杆菌(e.coli)o111:b4的脂多糖和其他试剂获得自sigma-aldrich(saint louis，密苏里州，美国)，为分析级或更纯。
[0148]
表4本研究中所使用的肽的序列、peg单体的数目、分子量。
20s-twin，fei company，hillsboro，俄勒冈州，美国)在100kv的电压下显现。使用数码相机(具有digtalmicrograph软件的gatan orius sc600型号831ccd相机2.7k
×
2.7k像素)拍摄显微照片。
[0159]
细胞培养
[0160]
a549细胞(人肺泡上皮腺癌)、beas-2b细胞(人支气管上皮细胞)和calu-3细胞(人肺上皮腺癌)获得自atcc(manassas，弗吉尼亚州，美国)。在补充有10％(体积/体积)fbs和1％(体积/体积)抗生素-抗真菌剂的dmem中培养a549细胞。在补充有人重组表皮生长因子(regf)、牛垂体提取物(bpe)和1％(体积/体积)抗生素-抗真菌剂的角化细胞-sfm中培养beas-2b细胞。在补充有10％(体积/体积)fbs和1％(体积/体积)抗生素-抗真菌剂的dmem/f12中培养calu-3细胞。将所有细胞维持在5％co2、37℃下，并根据atcc说明进行传代培养。
[0161]
sirna转染
[0162]
在转染前一至两天，将a549细胞、beas-2b和calu-3细胞分别以1.6
×
105个细胞/孔、2
×
105个细胞/孔和3
×
105个细胞/孔的密度接种在六-孔板中。用5:1至20:1比率(重量/重量)的含有gapdh sirna或阴性对照sirna(6至100nm)的肽/sirna复合物在optimem i血清减少的培养基中转染细胞。使用lipofectamine 2000用作比较。孵育5h之后，将细胞洗涤并用补充了血清的细胞培养基替换。转染后72h时，洗涤细胞并用细胞裂解缓冲液裂解。如先前所描述的，进行蛋白质印迹分析以分析gapdh蛋白质的水平[66]。使用image j软件(版本1.52)通过蛋白质印迹的密度测定法分析gapdh表达。gapdh表达用相应样品的β-肌动蛋白的表达归一化。剩余的gapdh表达是阳性对照的归一化gapdh表达除以阴性对照的归一化gapdh表达。
[0163]
流式细胞术研究
[0164]
流式细胞术用于研究肽/sirna复合物的细胞摄取。在实验前一天，将a549细胞和calu-3细胞分别以2.5
×
105和4
×
105个细胞/孔的密度接种在六-孔板中。用10:1比率(重量/重量)的含有荧光标记sirna(150nm)的肽/sirna复合物在opti-mem i血清减少的培养基中转染细胞。孵育4h之后移除转染培养基，并将细胞用pbs洗涤一次。由0.25％(重量/体积)胰蛋白酶-edta使细胞胰蛋白酶化并悬浮在培养基中。用0.04％(重量/体积)台盼蓝溶液淬灭细胞外荧光信号。孵育2min之后，将细胞用pbs洗涤三次。将细胞再悬浮于500μl的pbs中并用无菌40μm细胞过滤器(bd biosciences，加利福尼亚州，美国)筛分。通过采用pe/pi激光器(585/42nm)(bd facscantoii分析仪，bd biosciences，加利福尼亚州，美国)的流式细胞术分析荧光强度。每个样品分析至少10000个单细胞。
[0165]
动物
[0166]
使用具有8至9周的平均年龄和18至22g的体重的雌性balb/c小鼠。将小鼠饲养在恒定温度下的12h暗-光循环下，并随意喂食自来水和标准食物。所有小鼠获得自实验动物部(the laboratory animal unit)(香港大学)。所进行的所有实验均经香港大学教学与研究活体动物使用委员会(the committee on the use of live animals for teaching and research)(culatr)批准。
[0167]
体内炎性研究
[0168]
向小鼠气管内给予比率10:1(重量/重量)的含有10μg的sirna的kl4/sirna和peg
12
kl4/sirna复合物。pbs和lps(10μg)用作对照。在气管内给药之前，用腹膜内注射麻醉
剂(80mg/kg氯胺酮和4.5mg/kg甲苯噻嗪)使小鼠麻醉。所有样品在75μl的pbs中制备并负载到高压注射器(型号fmj-250；penncentury inc.，wyndmoor，宾夕法尼亚州，美国)中，并通过气雾器(型号ia-1c；penncentury inc.，wyndmoor，宾夕法尼亚州，美国)产生液体气雾剂，除了lps，其在25μl的pbs中制备并通过微量移液器递送。在给药前和给药后24h监测小鼠的体重。小鼠被腹膜内注射致死剂量的戊巴比妥。收集支气管肺泡灌洗液(balf)和肺组织。通过elisa测量tnf-α、mcp-1、kc和il-6在balf和肺匀浆中的表达。
[0169]
统计分析
[0170]
使用prism软件版本8(graphpad software inc.，san diego，加利福尼亚州)进行统计学检验，并通过单因素方差分析(anova)分析。除非另有说明，所有实验独立地重复至少三次。差异在p《0.05时被认为是统计学显著的。
[0171]
9.3结果
[0172]
肽的二级结构
[0173]
使用cd在不同温度下检查自由溶液中肽的二级结构(图21)。在更低温度下，kl4肽采取α-螺旋构象，因为在cd光谱中观察到在190-195nm处的典型强阳性条带和在208-210nm和222nm处的两个阴性条带。当温度升高至约90℃时，α-螺旋结构逐渐变成β-折叠构象，如由在215-220nm之间的单一阴性条带和在195nm处的阳性条带所指示的。peg6kl4和peg
24
kl4的结构非常相似，在所有测试温度下两者都采取α-螺旋结构，表明高热稳定性，尽管随着温度升高强度有小幅逐渐降低。与其他肽相比，peg
12
kl4肽的构象对温度响应更敏感。当温度升高时，它经历了从α-螺旋和β-折叠的混合物至典型的α-螺旋构象并最终至β-折叠结构的构象变化。
[0174]
荧光置换分析
[0175]
通过荧光置换分析研究肽与sirna的结合亲和力(图22)。当肽与sirna的比率增加时，荧光强度急剧下降，表明染料在肽与sirna之间结合时被置换。与kl4肽相比，peg化kl4肽在比率高达10:1(重量/重量)时显示出更陡的斜率，表明peg化肽在从sirna置换染料方面比kl4更有效。在比率10:1或更高时，所有肽的曲线开始平稳，表明sirna与肽之间的结合几乎完全。为了进一步检查sirna与肽之间的相互作用，以10:1比率形成所有复合物，并添加肝素以从复合物中置换sirna，导致荧光强度增加。有趣的是，kl4和peg6kl4肽的曲线形状不同于peg
12
kl4和peg
24
kl4肽的曲线形状。将数据拟合成四参数逻辑斯谛(4pl)s形模型用于进一步说明。所有肽的测定系数(r2)均大于0.995，表明模型与数据拟合良好。用该模型分析指示引起荧光强度增加50％的肝素的量的ec
50
和坡度。ec
50
随着peg链长度增加而降低，表明sirna在肝素滴定时更容易从复合物中释放。坡度用于定量曲线的陡度，曲线越陡，坡度值越高。随着peg链长度增加，坡度值增加，表明sirna更容易从具有更长peg长度的肽中释放。两个参数都显示，sirna与肽之间的相互作用随着peg链长度的增加而更弱。
[0176]
肽/sirna复合物的物理化学性质
[0177]
通过dls测量肽/sirna复合物的流体动力学直径(表5)。kl4/sirna复合物的平均直径是约650nm。用peg化kl4肽形成的复合物的粒度明显更小，范围从约160nm到230nm。kl4/sirna复合物的ζ电势是约 33mv，其也显著高于范围为 13至 19mv的peg化kl4肽/sirna复合物的ζ电势。为了考察电解质对复合物的粒度的影响，将pbs添加到复合物的溶液中(图23)。所有肽/sirna复合物在pbs的存在下显示粒度的显著增加，并且在kl4中效果最
显著，其中kl4/sirna复合物的尺寸升至几乎6000nm。随着peg链长度的增加，粒度的增加减弱。对于peg
24
kl4/sirna复合物，尺寸仅增加至约350nm，表明peg链长度越长，粒度越稳定。通过tem显现肽/sirna复合物的形貌(图24)。kl4/sirna复合物表现为观察到的具有游离kl4肽的大聚集体(游离kl4肽表现为丝状结构，参见图32)。由peg化kl4肽形成的所有复合物看起来尺寸更小且更致密，这与通过dls的尺寸测量一致。
[0178]
表5在水中以比率10:1(重量/重量)制备的肽/sirna复合物的由动态光散射和电泳光散射测量的粒度和ζ电势。数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0179][0180]
体外sirna转染
[0181]
在两种人肺癌细胞系(a549和calu-3)和一种人非癌肺细胞系(beas-2b)上获得肽的转染效率(图25-27)。在转染后72h时，在所有三种细胞系上，比率5:1至20:1(重量/重量)的肽/sirna复合物将gapdh蛋白质下调。通常，比率越高，转染效率越好。在a549细胞上(图25)，在用比率10:1(重量/重量)和更高的kl4/sirna、peg6kl4/sirna、peg
12
kl4/sirna转染的细胞中获得超过80％的gapdh蛋白质敲低。以相同比率形成的不同肽/sirna复合物(表6)、或以不同比率形成的相同肽的复合物(表7)之间没有显著差异，除了比率5:1(重量/重量)的peg
24
kl4/sirna，其表现显著更差于比率15:1和20:1。这些肽的转染效率与商业转染试剂lipofectamine 2000相当。对于calu-3细胞(图26)，比率10:1(重量/重量)或更高的所有肽/sirna复合物抑制了超过70％的gapdh蛋白质表达。在10:1比率(重量/重量)下，在peg
12
kl4/sirna复合物中可以观察到最高的敲低，达到超过90％的gapdh蛋白质抑制。值得注意地，lipofectamine 2000在介导对该细胞系的sirna转染方面是低效的，并且所有四种肽与lipofectamine 2000相比具有显著更高的转染效率。对于beas-2b细胞(图27)，转染效率也随着这些肽的比率增加而增加。与lipofectamine 2000相比，peg6kl4和peg
12
kl4肽两者均具有显著更高的转染效率。通过采用不同量的sirna，同时将肽与sirna比率保持在10:1(重量/重量)，在a549细胞上进一步比较不同肽的转染效率(图28)。所有肽的转染效率呈浓度依赖性方式。在这四种肽之中，peg6kl4和peg
12
kl4在转染sirna方面是最有效的。这两种肽在25nm sirna浓度下可以将gapdh蛋白质抑制80％，而其他两种肽需要50nm sirna以达到相似的抑制水平。
[0182]
表6以相同的肽与sirna比率制备的不同肽之间的比较。
[0183]
[0184]
表7以不同的肽与sirna比率制备的相同肽之间的比较。
[0185][0186]
通过单因素方差分析、随后图基(tukey’s)事后检验分析数据，n.s.不显著，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0187]
细胞摄取
[0188]
通过流式细胞术在a549细胞和calu-3细胞上定量评估由四种肽介导的sirna的细胞摄取(图29)。如所预期的，裸sirna不能进入细胞。对于a549细胞，少于20％的细胞显示出由kl4介导的sirna的摄取。随着peg链长度增加，细胞摄取增加，在peg
12
kl4和peg
24
kl4肽中观察到超过90％的细胞摄取。就a549细胞上的sirna摄取而言，这两种肽的表现均显著优于kl4和peg6kl4。细胞的中值荧光强度也遵循相同的趋势。与a549细胞相比，calu-3细胞更难转染，并且肽的差异不能反映在该细胞系上，因为在它们之间没有观察到显著差异，实现约30％至40％的细胞摄取。
[0189]
体内炎症反应
[0190]
通过测量balf和肺匀浆中促炎细胞因子的水平，在气管内给药后在小鼠中研究kl4/sirna和peg
12
kl4/sirna复合物的炎症反应(图30)。tnf-α、il-6、mcp-1和kc的表达在balf和肺匀浆两者中均被lps显著诱导，但不受peg
12
kl4/sirna的影响。kl4/sirna显著诱导balf和肺匀浆两者中mcp-1的表达。与peg
12
kl4/sirna处理的小鼠相比，在kl4/sirna处理的小鼠中balf中的il-6水平和肺匀浆中的kc水平更高。此外，在给药前和给药后24h时监测小鼠的体重(图31)。lps和kl4/sirna复合物均在24h之后导致超过5％的体重损失，而peg
12
kl4/sirna复合物不引起小鼠的显著体重变化。
[0191]
9.4讨论
[0192]
peg化是用于修饰治疗性蛋白质、肽、核酸以及包括脂质体和聚合物的递送系统以改善其物理化学和/或药代动力学性质的常用策略[67,68]。peg是具有高水溶性、生物相容性和结构柔性的多用途聚合物。这些期望的性质使得peg及其衍生物能够广泛用于药物应用，诸如增溶剂、渗透增强剂、药物递送系统和再生医学中的组织支架[69]。在该研究中，用peg修饰kl4肽的主要目的是提高肽的溶解度。发现12个单体或更长的peg长度有效提高kl4肽的溶解度。然而，预期电中性和亲水性peg的存在可能提供空间位阻并妨碍kl4肽与sirna之间的相互作用。如在荧光置换分析中所证实的，peg化kl4肽事实上更有效地从sirna/染
料混合物中置换染料。kl4肽在与sirna相互作用方面不如其他肽，这可能是由于其自聚集性质。如tem图像所示出的，kl4肽自组装成具有超过500nm的长度的纳米纤维结构(图32)。已经报道了其他基于α-螺旋和β-折叠的自组装肽形成具有类似于kl4肽的形貌的纳米纤维[70,71]。与其他peg化kl4肽相比，kl4肽的相对低的cd值与tem图像一致，因为许多kl4肽是自聚集的并且不再在溶液中。peg化之后，肽整体上变得更亲水并且不再聚集，允许sirna更有效地接近肽的结合位点。peg的存在可以提供空间位阻以促进染料从sirna/染料混合物中释放，导致在低比率下荧光强度的急剧下降。在另一研究中显示出了类似的观察结果，其中由于peg链的局部拥挤，与非peg化的聚合物相比，peg化的聚合物增加了从dna/染料混合物的染料置换[72]。peg化之后，肽通常采取α-螺旋构象，这对于有效的sirna转染是至关重要的[73]。然而，它们对温度变化的响应非常不同。在文献中没有关于peg化对蛋白质和肽的构象稳定性的影响的一致意见。一些研究报道了peg化对二级结构没有影响，而一些研究声称peg化可以增加或降低构象稳定性[74-76]。
[0193]
通过添加肝素的sirna释放研究表明，当peg长度增加时，肽与sirna之间的相互作用强度变得更弱。这部分地是因为不带电荷的peg链降低了阳离子kl4与sirna之间的有效电荷比[77]。10:1重量比的kl4、peg6kl4、peg
12
kl4和peg
24
kl4与sirna的电荷比分别是6.1比1、5.5比1、4.9比1和4.2比1。peg化kl4/sirna的ζ电势一致地显著低于kl4/sirna复合物的ζ电势，这表明peg的存在屏蔽了复合物的表面上的一些正电荷。与经常使用2000至5000da的peg的其他研究相比，本研究中使用的低于1200da的peg分子量相对较低[78-80]。因此，peg化kl4肽/sirna复合物保持带正电荷，这适合进入细胞。具有不同peg长度的肽的ζ电势是相似的，表明总体表面电荷不受peg长度的显著影响。另外，peg还提供了kl4与sirna的相互作用之间的空间位阻，其削弱了结合，促进了添加肝素后sirna从复合物中的释放。
[0194]
胶体体系的稳定可以通过两种主要机制实现，即空间排斥和静电排斥[81]。添加pbs之后，kl4/sirna复合物的尺寸显著增加。缓冲液中抗衡离子的存在中和了表面电荷[82]，当静电排斥减弱时导致粒子的聚集。因此，空间排斥已成为提供胶体稳定性的主要机制。[83]peg化是通过粒子的空间排斥提供胶体稳定性使粒子稳定的有效方法，并减少非特异性相互作用，防止复合物聚集[84,85]。这解释了为什么peg化kl4/sirna复合物更少受到生理盐的存在的影响。peg链长度越长，粒子越小，表明peg链的长度对其赋予粒子空间稳定性的能力具有影响[84]。
[0195]
kl4肽的物理化学性质受peg化的影响，而peg化进而影响肽/sirna复合物的细胞摄取。对a549细胞的流式细胞术研究示出，当peg链长度增加时，细胞摄取增加。不同肽的不同细胞摄取百分比是由于peg化肽在生理环境中的胶体稳定性的改善，得到用于有效进入细胞的更小粒子的制剂。然而，在calu-3细胞上的流式细胞术结果没有反映细胞摄取的趋势。可能的原因之一是a549与calu-3细胞之间在摄取机制和细胞层屏障性质方面的差异。sirna复合物的内化、细胞内运输和沉默效率是细胞系依赖性的[86]。在a549细胞上，进入是由网格蛋白和小窝蛋白通路介导的，而在calu-3细胞中，它更依赖于网格蛋白介导的通路。可能是peg
12
kl4和peg
24
kl4的sirna复合物更有效地利用网格蛋白和小窝蛋白通路两者，因此它们的摄取效率显著高于其他复合物在a549细胞上的摄取效率。然而，peg化kl4肽在不同细胞系中的确切摄取机制仍有待在未来的研究中研究。
[0196]
在三种不同的细胞系上进一步评价peg化对sirna基因沉默效率的影响。在所有三
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[0294]
具体实施方案的前述描述将充分揭示公开内容的一般性质，使得其他人可以通过应用相关领域的技术内的知识(包括引用并通过引用并入本文的文献的内容)容易地修改这样的具体实施方案和/或使这样的具体实施方案适应多种应用，无需过多的实验，而不偏离本公开内容的一般构思。因此，基于本文所提供的教导和指导，这样的适应和修改旨在处于所公开的实施方案的等同方案的含义和范围内。应理解，本文的措辞或术语是出于描述
的目的而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞应由本领域技术人员根据本文给出的教导和指导并结合相关领域技术人员的知识来解释。
[0295]
虽然以上已经描述了本公开内容的各种实施方案，但是应理解，它们是通过示例而非限制的方式给出的。对于相关领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离公开内容的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。因此，本公开内容不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据所附权利要求及其等同方案来限定。