具有纤维素结合域的PET水解酶的制作方法

具有纤维素结合域的pet水解酶
技术领域
1.本技术涉及一种pet水解酶，尤指一种具有纤维素结合域的pet水解酶。
现有技术
2.塑料制品因其可塑性以及稳定性高，目前已被广泛应用到生活的诸多方 面，给人类生活带来了许多便利，但同时引起的白色污染已经严重威胁全球 生态系统。目前全球合成塑料年生产量已超4亿吨，其中聚对苯二甲酸乙二醇 酯(polyethylene terephthalate,pet)由对苯二甲酸(terephthalic acid,tpa)和乙 二醇(ethylene glycol,eg)通过酯键聚合而成，性质稳定不易分解，常用于矿 泉水瓶、涤纶衣服和吸塑包装等，其产生的废弃物数量巨大，是白色污染的 重要来源。由于合成塑料废弃物在自然状态下需要数百年时间才能完全分解， 在环境中已持续积累并侵入人类食物链，严重威胁到地球生态和人类健康， 已成为全球关注的污染问题之一。
3.目前对pet废弃物的处理方法主要有填埋、焚烧、回收利用及生物降解 等。其中填埋和焚烧虽然最简单，但产生的废气、废水会对环境造成二次污 染；回收利用则因为回收成本的经济性和回收塑料的性能问题，导致现阶段 回收利用率较低。而利用生物降解技术(酶降解或微生物降解)则能将pet降解 成小的组成分子，然后再回收利用来合成pet。因此，生物降解法不但解决 了pet废弃物的问题，并且能够回收利用pet的合成原料。目前，生物降解 技术因其环境友好特性已逐渐成为研究热点。长久以来科学界一直在寻找有 效的pet生物降解方法，现已经从酯酶(esterase)、脂肪酶(lipase)和角质酶 (cutinase)等水解酶中发现了它们对pet降解的活力，证明了pet生物降解的可 能性。例如来自褐色嗜热裂孢菌(thermobifida fusca)的tfh和tfh bta-2水 解酶，来自植物堆肥中的lc角质酶，以及来自南极假丝酵母(candidaantarctica)的脂肪酶b等，已证实对pet有降解活性。但由于pet不是这些酶 的主要反应物，且这些酶都需要在高温下才能发挥最大的酶活性，因此造成 上述酶的工业应用价值较低。
4.近期，日本的研究团队报道了一种可以“吃塑料”的神奇细菌大阪堺菌 (ideonella sakaiensis)，此细菌能分泌一种新型的pet水解酶(petase)，在30℃ 条件下就能将pet分解成小片段的单(2-羟乙基)对苯二甲酸 (mono(2-hydroxyethyl)terephthalic acid,mhet)，并将分解后的产物运入体内 进一步“消化”，最终转化为对苯二甲酸(terephthalic acid,tpa)和乙二醇 (ethylene glycol,eg)这两种结构相对简单的pet组成分子。由于petase的水解 pet的活性高于其他酯酶或角质酶，因此具有潜在的工业应用价值。为了再 增加petase的活性，科学家们后续也做了很多的改造，其中韩国的研究团队 分析petase的结构后，设计改造获得了petase
s121e/d186h/r280a
(petase
eha
)突变 体，提升了petase在40℃的稳定性及活性。虽然petase
eha
突变体增加了对 pet水解活性，但是其降解pet效率还是较低，离商业化应用还有些差距。
5.因此，本技术欲进一步改造pet水解酶，以增加其降解速率及酶活性， 进而提升pet水解酶在产业上的应用价值。


技术实现要素：

6.本技术的目的在于改造现有pet水解酶，以增加其降解速率及酶活性， 进而提升pet水解酶的工业应用价值。
7.为达上述目的，本技术的一个较广义的实施方案提供一种pet水解酶， 其氨基酸序列包含seq id no.2及seq id no.6。
8.在一个实施方案中，seq id no.6连接于seq id no.2的c端。
9.在一个实施方案中，pet水解酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。
10.在一个实施方案中，pet水解酶的氨基酸序列与seq id no.4具有80％ 以上序列同源性。
11.本技术的另一个较广义的实施方案提供一种提升pet水解酶活性的方 法，包含将一个纤维素结合域融合至一个pet水解酶上的步骤。
12.在一个实施方案中，纤维素结合域的氨基酸序列如seq id no.6所示。
13.在一个实施方案中，纤维素结合域连接于pet水解酶的c端。
14.在一个实施方案中，纤维素结合域通过一个连接蛋白连接于pet水解酶 上。
15.在一个实施方案中，连接蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。
16.在一个实施方案中，融合后的酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。
17.在一个实施方案中，融合后的酶的氨基酸序列与seq id no.4具有80％ 以上序列同源性。
附图说明
18.图1显示petase
eha
的核苷酸序列以及氨基酸序列。
19.图2显示petase
eha-cbm的核苷酸序列以及氨基酸序列。
20.图3显示petase
eha
和petase
eha-cbm的hplc检测结果。
21.图4显示标准品tpa的hplc检测图。
22.图5显示标准品mhet的hplc检测图。
23.图6显示petase
eha
及petase
eha-cbm的pet降解活性分析。
具体实施方式
24.体现本技术特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。 应理解的是本技术能够在不同的态样上具有各种的变化，其皆不脱离本技术 的范围，且其中的说明及图式在本质上是当作说明之用，而非用以限制本申 请。
25.本技术所改造的pet水解酶即为从大阪堺菌(ideonella sakaiensis)分离 出，并经s121e、d186h、r280a突变的petase
s121e/d186h/r280a
(petase
eha
)。 为了使petase
eha
更有效地作用于pet，本技术采用一种将纤维素结合域 (carbohydrate-binding module,cbm)融合到petase
eha
上的新方法，从而提高 pet水解酶对pet的结合效率及降解效果。
26.首先，通过全基因合成的方法获得petase
eha
及petase
eha-cbm基因，并 利用ncoi及xhoi限制酶切位构建到pet32a载体，接着将该重组质粒转化入到 感受态细胞(competent cell)中，得到petase
eha
及petase
eha-cbm融合酶的重 组质粒。图1即显示petase
eha
的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，petase
eha
基因包含870个碱基(核苷酸序列以seq id no.1标
mhet及tpa活性为petase
eha
的165％及168％，而在40℃反应时 petase
eha-cbm的mhet及tpa活性为petase
eha
的142％及149％。因此，本 申请藉由将纤维素结合域(cbm)融合到petase
eha
上的新方法，明显地加快了 pet水解酶对pet的结合能力，进而增加其降解速率及酶活性，也提升了pet 水解酶的工业应用价值。
30.综上所述，为了增加pet水解酶的工业应用价值，本技术将petase
eha
与 纤维素结合域(cbm)融合，得到的petase
eha-cbm融合酶在30℃及40℃条件 反应下，对pet降解活性均高于petase
eha
，故本技术成功地提高petase
eha
的降解活性，也进一步地增加此pet水解酶的工业应用价值。此外，本技术 主要构想在于将petase
eha
与纤维素结合域(cbm)融合，故本技术所改造的 pet水解酶包含seq id no.2的petase
eha
序列及seq id no.6的cbm序列。 用来融合petase
eha
及cbm的连接蛋白则可依需求调整变化，而不限于seqid no.5所示的序列。又，酶在不同物种间通常存在一些变异，但仍具有相 同功能，且彼此间大多具有80％或90％以上的氨基酸序列同源性，显见要保 有酶功能，亦可容许有部分氨基酸序列的变异。换言之，本技术改造的pet 水解酶序列当不仅限于seq id no.4，亦可包含与seq id no.4具有80％或 90％以上序列同源性的序列。
31.纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由熟悉本技艺人士任施匠思 而为诸般修饰，然皆不脱如所附权利要求书所欲保护者。