一种胎盘来源内源性多肽及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种胎盘来源内源性多肽及其应用。


背景技术：

2.子痫前期(pre-eclampsia，pe)虽是妊娠期特发性疾病，但因可引发孕妇重要脏器损害(高血压脑病、肾功能损伤、心力衰竭)、胎盘早剥、早产、胎儿生长受限等并发症而危害巨大。pe全球发病率约4.6％，每年造成约7万孕产妇死亡，而我国部分地区发病率甚至高达10.49％。目前pe临床治疗主要为降压、预防抽搐，但效果有限，终止妊娠往往是最终手段，因此常伴随医源性早产。此外pe产妇及其子代远期不良心血管事件的风险明显增高。因此，积极寻找安全有效、特异的治疗方法刻不容缓。
3.在诸多致病因素中，血管内皮细胞损伤一直被认为是子痫前期的关键环节。胎盘血管重塑障碍，胎盘源性因子、毒性物质和炎性介质释放增多，造成系统性血管内皮细胞损伤，引发全身小血管痉挛性收缩，最终导致高血压、蛋白尿、水肿等一系列临床症状。从胎盘局部病变到全身多脏器功能损伤，血管内皮细胞既不仅是直接受损的靶细胞，更是子痫前期发生发展过程中的关键载体。近年来，普伐他汀，褪黑素，烟酰胺等在改善血管内皮细胞损伤方面的研究进展，虽未能获得确切的临床疗效及实际应用，但为子痫前期的治疗提供了新的线索。因此，聚焦血管内皮细胞损伤，寻找新的药物或靶标已成为子痫前期研究的热点方向。
4.近日，知名杂志science、circulation、ajog等相继报道了elabela(ela)肽的存在，ela作为apelin受体(aplnr)的内源性配体，可经血液循环调控胎盘血管发育、胚胎心脏祖细胞迁移，改善肺动脉高压大鼠的心肌肥厚和高血压。elaela作为内源性多肽的一员，其展现出的多重强大功能引起了我们的兴趣与关注。内源性多肽是一类普遍存在于机体内(组织、细胞以及体液)的肽类分子，主要来自蛋白的断裂片段。虽然既往被认为是不具有活性的蛋白加工或降解过程的中间物，但近年来内源性多肽被证实在免疫调节、细胞增殖与凋亡、神经递质调节等方面展示出强大调控作用。鉴于已有发现：c-肽(c-peptide)、胰高血糖素肽(glp-1)可通过调控nf-κb信号通路，减少糖尿病动物模型的血管内皮细胞损伤，治疗糖尿病微血管病变；松弛肽(serelaxin)则可通过抑制血管氧化应激，改善内皮细胞功能障碍，有望成为治疗动脉粥样硬化相关疾病的新药。因此，我们认为从内源性多肽角度，寻找影响血管内皮细胞功能的新成分，有可能为子痫前期防治提供新手段。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种人胎盘组织内源性多肽。
6.本发明的另一目的是提供含有人胎盘组织内源性多肽的组合物。
7.本发明的又一目的是提供人胎盘组织内源性多肽的应用。
8.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
9.一种人胎盘组织内源性多肽，氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.本发明所述多肽的获得可按照氨基酸序列通过固相合成方法获得；或者通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽的核苷酸序列的dna片段，通过现有的重组dna技术制备获得。所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pet载体、pgex载体；宿主细胞例如大肠杆菌(e.coli)，放线菌(actinomycetes)，芽孢杆菌(bacillus)，链霉菌(streptomyces)，本发明所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。
11.作为本发明的一种优选，所述的人胎盘组织内源性多肽的编码基因序列如seq id no.2所示。
12.所述的人胎盘组织内源性多肽在制备促进胎盘滋养细胞增殖的药物或试剂中的应用。
13.所述的人胎盘组织内源性多肽在制备促进胎盘滋养细胞侵袭的药物或试剂中的应用。
14.作为本发明的一种优选，所述的人胎盘组织内源性多肽在制备促进子痫前期患者胎盘滋养细胞增殖的药物或试剂中的应用。
15.本发明所述的人胎盘组织内源性多肽在制备提高滋养层细胞侵袭能力的药物或试剂中的应用。
16.含有所述人胎盘组织内源性多肽的组合物。
17.作为本发明的一种优选，所述人胎盘组织内源性多肽以治疗有效量存在于组合物中。
18.一种细胞培养液，含有权利要求1所述的人胎盘组织内源性多肽。
19.有益效果：
20.人胎盘组织内源性多肽(rndeelnkllggvtiaqggvlpniqav)，为h2ac1来源肽，由27个氨基酸组成，目前尚无其相关功能报道。生物信息学分析及实验结果显示：
①
来源于h2ac1蛋白c端的89～115位氨基酸；
②
protparam在线分析发现，的脂肪系数(aliphatic index)为126.30，平均亲疏水性(grand average of hydropathicity)为0.004，表现为疏水亲脂性，容易通过扩散或胞吞作用进入细胞内；
③
细胞培养液中加入，有促进滋养细胞细胞增殖的功能；cck8法可检测细胞增殖能力；
④
细胞培养液中加入，有促进滋养细胞细胞侵袭的功能；transwell法可检测细胞侵袭能力。因此，可以在制备促进子痫前期患者胎盘滋养细胞侵袭的药物或试剂中的应用。
附图说明
21.图1为实施例3中促进人绒毛膜滋养层细胞(htr-8/svneo)增殖的图
22.图2为实施例4中促进人绒毛膜滋养层细胞(htr-8/svneo)侵袭的图
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
24.rpmi 1640培养基购自美国invitrogen gibco公司，cck-8细胞增殖试剂盒购自美国ape x bio公司，bd matrigel matrix基质胶、细胞培养板购自美国corning公司
25.实施例1
26.人胎盘来源内源性多肽的筛选
27.收集妊娠30-39周、剖宫产分娩的重度子痫前期患者(3例)、健康孕妇(3例)的胎盘，取母体面组织块(直径约1cm)，用无菌磷酸盐缓冲盐水冲洗去除血液，对组织进行匀浆、超滤及脱盐以获得肽。筛选在两组胎盘中具有显著差异的肽(p值≤0.05)，使用blast2go软件进行go生物信息学分析，通过kegg网站(kegg；http://www.genome.jp/kegg)对多肽前体蛋白进行通路分析，利用expasy在线工具(https://web.expasy.org/compute.pi/)计算多肽等电点(pi)和分子量(mw)。选取两组胎盘中本底水平高、差异倍数大(≥2倍)，我们选择了来自组蛋白(h2ac1)的“rndeelnkllggvtiaqggvlpniqav”，以进一步探索它的潜在功能。
28.实施例2
29.委托上海科肽生物科技有限公司通过固相法合成如下seq id no.1所示多肽：arg asn asp glu glu leu asn lys leu leu gly gly val thr ile ala gln gly gly val leu pro asn ile(seq id no.1)
30.这是27个氨基酸组成的多肽，通过在线工具获取前述多肽序列的主要生物学参数如下：等电点(pi)为4.68，分子质量(mw)2819.21da。
31.取10mg多肽，用无菌双蒸水稀释成50mm-40℃储存备用。
32.实施例3 cck-8法检测多肽对人绒毛膜滋养层细胞(htr-8/svneo)增殖的影响
33.在37℃、5％co2孵箱中，培养人绒毛膜滋养层细胞，按2000个细胞/孔的密度接种在96孔培养板中，加入100μl培养基/每孔，分别加入多肽处理(终浓度分别为0.5，1.0，5.0，10.0μm)，对照组给予溶剂无菌双蒸水处理，每组5个复孔，37℃培养箱中培养。
34.24小时、48小时、72小时后取出96孔板，每孔贴壁加入10μl cck-8，避免气泡形成，放回37度培养箱继续孵育2小时。酶标仪测量吸光度，采用波长450nm计数，描绘生长曲线。
35.结果如图1所示，可见多肽明显促进滋养细胞增殖的功能。
36.实施例4 transwell法检测多肽对人绒毛膜滋养层细胞(htr-8/svneo)侵袭的影响
37.用无血清rpmi 1640培养基稀释基质胶(bd)，然后均匀铺在transwell小室上面，置于37℃、5％co2孵箱中2h以促进bd胶凝固。用不含血清的rpmi1640培养基重悬细胞并接种于小室中，分别加入多肽处理(终浓度为0.0μm、5.0μm)上室每孔200ul细胞悬液，约含5
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104个细胞。在下室中加入含10％fbs的rpmi1640完全培养基。培养48h后，取出小室并弃掉上室培养基。将小室浸入细胞固定液中固定，用结晶紫染色后观察并采集图像。
38.结果如图2所示，可见多肽明显促进滋养细胞侵袭的功能。
39.实施例5
40.细胞培养液配方:一种细胞培养液，配方为：rpmi 1640培养基(美国gibco公司)、10％胎牛血清(gibco公司)、5μm多肽。
41.实施例6
42.一种含有多肽的溶液剂，以双蒸水为溶剂，多肽浓度为5μm。
43.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。