抗ROR1抗体的制作方法

抗ror1抗体
技术领域
1.本公开涉及能够识别受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)的抗体。本文公开的抗体可用于治疗疾病，例如造血系统癌症和实体肿瘤。


背景技术：

2.受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)是一种进化上保守的i型膜蛋白，属于ror亚家族。它与ror家族的唯一一个另外的成员，ror2，具有58％的氨基酸(aa)序列同一性。ror1和ror2由具有一个免疫球蛋白样(ig样)结构域、一个卷曲(fz)结构域和一个kringle(kr)结构域的独特胞外区、以及随后的跨膜区和含酪氨酸激酶结构域的胞内区组成(baskar,s.,et al,(2008)clinical cancer research,14(2),396-404)。
3.ror1的表达受发育调节，在胎儿发育过程中衰减。对b细胞恶性肿瘤和正常b淋巴细胞的基因表达谱分析，揭示了ror1及其在淋巴细胞白血病细胞中的独特表达(参见，baskar等，2008，同上引文)。通过使用高灵敏度的鼠抗人ror1 mab 6d4，ror1被表征为在某些类型的实体瘤，包括卵巢癌、三阴性乳腺癌、肺腺癌和胰腺癌中，具有典型的膜均一表达。此外，ror1的细胞表面表达也在某些正常组织(如甲状旁腺、胰岛和人肠道的几个区域)中被观察到，但未见于其他组织(如脑、心脏、肺和肝脏)(berger等,2016,clinical cancer research,23(12),3061
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3071)。
4.ror1被提议为癌症治疗的靶点。例如，wo2005100605、wo2007051077、wo2008103849和wo2012097313描述了针对ror1的抗体及其作为靶向肿瘤治疗剂的用途，所述肿瘤包括实体瘤如乳腺癌和造血系统肿瘤如慢性淋巴细胞白血病(cll)。cirmtuzumab，通过对wo2012097313的抗ror1抗体d10所结合的表位进行作图而产生的一种人源化单克隆抗体，已用于多种癌症，包括慢性淋巴细胞白血病(cll)的临床试验中。cirmtuzumab阻止ror1与其配体wnt5a结合，这可以抑制wnt5a诱导的nf-κb活化刺激作用，从而在cll中抑制自分泌il-6依赖性stat3激活(chen等人，2019，blood，134(13)，1084
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1094)。cirmtuzumab可以被内化到细胞中，因此评估了其作为抗ror1抗体药物缀合物(adc)的靶向部分的用途。开发了基于cirmtuzumab的、含mmae的adc，vls-101，用于治疗ror1阳性恶性肿瘤患者。
5.针对ror1和第二抗原的双特异性抗体，例如双特异性t细胞衔接器(bispecific t cell engager,bite)，是开发的另一种治疗模式。wo2014/167022公开一种双特异性抗体，其中一个臂是缓慢内化的抗ror1抗体r12，另一个臂是抗cd3ε抗体。gohil等人，2017(onco immunology,6(7),1-11)使用靶向ror1卷曲结构域的单链可变片段(scfv)，产生阻止小鼠模型中胰腺肿瘤异种移植物植入的bite。qi等2018(proceedings of the national academy of sciences of america,115(24),e5467
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e5476)公开一种具有近膜表位的ror1靶向性scfv，r11，当构建在scfv-fc形式中时，使用基于异二聚的无糖基化fc结构域的ror1 x cd3双特异性抗体，其表现出强有力的选择性抗肿瘤活性。
6.bite是针对t细胞/cd3复合物的恒定成分和肿瘤相关抗原(taa)的双特异性抗体。这些双特异性抗体具有某些优势，例如以非mhc限制的方式将t细胞的细胞毒活性重定向到
恶性细胞。近年来，随着blinatumomab的临床成功，使用cd3靶向性bite进行癌症免疫治疗的兴趣日益增长。然而，已经出现与这种治疗方式的功效和毒性/安全性相关的问题。
7.对于严格肿瘤特异性的抗原，例如，可能期望具有增加的亲和力的抗体。然而，对于在肿瘤中过表达但也在正常组织中表达的肿瘤相关抗原，有利的是，抗体具有区分抗原在肿瘤中和在正常组织中的表达的能力。抗体的内化特性也对其治疗应用产生影响。对于抗体缀合物有效地将缀合的毒素递送到靶细胞中而言，例如，抗体结合后的强内化可能是合乎需要的。然而，内化作用对于t细胞衔接器则可能是不利的，对于通过t细胞结合来引发细胞毒性活性，可能期望的是将bite保持在细胞表面。此外，也已经显示，抗体药物的实体瘤渗透和功效受到抗体的亲和力和抗原内化的影响。根据rudnick等人，2011(rudnick等人，cancer res；71(6)；2250-9)的报道，高亲和力和快速内化可限制抗体向肿瘤内部的渗透，而相对较低的亲和力和较低的内化可以导致更有效的实体瘤渗透。
8.许多因素已经在本领域中被提出影响bite的体内效力和肿瘤选择性。并且经常地，根据靶标/表位的性质，t细胞衔接器被期望采取不同的属性。
9.例如，james等(cd22特异性嵌合tcr的抗原敏感性受靶表位距细胞膜的距离调节，j.immunol.180(10)(2008)7028
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7038)描述了，通过调节表位距细胞膜的距离来提高bite的功效和/或肿瘤选择性。通过用car-t细胞靶向与细胞膜具有不同距离的cd22表位，james等人发现，靶向中间结构域导致了靶标b细胞系的有效裂解，而未检测到正常b细胞的裂解。类似地，qi等人发现，ror1上的表位位置可以影响scfv-fc形式的ror1 x cd3双特异性抗体的活性(参见qi等人，2018，同上引文)。通过筛选一组在ror1上具有不同表位的mab，qi等人的数据表明，对于双特异性抗体的t细胞衔接而言，r11所靶向的位于ror1的kr结构域中的近膜端表位可能是合适的位点，而r12所靶向的位于fz和kr结构域连接处的远膜端表位则可能不是。具有抗体r12臂的双特异性抗体仅显示出弱的体内抗肿瘤活性。
10.已经描述了通过改造抗体形式(包括大小、价态和几何形状)来增加肿瘤细胞的优先结合的不同方法。slaga等人(基于亲合力的her2结合导致抗her2/cd3对her2过表达细胞的选择性杀伤，sci.transl.med.10(463)(2018))探索了一种多价抗体形式的基于亲合力的策略，并且开发了一种双特异性抗体，所述抗体的亲和力经选择可以增强对低密度her2表达细胞和高密度her2表达细胞的区分。g.l.moore等人(一种工程化用于有效开发多种双特异性抗体形式的稳健异二聚体fc平台，methods(2018))报道了类似的策略。
11.在开发双特异性抗体时有待考虑的再一个问题是制造适宜性。低产量和显著的聚集体形成是可造成抗体药物无法实际用于临床前和临床阶段评估的性质。
12.鉴于上述，考虑到ror1是癌症治疗中的一个有前景的靶点，本领域仍然需要开发具有不同结合效力和/或结合位点或内化特性的多样化抗ror1分子，以开发多样化的抗体形式，扩大和/或改善治疗效用和制造适宜性。
13.发明概述
14.本公开通过提供新的抗-ror1抗体、抗-cd3抗体和结合ror1和cd3的工程化双特异性蛋白，解决了上述需求。
15.具体地，在一些实施方案中，本公开提供抗ror1抗体，例如对表达ror1的细胞具有高结合效力并且具有低内化率的抗ror1抗体。在一些实施方案中，本公开还提供结合cd3的抗体，例如以高亲和力结合cd3的抗体。在一些实施方案中，本公开还提供串联fab免疫球蛋
白(fit-ig)形式或单价不对称串联fab双特异性抗体(mat-fab)形式的ror1/cd3双特异性结合蛋白，其中所述双特异性结合蛋白可以与ror1和cd3两者反应。在一些实施方案中，本公开的抗体可用于检测人ror1或人cd3、抑制ror1信号传导和/或抑制人ror1介导的肿瘤生长或转移，所有这些均可在体外或体内进行。此外，在一些实施方案中，本文所描述的双特异性多价结合蛋白可以用于诱导ror1重定向的t细胞细胞毒性和/或针对表达ror1的恶性细胞的体内有效抗肿瘤活性。
16.在一些实施方案中，本公开还提供制备和使用本文所述的抗ror1和抗cd3抗体以及ror1/cd3双特异性结合蛋白的方法。也公开了多种组合物，例如可在检测样品中的ror1和/或cd3的方法中使用的组合物、或在治疗或预防个体中与ror1和/或cd3活性相关的病症的方法中使用的组合物。
17.附图简述
18.图1显示单克隆抗体的ror1-ecd蛋白结合活性。无关migg1用作阴性对照。
19.图2a-b说明抗ror1单克隆抗体对ror1表达细胞的结合活性。无关migg1用作阴性对照。
20.图3显示，与其对应的亲本抗cd3单克隆抗体相比，ror1 x cd3双特异性抗体的cd3结合效力。无关higg用作阴性对照。
21.图4a-d说明ror1 x cd3双特异性抗体及其相应亲本抗ror1单克隆igg1抗体(huror1-mab004-1)在表达ror1的肿瘤细胞，(a)nci-h1975，(b)mda-mb-231、(c)a549和(d)rpmi-8226上的ror1结合效力。
22.图5显示共培养报告基因试验的结果，所述试验测量由ror1 x cd3双特异性fit-ig和mat-fab抗体引起的重定向的cd3激活，并与单特异性抗cd3 igg(huem1006-01-24和huem1006-01-27)以及无关fit-ig(emb01)进行比较。
23.图6显示基于jurkat-nfat-luc的报告基因试验的结果，该试验检测由暴露于人源化ror1 x cd3双特异性抗体引起的非靶标重定向的cd3激活作用，并与单特异性抗cd3 igg(huem1006-01-24和huem1006-01)以及无关fit-ig(emb01)进行比较。
24.图7显示研究各种ror1 x cd3双特异性抗体的重定向t细胞细胞毒性试验的结果。无关fit-ig(emb01)用作阴性对照。
25.图8显示用ror1 x cd3双特异性抗体或溶媒对照处理的人pbmc移植的m-nsg小鼠中mda-mb-231肿瘤体积的曲线图。
26.图9a-c显示使用人源化抗ror1抗体和双特异性抗体，(a)huror-mab004-1，(b)fit1007-12b-17和(c)mat1007-12b-17，的内化测定试验的结果。
27.图10a提供lh形式和hl形式的fit-ig双特异性抗体的域结构的示意图。图10b提供lh形式和hl形式的mat-fab双特异性抗体的域结构的示意图。
28.图11a显示fit-ig分子对表达ror1的mda-mb-231细胞的细胞结合活性。图11b显示了fit-ig分子对表达cd3的jurkat细胞的细胞结合活性。图11c显示重定向的t细胞细胞毒性测定试验的结果，以比较fit1007-12b-17与两种参考fit-ig分子。
29.发明详述
30.本公开涉及抗ror1抗体、抗cd3抗体、其抗原结合部分、和结合ror1和cd3的多价双特异性结合蛋白，例如fit-ig或mat-fab。本公开在多个方面涉及抗ror1和抗cd3抗体和抗
体片段、结合人ror1和人cd3的fit-ig和mat-fab结合蛋白，及其药物组合物，以及用于制备此类抗体、功能性抗体片段和结合蛋白的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本公开也涵盖：应用本公开的抗体、功能性抗体片段和双特异性结合蛋白用于检测人ror1、人cd3或两者的方法；在体外或体内调节人ror1和/或人cd3活性的方法；和治疗由ror1和cd3结合其各自配体所介导的疾病，尤其是癌症的方法。
31.定义
32.除非本文另有定义，否则与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在存在任何潜在歧义的情况下，此处提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应涵盖复数表达，复数术语应涵盖单数表达。在本公开中，除非另有说明，否则应用“或”表示“和/或”。此外，术语“包括”以及诸如“包含”和“含有”之类的其他形式的使用是非限制性的。再者，除非另外特别说明，诸如“元件”或“组分”等术语涵盖包含一个单元的元件和组分以及包含一个以上亚单元的元件和组分。
33.如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991)中描述的kabat编号系统编号，在本文中称为“根据kabat编号”。特别地，kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service，national institutes of health，bethesda，md(1991)的kabat编号系统(参见第647-660页)用于kappa和lambda同种型的轻链恒定域cl，并且kabat eu索引编号系统(参见第661-723页)用于重链恒定域(ch1、铰链、ch2和ch3，在这种情况下本文通过提及“根据kabat eu索引编号”进一步澄清)。
34.关于人免疫球蛋白轻链和重链序列的一般信息见：kabat,ea等,sequences of proteins of immunological interest,5th ed.,public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991)。
35.术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是这样一种蛋白质或多肽，所述蛋白或多肽基于其起源或衍生来源，或与在其天然状态下伴随它的天然相关组分不再相关，或基本上不含来自相同物种的其他蛋白质，或由来自不同物种的细胞表达，或在自然界中不存在。化学合成的或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽可以是与其天然相关组分“分离”的。还可以使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术通过分离使蛋白质基本上不含天然相关组分。
36.关于抗体、结合蛋白或肽与第二化学物质的相互作用，术语“特异性结合”或“特异结合”是指所述相互作用取决于第二化学物质上存在的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)。例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而非泛泛的蛋白质。一般而言，如果抗体对表位“a”具有特异性，则在含有标记的“a”和抗体的反应中，存在包含表位a的分子(或游离的、未标记的a)将减少结合到抗体的标记a的量。
37.术语“抗体”广泛地指，保留ig分子的基本表位结合特征的、由四个多肽链(即，两条重(h)链和两条轻(l)链)组成的任何免疫球蛋白(ig)分子、或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物。此类突变体、变体或衍生抗体形式在本领域已知，并且非限制性实施方案在下文讨论。
38.在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域组成：ch1、ch2和ch3。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。vh结构域的第一、第二和第三cdr通常列为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；同样，vl结构域的第一、第二和第三cdr通常列为cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。
39.术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c端区，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生。fc区可以是天然序列fc区或变体fc区。免疫球蛋白的fc区通常包含两个恒定结构域，即ch2结构域和ch3结构域，并且任选地包含ch4结构域，例如在igm和ige抗体的fc区的情况下。igg、iga和igd抗体的fc区包含铰链区、ch2结构域和ch3结构域。相比之下，igm和ige抗体的fc区缺少铰链区，但包含ch2结构域、ch3结构域和ch4结构域。在fc部分具有氨基酸残基置换以改变抗体效应子功能的变体fc区是本领域已知的(参见，例如，winter等人，美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的fc部分可介导一种或多种效应子功能，例如细胞因子诱导、adcc、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(cdc)和/或抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在某些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体是可取的，但在其他情况下可能是不必要的，甚至是有害的，这取决于治疗目标。某些人igg同种型，特别是igg1和igg3，分别通过与fcγrs和补体c1q结合来介导adcc和cdc。在另一个实施方案中，在抗体的恒定区，例如抗体的fc区中置换至少一个氨基酸残基，以改变抗体的效应子功能。免疫球蛋白的两条相同重链的二聚化由ch3结构域的二聚化介导，并由连接ch1恒定域和fc恒定域(例如ch2和ch3)的铰链区内的二硫键稳定化。igg的抗炎活性取决于igg fc片段的n-连接聚糖的唾液酸化。已经确定了抗炎活性的精确聚糖需求，由此可以构建合适的iggl fc片段，产生具有极大增强效力的完全重组的唾液酸化iggl fc(参见，anthony等人，science,320:373-376(2008))。
40.术语抗体的“抗原结合部分”和“抗原结合片段”或“功能片段”可互换使用，是指保留与抗原，即与衍生该部分或片段的全长抗体相同的抗原(例如，ror1、cd3)，特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。此类抗体实施方案也可以是双特异性、双重特异性或多特异性形式；特异地结合两种或更多种不同的抗原(例如，ror1和不同的抗原，例如cd3)。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段实例包括：(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，一种二价片段，包含通过铰链区二硫键连接的两个fab片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)包含一个单一的可变域的dab片段(ward等，nature，341：544-546(1989)；pct公开号wo 90/05144)；(vi)分离的互补决定区(cdr)。此外，虽然fv片段的两个结构域vl和vh由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头将其连接起来，由此形成单个蛋白质链，其中vl和vh区配对形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见，例如，bird等，science，242：423-426(1988)；和huston等，proc.natl.acad.sci.usa,85:5879-5883(1988))。此类单链抗体也旨在包含在术语抗体的“抗原结合部分”和上文给出的等同术语内。其他形式的单链抗体，例如双链抗
体(diabody)也包括在内。双链抗体可以是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短，不允许同一条链上的两个结构域配对，由此迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，holliger等人，proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)。此类抗体结合部分是本领域已知的(kontermann和d
ü
bel eds.,antibody engineering(springer-verlag,new york,2001),p.790(isbn 3-540-41354-5))。此外，单链抗体还包括包含一对串联的fv片段(vh-ch1-vh-ch1)的“线性抗体”，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(zapata等人，protein eng.,8(10):1057-1062(1995)；和美国专利号5,641,870))。
41.免疫球蛋白恒定(c)域是指重链恒定域(ch)或轻链恒定域(cl)。鼠和人igg重链和轻链恒定域氨基酸序列是本领域已知的。
42.术语“单克隆抗体”或“mab”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原决定簇(表位)。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种mab都针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。
43.术语“人序列”，就本技术的抗体或结合蛋白的轻链恒定域cl、重链恒定域ch和fc区而言，是指序列属于或来自人免疫球蛋白序列。本公开的人序列可以是天然人序列，或其包括了一个或多个(例如，至多20、15、10个)氨基酸残基变化的变体。
44.术语“嵌合抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。
45.术语“cdr移植抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列但其中vh和/或vl的一个或多个cdr区的序列被另一物种的cdr序列替换的抗体，例如具有其中的一个或多个人cdr已被鼠cdr序列取代的人重链和轻链可变区的抗体。
46.术语“人源化抗体”是指，包含来自非人物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列但其中至少一部分的vh和/或vl序列已被改变为更“类人”，即更类似于人种系可变序列的抗体。一种类型的人源化抗体是cdr移植抗体，其中来自非人物种(例如小鼠)的cdr序列被引入人vh和vl框架序列中。人源化抗体可以是这样的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其中所述抗体免疫特异性地结合目的抗原，并且包含基本上具有人抗体氨基酸序列的框架区和恒定区、但基本上是非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(cdr)。如本文所用，术语“基本上”在此cdr上下文中是指，所述cdr的氨基酸序列与非人抗体cdr的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同性。人源化抗体可以包含至少一个，通常为两个，可变域的基本上全部(fab、fab'、f(ab')2、fv)，其中所有或基本上所有的cdr区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的相应cdr区，且所有或基本上所有的框架区为具有人免疫球蛋白共有序列的框架区。在一个实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区，的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变域。所述抗体还可包括重链的ch1、铰链、ch2、ch3和ch4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化的轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化的重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅包含人源化的轻链可变域和/或人源化的重链。
47.人源化抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白，包括igm、igg、igd、iga和ige，以及任何同种型，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4。人源化抗体可以包含来自一种以上类别或同种型的序列，并且可以使用本领域公知的技术选择特定的恒定结构域以优化期望的效应子功能。
48.人源化抗体的框架和cdr区不需要与亲本序列精确对应，例如，供体抗体cdr或受体框架可以通过至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失进行诱变，从而该位点的cdr或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。在一个示例性实施方案中，然而，此类突变不是广泛的。通常，至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本fr和cdr序列的残基。在特定框架位置进行回复突变以恢复成出现在供体抗体中该位置的相同氨基酸，常可以用于保留特定环结构或正确定向cdr序列以与靶抗原接触。
49.术语“cdr”是指抗体可变域序列内的互补决定区。重链和轻链的可变区各有3个cdr，分别命名为cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。如本文所用，术语“cdr组”是指在能够结合抗原的单个可变区中出现的一组三个cdr。这些cdr的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。kabat(kabat等,sequences of proteins of immunological interest(national institutes of health,bethesda,maryland(1987)和(1991))所描述的系统不仅提供了适用于抗体任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了定义三个cdr的精确残基边界。
50.与抗体的重链和轻链cdr相关的术语“kabat编号”是本领域公认的，是指用于编号比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中其他氨基酸残基更可变(即高变)的氨基酸残基的系统。参见kabat等人，ann.ny acad.sci.,190:382-391(1971)；和kabat等人，sequences of proteins of immunological interest,fifth edition,u.s.department of health and human services,nih publication no.91-3242(1991)。
51.过去20年来，随着重链和轻链可变区氨基酸序列的大量公共数据库的增长和分析，人们了解了可变区序列内框架区(fr)和cdr序列之间的典型边界，并使得本领域技术人员能够根据kabat编号、chothia编号或其他系统准确确定cdr。参见，例如martin，“protein sequence and structure analysis of antibody variable domains”，在kontermann和d
ü
bel编，antibody engineering(springer-verlag,berlin,2001)，第31章，第432-433页。
52.术语“多价结合蛋白”表示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。在某些情况下，多价结合蛋白被工程化改造以具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“双特异性结合蛋白”(除非另有说明，可与术语“双特异性抗体”互换使用)是指，能够结合两个靶标的具有不同特异性的结合蛋白。本公开的fit-ig结合蛋白包含四个抗原结合位点并且通常是四价结合蛋白。本公开的mat-fab结合蛋白包含两个抗原结合位点并且通常是二价结合蛋白。根据本公开的fit-ig或mat-fab结合ror1和cd3两者，是双特异性的。
53.包含两个长(重)v-c-v-c-fc链多肽和四个短(轻)v-c链多肽的fit-ig结合蛋白形成六聚体，显示四个fab抗原结合位点(配对的vh-ch1与vl-cl，有时标记为vh-ch1::vl-cl)。fit-ig的每一个半分子各包含一个重链多肽和两个轻链多肽，并且这三个链的vh-ch1和vl-cl元件的互补免疫球蛋白配对导致串联排列的两个fab结构的抗原结合位点。在本公开中，优选包含fab元件的免疫球蛋白结构域直接融合在重链多肽中，而不使用结构域间接
头。也即，长(重)多肽链的n端v-c元件在其c端直接融合到另一个v-c元件的n端，后者又连接到c端fc区。在双特异性fit-ig结合蛋白中，串联fab元件可与不同的抗原发生反应。每个fab抗原结合位点包含一个重链可变域和一个轻链可变域，每个抗原结合位点总共有六个cdr。
54.fit-ig分子的设计、表达和表征的描述在pct公开wo 2015/103072中提供。这种fit-ig分子的一个例子包含一条重链和两条不同的轻链。重链包含结构式vl
a-cl-vh
b-ch1-fc，其中cl与vhb直接融合(即“lh形式”)；或结构式vh
a-ch1-vl
b-cl-fc，其中ch1与vlb直接融合(即“hl形式”)，而fit-ig的两条轻多肽链相应分别具有式vh
a-ch1和vl
b-cl(对于“lh形式”)或vl
a-cl和vh
b-ch1(对于“hl形式”)；其中vla是来自结合抗原a的亲本抗体的轻链可变域，vlb是来自结合抗原b的亲本抗体的轻链可变域，vha是来自结合抗原a的亲本抗体的重链可变域，vhb是来自结合抗原b的亲本抗体的重链可变域，cl是轻链恒定域，ch1是重链恒定域，fc是免疫球蛋白fc区(例如，igg1抗体重链的c端铰链-ch2-ch3部分)。在双特异性fit-ig实施方案中，抗原a和抗原b是不同的抗原，或相同抗原的不同表位。在本公开中，a和b之一为ror1，且另一为cd3，例如a为ror1，b为cd3。
55.包含一个长(重)v-c-v-c-fc链多肽、两个短(轻)v-c链多肽和一个免疫球蛋白fc链多肽的mat-fab结合蛋白形成一个四聚体，展现串联排列的两个fab抗原结合位点(配对的vh-ch1与vl-cl，有时标记为vh-ch1::vl-cl)和一个fc:fc二聚体。经常在mat-fab的重链的fc区ch3结构域(缩写为ch3m1结构域)以及mat-fab的fc多肽链的ch3结构域(缩写为ch3m2结构域)中引入修饰，以有利于两个ch3结构域的异二聚化。修饰可以是“孔内旋钮”(knob-in-hole,kih)突变，例如，进行突变以在重链的ch3m1结构域中形成结构旋钮，以便与包含互补结构孔的fc链的ch3m2结构域配对。然而，其他修饰，例如向结构域中引入盐桥或静电相互作用的那些修饰也是有用的。恒定区还可以进行其他修饰，例如，用于稳定mat-fab分子的cys残基，和/或用于防止或削弱fc效应子功能的突变。优选地，本文描述的mat-fab双特异性抗体的结构特征在于，所有相邻的免疫球蛋白重链和轻链可变域和恒定域彼此直接连接，没有介于其间的合成氨基酸或肽接头。
56.pct公开wo2018/035084中提供了对mat-fab分子的设计、表达和表征的描述。此类mat-fab分子的一个例子包含一条在fc区具有“旋钮”的重链、两条不同的轻链和一条具有“孔”的fc多肽链。在一些实施方案中，重链包含结构式vl
a-cl-vh
b-ch1-铰链-ch2-ch3m1，其中cl与vhb直接融合(即“lh形式”)；或结构式vh
a-ch1-vl
b-cl-fc，其中ch1直接与vlb融合(即“hl形式”)；并且mat-fab的两条轻多肽链相应地分别具有式vh
a-ch1和vl
b-cl(对于“lh形式”)或vl
a-cl和vh
b-ch1(对于“hl形式”)；其中vla是来自结合抗原a的亲本抗体的轻链可变域，vlb是来自结合抗原b的亲本抗体的轻链可变域，vha是来自结合抗原a的亲本抗体的重链可变域，vhb是来自结合抗原b的亲本抗体的重链可变域，cl是轻链恒定域，ch1是重链恒定域1，而ch3m1是具有旋钮突变，例如s354c和t366w的重链恒定域3。fc多肽链可以是免疫球蛋白(例如igg抗体)重链的c端铰链-ch2-ch3部分，在ch3m2中具有与旋钮突变互补的孔突变，例如t366s、l368a和y407v。在双特异性mat-fab实施方案中，抗原a和抗原b是不同的抗原，或相同抗原的不同表位。在本公开中，抗原a和b之一为ror1，且另一为cd3，例如a为ror1，b为cd3。
57.如本文所用，术语“kon”(也称为“kon”、“kon”)旨在指，如本领域已知，结合蛋白
(例如，抗体)与抗原结合以形成结合复合物，例如抗体/抗原复合物，的结合速率常数(on-rate constant)。“kon”也称为术语“结合速率常数”(association rate constant)或“ka”，在本文中可互换使用。该值表示，抗体与其靶抗原的结合速率，或抗体与抗原之间复合物形成的速率，如下面的公式所示：
58.抗体("ab") 抗原("ag")
→
ab-ag。
59.如本文所用，术语"koff"(也称为“koff”、“koff”)旨在指，如本领域已知，结合蛋白(例如抗体)自结合复合物(例如，抗体/抗原复合物)解离的解离速率常数(off-rate constant)或“解离速率常数”(dissociation rate constant)。该值表示抗体与其靶抗原的解离速率或ab-ag复合物随时间分离成游离抗体和抗原的速率，如下面的公式所示：
60.ab ag
←
ab-ag.
61.如本文所用，术语“k
d”(也称为“k
d”)旨在指“平衡解离常数”，指在平衡时滴定测量中获得的值，或通过解离速率常数(k
off
)除以结合速率常数(kon)获得的值。结合速率常数(k
on
)、解离速率常数(k
off
)和平衡解离常数(kd)用于表示抗体对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法是本领域公知的。使用基于荧光的技术可以提供平衡时在生理缓冲液中检测样品的高灵敏度和能力。可以使用其他实验方法和仪器，例如(生物分子相互作用分析)测定试验(例如，可从biacore international ab，ge healthcare公司，瑞典乌普萨拉获得的仪器)。使用例如red96系统(pall fort
é
bio llc)的生物膜层干涉仪(bli)是另一种亲和力测定技术。此外，也可以使用可从sapidyne instruments(boise,idaho)获得的(kinetic exclusion assay)试验。
62.术语“分离的核酸”是指，所述多核苷酸(例如，基因组、cdna或合成来源的多核苷酸，或其某种组合)，通过人为干预，不再结合在自然界中与其结合的所有或部分多核苷酸；或可操作地连接到在自然界中未与其连接的多核苷酸上；或作为更大序列的一部分，在自然界中并不存在。
63.如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是其中可以连接额外的dna片段的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，一些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，可用于重组dna技术的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本公开旨在包括具有等同功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
64.术语“可操作地连接”是指，使所描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的一种并置方式。与编码序列“可操作地连接”的控制序列将以这样的方式连接，所述方式允许在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作连接的”序列包括与目的基因相邻的表达控制序列、和反式或远距离发挥作用以控制目的基因的表达控制序列。如本文所用，术语“表达控制序列”是指，实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始序列、终止序列、启动子和增强子序
列；有效rna加工信号，如剪接信号和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(即kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，增强蛋白质分泌的序列。这种控制序列的性质因宿主生物而异；在原核生物中，这样的控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般来说，这样的控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工必不可少的组分，并且还可以包括其存在是有利的附加组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
65.如本文所定义，“转化”是指外源dna进入宿主细胞的任何过程。可以使用本领域熟知的各种方法在自然或人工条件下进行转化。转化可依赖于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。该方法基于被转化的宿主细胞进行选择，并且可以包括但不限于转染、病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。这种“转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的dna能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分进行复制。“转化的”细胞也包括在有限的时间内瞬时表达插入的dna或rna的细胞。
66.术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在指已引入外源dna的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含两种或更多种(例如，多种)编码抗体的核酸，例如美国专利号7,262,028中描述的宿主细胞。此类术语旨在不仅指特定主题细胞，而且指此类细胞的后代。由于某些修饰可能由于突变或环境影响而在后续世代中发生，因此此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生物界的原核细胞和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌(escherichia coli)；哺乳动物细胞系cho、hek 293、cos、ns0、sp2和per.c6；昆虫细胞系sf9；和真菌细胞酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
67.如本文所用，术语“有效量”是指这样的治疗量，所述治疗量足以减轻或改善疾病或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间；防止疾病的发展；导致疾病消退；预防与疾病相关的一种或多种症状的复发、发展或进展；检测疾病；或增强或改善另外的疗法(例如，预防剂或治疗剂)的(一种或多种)预防或治疗效果。
68.根据本公开的抗体、其功能片段和结合蛋白可以通过使用本领域中可用于纯化抗体和结合蛋白的多种方法和材料中的一种或多种来纯化(用于预期用途)。此类方法和材料包括但不限于亲和层析(例如，使用偶联至蛋白a、蛋白g、蛋白l或抗体的特定配体、其功能片段或结合蛋白的树脂、颗粒或膜)、离子交换层析(例如，使用离子交换颗粒或膜)、疏水相互作用层析(“hic”；例如，使用疏水颗粒或膜)、超滤、纳滤、渗滤、尺寸排阻层析(“sec”)，低ph值处理(以灭活污染病毒)及其组合，以获得预期用途可接受的纯度。灭活污染病毒的低ph处理的非限制性实例包括在18℃-25℃用0.5m磷酸将包含本公开的抗体、其功能片段或结合蛋白的溶液或悬浮液的ph降低至ph 3.5，持续60至70分钟。
69.标准技术可用于重组dna、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述进行。前述技术和程序通常可以根据本领域公知的常规方法，如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所描述的进行。参见例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版(冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港，1989年)。
70.抗-ror1和抗cd3单特异性抗体
id no:4)；
[0080]-cdr-h3包含序列iyydfyyaldy(seq id no:3)；
[0081]-cdr-l1包含序列kasqdinkyit(seq id no:5)；
[0082]-cdr-l2包含序列ytstlqp(seq id no:6)；
[0083]-cdr-l3包含序列lqydsllwt(seq id no:7),
[0084]
其中，所述cdr根据kabat编号进行定义。
[0085]
在一些实施方案中，抗ror1抗体或其抗原结合片段在根据kabat编号的位置h31-h35、h50-h65和h95-h102包含选自由以下组成的组的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3氨基酸序列：(i)seq id no:1、2、3；或(ii)seq id no：1、4、3。
[0086]
在一个实施方案中，抗ror1抗体或其抗原结合片段在根据kabat编号的位置l24-34、l50-56和l89-97分别包含seq id no：5、6和7的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的氨基酸序列。
[0087]
在一些实施方案中，根据kabat编号，抗ror1抗体或其抗原结合片段在vh结构域中包含g55a和g61a突变。在一些实施方案中，所述突变降低抗ror1抗体或其抗原结合片段中天冬酰胺脱酰胺的倾向。在一些实施方案中，相对于没有所述突变的亲本抗体，具有突变的抗ror1抗体或其抗原结合片段具有增加的稳定性。
[0088]
在一些实施方案中，抗ror1抗体或其抗原结合片段在seq id no：1-3和5-7的cdr序列中包含至少一个、两个、三个、四个但不超过五个残基修饰。在一些实施方案中，抗ror1抗体或其抗原结合片段在seq id no：1、4、3和5-7的cdr序列中包含至少一个、两个、三个、四个但不超过五个残基修饰。所述氨基酸修饰可以是氨基酸置换、缺失和/或添加，例如保守置换。
[0089]
在一个实施方案中，根据本公开的抗ror1抗体或其抗原结合片段包含重链可变域vh和轻链可变域vl的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中所述vh和vl选自由以下vh/vl序列对组成的组：seq id no：8/9、17/9、10/13、10/14、10/15、10/16、11/13、11/14、11/15、11/16、12/13、12/14、12/15、12/16和21/13。cdr可由本领域技术人员使用最广泛的cdr定义方案确定，例如kabat、chothia或imgt定义。
[0090]
在一个实施方案中，根据本公开的抗ror1抗体或其抗原结合片段包含重链可变域vh和轻链可变域vl，其中：
[0091]-vh结构域包含序列seq id no:8或17,或与其具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高同一性的序列,和/或
[0092]-vl结构域包含序列seq id no:9,或与其具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高同一性的序列。
[0093]
在另一个实施方案中，根据本公开的抗ror1抗体或其抗原结合片段包含重链可变域vh和轻链可变域vl，其中：
[0094]-vh结构域包含选自seq id no:10-12和21的序列,或与其具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高同一性的序列,和/或
[0095]-vl结构域包含选自seq id no:13-16的序列,或与其具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高同一性的序列。
[0096]
在一些实施方案中，抗ror1抗体包含具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列，所述vh序列相对于参考序列含有置换
(例如，保守置换)、插入或缺失，同时保留以相同或改进的结合特性(例如解离速率和/或内化率)结合ror1的能力。在一些实施方案中，在seq id no:8、17或seq id no:10-12或21中总共1至10个氨基酸已经被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr之外的区域(即，在fr中)。任选地，抗ror1抗体包含seq id no：8、17或seq id no：10-12或21的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，所述vh包含一个、两个或三个选自以下的cdr：(a)包含seq id no:1的氨基酸序列的cdr-h1，(b)包含seq id no:id no：2或4的氨基酸序列的cdr-h2，和(c)包含seq id no：3的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，vh序列是人源化vh序列。
[0097]
在一些实施方案中，抗ror1抗体包含具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列，所述vl序列相对于参考序列含有置换(例如，保守置换)、插入或缺失，同时保留以相同或改进的结合特性(例如解离速率和/或内化率)结合ror1的能力。在一些实施方案中，在seq id no:13中总共1至10个氨基酸已经被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr之外的区域(即，在fr中)。任选地，抗ror1抗体包含seq id no：13的vl序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，所述vl序列包含一个、两个或三个选自以下的cdr：(a)包含seq id no:5的氨基酸序列的cdr-l1，(b)包含seq id no:id no：6的氨基酸序列的cdr-l2，和(c)包含seq id no：7的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，vl序列是人源化vl序列。
[0098]
在一个实施方案中，根据本公开的抗ror1抗体或其抗原结合片段包含:包含seq id no:21或由其组成的重链可变域vh,和包含seq id no:13或由其组成的轻链可变域vl。
[0099]
在一个实施方案中，根据本公开的分离的抗ror1抗体或抗原结合片段是嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，抗ror1抗体或抗原结合片段是人源化抗体。
[0100]
在一些实施方案中，根据本公开的人源化分离的抗ror1抗体或抗原结合片段在框架区中的位置包含一个或多个回复突变以改善结合特性。在一些实施方案中，根据本公开的人源化抗ror1抗体或抗原结合片段的vh结构域包含从人残基到以下残基的回复突变：根据kabat编号，位置1的glu(1e)、位置27的tyr(27y)、位置94的his(94h)，以及可选地位置38的lys(38k)、位置48的ile(48i)、位置66的lys(66k)和位置67的ala(67a)中的一个或多个。在一个实施方案中，根据本公开的人源化抗ror1抗体或抗原结合片段的vl结构域包含从人残基到以下残基的回复突变：根据kabat编号，位置71的tyr(71y)，以及可选地位置4的leu(4l)、位置69的arg(69r)、位置49的his(49h)、和位置58的ile(58i)中的一个或多个。
[0101]
在一个实施方案中，根据本公开的分离的抗ror1抗体或抗原结合片段是人源化抗体，其包含vh结构域中的回复突变的氨基酸残基，所述残基选自：根据kabat编号，(i)1e,27y,和94h,(ii)1e,27y,48i,67a,和94h,(iii)1e,27y,38k,48i,67a,66k,和94h；和/或vl结构域中的回复突变的氨基酸残基，所述残基选自：根据kabat编号，(i)71y；(ii)49h,69r,和71y,(iii)4l,69r,和71y,和(iv)4l,49h,58i,69r,和71y。
[0102]
在一个实施方案中，根据本公开的分离的抗ror1抗体或抗原结合片段是人源化抗体，其包含根据kabat编号在vh结构域中的氨基酸残基1e、27y和94h、以及在vl结构域中的氨基酸残基71y。在另一个实施方案中，根据本公开的分离的抗ror1抗体或抗原结合片段进一步包含根据kabat编号在vh结构域中的g55a和g61a突变。
[0103]
在一些实施方案中，根据本公开的分离的抗-ror1抗体或抗原结合片段包含选自
由以下组成的组的vh和vl序列组合：
[0104][0105][0106]
在一些实施方案中，抗体包含：包含seq id no:21的序列或由其组成的vh结构域，和包含seq id no:13的序列或由其组成的vl结构域。
[0107]
在根据本公开的抗ror1抗体或抗原结合片段的一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含fc区，其可以是天然或变体fc区。在特定实施方案中，fc区是来自iggl、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd的人fc区。根据抗体的用途，可能期望使用变体fc区来改变(例如，减少或消除)至少一种效应子功能，例如adcc和/或cdc。在一些实施方案中，本公开提供包含fc区的抗ror1抗体或抗原结合片段，其中所述fc区具有改变至少一种效应子功能的一个或多个突变，例如l234a和l235a。
[0108]
在一些实施方案中，根据本公开的抗ror1抗体的抗原结合片段可以是，例如，fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；双链抗体；线性抗体；或单链抗体分子(例如scfv)。
[0109]
在一个实施方案中，根据本公开的抗ror1抗体或其抗原结合片段结合ror1胞外域
或其部分。在一些实施方案中，所述ror1胞外域包含uniprot identifier q01973-1下的人ror1蛋白的氨基酸序列q30-y406，或seq id no:41的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
[0110]
在一个实施方案中，本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段在ror1的ig样结构域的c端结合ror1。在一个实施方案中，所述抗体与具有seq id no：8和9的vh/vl序列对的抗体(例如ror1-mab004)结合ror1上的相同表位。在一个实施方案中，所述抗体与具有seq id no：42和43的vh/vl序列对的抗体(例如wo2012097313的d10抗体)竞争结合ror1。
[0111]
在一个实施方案中，如通过生物膜层干涉法或表面等离子体共振测量的，本文描述的抗ror1抗体或其抗原结合片段对人ror1具有至少1
×
104m-1
s-1
,至少3
×
104m-1
s-1
,至少5
×
104m-1
s-1
,至少7
×
104m-1
s-1
,至少9
×
104m-1
s-1
,至少1
×
105m-1
s-1
的结合速率常数(k
on
)。
[0112]
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振或生物膜层干涉法测量的，本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段对人ror1具有小于5
×
10-3
s-1
,小于3
×
10-3
s-1
,小于2
×
10-3
s-1
,小于1
×
10-3
s-1
的解离速率常数(k
off
)。在再一实施方案中，本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，并且对人ror1的k
off
值为采用相同抗体形式的具有seq id no：8和9的vh/vl序列对的抗体对人ror1的k
off
值的约1-100％，例如约3-50％。解离速率可用于表征抗体与其抗原的结合持续时间。通常，长的解离速率与形成的复合物的缓慢解离相关，而短的解离速率与快速解离相关。在一个实施方案中，与针对wo2012097313中描述的d10所观察到的解离速率相比，本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段具有慢解离速率，与靶标ror1保持结合的时间更长，可利于增强效应分子到ror1表达性(“ror1
”)肿瘤细胞的募集。
[0113]
在一个实施方案中，本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段对ror1具有在纳摩尔(10-7
至10-9
)范围内的解离常数(kd)，例如小于8
×
10-7
m,小于5
×
10-7
m,小于3
×
10-7
m,小于1
×
10-7
m,小于8
×
10-8
m,小于5
×
10-8
m,小于3
×
10-8
m,小于2
×
10-8
m,小于1
×
10-8
m,小于8
×
10-9
m,小于6
×
10-9
m,小于4
×
10-9
m,小于2
×
10-9
m,或小于1
×
10-9
m。
[0114]
在一个实施方案中，本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段特异性结合在ror1

靶细胞(例如表达ror1的cho细胞系或骨髓瘤细胞系)上展示的ror1。正如在基于细胞的测定中通过流式细胞术测量的，所述抗ror1抗体对ror1

细胞的结合效力强于wo2012097313中描述的d10。在一些实施方案中，细胞结合效力由在抗体饱和浓度或约100nm抗体浓度下检测到的mfi反映。在一些实施方案中，与以下抗体相比，本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段对靶细胞上呈现的ror1展示出更高的结合效力:具有seq id no:44和45的vh/vl序列对的抗体(例如wo 2014167022的抗体r12)，或与r12结合ror1的ig和fz结构域连接处的相同表位的抗体。在一个实施方案中，抗体对ror1表达细胞的结合效力在基于细胞的测定试验中测量，如实施例1.3中所述。
[0115]
在一些实施方案中，如预期，对ror1具有纳摩尔范围的相对低亲和力但具有强的细胞表面结合效力的本公开抗ror1抗体，可利于分布到肿瘤中，和/或导致对表达更高密度靶标的肿瘤细胞的更具选择性的靶向。
[0116]
在一个实施方案中，本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段在与ror1表达细胞的细胞表面结合时表现出极少的内化。在一个实施方案中，如在基于细胞的测定试验中测量，内化率不超过20％、15％、14％、13％、12％、11％或10％，或者抗体不发生内化。内化率
ig或mat-fab中的每个可变域(vh或vl)分别可以从结合靶抗原之一(即,ror1或cd3)的一种或多种“亲本”单克隆抗体获得。fit-ig或mat-fab结合蛋白可以使用本文公开的抗ror1和抗cd3单克隆抗体的可变域序列产生。例如，亲本抗体是人源化抗体。
[0135]
本公开的一个方面涉及选择亲本抗体，所述亲本抗体具有在fit-ig或mat-fab分子中所需的至少一种或多种性质。在一个实施方案中，所述抗体性质选自：抗原特异性、对抗原的亲和力、解离速率、细胞结合效力、内化率、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解性、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。
[0136]
在一些实施方案中，根据本公开的双特异性fit-ig和mat-fab蛋白被配置为没有任何结构域间肽接头。尽管在具有串联结合位点的多价工程化免疫球蛋白形式中，本领域通常认为相邻结合位点会相互干扰，除非使用灵活的接头将这些结合位点在空间上分隔开来。然而，已经发现对于本公开的ror1/cd3 fit-ig和mat-fab，根据本文公开的链结构式排布所述的免疫球蛋白结构域，将导致多肽链在转染的哺乳动物细胞中良好表达，恰当地组装，并作为结合靶抗原ror1和cd3的双特异性多价免疫球蛋白样结合蛋白分泌。参见下文实施例。再者，从结合蛋白中省略合成接头序列可以避免产生哺乳动物免疫系统可识别的抗原性位点，由此接头的消除将降低fit-ig和mat-fab的可能免疫原性，导致类似于天然抗体的循环半衰期，即fit-ig和mat-fab不会由于免疫调理和肝脏捕获而被快速清除。
[0137]
在一些实施方案中，根据本公开的rorl x cd3双特异性结合蛋白包含：
[0138]
a)特异性结合rorl的第一抗原结合位点；和
[0139]
b)特异性结合cd3的第二个抗原结合位点。
[0140]
在一个实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含源自根据本技术和本文所述的任何抗ror1抗体或其抗原结合片段的一组6个cdr，cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，来形成双特异性结合蛋白的ror1结合位点。在再一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含源自根据本技术和本文所述的任何抗ror1抗体或其抗原结合片段的vh/vl对，来形成双特异性结合蛋白的ror1结合位点。
[0141]
在一个实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白还包含源自根据本技术和本文所述的任何抗cd3抗体或其抗原结合片段的一组6个cdr，cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，来形成双特异性结合蛋白的cd3结合位点。在再一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含源自根据本技术和本文所述的任何抗cd3抗体或其抗原结合片段的vh/vl对，来形成双特异性结合蛋白的cd3结合位点。
[0142]
在一个实施方案中，在根据本公开的双特异性ror1/cd3结合蛋白中ror1结合位点和cd3结合位点是人源化的，分别包含人源化的vh/vl序列。
[0143]
双特异性fit-ig结合蛋白
[0144]
在一个实施方案中，根据本公开的ror1xcd3双特异性结合蛋白是能够结合ror1和cd3的双特异性fit-ig结合蛋白。串联fab免疫球蛋白(fit-ig)结合蛋白是一种单体、双特异性、四价结合蛋白，包含六个多肽链，具有四个功能性fab结合区，其中两个外部fab结合区和两个内部fab结合区。如图10a所示，所述结合蛋白采用(外部fab-内部fab-fc)x2形式，结合抗原a和抗原b。一方面，本公开的ror1xcd3双特异性结合蛋白是双特异性fit-ig结合蛋白，其中fit-ig蛋白的两个fab结构域形成特异性结合ror1的第一抗原结合位点；fit-ig蛋白的另外两个fab结构域形成特异性结合cd3的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，
根据本公开的fit-ig结合蛋白在免疫球蛋白结构域之间不使用接头。
[0145]
在再一实施方案中，本公开提供了一种双特异性串联fab免疫球蛋白(fit-ig)结合蛋白，其包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，其中
[0146]
(i)在lh形式中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl-vh
b-ch1-fc，其中cl与vhb直接融合；第二多肽链从氨基端到羧基端包含vh
a-ch1；第三多肽链从氨基端到羧基端包含vl
b-cl；或者
[0147]
(ii)在hl形式中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vh
a-ch1-vl
b-cl-fc，其中ch1直接与vlb融合；第二多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl；第三多肽链从氨基端到羧基端包含vh
b-ch1；
[0148]
其中vl是轻链可变域，cl是轻链恒定域，vh是重链可变域，ch1是重链恒定域，fc是免疫球蛋白fc区，例如igg1的fc(例如，fc从氨基端到羧基端包含铰链-ch2-ch3)，
[0149]
其中vl
a-cl与vh
a-ch1配对以形成特异性结合第一抗原a的第一fab，并且vl
b-cl与vh
b-ch1配对以形成特异性结合第二抗原b的第二fab，且
[0150]
其中第一抗原a是ror1并且第二抗原b是cd3，或者其中第一抗原a是cd3并且第二抗原b是ror1，且
[0151]
其中，两条第一多肽链、两条第二多肽链和两条第三多肽链缔合形成所述fit-ig结合蛋白。
[0152]
在根据本公开的双特异性fit-ig结合蛋白的一些实施方案中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl-vh
b-ch1-fc，其中抗原a是ror1并且抗原b是cd3，或抗原a为cd3并且抗原b为ror1。
[0153]
在一些实施方案中，fit-ig结合蛋白中通过vl-cl与vh-ch1配对形成的ror1结合性fab(例如，当a是ror1时，由vl
a-cl和vh
a-ch1形成；或当b是ror1，由vl
b-cl和vh
b-ch1形成)包含形成双特异性结合蛋白的ror1结合位点的一组六个cdr，即cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中该6个cdr源自根据本技术和本文所述的任何抗ror1抗体或其抗原结合片段。在再一些实施方案中，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3分别包含seq id no：1、2、3和5、6、7的序列；或seq id no：1、4、3和5、6、7的序列。
[0154]
在一些实施方案中，fit-ig结合蛋白中与ror1结合的fab包含源自根据本技术和本文所述的任何抗ror1抗体或其抗原结合片段的vh/vl对。在再一些实施方案中，所述vh/vl对包含选自由以下vh/vl序列对组成的组的序列：seq id no：8/9、17/9、10/13、10/14、10/15、10/16、11/13、11/14、11/15、11/16、12/13、12/14、12/15、12/16和21/13，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，fit-ig结合蛋白中与ror1结合的fab包含seq id no:21的vh序列和seq id no:13的vl序列。
[0155]
在一些实施方案中，fit-ig结合蛋白中通过vl-cl与vh-ch1配对形成的cd3结合性fab(例如，当a是cd3时，由vl
a-cl和vh
a-ch1形成；或当b是cd3时，由vl
b-cl和vh
b-ch1形成)包含形成双特异性结合蛋白的cd3结合位点的一组六个cdr，即cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中该六个cdr源自根据本技术和本文所述的任何抗cd3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述fit-ig结合蛋白中通过vl-cl与vh-ch1配对形成的cd3结合性fab包含一组六个cdr，其中cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3分别包含seq id no：25、26、27和28、29、30的序列。在再一些实施方案中，所述cd3结合性
fab包含vh/vl对，其中所述vh/vl对包含seq id nos：22和24的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列；或包含seq id nos：23和24的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
[0156]
在再一实施方案中，本公开提供一种双特异性串联fab免疫球蛋白(fit-ig)结合蛋白，其包含第一、第二和第三多肽链，
[0157]
其中
[0158]
(i)在lh形式中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl-vh
b-ch1-fc，其中cl与vhb直接融合；第二多肽链从氨基端到羧基端包含vh
a-ch1；第三多肽链从氨基端到羧基端包含vl
b-cl；或者
[0159]
(ii)在hl形式中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vh
a-ch1-vl
b-cl-fc，其中ch1直接与vlb融合；第二多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl；第三多肽链从氨基端到羧基端包含vh
b-ch1；
[0160]
其中vl是轻链可变域，cl是轻链恒定域，vh是重链可变域，ch1是重链恒定域，fc是免疫球蛋白fc区，a是ror1的表位，b是cd3的表位，或a 是cd3的表位，b是ror1的表位。根据本公开，所述fit-ig结合蛋白结合ror1和cd3。
[0161]
在一些实施方案中，所述fit-ig结合蛋白的fab片段并入来自与抗原ror1和cd3之一结合的亲本抗体的vl
a-cl和vh
a-ch1结构域，并且并入来自与抗原ror1和cd3之另一结合的亲本抗体的vl
b-cl和vh
b-ch1结构域。在一些实施方案中，vh-ch1::vl-cl配对形成识别ror1和cd3两者的串联fab部分。
[0162]
根据本公开，ror1/cd3 fit-ig结合蛋白包含第一、第二和第三多肽链，其中第一多肽链从氨基端到羧基端包含vl
ror1-cl-vh
cd3-ch1-铰链-ch2-ch3，其中cl与vh
cd3
直接融合，其中第二多肽链从氨基端到羧基端包含vh
ror1-ch1；并且其中第三多肽链从氨基端到羧基端包含vl
cd3-cl。在备选实施方案中，ror1/cd3 fit-ig结合蛋白包含第一、第二和第三多肽链，其中第一多肽链从氨基端到羧基端包含vh
ror1-ch1-vl
cd3-cl-铰链-ch2-ch3，其中ch1与vl
cd3
直接融合，其中第二多肽链从氨基端到羧基端包含vl
ror1-cl；并且其中第三多肽链从氨基端到羧基端包含vh
cd3-ch1。在一些实施方案中，vl
ror1
是抗ror1抗体的轻链可变域，cl是轻链恒定域，vh
ror1
是抗ror1抗体的重链可变域，ch1是重链恒定域，vl
cd3
是抗cd3抗体的轻链可变域，vh
cd3
为抗cd3抗体的重链可变域；任选地，结构域vl
cd3-cl与抗cd3亲本抗体的轻链相同，结构域vh
cd3-ch1与抗cd3亲本抗体的重链可变域和重链恒定域相同，结构域vl
ror1-cl与抗ror1亲本抗体的轻链相同，结构域vh
ror1-ch1与抗ror1亲本抗体的重链可变域和重链恒定域相同。
[0163]
在有关fit-ig结合蛋白的上述式子中，fc区可以是天然或变体fc区。在特定实施方案中，fc区是来自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd的人fc区。在特定实施方案中，fc是来自igg1的人fc，或是包含一个或多个突变以降低或消除至少一种fc效应子功能(例如，fc与fcγr的结合、adcc和/或cdc)的修饰的人fc。所述突变可以是例如l234a/l235a(根据kabat eu索引编号)。在一个实施方案中，fc区是具有突变l234a和l235a的人igg1的fc区，例如在下文表8中列出的(seq id no:31的aa104至aa 227)。在一个实施方案中，fc区包含seq id no:31的aa104至aa 227的序列，或与其具有至少90％、95％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。
[0164]
在根据本公开的fit-ig结合蛋白的一些实施方案中，ch1、cl和fc结构域是人序列的或来自人序列。在根据本公开的fit-ig结合蛋白的一些实施方案中，ch1是人igg1恒定ch1结构域，例如，具有seq id no:33的序列、或具有与其至少90％、95％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。在有关fit-ig结合蛋白的上述式子中，cl为人恒定κcl结构域，例如具有seq id no:32的序列、或具有与其至少90％、95％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。
[0165]
在一个实施方案中，本公开的fit-ig结合蛋白保留亲本抗体的一种或多种特性。在一些实施方案中，fit-ig保留与亲本抗体相当的靶抗原(即cd3和ror1)结合亲和力，这意味着fit-ig结合蛋白对ror1和cd3抗原靶标的结合亲和力，通过表面等离子共振或生物膜层干涉法测量，与亲本抗体对其相应靶抗原的结合亲和力相比，变化不超过10倍。
[0166]
在一个实施方案中，本公开的fit-ig结合蛋白结合ror1和cd3，并且由第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链组成，其中：
[0167]-第一多肽链包含seq id no:34或37的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，
[0168]-第二多肽链包含seq id no:35的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，以及
[0169]-第三多肽链包含seq id no:36的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
[0170]
在一个实施方案中，本公开的fit-ig结合蛋白结合ror1和cd3，并且由第一、第二和第三多肽链组成，其中第一多肽链包含、基本上由或由seq id no:34或37的序列组成；第二多肽链包含、基本上由或由seq id no:35的序列组成；第三多肽链包含、基本上由或由seq id no:36的序列组成。
[0171]
双特异性mat-fab结合蛋白
[0172]
在一个实施方案中，根据本公开的ror1xcd3双特异性结合蛋白是能够结合ror1和cd3的双特异性mat-fab结合蛋白。单价不对称串联fab(mat-fab)双特异性结合蛋白是一种单体、双特异性、二价结合蛋白，包含四个多肽链，具有两个串联的功能性fab结合区。如图10b所示，所述结合蛋白采用外部fab-内部fab-fc:fc二聚体形式，结合抗原a和抗原b。在一些实施方案中，根据本公开的ror1 x cd3双特异性结合蛋白是双特异性mat-fab结合蛋白，其中mat-fab蛋白的一个fab结构域形成特异性结合ror1的第一抗原结合位点；mat-fab蛋白的另一fab结构域形成特异性结合cd3的第二抗原结合位点。
[0173]
在再一实施方案中，本公开提供一种双特异性单价不对称串联fab(mat-fab)结合蛋白，其包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中：
[0174]
(i)在lh形式中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl-vh
b-ch1-fc，其中cl与vhb直接融合；第二多肽链从氨基端到羧基端包含vh
a-ch1；第三多肽链从氨基端到羧基端包含vl
b-cl；第四多肽链包含fc；或
[0175]
(ii)在hl形式中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vh
a-ch1-vl
b-cl-fc，其中ch1直接与vlb融合；第二多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl；第三多肽链从氨基端到羧基端包含vh
b-ch1；第四多肽链包含fc；
[0176]
其中vl是轻链可变域，cl是轻链恒定域，vh是重链可变域，ch1是重链恒定域，fc是
免疫球蛋白fc区，例如igg1的fc(例如，fc从氨基端到羧基端包含铰链-ch2-ch3)，
[0177]
其中vl
a-cl与vh
a-ch1配对以形成特异性结合第一抗原a的第一fab，并且vl
b-cl与vh
b-ch1配对以形成特异性结合第二抗原b的第二fab，且
[0178]
其中第一抗原a是ror1，第二抗原b是cd3，或其中第一抗原a是cd3，第二抗原b是ror1，
[0179]
其中第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链缔合形成mat-fab结合蛋白。
[0180]
在根据本公开的mat-fab结合蛋白的一些实施方案中，fc是免疫球蛋白fc区，从氨基端到羧基端包含铰链-ch2-ch3，其中铰链-ch2是免疫球蛋白重链的铰链-ch2区，其中铰链-ch2与ch3直接融合，且其中第一多肽链的fc区包含第一ch3结构域(ch3m1结构域)，第四多肽链的fc区包含第二ch3结构域(ch3m2结构域)。在进一步的实施方案中，第一和第四多肽链的fc区，尤其是在其ch3结构域中，包含异二聚化修饰，所述修饰有利于两个fc区发生异二聚化而非同二聚化。在一些实施方案中，使用“孔内旋钮”异二聚化技术来促进链的异二聚化。任选地，mat-fab结合蛋白还包含在第一ch3结构域(ch3m1结构域)和第二ch3结构域(ch3m2结构域)中的突变，所述突变引入半胱氨酸残基，在两个ch3结构域配对时促进二硫键形成。
[0181]
在一些实施方案中，将一个或多个孔内旋钮(kih)突变引入第一链的第一ch3结构域(ch3m1结构域)和第四链的第二ch3结构域(ch3m2结构域)。在进一步的实施方案中，当第一链的第一ch3结构域(ch3m1结构域)突变形成结构旋钮时，则第四链的第二ch3结构域(ch3m2结构域)突变形成互补结构孔，从而促进第一ch3结构域与第二ch3结构域配对；或者当第一链的第一ch3结构域(ch3m1结构域)突变形成结构孔时，则第四链的第二ch3结构域(ch3m2结构域)突变形成互补结构旋钮，从而促进第一ch3结构域与第二ch3结构域配对。在一些实施方案中，“旋钮”突变是t366w置换，而互补的“孔”突变是t366s、l368a和y407v置换。
[0182]
在一些实施方案中，根据本公开的双特异性结合蛋白是在第一ch3结构域中具有典型的旋钮(t366w)置换和在第二ch3结构域中具有相应的孔置换(t366s、l368a和y407v)的mat-fab蛋白，并且任选地具有两个额外引入的半胱氨酸残基s354c/y349c(分别包含在相应的ch3序列中)。例如，第一ch3结构域(ch3m1结构域)可包含旋钮置换t366w和引入的半胱氨酸残基s354c，第二ch3结构域(ch3m2结构域)包含孔置换t366s、l368a和y407v以及引入的半胱氨酸残基y349c。
[0183]
孔内旋钮二聚化模块及其在抗体工程中的应用是本领域众所周知的并且描述于例如ridgway等人，1996，protein engineering 9(7)617-621。在ch3结构域中引入额外的二硫桥报道在例如merchant,a.m.等人，nat.biotechnol.16(1998)677-681中。
[0184]
在根据本公开的双特异性mat-fab结合蛋白的一些实施方案中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl-vh
b-ch1-fc，其中抗原a是ror1，抗原b是cd3，或抗原a为cd3，抗原b为ror1。
[0185]
在一些实施方案中，mat-fab结合蛋白中通过vl-cl与vh-ch1配对形成的ror1结合性fab(例如，当a是ror1时，由vl
a-cl和vh
a-ch1形成)包含形成双特异性结合蛋白的ror1结合位点的一组六个cdr，即cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中该6个cdr
源自根据本技术和本文所述的任何抗ror1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3分别包含seq id no：1、2、3和5、6、7的序列；或分别包含seq id no：1、4、3和5、6、7的序列。在一些实施方案中，mat-fab结合蛋白中与ror1结合的fab包含源自根据本技术和本文所述的任何抗ror1抗体或其抗原结合片段的vh/vl对。在一些实施方案中，所述vh/vl对包含选自由以下vh/vl序列对组成的组的序列：seq id no：8/9、17/9、10/13、10/14、10/15、10/16、11/13、11/14、11/15、11/16、12/13、12/14、12/15、12/16和21/13，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，mat-fab结合蛋白中与ror1结合的fab包含seq id no:21的vh序列和seq id no:13的vl序列。
[0186]
在一些实施方案中，mat-fab结合蛋白中通过vl-cl与vh-ch1配对形成的cd3结合性fab(例如，当b是cd3时，由vl
b-cl和vh
b-ch1形成)包含形成双特异性结合蛋白的cd3结合位点的一组六个cdr，即cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中该六个cdr源自根据本技术和本文所述的任何抗cd3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述mat-fab结合蛋白中通过vl-cl与vh-ch1配对形成的cd3结合性fab包含一组六个cdr，其中cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3分别包含seq id no：25、26、27和28、29、30的序列。在再一些实施方案中，所述cd3结合性fab包含vh/vl对，其中所述vh/vl对包含seq id nos：22和24的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列；或包含seq id nos：23和24的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
[0187]
在进一步的实施方案中，本公开提供一种双特异性单价不对称串联fab(mat-fab)结合蛋白，其包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中:
[0188]
(i)在lh形式中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl-vh
b-ch1-fc，其中cl与vhb直接融合；第二多肽链从氨基端到羧基端包含vh
a-ch1；第三多肽链从氨基端到羧基端包含vl
b-cl；第四多肽链包含fc；或者
[0189]
(ii)在hl形式中，第一多肽链从氨基端到羧基端包含vh
a-ch1-vl
b-cl-fc，其中ch1直接与vlb融合；第二多肽链从氨基端到羧基端包含vl
a-cl；第三多肽链从氨基端到羧基端包含vh
b-ch1；第四多肽链包含fc；
[0190]
其中vl是轻链可变域，cl是轻链恒定域，vh是重链可变域，ch1是重链恒定域，fc是免疫球蛋白fc区，从氨基端到羧基端包含铰链-ch2-ch3，a是ror1的表位，b是cd3的表位，或者a是cd3的表位，b是ror1的表位。根据本公开，所述mat-fab结合蛋白结合ror1和cd3。
[0191]
在一些实施方案中，mat-fab结合蛋白的fab片段并入来自与抗原ror1和cd3之一结合的亲本抗体(例如，本文描述的抗ror1抗体或抗cd3抗体)的vl
a-cl和vh
a-ch1结构域，并且并入来自与抗原ror1和cd3之另一结合的不同亲本抗体(例如，本文描述的抗cd3抗体或抗ror1抗体)的vl
b-cl和vh
b-ch1结构域。在一些实施方案中，vh-ch1::vl-cl配对形成识别ror1和cd3两者的串联fab部分。
[0192]
根据本公开，ror1/cd3 mat-fab结合蛋白包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中第一多肽链从氨基端到羧基端包含vl
ror1-cl-vh
cd3-ch1-铰链-ch2-ch3m1，其中cl与vh
cd3
直接融合；其中第二多肽链从氨基端到羧基端包含vh
ror1-ch1；其中第三多肽链从氨基端到羧基端包含vl
cd3-cl；并且其中第四多肽链是包含铰链-ch2-ch3m2的fc多肽链。在备选实施
方案中，ror1/cd3 mat-fab结合蛋白包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中第一多肽链从氨基端到羧基端包含vh
ror1-ch1-vl
cd3-cl-铰链-ch2-ch3m1，其中ch1直接与vl
cd3
融合；其中第二多肽链从氨基端到羧基端包含vl
ror1-cl；其中第三多肽链从氨基端到羧基端包含vh
cd3-ch1；并且其中第四多肽链是包含铰链-ch2-ch3m2的fc多肽链。在一些实施方案中，vl
ror1
是抗ror1抗体的轻链可变域，cl是轻链恒定域，vh
ror1
是抗ror1抗体的重链可变域，ch1是重链恒定域，vl
cd3
是抗cd3抗体的轻链可变域，vh
cd3
是抗cd3抗体的重链可变域，并且一个或多个“孔内旋钮”突变被引入到ch3m1和ch3m2结构域中以促进抗体的ch3m1与ch3m2结构域异二聚化；并且，结构域vl
cd3-cl与抗cd3亲本抗体的轻链相同，结构域vh
cd3-ch1与抗cd3亲本抗体的重链可变域和重链恒定域相同，结构域vl
ror1-cl与抗ror1亲本抗体的轻链相同，结构域vh
ror1-ch1与抗ror1亲本抗体的重链可变域和重链恒定域相同。
[0193]
在有关mat-fab结合蛋白的第一多肽链的上述式子中，fc区可以是天然或变体fc区。在特定实施方案中，fc区是来自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd的人fc区。在特定实施方案中，fc是来自igg的人fc或其变体。在一些实施方案中，fc区是包含突变以降低或消除至少一种fc效应子功能(例如，fc与fcγr的结合、adcc和/或cdc)的变体fc区。所述突变可以是例如l234a/l235a(根据kabat eu索引编号)。在一个实施方案中，fc区是具有突变l234a和l235a的人igg1的fc区。
[0194]
在根据本公开的mat-fab结合蛋白的一些实施方案中，ch1、cl和fc结构域是人序列的或来自人序列。在根据本公开的mat-fab结合蛋白的一些实施方案中，ch1是重链恒定结构域，例如，人igg1恒定ch1结构域，例如具有seq id no:33的序列，或具有与之至少90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。在有关mat-fab结合蛋白的上述式子中，cl是轻链恒定域，例如人恒定κcl结构域，例如具有seq id no:32的序列，或具有与之至少90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
[0195]
在一些实施方案中，根据本公开的mat-fab结合蛋白在免疫球蛋白结构域之间不使用接头。
[0196]
在一个实施方案中，本公开的mat-fab结合蛋白保留亲本抗体的一种或多种特性。在一些实施方案中，mat-fab保留与亲本抗体相当的靶抗原(即cd3和ror1)结合亲和力，这意味着mat-fab结合蛋白对ror1和cd3抗原靶标的结合亲和力，通过表面等离子共振或生物膜层干涉法测量，与亲本抗体对其相应靶抗原的结合亲和力相比，变化不超过10倍。
[0197]
在一个实施方案中，本公开的mat-fab结合蛋白结合ror1和cd3并且由第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽组成，其中：
[0198]-第一多肽链包含seq id no:38或40的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，
[0199]-第二多肽链包含seq id no:35的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，
[0200]-第三多肽链包含seq id no:36的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列；和
[0201]-第四多肽链包含seq id no:39的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
[0202]
在一个实施方案中，本公开的mat-fab结合蛋白结合ror1和cd3并且由第一、第二、
第三和第四多肽链组成，其中所述第一多肽链包含、基本上由或由seqid no:38或40的序列组成；第二多肽链包含、基本上由或由seq id no:35的序列组成；第三多肽链包含、基本上由或由seq id no:36的序列组成；第四多肽链包含氨基酸序列seq id no：39。
[0203]
双特异性结合蛋白的特性
[0204]
在一个实施方案中，如本文所述的能够结合cd3和ror1的双特异性ror1/cd3 fit-ig或mat-fab结合蛋白包含人源化的ror结合位点或嵌合的ror1结合位点，例如人源化ror结合位点。在一个实施方案中，在fit-ig或mat-fab蛋白形式中的该人源化ror1结合位点，相对于在相同fit-ig或mat-fab形式中由seq id no:8和9的vh和vl对组成的嵌合ror1结合位点，具有更慢的ror1结合解离速率。在另一个实施方案中，通过表面等离子体共振或生物膜层干涉法测量，相对于该嵌合ror1结合位点，所述人源化ror1结合位点的解离速率小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、或5％。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振或生物膜层干涉法测量，本文所述的fit-ig结合蛋白对ror1的解离速率小于2
×
10-3
s-1
,1
×
10-3
s-1
,8
×
10-4
s-1
,6
×
10-4
s-1
,5
×
10-4
s-1
,4
×
10-4
s-1
,3
×
10-4
s-1
,2
×
10-4
s-1
,1
×
10-4
s-1
,8
×
10-5
s-1
,6
×
10-5
s-1
。在一个实施方案中，本文所述的fit-ig结合蛋白抗体或其抗原结合片段对ror1具有10-8
至10-10
范围的解离常数(kd)，例如，小于8
×
10-8
m,少于5
×
10-8
m,少于3
×
10-8
m,少于2
×
10-8
m,少于1
×
10-8
m,少于8
×
10-9
m,少于6
×
10-9
m,少于4
×
10-9
m,少于2
×
10-9
m,或少于1
×
10-9
m,少于8
×
10-10
m,少于6
×
10-10
m,少于4
×
10-10
m,少于2
×
10-10
m,或少于1
×
10-10
m。在一个实施方案中，就ror1结合而言，本文所述的fit-ig结合蛋白抗体或其抗原结合片段具有1
×
10-3
s-1
至1
×
10-4
s-1
，例如小于2
×
10-4
s-1
的解离速率,以及1x10-9
s-1
至1x10-10
s-1
,例如小于6x10-10
s-1
的kd。
[0205]
在一个实施方案中，如本文所述的能够结合cd3和ror1的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白可以在转染的哺乳动物宿主细胞例如cho细胞或hek293细胞的培养物中以每升细胞培养物大于10mg ror1/cd3结合蛋白(》10mg/l)的水平表达。在一个实施方案中，结合蛋白的表达水平大于15mg/l，例如15mg/l至100mg/l，或更多。在另一个实施方案中，结合蛋白的表达水平大于20mg/l。
[0206]
在一个实施方案中，如本文所述的能够结合cd3和ror1的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白，在使用蛋白a亲和层析从细胞培养基中一步纯化后，具有sec-hplc检测不低于90％的纯度。在一个实施方案中，一步纯化的结合蛋白具有sec-hplc检测不低于91％、92％、93％、95％、97％、99％的纯度。
[0207]
在一个实施方案中，如本文所述的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白在与ror1表达细胞的细胞表面结合时表现出极少的内化。在一个实施方案中，基于细胞的测定试验，内化率不超过20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％，或所述结合蛋白不发生内化。
[0208]
在一个实施方案中，如本文所述的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白能够结合表达cd3的细胞和表达ror1的细胞。在一个实施方案中，表达cd3的细胞是人tcr/cd3复合物转染的cho细胞系或人t细胞。在一个实施方案中，表达ror1的细胞是表达ror1的肿瘤细胞，例如人非小细胞肺癌细胞、人乳腺癌细胞、肺癌细胞或骨髓瘤细胞。
[0209]
在一个实施方案中，如在基于细胞的测定试验中通过流式细胞术测量的，双特异性fit-ig结合蛋白对表达ror1的细胞的结合效力等同于或可比于相应的亲本抗ror1单克
隆igg抗体，所述亲本抗体与双特异性fit-ig蛋白包含相同vh/vl序列对用于ror1结合。在一个实施方案中，例如在实施例4中描述的测定试验中，如通过流式细胞术测量的，双特异性fit-ig结合蛋白对表达cd3的细胞的结合效力等于或相对低于(但不超过10倍差异，例如，减少不超过2倍，1倍，或50％)相应的亲本抗cd3单克隆igg抗体，所述亲本抗体与双特异性蛋白包含相同vh/vl序列对用于cd3结合。
[0210]
在一个实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白能够调节ror1、cd3或两者的生物学功能。在一个实施方案中，本公开的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白能够依赖于ror1而激活cd3信号传导。在一个实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白表现出ror1依赖性的t细胞激活。在一个实施方案中，本公开的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白表现出ror1-重定向的t细胞细胞毒性。在一个实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白用于以非mhc限制的方式将t细胞的细胞毒活性重定向至表达ror1的细胞。
[0211]
在一个实施方案中，本公开的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白表现出ror1依赖性cd3活化作用。在一个实施方案中，在与表达ror1的细胞结合后，双特异性ror1/cd3抗体诱导t细胞上cd3/tcr复合物的交联和cd3信号传导的激活。在一个实施方案中，靶标ror1表达细胞与效应t细胞的比率为约1:1。在另一个实施方案中，例如以约1:1的靶细胞与效应t细胞比率测量，与相应的亲本抗cd3单克隆igg抗体相比，双特异性ror1/cd3结合蛋白在表达ror1的靶细胞存在时表现出增加的t细胞活化，并在表达ror1的靶细胞不存在时表现出少得多的非靶标重定向的cd3活化，其中所述亲本抗cd3抗体与双特异性fit-ig或mat-fab蛋白包含相同的vh/vl序列对用于cd3结合。
[0212]
在一个实施方案中，本公开的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白将t细胞细胞毒性重定向至表达ror1的肿瘤细胞。在另一个实施方案中，本公开的双特异性ror1/cd3 fit-ig结合蛋白或mat-fab结合蛋白表现出抗肿瘤活性，例如，降低肿瘤负荷、抑制肿瘤生长或阻抑赘生性细胞扩张。
[0213]
药物组合物
[0214]
本公开还提供药物组合物，其包含本公开的抗体或其抗原结合部分或双特异性多价结合蛋白(即主要活性成分)和药学上可接受载体。在一个具体实施方案中，组合物包含本公开的一种或多种抗体或结合蛋白。本公开还提供药物组合物，其包含如本文所述的抗ror1抗体和抗cd3抗体的组合、或其抗原结合片段的组合，以及药学上可接受载体。特别地，本公开提供包含至少一种能够结合ror1和cd3的fit-ig结合蛋白和药学上可接受载体的药物组合物。特别地，本公开提供包含至少一种能够结合ror1和cd3的mat-fab结合蛋白和药学上可接受载体的药物组合物。本公开的药物组合物还可包含至少一种另外的活性成分。在一些实施方案中，所述另外成分包括但不限于预防剂和/或治疗剂、检测剂，例如抗肿瘤药物、细胞毒性剂、不同特异性的抗体或其功能片段，可检测的标记或报告基因。在一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种另外的预防剂或治疗剂，即本公开的抗体或结合蛋白之外的药剂，用于治疗其中ror1活性有害的病症。在一个实施方案中，所述另外的预防剂或治疗剂已知可用于、或者已经用于、或者目前正在用于预防、治疗、管理或改善疾病或其一种或多种症状。
[0215]
包含本公开的蛋白质的药物组合物用于，但不限于，诊断、检测或监测病症；治疗、
管理或改善疾病或其一种或多种症状；和/或研究。在一些实施方案中，组合物还可包含载体、稀释剂或赋形剂。赋形剂通常是向组合物提供期望特征的、不同于主要活性成分(即，不同于本公开的抗体、其功能部分或结合蛋白)的任何化合物或化合物的组合。
[0216]
核酸、载体和宿主细胞
[0217]
在再一方面，本公开提供编码本公开的抗ror1抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列的分离的核酸；编码本公开的抗cd3抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列的分离的核酸；以及编码能够结合ror1和cd3的双特异性结合蛋白(包括串联fab免疫球蛋白(fit-ig)和mat-fab结合蛋白)的一个或多个氨基酸序列的分离的核酸。此类核酸可插入载体中以进行各种遗传分析，或用于表达、表征或改善本文所述的抗体或结合蛋白的一种或多种特性。载体可包含编码本文所述抗体或结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的一个或多个核酸分子，其中所述一个或多个核酸分子可操作地连接至允许在携带载体的特定宿主细胞中表达抗体或结合蛋白的合适转录和/或翻译序列。用于克隆或表达编码本文所述结合蛋白的氨基酸序列的核酸的载体实例，包括但不限于pcdna、ptt、ptt3、pefbos、pbv、pjv和pbj及其衍生物。
[0218]
本公开还提供宿主细胞，所述宿主细胞表达或能够表达包含编码本文所述抗体或结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的核酸的载体。可用于本公开的宿主细胞可以是原核或真核的。示例性原核宿主细胞是大肠杆菌。在本公开中用作宿主细胞的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。示例性真菌细胞是酵母细胞，包括酿酒酵母。根据本公开可用作宿主细胞的示例性动物细胞包括但不限于，哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。示例性哺乳动物细胞包括但不限于cho细胞、hek细胞和cos细胞。
[0219]
生产方法
[0220]
在另一方面，本公开提供一种生产抗ror1抗体或其功能片段的方法，包括：在足以使宿主细胞表达能够结合ror1的抗体或片段的条件下，在培养基中培养包含编码抗体或功能片段的表达载体的宿主细胞。
[0221]
在另一方面，本公开提供一种生产抗cd3抗体或其功能片段的方法，包括：在足以使宿主细胞表达能够结合cd3的抗体或片段的条件下，在培养基中培养包含编码抗体或功能片段的表达载体的宿主细胞。
[0222]
在另一方面，本公开提供一种生产能够结合ror1和cd3的双特异性多价结合蛋白，特别是结合ror1和cd3的fit-ig或mat-fab结合蛋白的方法，包括：在足以使宿主细胞表达能够结合ror1和cd3的结合蛋白的条件下，在培养基中培养包含编码fit-ig或mat-fab结合蛋白的表达载体的宿主细胞。
[0223]
抗体和结合蛋白的用途
[0224]
鉴于它们与人ror1和/或cd3结合的能力，本文所述的抗体、其功能片段和本文所述的双特异性多价结合蛋白可用于检测ror1或cd3或两者，例如在含有表达一种或两种所述靶抗原的细胞的生物样品中。本公开的抗体、功能片段和结合蛋白可用于常规免疫测定试验，例如酶联免疫吸附测定试验(elisa)、放射免疫测定试验(ria)或组织免疫组织化学。本公开提供了一种用于检测生物样品中的ror1或cd3的方法，包括将生物样品与本公开的抗体、其抗原结合部分或结合蛋白接触并检测是否发生与靶抗原的结合，由此检测生物样品中靶标的存在与否。抗体、功能片段或结合蛋白可以用可检测物质直接或间接标记以促
进结合或未结合的抗体/片段/结合蛋白的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；合适的放射性材料的例子包括3h,
14
c,
35
s,
90
y,
99
tc,
111
in,
125
i,
131
i,
177
lu,
166
ho,或
153
sm。
[0225]
在一些实施方案中，本公开的抗体、其功能片段能够在体外和体内中和人ror1活性。因此，本公开的抗体、其功能片段可用于抑制人ror1活性，例如，在含有ror1表达细胞的细胞培养物中、在人受试者中、或在具有与本公开的抗体、其功能片段或结合蛋白交叉反应的ror1的其他哺乳动物受试者中，抑制由ror1介导的细胞信号传导。
[0226]
在另一个实施方案中，本公开提供本公开的抗体或双特异性结合蛋白用于治疗受试者，其中所述受试者患有其中ror1活性有害的疾病或病症，其中向受试者施用所述抗体或结合蛋白使得受试者中由ror1介导的活性降低。如本文所用，术语“其中ror1活性有害的病症”旨在包括这样的疾病和其他病症，其中ror1与其配体(wnt-5a)在患有该病症的受试者中的相互作用或者负责所述病症的病理生理学或者是促进所述病症恶化的因素。因此，其中ror1活性有害的病症是预期通过抑制ror1活性可以减轻病症的症状和/或进展的病症。在一个实施方案中，本公开的抗ror1抗体、其功能片段用于抑制恶性细胞的生长或存活或降低肿瘤负荷的方法中。
[0227]
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白(fit-ig或mat-fab)能够在体外和体内将t细胞的细胞毒性重定向至表达ror的细胞。因此，本公开的双特异性结合蛋白可用于在人类受试者中或在其他具有与本公开抗体、其功能片段或双特异性结合蛋白交叉反应的ror1的哺乳动物受试者中，抑制表达ror1的恶性细胞的生长或扩增。
[0228]
在另一个实施方案中，本公开提供cd3/ror1双特异性(fit-ig或mat-fab)结合蛋白用于治疗受试者中的ror1表达性恶性肿瘤，其中向受试者施用所述结合蛋白。在一些实施方案中，所述恶性肿瘤是实体瘤或造血系统恶性肿瘤。
[0229]
本公开的抗体(包括其功能片段)和结合蛋白可以掺入适合施用于受试者的药物组合物中。通常，药物组合物包含本公开的抗体或结合蛋白和药学上可接受载体。如本文所用，“药学上可接受载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨糖醇)或氯化钠。药学上可接受载体可进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其提高组合物中存在的抗体或结合蛋白的保质期或有效性。本公开的药物组合物被配制成与其预期的给药途径相容。
[0230]
本公开的方法可以包括通过注射(例如，通过推注或连续输注)施用配制用于肠胃外施用的组合物。注射用制剂可以以单位剂型(例如，安瓿或多剂量容器)呈现，具有添加的防腐剂。组合物可以采用在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液等形式，并且可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，主要活性成分可以是粉末形式，以便在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)配制。
[0231]
本公开的用途可包括施用配制为贮库制剂的组合物。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射给药。例如，组合物可以用合适的聚合物或疏水材料(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物(例如，微溶盐)。
[0232]
本公开的抗体、其功能片段或结合蛋白也可以与一种或多种另外治疗剂一起施用，所述另外的治疗剂可用于治疗各种疾病。本文所述的抗体、其功能片段和结合蛋白可以单独使用或与另外的药剂例如另外的治疗剂组合使用，该另外的药剂由本领域技术人员选择用于其预期目的。例如，另外的药剂可以是本领域公认可用于治疗由本公开的抗体或结合蛋白治疗的疾病或病况的治疗剂。另外的药剂也可以是赋予治疗组合物有益属性的药剂，例如影响组合物粘度的药剂。
[0233]
治疗方法和医药用途
[0234]
在一个实施方案中，本公开提供用于在有需要的受试者中治疗其中ror1介导的信号传导活性相关或有害的病症(例如ror

实体瘤或造血系统恶性肿瘤)的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的抗-ror1抗体或其ror1结合片段，其中所述抗体或结合片段能够结合ror1并抑制表达ror1的细胞中由ror1介导的信号传导。在另一个实施方案中，本公开提供了有效量的本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段在治疗此类病症中的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗此类病症的组合物中的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本文所述的抗ror1抗体或其抗原结合片段用于治疗此类病症。
[0235]
在此描述的方法或用途的再一个实施方案中，本公开的抗ror1抗体或抗原结合片段结合ror1，并且包含：包含、基本上由或由seq id no:10或21的序列组成的vh结构域；和包含、基本上由或由seq id no:13的序列组成的vl结构域。
[0236]
在另一个实施方案中，本公开提供了用于在有需要的受试者中治疗其中ror1介导的信号传导活性相关或有害的病症(例如ror

实体瘤或造血系统恶性肿瘤)的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的能够结合cd3和ror1的双特异性fit-ig或mat-fab结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合cd3和ror1并诱导对表达ror1的肿瘤细胞的重定向的t细胞细胞毒性。在另一个实施方案中，本公开提供有效量的本文所述的双特异性fit-ig或mat-fab结合蛋白在治疗此类病症中的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本文所述的双特异性fit-ig或mat-fab结合蛋白在制备用于治疗此类病症的组合物中的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本文所述的双特异性fit-ig或mat-fab结合蛋白用于治疗此类病症。
[0237]
在此描述的方法或用途的再一实施方案中，本公开的fit-ig结合蛋白结合ror1和cd3并且由第一、第二和第三多肽链组成，其中第一多肽链包含、基本上由或由seq id no:34或37的序列组成；第二多肽链包含、基本上由或由seq id no:35的序列组成；以及第三多肽链包含、基本上由或由seq id no:36的序列组成。在再一个实施方案中，本公开的mat-fab结合蛋白结合ror1和cd3并且由第一、第二、第三和第四多肽链组成，其中第一多肽链包含、基本上由或由seq id no:38或40的序列组成；第二多肽链包含、基本上由或由seq id no:35的序列组成；第三多肽链包含、基本上由或由seq id no:36的序列组成；以及第四多肽链包含、基本上由或由seq id no:39的序列组成。
[0238]
在一些实施方案中，可以用根据本公开的抗体或结合蛋白治疗的病症包括在恶性细胞的细胞表面表达ror1的各种造血系统恶性肿瘤和实体恶性肿瘤。在另一个实施方案中，抗体或结合蛋白抑制恶性细胞的生长或存活。在另一个实施方案中，抗体或结合蛋白降低肿瘤负荷。在另一个实施方案中，癌症是乳腺癌如三阴性乳腺癌，或白血病如慢性淋巴细胞白血病(cll)。
[0239]
本文所述的治疗方法可进一步包括：向有需要的受试者施用适宜与本公开的抗体或结合蛋白组合以用于预期治疗目的的另外活性成分，例如具有抗肿瘤活性的另一种药物。在本公开的治疗方法中，可以将所述另外活性成分掺入包含本公开的抗体或结合蛋白的组合物中，并将该组合物施用于需要治疗的受试者。在另一个实施方案中，本公开的治疗方法可以包括向需要治疗的受试者施用本文所述的抗体或结合蛋白的步骤、以及在向受试者施用本公开的抗体或结合蛋白的步骤之前、同时或之后向受试者施用该另外的活性成分的分开步骤。
[0240]
现在已经详细描述了本公开，通过参考以下实施例将更清楚地理解本公开，包括这些实施例仅出于举例说明的目的而非旨在限制本公开。
实施例
[0241]
为了获得具有改进特性的ror1靶向单克隆抗体，使用常规杂交瘤技术生成抗ror1抗体。然后选择并表征抗体ror1-mab004，其在ror1的ig样结构域的c端与ror1结合。ror1-mab004序列通过常规cdr移植方法进一步人源化。设计了人源化序列。这些序列中的一些被表达为重组fit-ig并表征了它们的结合亲和力。
[0242]
构建了fit-ig蛋白fit1007-12b-17，并生成了其mat-fab对应物mat1007-12b-17及其低cd3亲和力比较物fit1007-12b-18。一般来说，当具有相同的ig可变序列时，fit-ig形式表现出比mat-fab更好的体外肿瘤细胞杀伤功效和更高的细胞因子释放。cd3亲和力降低也导致重定向的t细胞细胞毒性(rtcc)功效降低。
[0243]
fit-ig和mat-fab在共培养报告基因测定试验中都显示出了ror1靶标依赖性的t细胞激活。这表明，当靶标ror1不存在时，t细胞可能不能有效激活。该现象与fit-ig与其亲本cd3单克隆抗体之间的cd3结合活性差异是相符的。
[0244]
fit-ig和mat-fab在三阴性乳腺癌异种移植模型中显示出了强有力的体内功效。
[0245]
实施例1.抗ror1抗体的产生
[0246]
通过用人ror1的q30-y406(一种重组人ror1胞外域(uniprot标识符：q01973-1)免疫balb/c或sjl小鼠，获得抗ror1抗体:
[0247]
》human_ror1_ecd
[0248]
qetelsvsaelvptsswnisselnkdsyltldepmnnittslgqtaelhckvsgnppptirwfkndapvvqeprrlsfrstiygsrlrirnldttdtgyfqcvatngkevvsstgvlfvkfgppptaspgysdeyeedgfcqpyrgiacarfignrtvymeslhmqgeienqitaaftmigtsshlsdkcsqfaipslchyafpycdetssvpkprdlcrdeceilenvlcqteyifarsnpmilmrlklpncedlpqpespeaancirigipmadpinknhkcynstgvdyrgtvsvtksgrqcqpwnsqyphthtftalrfpelngghsycrnpgnqkeapwcftldenfksdlcdipacdskdskeknkmeily(seq id no:41)
[0249]
小鼠以2周的间隔进行免疫，并在第二次注射后每周监测一次血清效价。4至6次免
疫后，收获脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞系。将融合产物以每孔1
×
105个脾细胞的密度接种于96孔板中含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(hat)的选择培养基中。融合后七至十天，观察到肉眼可见的杂交瘤集落。然后筛选和选择杂交瘤细胞的上清液以鉴定产生ror1特异性小鼠抗体的细胞系。在初步表征后，选择并测序了一种抗ror1抗体，ror1-mab004。
[0250]
实施例1.1重链和轻链可变区序列
[0251]
为了扩增重链和轻链可变区，使用trizol
tm rna提取试剂(invitrogen，目录号#15596018)从超过5
×
106个细胞中分离每个杂交瘤克隆的总rna。使用invitrogen
tm superscript
tm iii first-strand synthesis supermix试剂盒(thermofisher scientific cat.#18080)按照制造商的说明书合成cdna，使用milliporesigma
tm novagen
tm
小鼠ig引物组(fisher scientific cat.#698313)扩增编码小鼠轻和重免疫球蛋白链的可变区的cdna。pcr产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳并用sybr
tm safe dna凝胶染色剂(thermofisher cat.#s33102)进行分析。使用gel和pcr clean-up试剂盒(macherey-nagel，目录号#740609)，根据制造商的说明书，纯化大小正确的dna片段，并将其分别单独亚克隆到pmd18-t载体中。从每次转化中选择15个集落，并通过dna测序分析插入片段的序列。通过序列同源性比对，分析鼠mab可变区的蛋白质序列。
[0252]
下表列出了所选抗ror1抗体的可变域序列。基于kabat编号的互补决定区(cdr)加下划线显示。
[0253]
表1.抗ror1抗体的可变区氨基酸序列
[0254][0255]
实施例1.2抗ror1抗体的结合动力学
[0256]
抗ror1抗体的结合亲和力和动力学常数在25℃使用red96生物膜层干涉仪(pall fort
é
bio llc)按照标准程序确定。简而言之，抗小鼠igg fc捕获(amc)生物传感器用于捕获纯化的抗ror1抗体。然后将传感器浸入含有重组人ror1-ecd蛋白的溶液中，以检测与捕获的抗体结合的靶标蛋白。动力学常数通过使用fortebio分析软件处理数据并将其拟合到1:1结合模型来确定。下表2显示了ror1-mab004与两种先前描述的抗ror1单克隆抗体相比获得的结果，其中ror1-tab1是wo2014167022中描述的克隆r12，而ror1-tab2是wo2012097313中描述的克隆d10。
[0257]
表2.抗ror1单克隆抗体的结合动力学
[0258]
样品idkd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)ror1-mab0041.85e-089.25e 041.71e-03ror1-tab11.28e-095.17e 056.60e-04ror1-tab29.88e-083.25e 053.21e-02
[0259]
实施例1.3抗ror1抗体的细胞表面结合表征
[0260]
抗ror1抗体的结合特异性和效力通过蛋白质elisa和流式细胞术分析细胞表面结合来表征。计算了结合ec50值并显示在下表3中。简而言之，抗ror1抗体的结合特性用elisa测量如下：重组ror1-ecd蛋白以1μg/ml包被在96孔板上，4℃过夜。将板用洗涤缓冲液(含有0.05％tween 20的pbs)洗涤一次，并在室温下用elisa封闭缓冲液(含有0.05％tween 20的pbs中的1％bsa)封闭2小时。然后加入抗ror1抗体并在37℃孵育1小时。用洗涤缓冲液将板洗涤3次。加入hrp标记的抗小鼠igg二抗(sigma，cat.#a0168)并将板在37℃孵育30分钟，然后在洗涤缓冲液中洗涤5次。每孔加入100μl四甲基联苯胺(tmb)显色溶液。显色后，用1n hcl终止反应，并在varioskan
tm lux微量板读板仪(thermofisher scientific)上测量450nm处的吸光度。使用graphpad prism 6.0软件针对抗体浓度绘制结合信号并相应地计算ec50。结果如图1所示。图1显示了单克隆抗体ror1-mab004和ror1-tab1的ror1-ecd蛋白结合活性，无关migg1作为阴性对照。
[0261]
用转染了人ror1的cho细胞系(cho-ror1)和表达ror1的骨髓瘤细胞系(rpmi8226)，测量了抗ror1抗体的细胞结合活性。简而言之，96孔板的每孔接种5
×
105个细胞。细胞以400g离心5分钟，弃去上清液。对于每个孔，然后加入100μl连续稀释的抗体并与细胞混合。在4℃孵育40分钟后，将板洗涤数次以去除过量抗体。然后加入第二荧光染料缀合的山羊抗小鼠igg抗体并在室温下与细胞孵育20分钟。在另一轮离心和洗涤步骤之后，将细胞重悬于facs缓冲液中，在cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)上读数。将中位荧光强度(mfi)读数相对于抗体浓度作图，并用graphpad prism 6.0软件进行分析。图2a-b中显示的结果说明，抗ror1单克隆抗体ror1-mab004和ror1-tab1与ror1表达细胞的结合活性。无关migg1用作阴性对照。
[0262]
表3.抗ror1单克隆抗体的结合ec50值
[0263][0264]
实施例1.4抗ror1抗体的内化表征
[0265]
用表达ror1的骨髓瘤细胞系rpmi8226表征抗ror1抗体的结合性内化。收获细胞并以每毫升300万个的密度重新悬浮在facs缓冲液中。将稀释的抗体加入管中并在4℃孵育30分钟。第一次孵育后，用冷pbs洗涤细胞3次以去除未结合的抗体。然后将各抗体处理的细胞分成两组，分别为“对照”组和“内化”组。“内化”组的细胞重悬于预温的培养基中，并在37℃孵育2小时以允许内化发生，而“对照”组中的细胞保持在4℃相同的时间。第二次孵育后，细胞用冷pbs洗涤一次，并与荧光素标记的二抗在4℃孵育30分钟。在另一轮离心和洗涤步骤后，将细胞重悬于facs缓冲液中，在cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)上读数。无关小鼠igg对照(mfi
背景
)用于背景校准。“对照”和“内化”的mfi读数之间的差异(δmfi)反映ror1抗体的内化，并且相对于“对照”的校准mfi的此差异反映抗体内化的百分比，计算如下并总结在下表4中：
[0266]
内化百分比(δmfi)＝[1-(mfi
内化
–
mfi
背景
)/(mfi
对照
–
mfi
背景
)]x 100％
[0267]
表4.抗ror1单克隆抗体的内化百分比.
[0268]
样品id内化百分比ror1-mab00411.58％ror1-tab1-3.23％ror1-tab229.94％
[0269]
实施例1.5抗ror1抗体的表位分组(epitope binning)
[0270]
ror1抗体的结合表位用竞争elisa鉴定。简而言之，96孔板用1ug/ml纯化抗体包被，并在4℃孵育过夜。用含有0.05％tween 20的pbs洗涤后，用封闭缓冲液(含有0.05％tween 20和2％bsa的pbs)在37℃封闭板2小时。将与ror1抗体(样品)或无关小鼠igg(基线)预先混合的生物素化人ror1-ecd蛋白加入板孔中，并在37℃孵育1小时，然后洗涤3次。然后将链霉亲和素-hrp(1:5000稀释)加入每个孔中并在37℃孵育1小时，然后再洗涤3次。加入四甲基联苯胺(tmb)显色溶液5分钟显色，然后用1m hcl终止反应。在微量板读板仪上测量450nm(od450)处的吸光度。od450
基线
代表在没有竞争的情况下人ror1-ecd与ror1抗体结合的水平，而od450
基线
和od450
样品
之间的差异反映了包被在板上的ror1抗体与溶液中的抗体之间的竞争。抑制百分数由下式计算：
[0271]
抑制％＝(1-od450
样品
/od450
基线
)x 100％
[0272]
下表5显示了竞争elisa的抑制百分数结果，表明ror1-mab004与ror1-tab2竞争，但不与ror1-tab1竞争。
[0273]
表5.抗ror1单克隆的竞争elisa结果
[0274][0275]
实施例2.ror1-mab004的人源化设计
[0276]
ror1-mab004可变区基因用于人源化设计。在此过程的第一步中，将ror1-mab004的vh和vl结构域的氨基酸序列与可用的人类ig v基因序列数据库进行比较，以找到总体最佳匹配的人类种系ig v基因序列。此外，将vh或vl的框架4区段与j区数据库进行比较，以找到分别与这些鼠vh和vl区具有最高同源性的人框架。对于轻链，最接近的人类v基因匹配是o18基因；对于重链，最接近的人类匹配是vh1-69基因。然后设计人源化可变域序列，其中将ror1-mab004轻链vl域的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3分别移植到o18基因的框架序列上，在cdr-l3之后使用jk4框架4序列；并且将ror1-mab004重链vh域的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3分别移植到vh1-69的框架序列上，在cdr-h3之后使用jh6框架4序列。然后生成ror1-mab004的三维fv模型，以确定是否存在其中小鼠氨基酸参与支持环结构或vh/vl界面的任何框架位置。人源化序列中的这些残基可以回复突变为相同位置的小鼠残基以保持亲和力/活性。鉴定了ror1-mab004 vh和vl的几个期望回复突变，并构建了替代的vh和vl设计，如下表6所示。
[0277]
此外，还设计了具有不同点突变的4个小鼠vh序列并显示在表6的最后4个vh序列
中，所述点突变旨在避免由ror1-mab004的cdr-h2中的两个“ng”(asn-gly)氨基酸引入的潜在天冬酰胺脱酰胺。参见，例如，qingrong yan等人，(2018)structure based prediction of asparagine deamidation propensity in monoclonal antibodies,mabs,10:6,901-912，关于在抗体的cdr-h2中“ng”(asn-gly)氨基酸诱导的天冬酰胺脱酰胺及其对抗体稳定性的影响。
[0278]
表6.ror1-mab004的vh/vl人源化和点突变设计
[0279][0280][0281]
注：人源化抗体中回复突变的框架氨基酸残基和嵌合抗体中的cdr-h2点突变用双下划线表示。
[0282]
实施例3.人源化抗cd3抗体的产生和表征
[0283]
杂交瘤产生的抗cd3单克隆抗体mabcd3-001使用常规杂交瘤技术产生和选择，然后通过常规cdr移植方法人源化。然后在人源化vh序列中引入回复突变，并进行ns突变以取代人源化κ链中的na以去除天冬酰胺脱酰胺倾向(pct/cn2019/120991中提供了详细描述，其通过引用完整地并入本文中)。所得人源化vh和vl构建体示于表7(以下)中。
[0284]
表7.cd3抗体可变区序列
[0285][0286]
人vh和人vk序列的配对产生了2种人源化抗体，命名为huem0006-01-24(具有seq id no：22和24的vh/vl对)和huem0006-01-27(具有seq id no：23和24的vh/vl对)(表7)。重组人源化mab在hek293细胞中瞬时表达并通过蛋白a层析纯化。
[0287]
通过流式细胞术，用表达人cd3的jurkat t细胞系，测试了人源化抗cd3抗体的结合活性。将facs缓冲液中的5
×
105jurkat细胞接种到96孔板的每个孔中。细胞以400g离心5分钟，弃去上清液。对于每个孔，然后加入100μl连续稀释的抗体并与细胞混合。在4℃孵育40分钟后，将板洗涤数次以去除多余的抗体。然后加入荧光染料缀合的二抗(alexa647山羊抗人igg1 h&l；jackson immunoresearch,cat.#109-606-170)并与细胞在室温下孵育20分钟。在另一轮离心和洗涤步骤之后，将细胞重悬于facs缓冲液中，在cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)上读数。将中位荧光强度(mfi)读数相对于抗体浓度作图，并用graphpad prism 5.0软件进行分析。抗体huem0006-01-24表现出比抗体huem0006-01-27更高的cd3结合亲和力。
[0288]
实施例4.ror1/cd3 fit-ig的生成
[0289]
利用表6中的vh/vl序列作为抗ror1部分、表7中的vh/vl序列作为抗cd3部分、以及表8中的人恒定区序列，构建了一组识别人ror1和人cd3的fit-ig蛋白。
[0290]
表8.人igg恒定区序列
[0291][0292]
fit-ig分子按照pct公开wo 2015/103072中描述的一般程序构建。每个fit-ig由具有以下结构的三个多肽链组成：
[0293]
链#1(长链)：vl
a-cl-vh
b-ch1-铰链-ch2-ch3；
[0294]
链#2(第一短链)：vh
a-ch1；
[0295]
链#3(第二短链)：vl
b-cl；
[0296]
其中a代表ror1，b代表cd3，vl
ror1
是识别ror1的人源化单克隆抗体的轻链可变域，vh
cd3
是识别cd3的人源化单克隆抗体的重链可变域，vl
cd3
是识别cd3的人源化单克隆抗体的轻链可变域，vh
ror1
是识别ror1的人源化单克隆抗体的重链可变域，每个cl是轻链恒定域(seq id no:32)，每个ch1是第一重链恒定域(seq id no:33)，ch1-铰链-ch2-ch3是从ch1到fc区末端的c端重链恒定区(seq id no:31)。
[0297]
为了构建长链载体，从头合成编码vl
ror1-cl-vh
cd3
片段的cdna并将其插入包含人ch1-铰链-ch2-ch3编码序列的载体的多克隆位点(mcs)。在得到的载体中，mcs序列在同源重组过程中被消除，以确保所有结构域片段都在正确的读框中。类似地，为了构建第一和第二短链，从头合成了vh
ror1
和vl
cd3
结构基因，并分别插入到适当载体的mcs中，所述载体包括人ch1和cl结构域的编码片段。
[0298]
人源化vh和人源化vl的配对产生了下表9中列出的人源化ror1/cd3 fit-ig结合蛋白。还产生了具有ror1-mab004的亲本小鼠vh/vl和人恒定序列的嵌合抗体(fit1007-12b)作为人源化结合蛋白排序的阳性对照。
[0299]
表9.产生具有人源化的抗ror1 vh/vl的fit-ig蛋白
[0300][0301]
表10中列出的重组fit-ig蛋白如本文所述进行瞬时表达和纯化。对于每个fit-ig构建体，分别将编码3个多肽链的3个质粒共转染到hek 293f细胞中。转染后细胞培养约六天后，收集上清液并进行蛋白a亲和层析。通过尺寸排阻层析(sec)分析纯化抗体的组成和纯度。将pbs中的纯化抗体应用于tskgel supersw3000，300x4.6mm，sec柱(tosoh)。使用dionex
tm ultimate 3000 hplc仪器(thermo scientific)在280nm和214nm处uv检测进行sec。表达和sec-hplc结果显示在下表10中。
[0302]
使用red96生物膜层干涉仪(pall fort
é
bio llc)对ror1/cd3 fit-ig蛋白进行分析并按解离速率常数(koff，“解离速率”)排序。抗higg fc捕获(ahc)生物传感器(pall)首先暴露于浓度为100nm的抗体30秒以捕获抗体，然后浸入运行缓冲液(1x ph 7.2pbs、0.05％tween 20、0.1％bsa)60秒以检查基线。将带有捕获抗体的传感器浸入10ug/ml的重组人ror1 ecd蛋白中5分钟以测量结合，然后浸入运行缓冲液1200秒以测量解离。使用fort
éꢀ
bio数据分析软件(pall)将结合和解离曲线拟合到1:1 langmuir结合模型。结果显示在下表10中。解离速率比通过抗体的解离速率与fit1007-12b的解离速率的比值来计算。比值越低表明与亲本嵌合抗体fit1007-12b相比，抗体的解离速度越慢。
[0303]
表10.人源化和嵌合ror1-mab004相关fit-ig蛋白的产生和解离速率排序
[0304][0305]
基于最高的结合活性，选择了fit1007-12b-1的vh/vl人源化设计。此外，与其他设计相比，fit1007-12b-13的cdr-h2点突变设计显示出了更高的表达滴度和结合活性。选择“ror1-mab004vh(aa)”(seq id no：17)的突变设计与“ror1-mab004vh.1a”(seq id no：10)的vh人源化设计组合，来产生候选分子。人源化vh序列，即ror1-mab004vh.1a(aa)，如下所示：
[0306]
》ror1-mab004vh.1a(aa)(seq id no:21)
[0307]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfsrswmnwvrqapgqglewmgriypgnadikynanfkgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycahiyydfyyaldywgqgttvtvss
[0308]
实施例5.ror1/cd3 fit-ig和mat-fab的构建和表达
[0309]
fit-ig的构建使用与实施例4中所示相同的方法。在免疫球蛋白结构域之间未使用接头。fit-ig结合蛋白的完整序列在表11的序列信息中提供。
[0310]
表11.fit-ig组分链的氨基酸序列
[0311]
[0312][0313]
也按照wo2018/035084中描述的程序，用相同的vh/vl序列组合，构建了一组ror1/cd3 mat-fab蛋白。每个mat-fab由具有以下结构的四个多肽链组成：
[0314]
链#1(带“旋钮”的长链)：vl
a-cl-vh
b-ch1-铰链-ch2-ch3；
[0315]
链#2(第一短链)：vh
a-ch1；
[0316]
链#3(第二短链)：vl
b-cl；
[0317]
链#4(fc“孔”)：铰链-ch2-ch3；
[0318]
其中，链#1具有突变的人恒定igg1，带有“旋钮”突变s354c,t366w；链#4为fc链，带有“孔”突变y349c,t366s,l368a,y407v；其中a代表ror1且b代表cd3。
[0319]
按照与之前针对fit-ig所示的类似克隆方法，合成产生了mat-fab多肽链的vh/vl基因，然后分别克隆到含有相应的恒定域的载体中。mat-fab蛋白的完整序列在表12的序列信息中提供。
[0320]
表12.mat-fab组分链的氨基酸序列
[0321]
[0322][0323]
重组fit-ig和mat-fab蛋白如本文所述进行进行了瞬时表达和纯化。对于每个fit-ig或mat-fab，将分别编码相应多肽链的3或4个质粒共转染到hek 293f细胞中。转染后细胞培养约六天后，收集上清液并进行蛋白a亲和层析。通过尺寸排阻层析(sec)分析纯化抗体的组成和纯度。将pbs中的纯化抗体应用于tskgel supersw3000，300x4.6mm，sec柱(tosoh)。使用dionex
tm ultimate 3000 hplc仪器(thermo scientific)在280nm和214nm处uv检测进行sec。表达和sec-hplc结果显示在下表13中。
[0324]
表13.ror1-mab004 fit-ig和mat-fab的生产表征
[0325]
fit-ig标识号表达滴度纯度％(sec-hplc)fit1007-12b-1714.12mg/l100fit1007-12b-1812.52mg/l99.89mat1007-12b-1723.15mg/l98.52mat1007-12b-1829.32mg/l95.64
[0326]
人源化候选物fit1007-12b-17及其亲本嵌合fit-ig fit1007-12b的ror1结合亲和力/动力学使用与实施例3中所述相同的方法进行测量。对于每种抗体，使用了6个抗原浓度(即，从500nm起3倍稀释)进行滴定测量。结合动力学和亲和力显示在下表14中。fit1007-12b-18、mat1007-12b-17和mat1007-12b-18的结合动力学与fit1007-12b-17的结合动力学相似。这些候选者共有相同的ror1结合性fab。
[0327]
表14.候选分子的ror1结合动力学
[0328]
样品idkd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fit1007-12b5.67e-091.82e 051.03e-03fit1007-12b-175.25e-102.24e 051.17e-04
[0329]
实施例6.人源化fit-ig和mat-fab的结合表征
[0330]
使用转染了人tcr/cd3复合物的cho细胞系(cho-cd3-tcr)和表达ror1的肿瘤细胞
系(nci-h1975、mda-mb-231、a549和rpmi8226)测量了ror1 x cd3抗体的细胞结合活性。简而言之，将5
×
105个细胞接种到96孔板的每个孔中。细胞以400g离心5分钟，弃去上清液。对于每个孔，然后加入100μl连续稀释的抗体并与细胞混合。在4℃孵育40分钟后，将板洗涤数次以去除多余的抗体。然后加入第二荧光染料缀合的山羊抗人igg抗体并在室温下与细胞孵育20分钟。在另一轮离心和洗涤步骤之后，将细胞重悬于facs缓冲液中，在cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)上读数。将中位荧光强度(mfi)读数相对于抗体浓度作图，并用graphpad prism 6.0软件进行分析。
[0331]
如图3所示，cho-cd3-tcr结合效力与每个分子的cd3结合亲和力和价态相关。通过比较fit-ig与其亲本抗cd3单克隆igg1抗体(即，fit1007-12b-17vs.huem0006-01-24(vh/vl序列：seq id nos：22和24，表7)，或fit1007-12b-18v.s.huem0006-01-27(vh/vl序列：seq id nos：23和24，表7)，fit-ig表现出了相对较低的结合效力，这可能是由于空间位阻所导致。
[0332]
如图4a-d所示，fit-ig与其相应亲本抗ror1单克隆抗体(huror1-mab004-1，具有ror1-mab004vh.1a(aa)和ror1-mab004vk.1a的序列，seq id no：21和13)。mat-fab的结合曲线表现出不同于fit-ig及其亲本抗ror1单克隆抗体的结合曲线，这可能是由于不同的靶标结合价所致。
[0333]
实施例7.人源化fit-ig和mat-fab的重定向cd3激活
[0334]
为了测量由ror1 x cd3双特异性fit-ig和mat-fab抗体引起的重定向的cd3激活，使用了共培养报告基因测定试验。在该测定中，当细胞表面cd3被激活时，jurkat-nfat-luc细胞会触发下游萤光素酶信号。rpmi8226细胞被用作表达ror1的靶细胞，它可以借助于结合ror1的双特异性ror1 x cd3抗体使t细胞上的cd3/tcr复合物交联。将jurkat-nfat-luc和rpmi8226细胞分别洗涤并重悬于测定培养基(含10％fbs的rpmi1640)中。两种细胞均以1
×
105个细胞/孔，按照1:1的比例，接种到96孔板(costar#3903)中。加入fit-ig或mat-fab抗体并与细胞混合并在37℃孵育4小时。孵育结束时，制备one-glo
tm
发光测定试剂盒(promega，目录号#e6130)试剂，并根据制造商的说明书加入孔中。使用varioskan
tm lux微量板读板仪(thermofisher scientific)读取板的发光信号。结果如图5所示。
[0335]
还测试了一种无关阴性对照fit-ig，即，抗egfr x cmet双特异性分子(emb01)，和两种抗cd3单克隆抗体，即huem0006-01-24和huem0006-01-27。与不具有ror1结合活性的单特异性抗cd3结合蛋白相比，所有双特异性ror1 x cd3结合蛋白在ror1表达靶细胞存在时都导致了t细胞活化增加。
[0336]
在不存在靶细胞的情况下，使用基于jurkat-nfat-luc的报告基因测定法，测试了非靶标重定向的cd3激活。结果如图6所示。该测定是在不存在表达双特异性结合蛋白的共靶点(在本例中为ror1)的细胞的情况下进行的。在没有表达ror1的靶细胞的情况下，双特异性ror1 x cd3抗体显示出了比单独的抗cd3抗体更少的非靶标重定向激活。
[0337]
实施例8.人源化fit-ig和mat-fab的重定向t细胞细胞毒性
[0338]
在使用人乳腺癌细胞系mda-mb-231作为靶细胞和人t细胞作为效应细胞的重定向t细胞细胞毒性测定中，测量了ror1 x cd3双特异性结合蛋白的肿瘤细胞杀伤效力。简而言之，收获细胞，洗涤，并用测定培养基(rpmi1640，含10％fbs)重悬。mda-mb-231细胞以每孔5
×
104个细胞接种到平底96孔板(corning，cat.#3599)中。使用商业pbmc分离试剂盒
(easysep
tm
,stemcell technologies,cat.#17951)从人pbmc中纯化t细胞，并以每孔2
×
105个细胞加入孔中。加入测试抗体并与细胞混合物在37℃孵育48小时。乳酸脱氢酶(ldh)释放用cytotox细胞毒性测定试剂盒(promega，目录号#g1780)测量。按照制造商的说明书获得od490读数。最大和最小裂解也根据cytotox试剂盒(promega,#g1780)说明书产生。通过向仅含有肿瘤细胞的样品中添加裂解缓冲液来产生最大裂解。最小裂解由培养基背景产生。从所有样品的读数中减去最小裂解。靶细胞mda-mb-231最大裂解(100％)减去最小裂解(0％)作为标化分母呈现。ldh释放百分数相对于双特异性抗体的浓度作图。如图7所示，ror1 x cd3双特异性结合蛋白表现出了对mda-mb-231肿瘤细胞的重定向t细胞细胞毒性，而egfr x cmet双特异性结合fit-ig emb01显示出低细胞毒活性。
[0339]
实施例9.在用ror1 x cd3双特异性抗体处理的植入了人pbmc的m-nsg小鼠中的mda-mb-231肿瘤体积
[0340]
在m-nsg小鼠中评估了抗肿瘤功效，所述m-nsg小鼠是一种缺乏t细胞、b细胞和自然杀伤细胞的免疫缺陷株。mda-mb-231细胞(5x106)皮下注射到右背侧。接种肿瘤细胞五天后，小鼠接受了3.5x106人pbmc的单个腹膜内剂量。在第15天根据肿瘤大小(～150-300mm3)将动物随机分组，并在第二天开始治疗。通过卡尺测量监测肿瘤生长。该研究在第一次给药后第16天终止，当出现gvhd迹象时对小鼠实施安乐死。通过腹膜内(i.p.)注射，用1mg/kg fit1007-12b-17、fit1007-12b-18、mat1007-12b-17或溶媒，每周治疗一次小鼠，持续3周(qw x 3)。如图8所示，fit-ig和mat-fab治疗组小鼠与溶媒组相比显示出了显著的肿瘤生长抑制(
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p《0.0001；与溶媒组相比，双向anova联合dunnett检验)。
[0341]
实施例10.人源化抗ror1抗体的内化表征
[0342]
人源化抗ror1抗体的结合性内化用表达ror1的骨髓瘤细胞系rpmi8226，采用与先前在实施例1.4中描述的方法相似的方法表征。简而言之，收获细胞并以每毫升300万个的密度重新悬浮在facs缓冲液中。将稀释的抗体加入管中并在4℃孵育30分钟。第一次孵育后，用冷pbs洗涤细胞3次以去除未结合的抗体。然后，将每种抗体处理的细胞分为三组，分别为4℃组、37℃组和37℃ pao组。37℃“内化”组的细胞重新悬浮在预温的培养基中，并在37℃孵育2小时以允许内化，而4℃“对照”组中的细胞保持在4℃相同的时间。“37℃ pao”组中的细胞重新悬浮在预温的培养基中，并在3μm氧化苯砷(一种防止膜蛋白内化的内吞抑制剂)存在下在37℃孵育2小时。37℃ pao处理组用于校正抗体解离效果。第二次孵育后，细胞用冷pbs洗涤一次，并与荧光素标记的二抗在4℃孵育30分钟。在另一轮离心和洗涤步骤后，将细胞重悬于facs缓冲液中，在cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)上读数。计算了无关小鼠igg对照(mfi
背景
)并用于背景校准。“对照”和“内化”的mfi读数之间的差异(δmfi)反映ror1抗体的内化，而相对于“对照”的校准mfi的此差异反映了抗体内化的百分比，计算如下并总结在下表15中。如图9所示，在100nm抗体浓度下，huror1-mab004-1及其相应的fit-ig/mat-fab表现出了有限的内化。huror-mab004-1和fit1007-12b-17的计算抗体内化百分比与实施例1.4表4中所示的结果相符。
[0343]
mat-fab在37℃显示了减少的结合，这可能是由于其较低的结合价和在37℃较高的结合解离速率所致。对于mat-fab内化的计算，结合曲线在100nm未达到结合平台。内化百分比(δmfi)＝[1-(mfi
内化
–
mfi
背景
)/(mfi
对照
–
mfi
背景
)]x 100％.
[0344]
表15.人源化抗ror1抗体的mfi减少和校正的内化百分比
[0345]
样品idmfi减少(校正后的内化百分比*)huror1-mab004-113％(13％)fit1007-12b-1715％(15％)mat1007-12b-1733％(-4％)
[0346]
*括号内的数值是使用pao处理组的数值进行校正的
[0347]
实施例11.参照fit-ig生成和与fit1007-12b-17的体外活性比较
[0348]
表7中显示的抗cd3抗体序列，与两种参考抗ror1抗体(ror1-tab1(克隆r12)和ror1-tab2(克隆d10))之一的vh/vl序列，用于生成fit-ig。参照fit-ig的构建和产生如实施例3中所述进行。在免疫球蛋白结构域之间未使用接头。这些fit-ig结合蛋白的完整序列在表16和17的序列信息中提供。参照fit-ig的细胞表面结合活性通过使用如实施例1.3中所述的方法进行了评估，并且重定向的细胞毒性活性通过使用如实施例6中所述的方法进行了评估。
[0349]
本实施例中使用的两种参考抗ror1抗体，ror1-tab1(克隆r12)和ror1-tab2(克隆d10)，的vh/vl序列如下:
[0350]
抗体d10的vh序列(seq id no:42)
[0351]
qvqlkesgpglvapsqtlsitctvsgfsltsygvhwvrqppgkglewlgviwaggftnynsalksrlsiskdnsksqvllkmtslqtddtamyycarrgssysmdywgqgtsvtvss
[0352]
抗体d10的vl序列(seq id no:43)
[0353]
eivlsqspaitaaslgqkvtitcsassnvsyihwyqqrsgtsprpwiyeisklasgvpvrfsgsgsgtsysltissmeaedaaiyycqqwnyplitfgsgtkleiq
[0354]
抗体r12的vh序列(seq id no:44)
[0355]
qeqlvesggrlvtpggsltlsckasgfdfsayymswvrqapgkglewiatiypssgktyyatwvngrftissdnaqntvdlqmnsltaadratyfcardsyaddgalfniwgpgtlvtiss
[0356]
抗体r12的vl序列(seq id no:45)
[0357]
elvltqspsvsaalgspakitctlssahktdtidwyqqlqgeaprylmqvqsdgsytkrpgvpdrfsgsssgadryliipsvqaddeadyycgadyiggyvfgggtqltvtg
[0358]
表16.参照fit-ig的组分链的氨基酸序列
[0359]
[0360][0361]
图11展示了fit1007-12b-17与表16中提供的参照fit-ig分子的比较。图11a和11b显示fit1007-12b-17和参照fit-ig都表现出了与表达ror1的mda-mb细胞和表达cd3的jurkat细胞两者的相似细胞表面结合。然而，如图11c所示，在针对mda-mb-231细胞的重定向t细胞细胞毒性上，fit1007-12b-17实现了比参照fit-ig分子更有力的细胞毒性。