控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点检测引物和检测方法及应用与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，涉及一个控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点、检测突变位点的引物对及检测方法和应用。


背景技术：

2.赤霉素(gibberellins,ga)是植物经典激素之一，主要控制种子萌发，茎干伸长，叶片、花和种子发育等重要过程，对植物生长和发育起着关键调控作用。
3.在被子植物中，编码柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase,cps)是双萜合酶基因，参与完成赤霉素合成通路的第一阶段。拟南芥中cps基因只有一个拷贝，该基因也被称为ga1基因，突变后会导致种子萌发困难，植株极度矮小，叶片小而深绿，花瓣、萼片和雌蕊严重发育不全、雄性败育，外施赤霉素可以恢复突变体表型。水稻中有四个cps基因(oscps1-oscps4)，oscps1主要参与赤霉素的合成。
4.在上个世纪60年代开始的第一次绿色革命，就是利用水稻中的赤霉素合成基因sd1和小麦中的信号转导基因rht的优异等位基因培育出抗倒伏、高产新品种，极大推动了粮食产量的提升。这些研究表明赤霉素对于农作物的株型，育性以及收获指数影响很大。这表示赤霉素在株型创建等辅助育种中的潜力巨大，有待进一步挖掘。因此，利用赤霉素合成酶基因关键位点的突变，使赤霉素合成酶酶活改变，进而改变植物中赤霉素合成量和株型的改变，是发掘和培育赤霉素合成量适度，株型优异的农作物新种质，新品种的一种重要途径。同时还可以通过特定引物序列对这些关键位点所在片段进行扩增，并测序确定这些位点的基因型，进而实现分子辅助设计育种。


技术实现要素：

5.本发明目的是针对赤霉素合成基因在调节植物体内赤霉素合成量，产生合适株型在种质创新和育种上应用潜力挖掘的不足，提供一个可以调节植物赤霉素合成量并进一步影响株型的突变位点及其产生的理想株型在农作物新品种培育方面的应用。
6.本发明的另一目的为提供检测该突变位点的引物。
7.本发明的又一目的为提供该突变位点的检测方法。
8.本发明的技术方案：
9.一个控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点，所述突变位点位于植物cps基因的第2768位核苷酸从鸟嘌呤(g)突变为腺嘌呤(a)，导致cps蛋白第326位的缬氨酸(v)突变成蛋氨酸(m)，进化中保守的v326位于terpene synth(272-478)结构域中。所述突变位点是一个影响cps酶活的关键位点，与植物的赤霉素合成量及株型直接相关，该位点的突变会显著降低植物体内赤霉素的合成量，导致植物根短、矮化、丛生。
10.一种用于检测上述突变位点的特异性引物对，正向引物为lp:acwgcwtdygcdytbatgca，反向引物为rp:cgnggyargctngcrtacct。
11.一种检测植物基因组中是否存在本发明所述的基因突变位点的方法，包括：以待测植物的基因组dna为模板，利用上述的特异性引物对进行pcr扩增，利用所述正向引物lp对扩增产物测序分型；扩增产物的序列峰图中编码保守位点v326的密码子gtg的第一个碱基为单峰a的，为aa基因型，表明该植株存在所述的基因突变位点，该植物样品赤霉素合成量低，株型矮；编码保守位点v326的密码子gtg的第一个碱基为单峰g的，为gg基因型，表明该植株不存在所述的基因突变位点，该植物样品赤霉素合成量高，株型高。
12.本发明所述的引物和检测方法对在植物编码cps基因保守位点v326密码子中的第一碱基进行分析，用于检测v326位点是否突变或发生定点编辑，进而调节赤霉素合成量及株型创建的辅助选择育种中的应用。
13.本发明的优点和有益效果：
14.本发明提供了可以控制植物赤霉素合成并进一步影响株型的突变位点检测引物及其检测方法，可用于该位点定点编辑创造更适赤霉素合成量和理想株型农作物种质，该种质可进一步应用于基因辅助选择育种。
附图说明
15.图1col-0和突变体ga1-168中赤霉素含量(ng/g fw)。
16.图2col-0和突变体ga1-168的株型。
17.图3col-0和突变体ga1-168测序比对结果。
具体实施方式
18.实施例1：
19.本发明所述的检测所述突变位点的方法，包括以下步骤：
20.1、dna提取
21.以植物(主要包括农作物玉米，水稻，大麦，大豆，番茄，油菜)的叶片为材料提取基因组dna，采用ctab法提取。
22.2、引物设计
23.根据玉米，水稻，大麦，大豆，番茄，油菜的cps基因序列，利用primer5.0软件设计1对引物，正向引物为lp:acwgcwtdygcdytbatgca(seq id no.1)，反向引物为rp:cgnggyargctngcrtacct(seq id no.2)。引物可委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
24.3、pcr扩增
25.在0.2ml的pcr扩增专用薄壁管中，pcr扩增体系为35μl，主要包括：2μl植物基因组dna，0.25μm正向引物，0.25μm反向引物，17.5μl 2
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rapid taq master mix(南京诺唯赞公司)，用双蒸水定容至35μl。pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，58℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸5min。本发明采用的热循环仪为biorad公司的c1000型。
26.4、电泳图谱分析
27.扩增产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。在凝胶成像仪(tanon公司)上观察凝胶上的电泳条带，通过比对dnamarker判断电泳条带的大小，其中玉米电泳条带大小应为
984bp(seq id no.3)，水稻为1085bp(seq id no.4)，大麦为1181bp(seq id no.5)，大豆为1519bp(seq id no.6)，番茄为1086bp(seq id no.7)，油菜为1048bp(seq id no.8)。pcr扩增产物采用纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)纯化后，直接由生工生物工程(上海)股份有限公司利用正向引物lp进行测序。
28.5、测序分型
29.测序峰图用snapgene软件进行分析。根据峰图判断基因型，其中序列峰图中编码保守位点v326的密码子gtg的第一个碱基为单峰g的为gg型，表明该植株不存在所述的基因突变位点，该植物样品赤霉素合成量高，株型高。如果编码保守位点v326的密码子gtg的第一个碱基为单峰a的为aa基因型，表明该植株存在所述的基因突变位点，该植物样品赤霉素合成量低，株型矮。
30.为了证明本发明的正确性，发明人设置了实施例2的试验。
31.实施例2
32.利用本发明所述特异性引物对对野生型拟南芥col-0，拟南芥cps v326纯合突变体ga1-168进行pcr扩增，扩增条带大小应为1081bp左右(seq id no.9)，pcr产物经过纯化后，直接对cps基因的第2768位核苷酸进行检测，最终结果如下：
33.检测到野生型拟南芥序列峰图中编码保守位点v326的密码子gtg的第一个碱基只有单峰g，为gg基因型，表明该植株体内赤霉素含量高，与其较高的株型吻合(图1，图2)；检测到拟南芥cps v326m纯合突变体ga1-168序列峰图中编码保守位点v326的密码子gtg的第一个碱基为单峰a，是aa基因型，表明该植株体内赤霉素含量低，与其矮化、丛生的株型吻合(图1，图2)。序列比对结果如图3所示。由此可见，所述突变位点的aa基因型可显著降低植物赤霉素的合成量，达到培育筛选合适株型的品种的目的。
34.35.36.37.38.39.40.