基于KDM2B序列合成的生物活性多肽在间充质干细胞神经分化和再生修复中的应用的制作方法

基于kdm2b序列合成的生物活性多肽在间充质干细胞神经分化和再生修复中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及基于组蛋白去甲基化酶kdm2b合成的生物活性多肽及其 在间充质干细胞神经向分化过程和损伤神经组织再生修复中的应用。


背景技术：

2.颅颌面的神经组织分布广泛，易受损伤。近年流行病学调查显示55.2％的颅颌面外伤患者存在不同 程度神经损伤，2.2％的患者另伴有脊髓挫伤，后续治疗并发症中24.0％的患者出现神经功能障碍。以往 治疗方式主要是使用神经保护措施如温热等，使用神经保护药物如糖皮质激素类、谷氨酸拮抗剂类等， 使用电、热、力等刺激神经自我愈合等，这些治疗复杂、周期长，神经功能恢复率低，导致高致残率。 自/异体神经移植治疗存在供体组织取材困难、取材处二次损伤等，同时移植神经无法进行良好塑型， 仍不能很好恢复组织结构外形和受损功能。目前损伤神经的临床治疗效果仍待提升。
3.以间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)介导为基础的生物性再生治疗将是未来修复损伤神 经功能的治疗新方式。作为对组织损伤信号的响应，mscs良好的分化能力可以促进神经修复细胞形成 和轴突再生等，最终促进损伤神经的再生修复。但是，神经源性干细胞来源有限、取材困难，仍需发掘 更多种子干细胞。牙源性mscs发育自神经嵴，神经嵴最初起源于外胚层，与神经组织发源密切，因此 牙源性mscs更具有转化应用的优势。其中，根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,scap) 存在于牙齿根尖部牙乳头组织中，研究发现scap在体内可形成牙髓神经样组织，提示scap是神经再 生的可用种子细胞。目前限制scap潜在应用的主要问题是神经分化效率低和调节机制不明确。因此， 如何有效发掘关键调控靶点，促进牙源性间充质干细胞修复潜能显得尤为重要。
4.最近的研究确定了染色质的表观遗传调控是决定mscs神经谱系分化的关键机制。通过全基因组表 观遗传调控图谱的揭示，发现分化后mscs组蛋白h3上赖氨酸27位点(h3k27)和赖氨酸4位点(h3k4) 的甲基化修饰分值明显升高。组蛋白的甲基化修饰多发生在赖氨酸残基(k)上，是表观遗传机制中组 蛋白共价修饰的主要形式。存在于基因启动子区的组蛋白甲基化修饰基团阻碍该基因的转录表达(如 h3k27me3)或促进该基因的转录表达(如h3k4me3)，组蛋白甲基化/去甲基化酶在组蛋白的甲基化 修饰中分别起到关键调控作用，同时也存在一定的功能相互作用(如通过功能域结合形成复合体)。
5.一项关于胚胎干细胞的全基因组染色质免疫沉淀(chip)测序表明，组蛋白甲基化酶ezh2的结合 和神经分化调控基因的启动子区的h3k27me3修饰高度相关。ezh2属于多梳蛋白组(polycomb group， pcgs)的核心一员，其修饰的h3k27me3是一种基因转录抑制的组蛋白甲基化修饰，被认为阻碍特定 细胞命运的分化进程。研究发现ezh2抑制神经干细胞分化形成神经源性细胞，使用h3k27me3特异 拮抗剂epz005687可有效提高中脑腹侧来源神经干细胞的神经元性分化能力，提示ezh2对神经分化 可能的抑制作用。因此，如何有效调控ezh2的功能作用十分关键。
6.研究发现kdm2b参与招募prc2-ezh2复合体对下游靶基因的锚定和后续组蛋白的共价修饰，提 示kdm2b与ezh2之间可能存在表观遗传调控作用上的交叉。kdm2b属于组蛋白去甲基化酶，主要 通过发挥去除组蛋白h3k4位点的三甲基化修饰(h3k4me3)的作用，参与多种细胞进程的调控。研 究者分析发现kdm2b功能的发挥依赖其含有的jmjc、cxxc、phd等多种功能结构域。然而，kdm2b 与牙源性mscs神经分化功能的关系尚不清楚；kdm2b与ezh2蛋白之间可能的相互作用不清楚。
7.目前，一种分析蛋白质结合的技术方法正发展起来，使得研究者关于两个蛋白质相互作用的具体结 合位点信息可以遵循一个广泛观点，这种方法是“多肽微阵列分析”，基于蛋白质的免疫杂交试验，利用 感兴趣的蛋白与基于另一个蛋白全长氨基酸序列合成的微阵列芯片杂交，借助酶联标记放大这种杂交结 合的信号，从而识别两个蛋白质之间可能的结合片段位点和这一可能位点具体的氨基酸序列信息。由此， 通过使用多肽微阵列的方法可以研究kdm2b与ezh2间可能的结合功能域片段，理解这一过程有望明 确调控牙源性mscs神经分化的潜在表观修饰酶的关键相互作用位点，研发促进牙源性mscs神经分化 的生物性新药，提升临床条件下损伤神经生物性再生效果。
8.本发明研究的目的是阐明kdm2b对牙源性间充质干细胞神经分化与再生的作用，阐明kdm2b与 ezh2的可能互作，通过使用多肽微阵列的方法研究kdm2b与ezh2间可能的结合位点片段信息。


技术实现要素：

9.有鉴于此，本发明提供一种基于组蛋白去甲基化酶kdm2b合成的生物活性多肽及其在间充质干细 胞神经向分化过程和损伤神经组织再生修复中的调控方法，旨在解决现有技术没有涉及kdm2b基因及 其生物活性多肽在牙源性间充质干细胞神经分化过程和损伤神经组织再生修复中调控的问题。
10.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
11.本发明提供了kdm2b过表达在制备诱导根尖牙乳头干细胞体外神经分化的制剂或药物中的应用。
12.在本发明一些具体实施方案中，kdm2b的过表达在制备促进根尖牙乳头干细胞体外β
ⅲ‑
tubulin 阳性及nestin阳性类神经球的形成的制剂或药物中的应用。
13.本发明还提供了kdm2b的过表达在制备促进体内根尖牙乳头干细胞介导的脊髓神经损伤组织再 生修复的制剂或药物中的应用。
14.更重要的是，本发明提供了多肽，其具有：
15.(i)、如seq id no.1～266任意所示的氨基酸序列；或
16.(ii)、如(i)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与 (i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
17.(iii)、与如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；
18.所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个或5个。
19.此外，本发明还提供了编码所述多肽的核酸分子。
20.本发明还提供了表达载体，包括所述的核酸分子。
21.更重要的是，本发明还提供了所述的多肽，所述的核酸分子，所述的表达载体，直
接或间接在制备 诱导根尖牙乳头干细胞体外成神经分化的制剂或药物中的应用。
22.同样重要的是，本发明还提供了所述的多肽，所述的核酸分子，所述的表达载体，直接或间接在制 备促进体内根尖牙乳头干细胞介导的脊髓神经损伤组织再生修复的制剂或药物中的应用。
23.在本发明的一些具体实施方案中，kdm2b与ezh2的结合位点包括：
24.阳性结合位点选自peptide 5、peptide 46、peptide 47、peptide 122、peptide 123、peptide 131、peptide 132、peptide 139、peptide 142、peptide 151、peptide 152、peptide 153、peptide 231、peptide 232、peptide 233；
25.所述阳性结合位点的氨基酸序列如seq id no.5、seq id no.46、seq id no.47、seq id no.122、 seq idno.123、seq id no.131、seq id no.132、seq id no.139、seq id no.142、seq id no.151、 seq idno.152、seq id no.153、seq id no.231、seq id no.232或seq id no.233所示；
26.所述阴性结合位点选自peptide 83、peptide 84；
27.所述阴性结合位点的氨基酸序列如seq id no.267所示。
28.此外，本发明还提供的多肽还包括氨基酸序列如seq id no.267～270任意所示的多肽。
29.本发明还提供了药物或制剂，包括所述的多肽以及药学上可接受的辅料。
30.此外，本发明还提供了所述多肽的制备方法，包括如下步骤：
31.步骤1，间充质干细胞培养，质粒构建与病毒转染；
32.步骤2，β
ⅲ‑
tubulin、nestin双阳性类神经球形成，间充质干细胞使用神经干细胞优势培养 基诱导培养，诱导9天时形成的类神经球，4％多聚甲醛固定，triton进行膜通透处理后基础白蛋白液 封闭处理，然后用特异性一抗液4℃孵育过夜，荧光标定种属特异二抗、细胞骨架染料pdi、细胞核染 料dapi依次孵育后借助荧光激发使其可视化；主要针对特异性一抗是抗神经元特异表达基因微管蛋白 β
ⅲ‑
tubulin、神经祖细胞标记物巢蛋白nestin多克隆抗体；
33.步骤3、大鼠脊髓神经损伤模型及根尖牙乳头干细胞回植，将约1
×
106个根尖牙乳头干细胞移植 到10周龄大鼠t10部脊髓组织全切断位点，分别于移植后0周、1周、2周和3周对大鼠进行bbb后 肢运动能力评分；组织病理学分析，三周后获取损伤处脊髓组织，制作石蜡切片，苏木精-伊红染色(he) 染色，神经元特异表达微管蛋白β
ⅲ‑
tubulin、神经纤维丝特异蛋白nef-m的免疫组织化学染色；
34.进一步，根尖牙乳头干细胞移植大鼠t10脊椎部脊髓组织全切断位点，特别的，通过微注射体系 (共30ul)于全切断位点的正中、左侧和右侧分别向中线方向进针，每位点分别缓慢注射10ul；
35.步骤4，免疫共沉淀反应，ripa裂解液溶解细胞提取总蛋白，蛋白样本与特异一抗免疫球蛋白 a/g珠子4℃孵育过夜，三乙醇胺缓冲盐水溶液(tbs)清洗后，99℃煮沸变性，进行蛋白质印迹分析， 蛋白样本用10％sds聚丙烯酰胺凝胶分离并利用半干转移膜装置转移到聚乙二烯二氟化物(pvdf)中， 膜上涂抹5％脱脂牛奶放置2h，然后用一抗孵育一夜；免疫复合物与兔或小鼠免疫球蛋白g抗体一同 孵育并用化学发光底物试剂使其可视化；主要针对特异一抗是抗kdm2b、ezh2多克隆抗体；
36.步骤5，多肽微阵列杂交及数据分析，根据kdm2b全长氨基酸序列，通过overlapping设计方式 设计、全自动多肽芯片合成仪合成kdm2b多肽微阵列芯片；多肽微阵列芯片与重组蛋白免疫杂交反应， 将多肽微阵列芯片活化后封闭处理，与生物素标记的ezh2蛋白样品反应液4℃震荡孵育过夜，hrp显 色底物孵育，ecl化学发光试剂于chempchemi数字成像仪可视化；芯片显色点扫描及数据分析，成像 图片使用totallab图像分析软件分析显色点光密度值，使用软件中“spot edge average”算法，计算每个 显色点的显色强度百分比值。
37.步骤6，生物活性多肽的合成和纯化，获得生物活性多肽序列，穿膜肽及fitc绿色荧光基团标 定，树脂-二氯甲烷液溶胀下按序列顺次合成相应氨基酸，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端，洗 净、乙醚析出粗产物，离心后液相色谱法提纯，冻干机冻干获得生物活性多肽粉末。
38.本发明还提供了免疫共沉淀分析用于本发明提供的生物活性多肽对kdm2b/ezh2复合体结合的 应用；β
ⅲ‑
tubulin、nestin双阳性类神经球形成用于生物活性多肽对根尖牙乳头干细胞成神经球分 化的应用；大鼠脊髓损伤神经组织局部位点回植用于生物活性多肽对脊髓神经损伤组织再生的应用。
39.本发明提供了一种基于组蛋白去甲基化酶kdm2b合成的生物活性多肽及其在间充质干细胞神经 向分化过程和脊髓神经损伤组织再生中的应用，通过多肽微阵列芯片杂交及数据分析、蛋白质印迹分析、 类神经球诱导形成和β
ⅲ‑
tubulin、nestin双阳性类神经球免疫荧光染色、大鼠脊髓组织全切断损伤 模型局部位点回植试验发现kdm2b生物活性多肽在间充质干细胞神经向分化过程中的作用，以及在脊 髓神经损伤组织再生中的作用。本发明涉及组蛋白去甲基化酶kdm2b与组蛋白甲基化酶ezh2可能的 蛋白互作结合位点、涉及kdm2b及生物活性多肽在间充质干细胞神经向分化过程中的作用、涉及 kdm2b及生物活性多肽在脊髓神经损伤组织再生中的作用，得到kdm2b及基于其合成的生物活性多 肽可能在根尖牙乳头干细胞成神经分化及脊髓神经损伤组织再生中起促进作用。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需 要使用的附图作简单地介绍。
41.图1示本发明实施例提供的间充质干细胞中及脊髓组织中kdm2b的表达；其中，图1(a)实时 荧光定量反转录pcr结果表明kdm2b在根尖牙乳头干细胞体外成神经分化诱导过程中表达升高，峰 值出现在诱导的第三天；图1(b，c)免疫组织化学染色结果表明相较于正常脊髓神经组织，kdm2b 在脊髓神经损伤组织中表达降低；gapdh作为内部控制；数据t检验用来确定统计学意义；all error bars represent the s.d.(n＝3)；**p≤0.01；red scale bar:100μm；
42.图2示本发明实施例提供的kdm2b的过表达促进根尖牙乳头干细胞体外β
ⅲ‑
tubulin及nestin 阳性类神经球形成量的示意图；其中，图2(a)实时荧光定量反转录pcr结果和图2(b)蛋白质免 疫印迹结果表明构建完成kdm2b的过表达根尖牙乳头干细胞；图2(c)成神经诱导9天时，相较于 对照vector组，kdm2b的过表达促进根尖牙乳头干细胞体外类神经球形成；图2(d)免疫荧光染色 结果及图2(e)定量结果表明kdm2b的过表达促进根尖牙乳
头干细胞体外β
ⅲ‑
tubulin阳性类神经 球形成；图2(f)免疫荧光染色结果及图2(g)定量结果表明kdm2b的过表达促进根尖牙乳头干细 胞体外nestin阳性类神经球形成；图2(h-k)实时荧光定量反转录pcr结果表明kdm2b的过表达上 调了根尖牙乳头干细胞中th(h)、ncam(i)、nef(j)、neurod(k)的表达；gapdh作为 内部控制；数据t检验用来确定统计学意义；all error bars represent the s.d.(n＝3)；**p≤0.01；white scale bar:100μm；
43.图3示本发明实施例提供的kdm2b的敲低表达抑制根尖牙乳头干细胞体外β
ⅲ‑
tubulin及 nestin阳性类神经球形成量的示意图；其中，图3(a)实时荧光定量反转录pcr结果表明构建完成 kdm2b的敲低表达根尖牙乳头干细胞；图3(b)成神经诱导9天时，相较于对照scramsh组，kdm2b 的敲低表达抑制根尖牙乳头干细胞体外类神经球形成；图3(c)免疫荧光染色结果及图3(d)定量结 果表明kdm2b的敲低表达抑制根尖牙乳头干细胞体外β
ⅲ‑
tubulin阳性类神经球形成；图3(e)免 疫荧光染色结果及图3(f)定量结果表明kdm2b的敲低表达抑制根尖牙乳头干细胞体外nestin阳 性类神经球形成；gapdh作为内部控制；数据t检验用来确定统计学意义；all error bars represent the s.d.(n＝3)；**p≤0.01；white scale bar:100μm；
44.图4示本发明实施例提供的kdm2b的过表达促进体内根尖牙乳头干细胞介导的脊髓神经损伤组织 再生修复的示意图；其中根尖牙乳头干细胞回植3周时，图4(a)脊髓神经组织大体观显示kdm2b 过表达组损伤愈合明显；图4(b)bbb行为学评分结果表明kdm2b过表达组显著提高大鼠后肢运动 能力；图4(c)苏木精-伊红染色(he)染色结果表明kdm2b过表达组显著促进脊髓损伤神经纤维 修复再生；图4(d)免疫组织化学染色结果表明kdm2b过表达组显著调高了脊髓损伤神经组织中 β
ⅲ‑
tubulin和nef-m的表达；gapdh作为内部控制；数据t检验用来确定统计学意义；all error bars represent the s.d.(n＝3)；*p≤0.05，**p≤0.01；white scale bar:5mm，red scale bar:100μm；
45.图5示本发明实施例提供的免疫共沉淀(co-ip)方法检测kdm2b与ezh2蛋白结合的示意图；
46.图6示本发明实施例提供的ezh2蛋白与kdm2b多肽微阵列芯片的示意图；其中，图6(a)杂 交斑点图及图6(b)微阵列多肽斑点灰度值结果表示阳性结合肽段位点；图6(c)ezh2与kdm2b 蛋白结合功能域片段示意图；图6(d)免疫共沉淀(co-ip)结果表明10ug/ml生物活性多肽peptide 46-47 (pp1组)、peptide 122-123(pp2组)、peptide 131-132(pp3组)有效阻断ezh2与kdm2b的结合；
47.图7示本发明实施例提供的生物活性多肽peptide 46-47(pp1组)、peptide 122-123(pp2组)、peptide 131-132(pp3组)促进根尖牙乳头干细胞体外β
ⅲ‑
tubulin及nestin阳性类神经球形成量的示意图； 其中，图7(a)成神经诱导9天时，相较于对照conpp添加组，peptide 46-47、peptide 122-123、peptide 131-132添加组均显著促进根尖牙乳头干细胞类神经球形成；免疫荧光染色及定量结果表明peptide 46-47、peptide 122-123、peptide 131-132添加组均显著促进根尖牙乳头干细胞体外β
ⅲ‑
tubulin(b,c) 阳性和nestin(d,e)阳性类神经球形成；数据t检验用来确定统计学意义；all error bars represent the s.d.(n＝3)；**p≤0.01；white scale bar:5mm；
48.图8示本发明实施例提供的生物活性多肽peptide 46-47(pp1组)促进脊髓损伤神经组织再生修复 的示意图；其中10ug/ml peptide 46-47预处理根尖牙乳头干细胞回植4
周后，图8(a)脊髓组织大体 观显示10ug/ml peptide 46-47预处理组损伤神经组织愈合明显；图8(b)bbb行为学评分结果表明10 ug/ml peptide 46-47预处理组显著提高大鼠后肢运动能力；同时，脊髓损伤局部位点单独应用10ug/ml peptide 46-47连续注射4周后，图8(c)脊髓组织大体观显示10ug/ml peptide 46-47注射组损伤神经 组织愈合明显；图8(d)bbb行为学评分结果表明10ug/ml peptide 46-47注射组显著提高大鼠后肢运 动能力；图8(e)联合分析bbb行为学评分结果表明干预施加4周时，10ug/ml peptide 46-47预处理 干细胞回植组和单独10ug/ml peptide 46-47注射组均能显著提高大鼠后肢运动能力，且两组间无明显差 别；数据t检验用来确定统计学意义；all error bars represent the s.d.(n＝3)；*p≤0.05，**p≤0.01；white scale bar:5mm；
49.图9示kdm2b多肽微阵列膜上多肽点示意图和考马斯染色图；左侧图示kdm2b多肽微阵列膜上 多肽点示意图；右侧图示芯片完成后考马斯染色图像。
具体实施方式
50.本发明公开了基于组蛋白去甲基化酶合成的生物活性多肽及其在间充质干细胞神经向分化过程中 的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的 替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法 和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
51.本发明的目的在于提供一种基于组蛋白去甲基化酶kdm2b合成的生物活性多肽及其在间充质干 细胞成神经分化过程中的调控方法，旨在解决现有技术没有涉及kdm2b基因及其生物活性多肽在间充 质干细胞成神经分化过程中调控的问题。
52.本发明是这样实现的，一种基于组蛋白去甲基化酶kdm2b合成的生物活性多肽及其在间充质干 细胞成神经分化过程中的调控方法，该kdm2b多肽微阵列设计、分析及基于kdm2b合成的生物活性 多肽方法包括以下步骤：
53.步骤一，kdm2b蛋白的多肽微阵列芯片设计信息，通过uniprot蛋白信息网站 (https://www.uniprot.org/)查询获得人源kdm2b蛋白全长序列，根据kdm2b蛋白的1336个氨基酸 序列合成多肽芯片(详列于表12)，通过overlapping设计，即从第一个氨基酸位点开始，以15个氨 基酸序列长度做为一个观察窗，设计该阵列的第一条多肽，然后向后移位5个氨基酸位点，以后面15 个氨基酸序列长度作为为第二个观察窗，设计该阵列的第二条多肽，并以此方法依次顺延，最终获得 266条多肽，组成一个基于kdm2b蛋白为基础的多肽微阵列芯片。
54.步骤二，多肽阵列合成，活化过的基质芯片膜放置于全自动多肽芯片合成仪上，根据程序自动转移 fmoc(9-芴甲氧羰基)-氨基酸原料溶液到活化膜上的特定位置与膜进行反应；接着，膜按序浸入bsa 蛋白封闭液i和ii中，进行侧链封闭；然后，dmf(二甲基甲酰胺)洗膜移除氨基端的fmoc保护基 团，而后再用乙醇干燥；重复以上步骤，直至多肽阵列全部合成完毕。最后，用特定的有机试剂去除侧 链保护基团，再用ch2cl2洗膜，乙醇洗涤后干燥，立即使用或-20℃保存。
55.步骤三，多肽阵列与重组蛋白免疫杂交结合反应，将多肽微阵列芯片活化后加入
封闭液，室温下震 荡封闭4小时，洗涤芯片；取ezh2蛋白样品反应液(浓度1.5mg/ml)，用ez-link nhs-peo4-biotinylationkit(prod#21455)进行蛋白标记；用封闭液稀释的生物素标记的ezh2蛋白样品反应液(终浓度1ug/ml) 与多肽微阵列芯片混合，4℃震荡孵育过夜，对照组用封闭液孵育；显色底物streptavidin-hrp孵育(highsensitivity streptavidin-hrp(prod#21133))，封闭液稀释(1:10000)后，用5ml孵育多肽微阵列芯片， 室温震荡2小时，洗涤芯片；ecl化学发光试剂于chempchemi数字成像仪可视化。
56.步骤四，芯片扫描及显色点数据分析，显色芯片使用chempchemi化学发光成像系统425nm扫描 成像，显色时长200s。成像图片使用totallab图像分析软件分析显色点光密度值，使用软件中“spot edgeaverage”算法，以每个显色点周边背景值为参照计算每个显色点的光密度值。
57.步骤五，生物活性多肽的合成，本项目内，合成的生物活性多肽共7条(氨基酸序列详列于表17)。 其中，每条生物活性多肽的左侧氨基端均添加了穿膜肽序列：ygrkkrrqrrr，以利于其通过细胞通 透膜，进入细胞内发挥作用。同时，每条生物活性多肽均使用fitc绿色荧光基团进行标定；合成顺序： 从每条生物活性多肽序列的羧基端到氨基端。
58.具体的，合成步骤如下：称取n当量树脂放入反应器，加入dcm(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽 掉dcm，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的diea，适量的dmf、dcm(适量是指以 可使树脂充分鼓动起来为宜)、diea(二异丙基乙胺)、dmf(二甲基甲酰胺)、dcm，氮气鼓泡反 应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用dmf、meoh洗净；往反应器中 加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量hbtu(1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐) 及diea，氮气鼓泡反应30min，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入 适量的脱帽液去除fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；依上步骤2)的方式依次加入 后续多肽序列中的氨基酸并进行反应修饰；将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往 烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％tfa，2％乙二硫醇，2％ 三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，离 心，清洗即可得到生物活性多肽序列的粗产物；
59.步骤六，生物活性多肽纯化、冻干，借助高效液相色谱方法将粗品提纯至要求纯度，纯化好的液体 放入冻干机中进行浓缩、冻干，最终获得淡黄色粉末即为生物活性多肽。
60.如图6所示，本发明实施例的kdm2b多肽微阵列设计、分析及基于kdm2b合成的生物活性多肽 方法包括以下步骤：
61.s601:kdm2b蛋白的多肽微阵列芯片设计信息
62.通过uniprot蛋白信息网站(https://www.uniprot.org/)查询获得人源kdm2b蛋白全长序列，根据 kdm2b蛋白的1336个氨基酸序列合成多肽芯片(详列于表12)，通过overlapping设计，即从第一个 氨基酸位点开始，以15个氨基酸序列长度做为一个观察窗，设计该阵列的第一条多肽，然后向后移位 5个氨基酸位点，以后面15个氨基酸序列长度作为为第二个观察窗，设计该阵列的第二条多肽，并以 此方法依次顺延，最终获得266条多肽，组成一个基于kdm2b蛋白为基础的多肽微阵列芯片。
63.s602：多肽阵列合成
64.活化过的基质芯片膜放置于全自动多肽芯片合成仪上，根据程序自动转移fmoc
(9-芴甲氧羰基)
‑ꢀ
氨基酸原料溶液到活化膜上的特定位置与膜进行反应；接着，膜按序浸入bsa蛋白封闭液i和ii中， 进行侧链封闭；然后，dmf(二甲基甲酰胺)洗膜移除氨基端的fmoc保护基团，而后再用乙醇干燥； 重复以上步骤，直至多肽阵列全部合成完毕。最后，用特定的有机试剂去除侧链保护基团，再用ch2cl2洗膜，乙醇洗涤后干燥，立即使用或-20℃保存。
65.s603：多肽阵列与重组蛋白免疫杂交结合反应
66.多肽微阵列芯片加入封闭液，室温震荡4小时；取ezh2蛋白样品反应液(浓度1.5mg/ml)，用 ez-link nhs-peo4-biotinylation kit(prod#21455)进行蛋白标记；使用5ml封闭液稀释的生物素标记的 ezh2蛋白样品反应液(终浓度1ug/ml)与多肽微阵列芯片4℃震荡过夜，对照组用封闭液孵育；使用 封闭液稀释(1:10000)显色底物streptavidin-hrp(high sensitivity streptavidin-hrp(prod#21133)) 后，使用5ml与多肽微阵列芯片室温震荡2小时；ecl化学发光试剂使其可视化。
67.s604：芯片扫描及显色点数据分析
68.芯片使用chempchemi化学发光成像系统425nm扫描成像，显色时长200s。成像图片使用totallab 图像分析软件分析显色点光密度值，使用软件中“spot edge average”算法，计算各点显色百分值。
69.s605：生物活性多肽的合成
70.本发明中，合成的生物活性多肽共7条(氨基酸序列详列于表17)。其中，每条生物活性多肽的 左侧氨基端均添加了穿膜肽序列：ygrkkrrqrrr，以利于其通过细胞通透膜，进入细胞内发挥作用。 同时，每条生物活性多肽均使用fitc绿色荧光基团进行标定；合成顺序：从每条生物活性多肽序列的 羧基端到氨基端。
71.具体的，合成步骤如下：称取n当量树脂放入反应器，加入dcm(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽 掉dcm，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的diea，适量的dmf、dcm(适量是指以 可使树脂充分鼓动起来为宜)、diea(二异丙基乙胺)、dmf(二甲基甲酰胺)、dcm，氮气鼓泡反 应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用dmf、meoh洗净；往反应器中 加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量hbtu(1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐) 及diea，氮气鼓泡反应30min，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入 适量的脱帽液去除fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；依上步骤2)的方式依次加入 后续多肽序列中的氨基酸并进行反应修饰；将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往 烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％tfa，2％乙二硫醇，2％ 三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，离 心，清洗即可得到生物活性多肽序列的粗产物；
72.s606：生物活性多肽纯化、冻干：
73.借助高效液相色谱方法将粗品提纯至要求纯度，纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩、冻干，最终 获得淡黄色粉末即为生物活性多肽。
74.s607：生物活性多肽的使用方法：
75.使用干细胞培养液(如本项目中使用的为含有15％胎牛血清、2mmol/l谷氨酰胺、100u/ml青霉 素和100ug/ml链霉素的α-mem基液)或细胞磷酸盐缓冲盐水按照10ug/ul的储
存浓度溶解即可，分 装后于-80℃保存，避免反复冻融。使用时按10ug/ml的工作浓度加入相应培养液体系(如本项目中使 用的干细胞培养液及成神经分化诱导液)，现用现配。
76.所述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
77.综上，本发明通过基于kdm2b合成的生物活性多肽来研究kdm2b及其生物活性多肽在根尖牙乳 头干细胞神经分化中的作用，以及在损伤神经组织再生修复中的作用。
78.本发明中附图对应的数据：
79.表1图1(a)的数据
[0080][0081]
表2图1(c)的数据
[0082][0083]
表3图2(a)的数据
[0084][0085]
表4图2(e)的数据
[0086]
[0087][0088]
表5图2(g)的数据
[0089][0090]
表6图2(h-k)的数据
[0091][0092]
表7图3(a)的数据
[0093][0094][0095]
表8图3(e)的数据
[0096][0097]
表9图3(f)的数据
[0098][0099]
表10图4(b)的数据
[0100][0101][0102]
表11图4(e)的数据
[0103][0104]
表12图6(b)的数据
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111][0112]
表13图7(c)的数据
[0113][0114]
表14图7(e)的数据
[0115]
[0116][0117]
表15图8(b)、(d)、(e)使用的原始数据
[0118][0119]
本发明提供的生物活性多肽的合成及应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0120]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0121]
实施例1细胞培养及体外神经分化诱导
[0122]
本发明所涉及的所有干细胞均遵守人类胚胎干细胞研究的行为指南，人体组织的利用得到首都医科 大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意，并术前签订知情同意书。简要说，75％酒精消毒牙齿后， 磷酸缓冲液继续清洗10次。使用无菌手术刀片小心分离牙齿根尖部牙乳头组织，无菌剪刀剪碎后，加 入3mg/ml的胶原蛋白酶i(worthington biochemical corp.,lakewood,nj)和4mg/ml的分散酶(rochediagnostics corp.,indianapolis,in)溶液各1ml，放入37℃震荡消化1小时。通过70-um的过滤器(bdbiosciences,san jose,ca,)得到单一细胞的悬浮液。接着，将这些细胞接种于低限量eagle培养基 (minimum eagle medium，mem)(invitrogen,carlsbad,ca)，加15％胎牛血
清、2mmol/l谷氨酰胺、100 u/ml青霉素和100mg/ml链霉素，置于5％co2和37℃的加湿保温箱中，每3天更换一次培养基。
[0123]
所有干细胞按照之前描述进行干细胞表面标志物鉴定，后续实验使用第3-5代干细胞。对于体外神 经分化诱导，使用神经干细胞优势培养基(neurobasal a液中添加2％b27、40ng/ml bfgf、20ng/ml egf、2mm l-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)诱导培养干细胞，每3天更换一次；
[0124]
对于类神经球形成观察，分化诱导9天时于倒置显微镜下观察；对于免疫荧光染色实验，收集诱 导9天时的类神经球，4％多聚甲醛固定，triton进行膜通透处理后基础白蛋白液封闭处理，特异一抗 液4℃孵育过夜，荧光标定种属二抗、细胞骨架染料pdi和细胞核染料dapi依次孵育后借助荧光激发 使可视化；主要针对特异一抗是抗β
ⅲ‑
tubulin、nestin多克隆抗体(abcam,cambridge,usa)。
[0125]
实施例2质粒构建和病毒感染
[0126]
质粒构建与病毒转染，按照标准方法进行质粒的构建，靶向kdm2b基因设计的目的互补shrna 序列被克隆进入到病毒载体plko.1质粒环中，测序鉴定，构建完成kdm2b shrna质粒；设计kdm2b 基因全长的pcr引物，扩增得到kdm2b的全长基因序列，添加ha-tag标签，将其连接到逆转录病 毒的表达载体pqcxin上，测序鉴定，构建得到含有ha-tag标签的全长kdm2b基因序列的质粒；然 后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱；病毒转染，10-7
滴度的逆转录病毒 或慢病毒在凝聚胺参与下与根尖牙乳头干细胞培养过夜，48小时后抗生素筛选被转染的细胞；靶向 kdm2b基因设计的目的互补shrna序列是，kdm2bsh：5
’‑
atttgacgggtggataatctg-3’。
[0127]
实施例3总rna分离、逆转录(rt)pcr和实时荧光定量逆转录pcr
[0128]
来源于不同个体的根尖乳头干细胞的三组总rna样本通过使用抽提试剂和rna抽提试剂盒 (qiagen，gmbh，germany)提取、纯化后，溶解于rnase-free water(qiagen)。总rna通过分光光 度仪nd-2100(赛默飞世尔)定量，使用安捷伦2100(安捷伦科技)评估rna完整性。对于mrna检测， 依据生产厂家的标准(英杰)，使用随机引物试剂盒(qiagen)逆转录合成等量cdna样本。使用荧光pcr (qiagen)和icycleriq多色实时荧光定量pcr技术检测系统进行实时pcr反应。引物设计使用在线引 物3程序(引物序列详列于表18)，gapdh作为内部控制，相对mrna水平通过使用2-δδct
方法计算。
[0129]
实施例4免疫共沉淀反应及蛋白质印迹分析
[0130]
来源于不同个体的根尖乳头干细胞的三组总蛋白样本使用ripa裂解液溶解提取。对于免疫共沉淀 反应，等质量总蛋白样本与特异一抗免疫球蛋白a/g珠子4℃孵育过夜，三乙醇胺缓冲盐水溶液(tbs) 清洗后，99℃煮沸变性，进行蛋白质印迹分析或-80℃备用；
[0131]
对于蛋白质印迹分析，等质量总蛋白样本用10％sds聚丙烯酰胺凝胶分离并利用半干转移膜装置 转移到聚乙二烯二氟化物(pvdf)中，膜上涂抹5％脱脂牛奶放置2h，然后用一抗孵育一夜；免疫复合 物与兔或小鼠免疫球蛋白g抗体一同孵育并用化学发光底物试剂使其可视化；主要针对特异性一抗是 抗kdm2b、ezh2多克隆抗体(abcam)。
[0132]
实施例5大鼠脊髓神经损伤模型及根尖牙乳头干细胞回植
[0133]
本发明通过首都医科大学附属北京口腔医院动物关怀和使用委员会允许；将约1
×
106个根尖牙乳头 干细胞移植到一只10周龄大鼠脊椎t10部脊髓组织全切断位点。特别
的，通过微注射体系(共30ul) 于全切断位点的正中、左侧和右侧分别向中线方向进针，每位点分别缓慢注射10ul。主要针对的，对 照vector组和kdm2b过表达组根尖牙乳头干细胞是分别进行5只大鼠的回植，这些程序依照动物协 议批准规范进行；分别于移植后0周、1周、2周和3周对大鼠进行bbb后肢运动能力评分；
[0134]
对于组织病理学分析，三周后获取移植部脊髓组织用10％福尔马林固定，石蜡包埋，5um切片， 苏木精-伊红染色(he)染色；免疫组织化学染色，5um切片脱蜡脱水，去除内源过氧化物酶封闭后， 特异性一抗液4℃孵育过夜，生物素-辣根过氧化物酶依次孵育后，借助3，3-二氨基联苯胺(dab)底 物显色使其可视化；主要针对特异性一抗是抗β
ⅲ‑
tubulin、nef-m多克隆抗体(abcam)。
[0135]
实施例6多肽微阵列芯片设计及分析
[0136]
通过uniprot蛋白信息网站(https://www.uniprot.org/)查询获得人源kdm2b蛋白全长序列，kdm2b 全长氨基酸序列通过overlapping设计合成多肽芯片；借助全自动多肽芯片合成仪合成多肽阵列，封闭 后与生物素标记目标蛋白孵育杂交，化学显色底物可视化，chempchemi数字成像仪成像；显色芯片图 片使用totallab图像分析软件分析显色点光密度值，特别的，阳性显色多肽位点以该显色点周边背景 值为参照计算，设置膜上显色点光密度值最高的值为100％，其余各点光密度值为该点光密度值的百分 比数值，选择多肽芯片膜上点光密度值超过30％且阴性反应膜上点光密度值低于30％的为阳性显色点。
[0137]
进一步，kdm2b多肽微阵列膜上多肽点示意图和考马斯染色图，如图9所示：
[0138]
如图9左侧图所示，阵列中多肽共18列15行，编号由左至右，由上至下依次增大，共由266个多 肽点即266条肽组成，按照此芯片示意图合成1个拷贝的多肽微阵列芯片，每条多肽序列详列于表12。 图9右侧图像为芯片完成后考马斯染色图像。
[0139]
进一步，kdm2b多肽微阵列膜与ezh2蛋白杂交反应；
[0140]
杂交实验使用nhs-peo4-biotinylation标记的ezh2蛋白液(1ug/ml)进行多肽芯片杂交反应，使 用streptavidin-hrp进行放大反应，反应步骤及条件如前所述，显色5min(结果如图6a所示)，由图 可以看出，标记蛋白和芯片上某些多肽点有明显的结合并显色。
[0141]
进一步，kdm2b多肽微阵列膜阳性显色反应点分析；
[0142]
使用totallab软件图片显色点光密度数据分析(各点光密度值原始数据见附件excel表格)，设置 膜上显色点光密度值最高的值为100％，其余各点光密度值为该点光密度值的百分比数值，检测获得的 阳性显色位点的灰度值表(结果如图6b显示)。该表中，横坐标为多肽点编号亦即对应阵列的266条 多肽，纵坐标为个点光密度值百分比。根据经验，选择多肽芯片膜上点光密度值超过30％且阴性反应 膜上点光密度值低于30％的为阳性显色点，则以下序列有明显差异(表16)：
[0143]
表16 kdm2b多肽微阵列芯片与ezh2蛋白免疫杂交显色阳性位点的多肽段
[0144]
芯片肽段序号序列编号氨基酸序列5seq id no.5aekqkkktviytkcf46seq id no.46vkkyclmsvkgcftd47seq id no.47lmsvkgcftdfhidf122seq id no.122arrrrtrcrkceacl123seq id no.123trcrkceaclrtecg
46-47预处理组大鼠后肢运动能力显著提高(图8b)。
[0155]
进一步，我们借助微注射体系以每周注射一次的频率将30ul的10ug/ml peptide 46-47单独注射到 10周龄大鼠t10脊椎部脊髓组织全切断位点(每组5只独立大鼠个体)。4周后，相较于单独注射对 照conpp组，脊髓组织大体观显示单独注射10ug/ml peptide 46-47组损伤神经组织愈合显著(图8c)； bbb行为学评分结果表明单独注射10ug/ml peptide 46-47组大鼠后肢运动能力显著提高(图8d)。
[0156]
进一步，我们联合分析了对照conpp预处理干细胞回植组、10ug/ml peptide 46-47预处理干细胞回 植组和单独注射10ug/ml peptide 46-47组的大鼠bbb行为学评分，结果显示干预第4周时10ug/ml peptide46-47预处理干细胞回植组和单独注射10ug/ml peptide 46-47组大鼠后肢运动能力均显著提高，两组间 无明显差别(图8e)。
[0157]
表18、进行实时定量pcr试验的引物
[0158][0159][0160]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离 本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。