一种方酸菁染料及其制备方法与应用与流程

一种方酸菁染料及其制备方法与应用
(一)技术领域
1.本发明属于方酸菁染料技术领域，尤其涉及一种方酸菁染料及其制备方法和在肿瘤光声、荧光成像，光热治疗中的应用。
(二)

背景技术：

2.肿瘤的精准检测、诊断和切除有赖于精准的成像系统，相比较于辐射成像、超声成像、磁共振成像等传统的生物成像技术相比，荧光成像与光声成像在诊断与引导手术切除中因其高灵敏度和高特异性、低成本、无创性和更好的生物安全性等优点展现出巨大的应用潜力。很多荧光材料也已被广泛的应用于荧光成像研究中，但大多数表现为可见光以及近红外一区(nir-i,750-900nm)发射，其在进入生物组织时会被不同程度地吸收和散射而衰减，从而降低成像深度和对比度。近红外二区(nir-ii)由于发射波长(1000-1700nm)更长，生物组织的穿透性更强，探测深度更深、空间分辨率更高等优点而成为生物医学研究的热点方向。目前已有的一些无机材料如稀土下转换纳米颗粒，碳纳米管，量子点等能够实现近红外二区发射，但是它们的发射波长大多位于近红外一区，且重金属生物安全性能差，进入活体后代谢缓慢等缺点限制了它们的应用。相对于无机材料，有机方酸类荧光染料相对分子量较小，易于代谢，有更好的生物相容性和稳定性，更容易被修饰，同时也可以实现近红外第二窗口区的发射。
3.光声成像技术是一种新兴的无损非侵入性成像模式，其基本原理是局部组织吸收特定波长的光能转化为热能，发生热弹性膨胀，形成宽带的超声波信号被探头接收，从而实现组织的功能性和结构性成像。光声成像技术作为一种复合成像技术，同时具备了光学成像的高灵敏度和声学成像的高穿透性和分辨率的特点，在生物医学临床诊断，特别是在活体组织结构和功能成像方面具有广泛的应用前景。为了克服光的散射效应，提高光声信噪比，增强光声成像技术的成像质量，除了选择合适的波长区域作为工作区域外，利用外源性光声造影剂是另一种行之有效的方法。使用外源性近红外造影剂，由于发射波长长，能够提高光声成像的穿透深度，提高最大允许辐照能量，降低背景信号，改变局部组织的光学和声学性能，提高成像的对比度和分辨率，从而显著增强光声成像的成像效果。
4.理想的光声成像造影剂依赖良好的光热转换效率，在将光能转换为热能达到成像目的同时，也能将热能用于肿瘤的光热治疗。光热治疗将光能转换为热能消融肿瘤作为治疗肿瘤的一种非侵入性手段，具有高破坏力，高选择性，低毒性，副作用少，耐药性可忽略不计等特点。近红外激发光热治疗体系穿透性强，可实现更深层次的肿瘤消融，且最大允许辐照能量更大，肿瘤消融效果更强。
5.因此，本发明试图开发在近红外区域具有吸收的方酸菁染料，其能够实现荧光成像技术、光声成像技术与光热治疗的结合，不仅可以实现成像技术之间的优势互补，为疾病的诊断提供更加丰富的生物学信息，同时实现了诊断与治疗的目的，并且避免了多次注射不同造影剂所带来的风险与负担，具有广阔的应用前景。
(三)

技术实现要素：

6.本发明目的是提供一种方酸菁染料及其制备与在制备肿瘤制剂中的应用，除了能用于肿瘤光声、荧光成像，在近红外光的激发下显示出肿瘤组织边界，为肿瘤的完整切除提供一种较为客观的参考外，还可用于肿瘤的光热治疗，有效地消融肿瘤组织。
7.本发明采用的技术方案是：
8.本发明提供一种式(i)所示方酸菁染料：
[0009][0010]
本发明还提供一种所述方酸菁染料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]
(1)式b所示化合物的合成：
[0012][0013]
将化合物a溶于无水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，在催化剂的作用下，加入碘代正丁烷，室温搅拌2h后，反应物用氯化钠饱和水洗涤后，再用体积比1:1的乙酸乙酯和水进行萃取，取乙酸乙酯层旋转蒸发去除溶剂后，得到粗产物；粗产物用乙酸乙酯溶解后上样硅胶层析柱，以乙酸乙酯为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度为1ml/min，洗脱量为5-7个柱体积，以乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂(体积比为4:1)为展开剂进行薄层层析监测，收集rf值为0.4-0.6的组分，真空旋转蒸干乙酸乙酯后，得到化合物b；所述催化剂为氢化钠；
[0014]
(2)中间体c的合成：
[0015][0016]
将化合物b溶于无水四氢呋喃(thf)后，冰水浴和氮气保护条件下加入格氏试剂甲基氯化镁(ch3mgcl)后，50-60℃反应2h，待冷却到室温后，加入高氯酸淬灭后，加水沉淀，真空冷冻干燥(优选-40℃)，得到中间体c；
[0017]
(3)式(i)所示目标产物的合成：
[0018][0019]
将中间体c与方酸(3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮)溶于正丁醇和甲苯中，加热到110-120℃进行回流反应，反应液旋转蒸发去除溶剂后，浓缩物用二氯甲烷溶解后上样硅胶层析柱，以二氯甲烷为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度为1ml/min，洗脱量为6-8个柱体积，以二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比为10:1)为展开剂进行薄层层析监测，收集rf值为0.2-0.4的组分，旋转蒸干二氯甲烷后，得到式(i)所示方酸菁染料，记为sq890。
[0020]
进一步，步骤(1)中化合物a与催化剂质量比为1:0.1-1.0，优选1:0.4；所述无水n，n-二甲基甲酰胺体积用量以化合物a质量计为10-30ml/g，优选19.5ml/g；所述化合物a与碘代正丁烷质量比为1:1-5，优选1:1.67。
[0021]
进一步，步骤(2)中，无水四氢呋喃(thf)体积用量以化合物b质量计为5-20ml/g，优选10ml/g；甲基氯化镁(ch3mgcl)体积用量以化合物b质量计为1-10ml/g，优选5ml/g；高氯酸体积用量以化合物b质量计为1-10ml/g，优选2ml/g。
[0022]
进一步，步骤(3)中，中间体c与方酸质量比为1:0.1-1.0，优选1:0.26；所述正丁醇体积用量以中间体c质量计为100-200ml/g，优选148ml/g；所述正丁醇与甲苯体积比1：1。
[0023]
本发明还提供一种式(i)所示方酸菁染料在制备肿瘤成像试剂中的应用，用于肿瘤检测的光声成像或荧光成像。
[0024]
本发明还提供一种式(i)所示方酸菁染料在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用，所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、口腔癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、结直肠癌细胞、膀胱癌细胞和前列腺癌细胞等实体瘤细胞。更具体为乳腺癌细胞4t1、人舌鳞癌细胞cal27、人舌鳞癌细胞um1。
[0025]
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0026]
本发明提供一种对称方酸菁染料，通过引入给电子基团扩大体系的π共轭程度，并具有供体-受体-供体结构，形成稳定两性离子的刚性共振平面结构，有效调控菁染料的吸收和发射波长，将其红移到更长波长的近红外区域。该化合物制备方法简单，反应位点明显，易于控制反应进程。
[0027]
本发明提供的方酸菁染料，在近红外区具有良好的吸收性能，能用于肿瘤检测的光声成像。
[0028]
本发明提供的方酸菁染料，具有良好的荧光量子产率，能用于肿瘤检测的荧光成像。
[0029]
本发明提供的方酸菁染料，具有良好的光热转换效率，能用于肿瘤治疗的光热治疗。
(四)附图说明
[0030]
图1为实施例2制得的方酸菁染料(sq890)的核磁氢谱。
[0031]
图2为实施例2制得的方酸菁染料(sq890)的核磁碳谱。
[0032]
图3为实施例3中方酸菁染料的紫外可见吸收光谱。
[0033]
图4为实施例3中方酸菁染料的荧光发射图谱。
[0034]
图5为实施例3中方酸菁染料的光声信号图谱。
[0035]
图6为实施例4中方酸染料的光热升温效果图。
[0036]
图7为实施例5中方酸染料对癌细胞存活率图谱。
(五)具体实施方式
[0037]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0038]
本发明所述室温为25-30℃。
[0039]
实施例1、中间体c的合成
[0040][0041]
(1)将化合物a(2.56g)投入到含有50ml dmf的圆底烧瓶中，待完全溶解后，在冰水浴条件下加入氢化钠(1.09g)，室温搅拌5分钟后，加入碘代正丁烷(4.27g)，室温搅拌2h后，反应物用氯化钠饱和水(2
×
50ml)洗涤后，再用乙酸乙酯和水(体积比为1:1)进行萃取，取乙酸乙酯层旋转蒸发去除溶剂后，得到粗产物；粗产物用1ml乙酸乙酯溶解后全部作为硅胶柱层析上样液。将100～200目柱层析硅胶50g和50ml乙酸乙酯充填层析柱(3cm
×
30cm)，释放乙酸乙酯后，沿管壁缓慢上样，以乙酸乙酯为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度为1ml/min，洗脱6个柱体积，以乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂(体积比为4:1)为展开剂进行薄层层析监测，收集rf值为0.4-0.6的组分，真空旋转蒸干乙酸乙酯后，得到化合物b1.41g。
[0042]
化合物b的核磁数据：1h nmr(400mhz,dmso)δ8.10(d,j＝8.0hz,1h),8.00(d,j＝8.0hz,1h),7.74(t,j＝8hz,1h),7.56(d,j＝8hz,1h),7.48(t,j＝8hz,1h),7.08(t,j＝8.0hz,1h),3.82(t,j＝8hz,2h),1.66-1.58(m,2h),1.32-1.23(m,2h),0.84(t,j＝8hz,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso)δ167.25,139.33,131.27,129.22,129.05,126.33,124.63,124.25,120.28,105.87,40.16,39.95,39.74,39.62,30.68,19.93,13.91.
[0043]
(2)将化合物b(300mg)投入含有3ml无水thf的圆底烧瓶中，于冰水浴和氮气保护条件下加入甲基氯化镁(1.5ml)，室温反应30分钟后，转移到60℃水浴条件下反应2h，冰水浴冷却到0℃后，加入高氯酸(0.6ml)淬灭后，加水(50ml)沉淀后水洗(7
×
50ml)，-40℃冷冻真空干燥后，得到中间体c 280mg。
[0044]
化合物c的核磁数据：
[0045]1h nmr(400mhz,dmso)8.95(d,j＝8hz,1h),8.77(d,j＝8hz,1h),8.51(d,j＝4hz,
1h),8.43(d,j＝8hz,1h),8.15(t,j＝8hz,1h),7.99(d,j＝8hz,1h),4.66(t,j＝8hz,2h),3.24(s,3h),1.92(d,j＝8hz,2h),1.46(t,j＝8hz,2h),0.95(t,j＝8hz,3h).
[0046]
实施例2、方酸菁染料sq890的合成。
[0047][0048]
将实施例1方法制备的中间体c(27mg)与方酸(7mg)投入到含有正丁醇(4ml)和甲苯(4ml)的圆底烧瓶中，110℃加热回流反应1h，反应液旋转蒸发去除溶剂后，浓缩物用1ml二氯甲烷溶解后全部作为硅胶柱层析的上样液。以100～200目柱层析硅胶50g和50ml二氯甲烷充填层析柱(3cm
×
30cm)，释放二氯甲烷后沿管壁缓慢上样，以二氯甲烷为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度为1ml/min，洗脱量为7个柱体积，以二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比为10:1)为展开剂进行薄层层析监测，收集rf值为0.2-0.4的组分，旋转蒸干二氯甲烷后，得到式(i)所示方酸菁染料(记为sq890)5.9mg。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。
[0049]
sq890的核磁数据：
[0050]1h nmr(400mhz,dmso)δ9.05(d,j＝4hz,2h),8.13(d,j＝4hz,2h),7.88(t,j＝8hz,2h),7.69(d,j＝8hz,2h),7.62(t,j＝8hz,2h),7.48(d,j＝8hz,2h),6.29(s,2h),4.34(t,j＝4hz,4h),1.80(t,j＝4hz,4h),1.47-1.41(m,4h),0.95(t,j＝8hz,6h).
[0051]
13
c nmr(101mhz,dmso)δ182.10,176.72,149.96,141.58,130.23,130.15,129.84,129.67,129.49,124.88,121.98,108.97,92.23,43.54,30.88,20.11,14.13.
[0052]
实施例3、方酸菁染料吸收光谱和发射光谱检测
[0053]
紫外可见吸收光谱测试：采用紫外可见光分光光度计(uv-5500pc，上海元析仪器有限公司)对实施例2方法制备的方酸菁染料sq890进行紫外可见吸收光谱检测：取300μl浓度为0.15mg/ml的sq890 dmf溶液置于石英比色皿中，以dmf置零做基线，选择650nm～1100nm波长范围进行光谱扫描，结果见图3所示，sq890在750nm～950nm之间具有强吸收。
[0054]
荧光发射光谱测试：采用荧光分光光度计(perkinelmer lambda 750)对实施例2方法制备的方酸菁染料sq890进行荧光发射光谱检测：取3ml浓度为10μm的sq890dmf溶液，选择800nm～1550nm波长范围进行光谱扫描，结果见图4所示，sq890在800nm～1400nm之间具有宽发射。
[0055]
光声信号测试：采用光声成像仪(vevo lazr，fujifilm visualsonics)对实施例2方法制备的方酸菁染料sq890进行光声信号检测：用680nm～970nm的激发光，检测不同浓度(1000μm、500μm、250μm、120μm、60μm)的sq890 dmf溶液的光声图谱，结果见图5所示，sq890在750nm～950nm具有强光声信号。
[0056]
结果表明sq890的吸收光谱和发射光谱都处于近红外区，发射光谱延伸到了近红外二区，且具有强的光声信号。
[0057]
实施例4、方酸菁染料sq890的光热升温效果
[0058]
将实施例2方法制备的方酸菁染料sq890溶于二甲基亚砜中，配置成不同浓度(5μm、10μm、20μm、40μm)溶液，用808nm激光持续照射480s，用红外相机记录各浓度sq890溶液的温度变化情况。结果如图6所示，随着浓度的升高，sq890升温效果增加，在浓度为40μm时，808nm激光照射480s后温度升高到了60℃，展现出了良好的光热转换效率。
[0059]
实施例5、方酸菁染料sq890的抗4t1肿瘤细胞增殖活性
[0060]
本实施例验证本方酸菁染料对肿瘤细胞的光热治疗效果。
[0061]
1、将实施例2方法制备的方酸菁染料sq890用薄膜分散法制成纳米制剂以提高生物利用度及生物安全性，具体操作为：将2mg的sq890和10mg的dspe-mpeg5000(二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇5000)共同溶解于二氯甲烷(2ml)中，将二氯甲烷挥发干，使样品均匀铺散在玻璃瓶表面。随后加入蒸馏水(1ml)并在40khz下超声处理2分钟，得到纳米粒10mg，粒径140nm，记为sq890 nps。
[0062]
2、用mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)法评估sq890 nps对乳腺癌细胞4t1代谢活性，具体步骤如下：
[0063]
将乳腺癌细胞4t1(购自湖南丰晖生物科技有限公司)接种至rpmi 1640完全培养基，置于培养箱(37℃，5％co2)孵育，培养3代后，取对数生长期的细胞接种在96孔板中，密度为5
×
103细胞/孔，孵育过夜，使细胞充分贴壁。吸弃旧的培养基，分为实验组(sq890 nps l)和空白对照组(sq890 nps)，每组设置3个平行(计算误差)。实验组(sq890 nps l)加入100μl含不同浓度(2.5μm、5μm、10μm、20μm、40μm)的sq890 nps的rpmi 1640完全培养基，空白对照组(sq890 nps)添加100μl的rpmi 1640完全培养基。继续培养4小时后，实验组分别给予1w/cm2的808nm激光照射5min，空白对照组无光照处理。照射后继续孵育24h后，采用酶标仪(thermo scientific
tm multiskan
tm fc)检测各组在490nm处吸光值，通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对肿瘤细胞存活率的影响。结果如图7所示。从结果中可以看到，方酸菁染料显示出剂量依赖的光细胞毒性，细胞存活率在照明条件下随着染料的浓度增加而降低，这表明它们在这些条件下具有高的细胞杀伤效率。同时，发现这些染料在黑暗中细胞存活率高，这表明它们在没有光存在的情况下是无毒性的。这些结果展示了此方酸菁染料在光热治疗中的应用前景。