核酸分子、载体、细胞和引物及其应用以及基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法与流程

1.本发明属于植物分子生物学和农业生物技术领域，具体涉及一种核酸分子，一种重组载体，一种转基因细胞，所述核酸分子、所述重组载体或所述转基因细胞的应用，一种引物，一种培育转基因植物的方法，一种鉴定所述转基因植物的方法，一种基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，以及一种筛选无融合生殖系的方法。


背景技术：

2.一个完整的植株包括孢子体世代(2n)，它具有特定的生殖结构(花器官)，其中的雌蕊、雄蕊经过减数分裂和遗传重组，分别产生大孢子(1n)和小孢子(1n)；大、小孢子经过几次有丝分裂形成雌、雄配子体，雌配子体(胚囊)含有7个细胞(1个卵细胞、2个助细胞、1个具2核的中央细胞、3个反足细胞)并深埋于母体的胚珠组织中，雄配子体(花粉)含有1个营养细胞和2个精子；传粉后，花粉管进入胚囊，发生双受精作用，其中一个精子(雄配子)和卵细胞(雌配子)结合形成合子胚(2n)，另一个精子和中央细胞结合形成胚乳(3n)，由此完成一个生活周期，并开始新一轮孢子体世代。
3.无融合生殖是植物在由孢子体产生配子体的过程中不经过精卵细胞融合而产生胚和种子的生殖方式。包括单倍体无融合生殖和二倍体无融合生殖两种基本类型。二倍体无融合生殖由于能产生与母体植株基因型完全相同的后代，能固定任何优良的基因型，所以，特别受育种家们的重视，研究者们通常所指的无融合生殖育种也主要是专指这一类型，它包括：不定胚(adventive embryony)生殖，无孢子生殖(apospory)和二倍体孢子生殖(diplospory)。
4.近年来植物生物技术飞速发展，通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中取得了很好的应用前景。近期通过分子生物学以及基因工程的手段在无融合生殖研究领域取得了重要进展。2018年底，美国加州大学戴维斯分校venkatesan sundaresan教授团队发表的水稻无融合生殖体系；通过编辑pair1、rec8、osd1(mime)三个基因，结合卵细胞中异位表达 bbm1(synthetic-apomictic)，实现了水稻的无融合生殖。但是该无融合生殖体系中克隆种子的比率只达到29％，远低于生产上的纯度要求，且克隆种子和正常授粉受精而成的种子无法进行分选。以至于还无法实现杂交种无融合生殖体系的应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决上述背景技术中的不足，提供一种核酸分子，一种重组载体，一种转基因细胞，所述核酸分子、所述重组载体或所述转基因细胞的应用，一种引物，一种培育转基因植物的方法，一种鉴定所述转基因植物的方法，一种基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，以及一种筛选无融合生殖系的方法。本发明提供的方法基于双重调控能够提高克隆种子的高纯度分选，解决现有杂种优势固定分选技术不能获得纯度要求
的克隆种子的问题，从而实现杂交种无融合体系应用的方法。
6.为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包含表达盒e1，所述表达盒e1携带有筛选标记基因和花粉致死基因，所述表达盒e1经表达能够获得带有筛选标记的活性花粉，同时使得不带有筛选标记的花粉失活。
7.优选的，所述表达盒e1自上游至下游包括如下元件：胚特异表达启动子、第一调控位点、第一终止子、花粉特异表达启动子、花粉致死基因、第二终止子、第二调控位点、筛选标记基因和第三终止子；
8.其中，所述第一调控位点和第二调控位点的设置使得能够被酶识别，并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件。
9.优选的，该核酸分子还包含表达盒e2，所述表达盒e2自上游至下游包括如下元件：花粉特异表达启动子、调控基因和第四终止子，该调控基因能够识别所述第一调控位点和第二调控位点并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件。
10.优选的，该核酸分子还包含表达盒e3，所述表达盒e3自上游至下游包括如下元件：卵细胞特异启动子、胚自主发生基因和第五终止子。
11.优选的，该核酸分子还包含表达盒e4，所述表达盒e4携带有产生mime突变体的元件，以促使有丝分裂替代减数分裂。
12.第二方面，本发明提供了一种重组载体，该重组载体包括如上所述的核酸分子。
13.优选的，所述重组载体包括含有连锁表达盒的核酸分子，所述连锁表达盒包含所述表达盒e1、表达盒e2和表达盒e3。
14.优选的，所述重组载体包括含有所述连锁表达盒和表达盒e4的核酸分子。
15.第三方面，本发明提供一种转基因细胞，该转基因细胞含有如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体。
16.第四方面，本发明提供了如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体，或者如上所述的转基因细胞的应用，其中，所述应用包括如下(a1)-(a4)中的至少一种：
17.(a1)孤雌生殖克隆种子的筛选；
18.(a2)制备无融合生殖系；
19.(a3)一系法育种；
20.(a4)固定植物杂种优势。
21.第五方面，本发明提供了一种引物，该引物能够对如上所述的核酸分子的全长或任意片段进行特异性扩增。
22.第六方面，本发明提供了一种培育转基因植物的方法，该方法包括：将如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体导入植物，得到转基因植物；
23.优选的，该方法包括：将如上所述的含有表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4的核酸分子，或者如上所述的含有所述连锁表达盒和表达盒e4的核酸分子的重组载体导入植物，得到转基因植物。
24.第七方面，本发明提供了一种鉴定如上所述的转基因植物的方法，该方法包括如下至少一种方法：
25.(1)利用如上所述的引物对所述转基因植物或其部分进行特异性扩增；
26.(2)通过对所述筛选标记进行观察；
27.(3)通过荧光定量分选；
28.(4)通过探针杂交检测。
29.第八方面，本发明提供了一种基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，该方法包括如下步骤：
30.a、将如上所述的含有表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4的核酸分子，或者如上所述的含有所述连锁表达盒和表达盒e4的核酸分子的重组载体导入植物，得到转基因植物；
31.b、将步骤a中获得的转基因植物自交，获得带有筛选标记的合子胚种子和不带有筛选标记的无性胚种子；
32.c、通过筛选标记对所述合子胚种子和无性胚种子进行分选，从而获得高纯度的无性胚种子作为克隆种子。
33.第九方面，本发明提供了一种筛选无融合生殖系的方法，该方法包括：
34.a、将如上所述的含有表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4的核酸分子，或者如上所述的含有所述连锁表达盒和表达盒e4的核酸分子的重组载体导入植物，得到转基因植物；
35.b、将步骤a中获得的转基因植物自交，检测其是否满足以下条件：(a1)具有mime突变，有丝分裂替代减数分裂；(a2)产生无性胚种子和合子胚种子两种种子；(a3)合子胚种子胚中携带有表达盒 e1中的筛选标记基因，且表达盒e1中的花粉致死基因保证合子胚种子携带表达盒e1中的筛选标记基因；(a4)无性胚种子的胚中不带有筛选标记基因；
36.c、筛选同时满足步骤b中条件的转基因植物作为无融合生殖系。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
38.本发明取得的有益效果在于利用双重调控使克隆种子的筛选效率大大提高，例如，可达到100％，具体的，通过控制表达盒e1的表达，可获得带有筛选标记的活性花粉，同时使得不带有筛选标记的花粉失活，因此，通过筛选标记基因和花粉致死基因的双重调控可使得活性花粉中携带有筛选标记基因，进而导致由此花粉授粉受精产生的合子胚种子携带有筛选标记，有助于筛选。当将其用于克隆种子的分选时，可解决现有杂种优势固定分选技术不能获得纯度要求的克隆种子的问题，从而实现杂交种无融合体系应用的方法。因此，本发明能在杂种后代中高效分选出固定了杂种优势的种子，并达到杂种优势利用一系法的产业化要求。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
39.优选的，本发明将4个基因表达盒同时转入杂交植物，4个基因表达盒包括：1)受表达盒e2 调控的筛选标记基因表达盒e1，其携带有花粉致死基因；2)花粉特异性调控的表达盒e2；3)胚自主发生基因表达盒e3；4)创制mime突变体的基因编辑表达盒e4。其中，e1和e2可构成一个基因开关系统，e2中携带的调控基因表达，删除表达盒e1中的第一调控位点和第二调控位点之间的基因元件，进而在胚特异表达启动子下调控筛选标记基因的表达，使授粉受精产生的合子胚带有筛选标记。若e2调控e1的效率(第一和第二调控位点的识别效率和/或其之间的元件切除效率)达不到预期，例如，100％，则表达盒e1中识别位点之间的花粉特异启动子驱动致死基因表达从而使花粉失活而无法受精产生合子胚。所述表达盒e3的表达使卵细胞在卵细胞特异启动子驱动胚自主发生基因表达的作用下，进行孤雌生殖得到不带有筛选标记的无性胚，在表达盒e4产生mime突变体的条件下，无性胚进一步可发育
成克隆种子，也即无性胚种子。合子胚种子和无性胚种子可以通过筛选标记进行分选且分选效率较高，可达100％。
附图说明
40.图1为本发明提供的一种具体的含有表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4的重组载体p68c。
具体实施方式
41.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
42.第一方面，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包含表达盒e1，所述表达盒e1携带有筛选标记基因和花粉致死基因，所述表达盒e1经表达能够获得带有筛选标记的活性花粉，同时使得不带有筛选标记的花粉失活。
43.由以上可以看出，所述核酸分子的设置需要使得表达盒e1经表达能够获得带有筛选标记的活性花粉，同时使得不带有筛选标记的花粉失活。能够理解的是，当所述筛选标记不能够成功表达或是虽然成功表达但无法发挥预期的作用时，花粉致死基因启动表达，使得这部分花粉失活，从而导致这种花粉不参与受精。因此，本发明通过双重调控，能够获得纯度较高，例如，90％以上，可以为90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的带有筛选标记的活性花粉，当该花粉完成受精后形成的带有筛选标记的合子胚种子纯度较高，例如，90％以上，可以为90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
44.此处需要说明的是，“不带有筛选标记的花粉”是指花粉中不含有筛选标记或者是虽然含有筛选标记但无法发挥其预期的作用。
45.在本发明的构思下，本领域技术人员根据本领域的常识和常规技术手段通过对表达盒e1的设置能够使得所述筛选标记基因和花粉致死基因按照预期的方向表达。为了进一步提高所得活性花粉中带有筛选标记的活性花粉的纯度，根据本发明一种优选的实施方式，所述表达盒e1自上游至下游包括如下元件：第一启动子、第一调控位点、第一终止子、第二启动子、花粉致死基因、第二终止子、第二调控位点、筛选标记基因和第三终止子，更优选的，所述表达盒e1自上游至下游包括如下元件：胚特异表达启动子、第一调控位点、第一终止子、花粉特异表达启动子、花粉致死基因、第二终止子、第二调控位点、筛选标记基因和第三终止子；
46.其中，所述第一调控位点和第二调控位点的设置使得能够被酶识别，并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件。
47.因此，在该优选的实施方式下，所述第一调控位点和第二调控位点被酶识别，并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件，剩下胚特异表达启动子、筛选标记基因和第三终止子，筛选标记基因得以表达；当第一调控位点和第二调控位点未能被有效调控(例如，第一调控位点和第二调控位点中的任意一个无法成功被酶识别时，或者是识别有误时)
时，e1的元件不变，表达盒e1中的花粉特异启动子驱动致死基因表达，从而使花粉失活而无法受精产生合子胚，由此保证了合子胚高比例甚至全部都(例如，可以为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)携带 e1中的筛选标记。
48.根据本发明，所述酶可以为该核酸分子所在的宿主细胞自身所表达的酶，也可以为转化入宿主细胞中的其他核酸分子或载体所表达的酶，还可以为以任意的其他方式所引入的发挥该作用的酶，本发明对此并没有特别的限制。
49.根据本发明，所述胚特异表达启动子可以包括但不限于osesp1、ole18、osvp1p和zmesp，优选为osesp1启动子，其序列优选如seq id no.2所示(seq id no.1的1bp-1439bp)。
50.根据本发明，所述酶的选择与第一调控位点和第二调控位点的序列相适应，也即，第一调控位点和第二调控位点能够被所述酶识别，并将其间的基因元件切除。
51.根据本发明，所述第一调控位点可以选自但不限于重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点；优选的，所述第一调控位点为重组酶识别位点，更优选为loxp/frt融合位点，或者自上游至下游为重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点，更优选为loxp/frt融合位点和双链断裂诱导酶i-scei 位点；进一步优选的，所述loxp/frt融合位点的序列如seq id no.3(1、seq id no.1序列 1440bp-1525bp和6522bp-6607bp)所示；和/或，所述双链断裂诱导酶的序列如seq id no.4(seq idno.1序列1526bp-1543bp和6504bp-6521bp)所示。
52.根据本发明，所述第一终止子可以包括但不限于nos终止子，所述nos终止子的序列优选如seqid no.5(seq id no.1序列1544bp-1821bp和7298bp-7575bp)所示。
53.根据本发明，所述第二调控位点可以选自但不限于重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点；优选的，所述第二调控位点为重组酶识别位点，更优选为loxp/frt融合位点，或者所述第二调控位点自上游至下游为双链断裂诱导酶识别位点和重组酶识别位点，更优选为双链断裂诱导酶i-scei位点和loxp/frt融合位点；进一步优选的，所述loxp/frt融合位点的序列如seq id no.3所示；和/ 或，所述双链断裂诱导酶如seq id no.4所示。
54.根据本发明，所述花粉特异表达启动子可以包括但不限于pg47；所述pg47启动子的序列优选如seq id no.6(seq id no.1序列1822bp-4593bp)或seq id no.23(seq id no.10序列1bp-2771bp) 所示。
55.根据本发明，所述花粉致死基因可以选自但不限于zmaa1和barnase，优选为zmaa1，更优选的，所述zmaa1基因的序列如seq id no.7(seq id no.1序列4594bp-6154bp)所示。
56.根据本发明，所述第二终止子可以包括但不限于in2-1终止子，所述in2-1终止子的序列优选如 seq id no.8(seq id no.1序列6155bp-6503bp)所示。
57.根据本发明，所述筛选标记基因可以包括但不限于荧光蛋白编码基因，优选为红色荧光蛋白编码基因，进一步优选为红色荧光蛋白编码基因dsred2，所述dsred2的序列优选如seq id no.9(seqid no.1序列6620bp-7297bp)所示。
58.根据本发明，所述第三终止子可以包括但不限于nos终止子，所述nos终止子的序列优选如seq id no.5所示。
59.根据本发明，优选的，所述表达盒e1包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。
60.根据本发明一种优选的实施方式，该核酸分子还包含表达盒e2，所述表达盒e2携带有调控基因，该调控基因能够识别所述第一调控位点和第二调控位点并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件。
61.根据本发明一种优选的实施方式，所述表达盒e2自上游至下游包括如下元件：第三启动子、调控基因和第四终止子，更优选的，所述表达盒e2自上游至下游包括如下元件：花粉特异表达启动子、调控基因和第四终止子。
62.根据本发明，所述花粉特异表达启动子可以包括但不限于pg47；优选为pg47，所述pg47启动子的序列优选如seq id no.6(seq id no.1序列1822bp-4593bp)或seq id no.23所示(seq idno.10序列1bp-2771bp)。
63.根据本发明，所述调控基因可以选自但不限于重组酶系统、双链断裂诱导酶系统、基因组编辑系统和转座子系统，优选为重组酶系统，更优选为重组酶编码基因cre，进一步优选的，重组酶编码基因cre的序列如seq id no.11(seq id no.10序列2772bp-4079bp)所示。
64.根据本发明，所述第四终止子可以包括但不限于nos终止子，所述nos终止子的序列优选如seqid no.5(seq id no.10序列4080bp-4357bp)所示。
65.根据本发明，优选的，表达盒e2包括如seq id no.10所示的核苷酸序列。
66.根据本发明一种优选的实施方式，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包括如上所述的表达盒e1和表达盒e2。
67.当所述表达盒e1和表达盒e2联合使用时，它们可构成一个基因开关系统，e2中调控基因表达，切除表达盒e1中的第一调控位点和二调控位点之间的基因元件，进而胚特异表达启动子下调控筛选标记基因的表达，得到带有筛选标记的活性花粉，从而使授粉受精产生的合子胚带有筛选标记；当 e1未能被e2有效调控(例如，第一调控位点和第二调控位点中的任意一个无法成功被识别时，或者是识别有误时)时，表达盒e1中元件不变，花粉特异启动子驱动致死基因表达，从而使花粉失活而无法受精产生合子胚，由此保证了合子胚高比例甚至全部都携带e1中的筛选标记。
68.在该优选的实施方式下，能够进一步提高合子胚种子中携带筛选标记的比例，例如，可提高至 95％以上，例如，可以为95％、96％、97％、98％、99％、100％，且获得该比例的稳定性较高。
69.根据本发明，优选的，所述核酸分子还包含表达盒e3，所述表达盒e3携带有胚自主发生基因。
70.根据本发明一种优选的实施方式，所述表达盒e3自上游至下游包括如下元件：第四启动子、胚自主发生基因和第五终止子，更优选为卵细胞特异启动子、胚自主发生基因和第五终止子。
71.根据本发明，所述卵细胞特异启动子可以选自但不限于atdd45、os03g0296600 pro、eca1-like1pro、dcl2、at1g74480.1和zmealpromoter；优选为atdd45，atdd45的序列优选如seq id no.13 (seq id no.12序列1bp-1002bp)所示。
72.根据本发明，所述胚自主发生基因可以选自但不限于bbm1、wus、lec、clavata和myb115，优选为bbm1，bbm1的序列优选如seq id no.14(seq id no.12序列1003bp-2682bp)所示。
73.根据本发明，所述第五终止子可以为但不限于nos终止子，所述nos终止子的序列优选如seq idno.5(seq id no.12序列2683bp-2960bp)所示。
74.根据本发明，优选的，所述表达盒e3包括如seq id no.12所示的核苷酸序列。
75.根据本发明，所述表达盒e3的表达使卵细胞在卵细胞特异启动子驱动胚自主发生基因表达的作用下，进行孤雌生殖得到无性胚。
76.根据本发明，所述核酸分子包含表达盒e4，所述表达盒e4携带有产生mime突变体的元件，以促使有丝分裂替代减数分裂。
77.优选的，mime突变体中包括pair1、rec8和osd1的突变，产生mime突变体的元件包括：如 seq id no.15和seq id no.16所示的构建pair1突变的靶标序列，如seq id no.17和seq id no.18 所示的构建pair1突变的靶标序列，如seq id no.19和seq id no.20所示的构建pair1突变的靶标序列。
78.其中，所述mime突变体可以通过基因编辑获得，所述载体可以为cas9载体。
79.根据本发明，通过mime突变，可以促使有丝分裂替代减数分裂，从而使减数分裂受阻，使得在表达盒e4产生mime突变体的条件下，可使无性胚进一步可发育成克隆种子。
80.本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除met(atg)或trp(tgg)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录d)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的核苷酸序列，完全可以推导出能够编码相同蛋白质分子的其他核苷酸序列，通过生物学方法(如pcr方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。
81.根据本发明一种优选的实施方式，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包括如上所述的表达盒e1、表达盒e2和表达盒e3。
82.根据本发明一种优选的实施方式，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包括如上所述的表达盒e1、表达盒e2和表达盒e4。
83.根据本发明一种优选的实施方式，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包括如上所述的表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4。
84.当表达盒e3和表达盒e4联用时，表达盒e3的表达使卵细胞在卵细胞特异启动子驱动胚自主发生基因表达的作用下，进行孤雌生殖得到无性胚，并在表达盒e4产生mime突变体的条件下，无性胚进一步可发育成与母本基因型完全相同的克隆种子。
85.第二方面，本发明提供了一种重组载体，该重组载体包含如上所述的核酸分子。
86.根据本发明，所述重组载体可以按照本领域的常规技术手段进行构建，例如，当所述重组载体包括表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4中的至少1个时，可以将不同的表达盒构建在同一载体中，也可以构建在不同的载体中。
87.所述载体可以为本领域常规的各种载体，例如，可以为但不限于cas9载体。
88.根据本发明，可以采用本领域常规技术手段来构建本发明的重组载体，例如，可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的目的基因片段连接，获得本发明的重组载体。
89.根据本发明一种优选的实施方式，所述重组载体包括含有连锁表达盒的核酸分子，该连锁表达盒包含所述表达盒e1、表达盒e2和表达盒e3。。
90.根据本发明另一种优选的实施方式，所述重组载体包括含有所述连锁表达盒和表达盒e4的核酸分子。
91.根据本发明一种优选的实施方式，用于构建所述重组载体的载体为cas9载体，该重组载体通过如下的方式获得，通过gate-way方法将mime突变引入基因编辑载体cas9载体中，然后利用酶切连接的方法将如上所述连锁表达盒通过亚克隆方式引入。
92.第三方面，本发明提供了一种转基因细胞，该转基因细胞包括如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体。
93.所述转基因细胞可以为细菌细胞，例如，可以为大肠杆菌细胞(可以为大肠杆菌dh5a)或者农杆菌细胞(可以为农杆菌eha105)。
94.可以通过本领域常规的技术手段将如上所述的核酸分子引入所述宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、热激转化、电击转化等。
95.第四方面，本发明提供了如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体或者如上所述的转基因细胞的应用，其中，所述应用包括如下(a1)-(a4)中的至少一种：
96.(a1)孤雌生殖克隆种子的筛选；
97.(a2)制备无融合生殖系；
98.(a3)一系法育种；
99.(a4)固定植物杂种优势。
100.根据本发明一种具体的应用，所述核酸分子含有表达盒e1，如上所述的，该表达盒e1能够通过双重调控获得带有筛选标记的活性花粉，并且使得不带有筛选标记的花粉失活，从而使得授粉受精后发育得到的合子胚种子带有筛选标记，可以很容易被分选出。该双重调控的实现可以借助于本领域的常识和常规技术手段。
101.当用于如上的应用时，本领域技术人员可以根据本领域的常规技术手段结合其他的操作从而实现所述应用，例如，当用于孤雌生殖制备克隆种子时，本领域技术人员可以根据本领域的常规技术手段实现无性胚的获得以及实现无性胚种子的获得。
102.根据本发明一种具体的应用，所述核酸分子含有表达盒e1和表达盒e2。所述表达盒e2能够协助表达盒e1完成所述双重调控，使得获得的带有筛选标记的活性花粉的比例进一步提高。
103.根据本发明一种具体的应用，所述核酸分子含有表达盒e1、表达盒e2和表达盒e3。
104.根据本发明一种具体的应用，所述核酸分子含有表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4。
105.第五方面，本发明提供了一种引物，该引物能够对如上所述的核酸分子的全长或任意片段进行特异性扩增。
106.根据本发明一种优选的实施方式，该引物能够对所述表达盒e1的全长或任意片段进行特异性扩增，且所述筛选标记基因为如seq id no.9所示的红色荧光蛋白基因dsred2，该引物包括如seq idno.23所示的上游引物和如seq id no.24所示的下游引物。
107.第六方面，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，该方法包括：将如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体导入植物，得到转基因植物。
108.优选的，该方法包括：将含有表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4的核酸分子，或者含有所述连锁表达盒和表达盒e4的核酸分子导入植物，得到转基因植物。
109.根据本发明，将如上所述的核酸分子导入植物中的方法可以包括：构建表达载体，并将该表达载体导入大肠杆菌中以对其正确性进行验证，然后将验证正确的表达载体转化入农杆菌中；最后再用该农杆菌浸染植物的愈伤组织，从而导入植物中。
110.优选的，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物或双子叶植物为水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒；优选为单子叶植物。
111.优选的，所述单子叶植物为水稻，更优选为杂交水稻。
112.第七方面，本发明提供了一种鉴定如上所述的转基因植物的方法，该方法包括如下至少一种方法：
113.(1)利用如上所述的引物对所述转基因植物或其部分进行特异性扩增；
114.(2)通过对所述筛选标记进行观察；
115.(3)通过荧光定量分选；
116.(4)通过探针杂交检测。
117.第八面，本发明提供了一种基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，该方法包括如下步骤：
118.a、将含有表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4的核酸分子，或者含有所述连锁表达盒和表达盒e4的核酸分子导入植物，得到转基因植物；
119.b、将步骤a中获得的转基因植物自交，获得带有筛选标记的合子胚种子和不带有筛选标记的无性胚种子；
120.c、通过筛选标记对所述合子胚种子和无性胚种子进行分选，从而获得高纯度的无性胚种子作为克隆种子。
121.步骤b中，表达盒e1和表达盒e2可构成一个基因开关系统，e2中调控基因表达，切除表达盒 e1中的第一调控位点和二调控位点之间的基因元件，进而胚特异表达启动子下调控筛选标记基因的表达，得到带有筛选标记的活性花粉，从而使授粉受精产生的合子胚带有筛选标记；当e1未能被e2 有效调控(例如，第一调控位点和第二调控位点中的任意一个无法成功被识别时，或者是识别有误时) 时，表达盒e1中元件不变，花粉特异启动子驱动致死基因表达，从而使花粉失活而无法受精产生合子胚，由此保证了合子胚高比例甚至全部都携带e1中的筛选标记。表达盒e3的表达使卵细胞在卵细胞特异启动子驱动胚自主发生基因表达的作用下，进行孤雌生殖得到不带有筛选标记的无性胚，并在表达盒e4产生mime突变体的条件下，无性胚进一步可发育成与母本基因型完全相同的克隆种子。
122.第九方面，本发明提供了一种筛选无融合生殖系的方法，该方法包括：
123.a、将含有表达盒e1、表达盒e2、表达盒e3和表达盒e4的核酸分子，或者含有所述连锁表达盒和表达盒e4的核酸分子导入植物，得到转基因植物；
124.b、将步骤a中获得的转基因植物自交，检测其是否满足以下条件：(a1)mime突变，有丝分裂替代减数分裂；(a2)产生无性胚种子和合子胚种子两种种子；(a3)合子胚种子胚中携带有表达盒e1中的筛选标记基因，且表达盒e1中的花粉致死基因保证合子胚种子携带表达盒e1中的筛选标记基因； (a4)无性胚种子中的胚不带有筛选标记基因；
125.c、筛选同时满足步骤b中条件的转基因植物作为无融合生殖系。
126.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中：
127.实施例1
128.本实施例用于说明无融合生殖载体p68c的载体构建
129.1.合成表达盒e1、e2和e3
130.合成表达盒e1，序列如seq id no.2所示：包括胚特异表达启动子osesp1(seq id no.2)、 loxp-frt融合识别位点(seq id no.3)、双链断裂诱导酶i-scei位点(seq id no.4)、nos终止子(seq id no.5)、花粉特异表达启动子pg47(seq id no.6)、致死基因zmaa1(seq id no.7)、in2-1 终止子(seq id no.8)、双链断裂诱导酶i-scei位点(seq id no.4)、loxp-frt融合识别位点(seqid no.3)、红色荧光蛋白基因dsred2(seq id no.9)、nos终止子(seq id no.5)。
131.合成表达盒e2，序列如seq id no.12所示：花粉特异表达启动子pg47(seq id no.23)、重组酶编码基因cre(seq id no.11)和nos终止子(seq id no.5)。
132.合成表达盒e3，序列如seq id no.10所示：卵细胞特异启动子atdd45(seq id no.13)、胚自主发生基因bbm1(seq id no.13)和nos终止子(seq id no.5)。
133.将e1、e2、e3构建成连锁表达盒，命名为seq68e。
134.2.构建表达载体p68c
135.分别在osd1、pair1、rec8基因编码区设计2个靶标(osd1：seq id no.15和seq id no.16； pair1：seq id no.17和seq id no.18；rec8：seq id no.19和seq id no.20)，通过gate-way 方法构建至基因编辑载体cas9载体，构建mime突变体，命名为p56dm。
136.利用酶切连接的方法将seq68e亚克隆至基因编辑载体p56dm，载体重新命名为p68c，完整载体图谱见附图1。
137.3.重组质粒的转化
138.(1)取一管200μl大肠杆菌感受态细胞dh5a与5μl连接产物混合，冰浴30min；
139.(2)迅速置于42℃恒温水浴锅中，热激90s，冰浴2min；
140.(3)加入500μl lb液体培养基，混匀；
141.(4)37℃、200rpm,培养45min，使细胞恢复正常生长状态；
142.(5)将菌液均匀涂布于lb固体培养基平板上；
143.(6)30min后，置37℃恒温培养箱，过夜培养。
144.(7)挑取正确的单克隆接菌，抽提质粒，酶切验证。
145.4.重组农杆菌的获得
146.将构建正确的植物表达载体使用电击法转化农杆菌eha105。导入方法采用电击转化方法，主要参考bio-rad公司的电击仪使用说明书进行，具体步骤如下：
147.将储存于-80℃的eha105感受态细胞取出放在冰上冻融，1mm电击杯放在冰上预冷，把冻存的soc放置在37℃解冻。将干净的ep离心管插在冰上预冷，一般ep离心管的数目比要转化的样品多两个，一个用来做阴性对照(没有加入dna)、另一个做阳性对照(加入1μl的10ng/μlpuc19)。分别吸取1μl要转化的dna样品放入预冷的ep离心管中，然后将融化的eha105感受态细胞20μl轻轻取出放入预冷的离心管底部，轻轻的将两者混匀，尽量不要产生气泡，离心管底部不要用手接触，避免温度变化对感受态转化效率造成影响，操作过程尽量的快。设置转化参数，电阻200ω，电容25μf，电压1800v，电激杯规格1mm，biorad电击仪一
般有推荐使用的参数。轻轻吸取感受态和dna混合物，放入电激杯中，轻敲使混合物均匀的分布于杯底。盖上盖子放入电激槽中，关上安全盖，按下电激红色按钮，待电激完成后，将在37℃预热好的soc放入电激杯中，将混合物旋起，用吸头将混合物转入摇菌管中，于28℃恒温摇床，180rpm,2h。取50μl菌液涂布在含卡那霉素(50μg/ml)和利福平(25μg/ml)的lb固体培养基上，28℃暗培养2d，挑取农杆菌转化子单菌落(水稻表达载体p69c农杆菌单菌落)，接种到添加了相同抗生素的lb液体培养基中， 28℃条件下，振荡培养2d。取适量菌液加入等体积的50％浓度的无菌甘油混合，于-80℃条件下保存、备用。
148.实施例2
149.本实施例用于说明转基因植株的获得
150.挑选水稻表达载体p69c农杆菌单菌落接种于含50mg/l kanamycin的lb培养基上26℃暗培养2 天后，用nb-as液体培养基洗下农杆菌菌体，28℃180rpm液体振荡培养90-120min。调整菌落浓度至od600为0.8-1.0，转化杂交稻，杂交水稻种子消毒，挑选子粒饱满的种子，用75％的酒精浸泡 30s，倒掉酒精，无菌水冲洗一遍，用hgcl2消毒8min，无菌水清洗2遍，每次浸泡1min，用无菌水浸泡1h。消毒后的种子接种到诱导培养基上，光照下生长7d，获得无菌愈伤组织。
151.将无菌愈伤组织集中在一起，放入农杆菌悬浮液中，浸泡5-10min，取出，用滤纸晾干。接种到共培养培养基，共培养2天，将共培养的愈伤，清洗6遍，并用滤纸晾干后接种到具有潮霉素抗性的筛选培养基上45天。
152.将抗性愈伤转移到分化培养基上，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待小植株长至7-10cm左右时进行室内炼苗，3～4d后将其移栽到土壤中生长。通过观察绿色(载体上自带)荧光筛选出转化植株。
153.实施例3
154.本实施例用于说明转基因植株的分子检测
155.dna抽提：取1.0g叶片，液氮研磨至粉末状，转入2ml ep管中，加入700μl预热的ctab溶液。于65℃水浴30-60min，期间轻轻混匀，冷却后加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，12000 rpm离心10min,取上清至新的离心管中，加入500μl异丙醇，-20℃静置30-60min。4℃，12000rpm, 10min收集沉淀，弃上清。70％乙醇清洗沉淀2次，吹干酒精残留，50-100μl ddh2o溶解沉淀，备用。
156.pcr分析：以dsred2基因作为模板设计引物，扩增产物片段为431bp。
157.正向引物：
158.f:5'-cccagttccagtacggctccaag-3'(seq id no.21)；
159.反向引物：
160.r:5'-ctcgttgtgggaggtgatgtccag-3'(seq id no.22)。
161.pcr反应体系：dna 30-90ng,10
×
buffer 2.0μl,1mm dntp 1.8μl,25mm mgcl2 1.5μl,10umprimer两种各0.5μl,tag酶1.5u，加ddh2o至20μl反应体积。pcr循环条件94℃，3min；94℃,1min，64℃,1.5min，72℃30s，40个循环；72℃，延伸5min。用1.4％琼脂糖凝胶电泳检测，照相记录电泳结果，结果显示，扩增片段与预期大小相符。
162.荧光定量分析：使用植物总rna提取试剂盒(天根dp432)对t0代转基因杂交稻和野
生型杂交稻对照进行rna抽提，方法参考试剂盒说明书。以总rna为模板逆转录合成相应的cdna。以 actin为内参基因，野生型植株为对照，用rt-pcr的方法对rfp(红色荧光蛋白)基因进行定量pcr 检测。显示，rfp的定量pcr检测的转录水平应与荧光显微镜观察的翻译表达水平相对应。
163.southern印迹分析：取水稻总dna进行ecorⅰ酶切、电泳、转移至硝酸纤维素膜hybond-n。利用随机引物标记试剂盒(promega公司)和[α-32p]datp(北京亚辉公司)，随机引物法制备α-32p 标记的rfp基因片段，作为分子探针，按照sambrook等分子克隆方法进行转化植株的southern杂交分析。southern杂交分析可以显示转基因的拷贝数，通过农杆菌介导转化的转基因拷贝数多为1-3 拷贝，但由于本实施例中采用了mime突变体，减数分裂被有丝分裂所替代，后代中无基因自由组合和分离，因此克隆种子中转基因拷贝数的个数不受制约。
[0164]
实施例4
[0165]
本实施例用于说明无融合生殖系的筛选
[0166]
对经过分子鉴定的转基因植株进行自交，考察其株高、分蘖数、剑叶长、结实率、千粒重等农艺性状，与野生型无差异；花粉育性检测显示，部分花粉不育，且不育花粉无rfp，而可育花粉都有 rfp。收获的种子观察其大小差异，与野生型无差异，并在手持式荧光灯下观察，可见种子中，有的胚显示红色荧光，有的胚没有红色荧光，统计其荧光种子和非荧光种子比例。
[0167]
取胚无红色荧光的种子进行发芽，流式细胞检测其染色体倍数。以亲本为对照，通过全基因组测序检测其杂合性。筛选出具有以下特征的转化植株即为无融合生殖系：(1)自交产生具有红色荧光的胚和无荧光的胚；(2)无红色荧光的胚为二倍体且保留了母本杂合性；(3)具有mime突变。
[0168]
实施例5
[0169]
本实施例用于说明杂交水稻的无融合生殖繁殖
[0170]
取无红色荧光的种子进行繁殖，考察其株高、分蘖数、剑叶长、结实率、千粒重等农艺性状，与野生型无差异。收获的种子观察其大小差异，与野生型无差异，并在手持式荧光灯下观察其胚是否红色荧光，统计其荧光种子和非荧光种子比例。
[0171]
取无红色荧光的胚进行发芽，流式细胞检测其染色体倍数。以亲本为对照，通过全基因组测序检测其杂合性。重复多代，取表现稳定的株系供一系法育种的应用。
[0172]
对比例1
[0173]
本对比例用于说明参比的无融合生殖系的筛选
[0174]
按照实施例1-5的方法进行无融合生殖系的筛选，不同的是，表达盒e1中不设置花粉致死基因。经检查，在转基因植物的花粉中活性花粉中有约30％不带有筛选标记，而实施例4显示，表达盒e1 中设置了花粉致死基因的转基因植株，其活性花粉接近100％带有筛选标记。
[0175]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。