一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法与流程

1.本公开涉及一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法。


背景技术：

2.本部分的陈述仅仅是提供了与本公开相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。
3.目前金针菇菌种的保藏办法包括液氮保存法，麦粒保藏法，斜面生理盐水保藏法，斜面低温保藏法，麸皮保藏法，连续传代保存法等；
4.液氮保藏设备要求严格，成本高，活化后原有性状保留差；斜面低温保藏法周期短，斜面培养基易干燥，菌丝易发黄老化；麦粒和麸皮保藏法容易长出子实体和粉孢子；斜面生理盐水保藏法容易出现部分斜面露出水面，干燥老化；连续传代保存法，传递代数过多，容易因操作手法导致退化。


技术实现要素：

5.本公开为了解决上述问题，提出了一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法。
6.本公开的目的是提供一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法，为克服以往菌种保藏方法的不足，实现金针菇菌种更好的保藏和便于生产利用，本发明的目的在于提供一种新的斜面菌种的保藏方法，降低保藏成本投入，增长保藏时间，避免产生粉孢子和干燥老化，能长时间保持菌种的遗传稳定性。
7.为了实现上述目的，本公开采用如下技术方案：
8.一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法，包括以下步骤：
9.(1)斜面培养基和保藏液的制备；
10.(2)斜面菌种的制备：将金针菇菌种接种到步骤(1)制备的斜面培养基中；
11.(3)保藏菌种的制备：取步骤(2)所得斜面培养基基质菌丝块放于步骤 (1)保藏液中封口；
12.(4)保藏：将所述步骤(3)的金针菇斜面培养基放置于0-6℃恒温血液培养箱保藏；
13.所述步骤(1)中，斜面培养基原料包括：马铃薯80
–
400g/l，葡萄糖8
–ꢀ
40g/l，琼脂15
–
25g/l，大豆蛋白5
–
15g/l，牛肉膏浸出物5
–
12g/l，硫酸镁 0.2
–
1.2g/l，磷酸二氢钾0.5
–
2g/l，麦芽粉2
–
6g/l；
14.所述步骤(1)中斜面培养基制作步骤如下：取新鲜无芽的马铃薯80-400g 加入1升的水煮熟，过滤，得到滤液，向滤液内加入葡萄糖8-40g、琼脂15-25g、大豆蛋白5-15g、牛肉膏浸出物5
–
12g、硫酸镁0.2
–
1.2g、磷酸二氢钾0.5
–ꢀ
2g、麦芽粉2
–
6g加热至琼脂全部溶解，补水定容至1l，将获得的溶液置于三角瓶内，塞上透气塞，于119-135℃灭菌30-60min，灭菌完成后待溶液降温至 50-80℃时倒入20mm*200mm试管内摆成斜面，冷却至完全凝固后得到斜面培养基；
15.优选的，所述步骤(1)中，斜面培养基制作步骤如下：取新鲜无芽的马铃薯260g加
入1升的水煮熟，过滤，得到滤液，向滤液内加入葡萄糖20g、琼脂 20g、大豆蛋白11g、牛肉膏浸出物7g、硫酸镁0.8g、磷酸二氢钾1.1g、麦芽粉4g加热至琼脂全部溶解，补水定容至1l，将获得的溶液置于三角瓶内，塞上透气塞，于122℃灭菌45min，灭菌完成后待溶液降温至70℃时倒入20mm*200mm试管内摆成斜面，冷却至完全凝固后得到斜面培养基。
16.优选的，所述步骤(1)中，斜面培养基的制作步骤如下：按上述质量称取马铃薯、葡萄糖、琼脂、大豆蛋白、牛肉膏、硫酸镁、磷酸二氢钾、麦芽粉，先将马铃薯切成4mm薄片，加水1升，烧开，水沸腾5min后关火，过滤，取得滤液于烧杯内，加入其它原料，加热，搅拌至完全溶解，加水定容至1l，用分装器分装到试管内，每个试管定容15ml，塞上硅胶塞，试管放于聚丙烯瓶子内，每10支一组，塞子上盖上铝箔纸，放于电热灭菌锅灭菌，119-135℃灭菌15-25min，灭菌完成后，降温至60-80℃，摆斜面，培养基占试管2/3-3/4长度，培养基完全凝固后得到斜面培养基。
17.优选的，所述步骤(1)中保藏液为0.8-1g氯化钠和100ml纯水。
18.优选的，所述步骤(1)中保藏液的制备方法法包括如下步骤：取0.80-1g 氯化钠于三角瓶内，加入纯水定容至100ml，119-135℃灭菌15-25min，冷却至常温得到保藏液。
19.优选的，所述步骤(2)中，斜面培养基的接种操作为，在超净台下开启新风，用酒精对超净台内部消毒，用火焰对接种工具消毒，带接种工具降为室温后，用接种工具刮除斜面培养基的气生菌丝，用接种钩划3*3*3mm的菌丝块，用接种铲取1块放于待接种的斜面培养基底部3cm处，放于培养箱培养，培养温度10-20℃，培养8-15天。
20.优选的，将所述步骤(3)的具体方法是，将步骤(2)中所得斜面基质菌丝取(3-6)*(3-6)*(3-6)mm基质菌丝块置于安瓿瓶内，注入步骤(1)所得保藏液，安瓿瓶火焰封口，置于0-4℃保藏箱保藏。
21.与现有技术相比，本公开的有益效果为：
22.1.本公开通过斜面培养基培养取得斜面菌丝，通过刮除斜面表面气生菌丝获得基质菌丝块，选取生长健壮的基质菌丝置于安瓿瓶内，注入生理盐水保藏液低温保藏，能长时间保持菌种原有优良性状。
23.2.本公开刮除斜面气生菌丝，采用基内菌丝进行保存，避免了气生菌丝容易产生粉孢子的特点，基质内菌丝遗传稳定性更稳定，提高菌种的稳定性。
24.3.本公开采用小块菌丝块保存，能提高保藏数量，降低保藏成本，提高了保藏效率。
25.4.本公开采用安瓿瓶保藏菌种，避免了保藏过程，菌种污染的风险。
26.5.本公开的原理是在保藏过程用低温条件减小菌丝的代谢，用菌丝块内少量营养来维持菌丝的基本生理活动，用生理盐水维持细胞的渗透压和菌丝块的湿润状态，保持细胞的生理活性和细胞形态，实现菌种的长期保藏。
具体实施方式：
27.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
28.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根
据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
29.在本公开中，术语如“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“侧”、“底”，只是为了便于叙述本公开各部件或元件结构关系而确定的关系词，并非特指本公开中任一部件或元件，不能理解为对本公开的限制。
30.本公开中，术语如“固接”、“相连”、“连接”等应做广义理解，表示可以是固定连接，也可以是一体地连接或可拆卸连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的相关科研或技术人员，可以根据具体情况确定上述术语在本公开中的具体含义，不能理解为对本公开的限制。
31.实施例1
32.一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法，包括以下步骤：
33.(1)斜面培养基和保藏液的制备；
34.(2)斜面菌种的制备：将金针菇菌种接种到步骤(1)制备的斜面培养基中；
35.(3)保藏菌种的制备：取步骤(2)所得斜面培养基基质菌丝块放于步骤 (1)保藏液中，封口；
36.(4)保藏：将所述步骤(3)的金针菇斜面培养基放置于0℃恒温血液培养箱保藏；
37.所述步骤(1)中，斜面培养基原料包括：马铃薯80g/l，葡萄糖40g/l，琼脂15g/l，大豆蛋白5g/l，牛肉膏浸出物12g/l，硫酸镁0.2g/l，磷酸二氢钾2g/l，麦芽粉2g/l；
38.斜面培养基的制备方法包括如下步骤：取新鲜无芽的马铃薯80g加入1升的水煮熟，过滤，得到滤液，向滤液内加入葡萄糖40g、琼脂15g、大豆蛋白5g、牛肉膏浸出物12g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾2g、麦芽粉2g加热至琼脂全部溶解，补水定容至1l，将获得的溶液置于三角瓶内，塞上透气塞，于119℃灭菌60min，灭菌完成后待溶液降温至80℃时倒入20mm*200mm试管内摆成斜面，冷却至完全凝固后得到斜面培养基；
39.所述步骤(1)中保藏液包括1g氯化钠,100ml纯水，容器为安瓿瓶。
40.保藏液的制备办法包括如下步骤：取1g氯化钠于三角瓶内，加入纯水定容至100ml，135℃灭菌15min，冷却至常温得到保藏液。
41.所述步骤(2)培养的温度为20℃，培养期为8天，得到斜面菌种。
42.所述步骤(3)得到的斜面菌丝，取3*3*3mm基质菌丝块置于安瓿瓶内，注入步骤(1)所得保藏液，安瓿瓶火焰封口，置于0℃保藏箱保藏。
43.实施例2
44.一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法，包括以下步骤：
45.(1)斜面培养基和保藏液的制备。
46.(2)斜面菌种的制备：将金针菇菌种接种到步骤(1)制备的斜面培养基中。
47.(3)保藏菌种的制备：取步骤(2)所得斜面培养基基质菌丝块放于步骤 (1)保藏液中，封口。
48.(4)保藏：将所述步骤(3)的金针菇斜面培养基放置于0℃恒温血液培养箱保藏。
49.所述步骤(1)中，斜面培养基原料包括：马铃薯140g/l，葡萄糖32g/l，琼脂17g/l，大豆蛋白7g/l，牛肉膏浸出物10g/l，硫酸镁0.4g/l，磷酸二氢钾1.7g/l，麦芽粉3g/l。
50.斜面培养基的制备方法包括如下步骤：取新鲜无芽的马铃薯140g加入1升的水煮熟，过滤，得到滤液，向滤液内加入葡萄糖32g、琼脂17g、大豆蛋白7g、牛肉膏浸出物10g、硫酸镁0.4g、磷酸二氢钾1.7g、麦芽粉3g加热至琼脂全部溶解，补水定容至1l，将获得的溶液置于三角瓶内，塞上透气塞，于122℃灭菌55min，灭菌完成后待溶液降温至75℃时倒入20mm*200mm试管内摆成斜面，冷却至完全凝固后得到斜面培养基。
51.所述步骤(1)中保藏液包括0.95g氯化钠,100ml纯水，容器为安瓿瓶。
52.保藏液的制备办法包括如下步骤：取0.95g氯化钠于三角瓶内，加入纯水定容至100ml，130℃灭菌16min，冷却至常温得到保藏液。
53.所述步骤(2)培养的温度为19℃，培养期为9天，得到斜面菌种。
54.所述步骤(3)得到的斜面菌丝，取3*3*3mm基质菌丝块置于安瓿瓶内，注入步骤(1)所得保藏液，安瓿瓶火焰封口，置于0℃保藏箱保藏。
55.实施例3
56.一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法，包括以下步骤：
57.(1)斜面培养基和保藏液的制备。
58.(2)斜面菌种的制备：将金针菇菌种接种到步骤(1)制备的斜面培养基中。
59.(3)保藏菌种的制备：取步骤(2)所得斜面培养基基质菌丝块放于步骤 (1)保藏液中，封口。
60.(4)保藏：将所述步骤(3)的金针菇斜面培养基放置于1℃恒温血液培养箱保藏。
61.所述步骤(1)中，斜面培养基原料包括：马铃薯200g/l，葡萄糖26g/l，琼脂19g/l，大豆蛋白9g/l，牛肉膏浸出物8g/l，硫酸镁0.6g/l，磷酸二氢钾1.4g/l，麦芽粉4g/l。
62.斜面培养基的制备方法包括如下步骤：取新鲜无芽的马铃薯200g加入1升的水煮熟，过滤，得到滤液，向滤液内加入葡萄糖26g、琼脂19g、大豆蛋白9g、牛肉膏浸出物8g、硫酸镁0.6g、磷酸二氢钾1.4g、麦芽粉4g加热至琼脂全部溶解，补水定容至1l，将获得的溶液置于三角瓶内，塞上透气塞，于124℃灭菌50min，灭菌完成后待溶液降温至75℃时倒入20mm*200mm试管内摆成斜面，冷却至完全凝固后得到斜面培养基。
63.所述步骤(1)中保藏液包括0.95g氯化钠,100ml纯水，容器为安瓿瓶。
64.保藏液的制备办法包括如下步骤：取0.9g氯化钠于三角瓶内，加入纯水定容至100ml，125℃灭菌17min，冷却至常温得到保藏液。
65.所述步骤(2)培养的温度为18℃，培养期为10天，得到斜面菌种。
66.所述步骤(3)得到的斜面菌丝，取4*4*4mm基质菌丝块置于安瓿瓶内，注入步骤(1)所得保藏液，安瓿瓶火焰封口，置于1℃保藏箱保藏。
67.实施例4
68.一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法，包括以下步骤：
69.(1)斜面培养基和保藏液的制备。
70.(2)斜面菌种的制备：将金针菇菌种接种到步骤(1)制备的斜面培养基中。
71.(3)保藏菌种的制备：取步骤(2)所得斜面培养基基质菌丝块放于步骤 (1)保藏液中，封口。
72.(4)保藏：将所述步骤(3)的金针菇斜面培养基放置于2℃恒温血液培养箱保藏。
73.所述步骤(1)中，斜面培养基原料包括：马铃薯260g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，
大豆蛋白11g/l，牛肉膏浸出物7g/l，硫酸镁0.8g/l，磷酸二氢钾1.1g/l，麦芽粉4g/l。
74.斜面培养基的制备方法包括如下步骤：取新鲜无芽的马铃薯260g加入1升的水煮熟，过滤，得到滤液，向滤液内加入葡萄糖20g、琼脂20g、大豆蛋白11g、牛肉膏浸出物7g、硫酸镁0.8g、磷酸二氢钾1.1g、麦芽粉4g加热至琼脂全部溶解，补水定容至1l，将获得的溶液置于三角瓶内，塞上透气塞，于126℃灭菌45min，灭菌完成后待溶液降温至70℃时倒入20mm*200mm试管内摆成斜面，冷却至完全凝固后得到斜面培养基。
75.保藏液的制备办法包括如下步骤：取0.85g氯化钠于三角瓶内，加入纯水定容至100ml，125℃灭菌17min，冷却至常温得到保藏液,最后装入安瓿瓶中。
76.所述步骤(2)培养的温度为17℃，培养期为11天，得到斜面菌种。
77.所述步骤(3)得到的斜面菌丝，取4*4*4mm基质菌丝块置于安瓿瓶内，注入步骤(1)所得保藏液，安瓿瓶火焰封口，置于2℃保藏箱保藏。
78.实施例5
79.一种金针菇斜面菌丝块的保藏方法，包括以下步骤：
80.(1)斜面培养基和保藏液的制备。
81.(2)斜面菌种的制备：将金针菇菌种接种到步骤(1)制备的斜面培养基中。
82.(3)保藏菌种的制备：取步骤(2)所得斜面培养基基质菌丝块放于步骤 (1)保藏液中，封口。
83.(4)保藏：将所述步骤(3)的金针菇斜面培养基放置于3℃恒温血液培养箱保藏。
84.所述步骤(1)中，斜面培养基原料包括：马铃薯320g/l，葡萄糖14g/l，琼脂23g/l，大豆蛋白13g/l，牛肉膏浸出物6g/l，硫酸镁1g/l，磷酸二氢钾 0.8g/l，麦芽粉5g/l。
85.斜面培养基的制备方法包括如下步骤：取新鲜无芽的马铃薯320g加入1升的水煮熟，过滤，得到滤液，向滤液内加入葡萄糖40g、琼脂15g、大豆蛋白5g、牛肉膏浸出物12g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾2g、麦芽粉2g加热至琼脂全部溶解，补水定容至1l，将获得的溶液置于三角瓶内，塞上透气塞，于128℃灭菌40min，灭菌完成后待溶液降温至70℃时倒入20mm*200mm试管内摆成斜面，冷却至完全凝固后得到斜面培养基。
86.保藏液的制备办法包括如下步骤：取0.85g氯化钠于三角瓶内，加入纯水定容至100ml，121℃灭菌20min，，冷却至常温得到保藏液,最后装入安瓿瓶中。
87.所述步骤(2)培养的温度为15℃，培养期为12天，得到斜面菌种。
88.所述步骤(3)得到的斜面菌丝，取5*5*5mm基质菌丝块置于安瓿瓶内，注入步骤(1)所得保藏液，安瓿瓶火焰封口，置于3℃保藏箱保藏。
89.对比数据1
[0090][0091]
对比数据2
[0092]
[0093][0094]
对比数据3
[0095][0096]
结论：通过实验数据对比可见，本公开能够在较长时间内保持金针菇菌种的遗传稳定性，能表达较为稳定的出菇表现，该方法操作简单，成本较低，对保藏设备要求不高，可以广泛应用于食用菌生产性单位，对于菌种的保藏有积极的意义和作用。
[0097]
以上仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。
[0098]
上述虽然对本公开的具体实施方式进行了描述，但并非对本公开保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本公开的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本公开的保护范围以内。