利用谷氨酸棒状杆菌高效分泌生产类蛛丝、类弹性蛋白并快速纯化的方法与流程

1.本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种利用谷氨酸棒状杆菌高效分泌生产类蛛丝、类弹性蛋白并快速纯化的方法。


背景技术：

2.蜘蛛牵引丝蛋白氨基酸序列和基因序列已被成功解析实现人工合成，并被导入到不同的宿主细胞中实现表达生产重组类蜘蛛丝蛋白。现有技术已能够在番茄、马铃薯、玉米等植物细胞，以及小鼠、山羊等哺乳动物细胞中实现不同类型重组蜘蛛丝蛋白的表达。但现有的蜘蛛牵引丝蛋白的表达水平比较低且生长周期长、生产成本高，难以实现大规模生产。因此，微生物表达以其培养条件简单，宿主生长快，表达周期短等优势，成为目前研究最多的蜘蛛丝蛋白的表达系统。然而，目前微生物表达的蛛丝蛋白大多滞留在宿主细胞内，需通过破碎细胞获得目的蛛丝蛋白。


技术实现要素：

3.本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种利用谷氨酸棒状杆菌高效分泌生产类蛛丝、类弹性蛋白并快速纯化的方法，进一步通过基因工程改造原始谷氨酸棒状杆菌，提升类蛛丝蛋白的分泌水平，较原始菌株相比，提高2.5倍，并建立快速纯化方法，获得纯度高达93％的目的蛋白。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：
5.本发明涉及一种用于表达分泌重组蛛丝蛋白、类节肢弹性蛋白或类丝节肢弹性蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌的实现方法，分别将信号肽序列和重组蛛丝蛋白、类节肢弹性蛋白或类丝节肢弹性蛋白的编码基因连接到表达载体自身启动子序列之后，再将构建的重组表达载体转化到宿主谷氨酸棒状杆菌中，得到谷氨酸棒状杆菌重组菌。
6.所述的重组蛛丝蛋白包括：具有金丝网蛛(trichonephila clavipes)蜘蛛牵引丝蛋白单体核心氨基酸序列maspi和maspii的肽重复8、16、32和64次的蛋白，其中：单体核心氨基酸序列maspi和maspii如seq id no.1和seq id no.2所示。
7.所述的类节肢弹性蛋白是指：具有果蝇节肢弹性蛋白resilin保守肽段氨基酸序列的肽重复16和32次的蛋白，其中：保守肽段氨基酸序列如seq id no.3所示。
8.所述的类丝节肢弹性蛋白是指：具有果蝇节肢弹性蛋白和蚕丝蛋白的共聚物的肽重复5次的蛋白，其中：共聚物的氨基酸序列如seq id no.4所示。
9.所述的信号肽序列包括：
10.①
sec分泌系统信号肽，其序列包括：cg1514、cg2196、cg2518、cg2195、cg2585、cg3186、cg3182、cg1109、cg0413、cg1087、cg1243、cg2868、cg3393、cg0470、cg2394、cg2402、cg0316；
11.②
tat分泌系统信号肽，其序列包括：cg0955、cg2485、tora。
id no.35所示的基因ncgl1095，核苷酸序列如seq id no.36所示的基因ncgl2717，核苷酸序列如seq id no.37所示的基因ncgl0550，核苷酸序列如seq id no.38所示的基因ncgl0291，核苷酸序列如seq id no.39所示的基因ncgl1748，核苷酸序列如seq id no.40所示的基因ncgl0841。
31.所述的过表达，涉及的核苷酸序列包括：核苷酸序列如seq id no.33所示的基因ncgl2316，核苷酸序列如seq id no.34所示的基因ncgl1383，核苷酸序列如seq id no.35所示的基因ncgl1095，核苷酸序列如seq id no.36所示的基因ncgl2717，核苷酸序列如seq id no.41所示的基因ncgl2356，核苷酸序列如seq id no.42所示的基因ncgl0891，核苷酸序列如seq id no.43所示的基因ncgl0546，核苷酸序列如seq id no.44所示的基因ncgl1382，核苷酸序列如seq id no.45所示的基因ncgl2716。
32.本发明涉及一种分泌至培养基中的重组蛛丝蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
33.步骤
①
取高密度发酵结束后的发酵液，使用低温离心机7,024g，4℃，离心20min，收集上清；
34.步骤
②
取上述上清，利用1.32m hcl调节ph为4.0，室温搅拌2h；
35.步骤
③
取上述溶液进行离心，15,422g，4℃，离心10min，收集上清；
36.步骤
④
收集上述上清，加入终浓度为10％至25％(w/v)的饱和硫酸铵，室温搅拌1h；
37.步骤
⑤
取上述溶液进行离心，15,422g，4℃，离心10min，收集沉淀，将沉淀使用去离子水重悬，即为目的蛋白溶液。
38.上述用于克隆的大肠杆菌e.colidh5α购于天根生化科技有限公司；用于基因扩增的e.colimg1655菌株购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司(www.zomanbio.com)；用于蛛丝蛋白表达的质粒pxmj19购于长沙艾碧维生物科技有限公司(www.honorgene.com)；用于谷氨酸棒状杆菌基因敲除的质粒pk19mobsacb(atcc87098)购于生物风公司(www.biofeng.com)。
39.所用限制性内切酶、dna连接酶等分子生物学试剂从new england biolabs公司(www.neb.com)购买。技术效果
40.与现有技术相比，本发明分泌蛛丝蛋白水平高达2.2g/l,是目前分泌生产蛛丝蛋白的最高水平；无需复杂的色谱纯化，只需两步简单沉淀获得纯度高达93％的蛛丝蛋白，且该蛋白水溶性超越以往所有重组表达的蛛丝蛋白，达到660mg/ml。
附图说明
41.图1为用于类蛛丝蛋白、类节肢弹性蛋白、类丝节肢弹性蛋白分泌表达的质粒示意图；
42.图2为摇瓶培养重组谷氨酸棒状杆菌res167所得培养液的电泳胶图，重组菌株带有分泌表达不同分子量蛛丝蛋白maspi/maspii的质粒，且所用信号肽为cg1514；
43.图3为摇瓶培养重组谷氨酸棒状杆菌res167所得培养液的电泳胶图，重组菌株分别带有分泌表达类节肢弹性蛋白r16/r32和类丝节肢弹性蛋白(r4s4)5的质粒，且所用信号肽为cg1514；
44.图4为摇瓶培养重组谷氨酸棒状杆菌res167所得培养液的电泳胶图，重组菌株分别带有以不同信号肽表达分泌蛛丝蛋白maspi16的质粒；ctrl指含pcg2空白质粒的重组菌，m指蛋白marker；
45.图5为敲除reca(a)及pbp1a(b)基因的pcr验证核酸胶图；
46.图6为经过基因工程改造的重组谷氨酸棒状杆菌在摇瓶培养条件下，与未改造的出发重组菌株(wt)相比目的蛋白相对分泌水平对比；
47.图7为重组菌res167/pcg8、δpbp1a/pcg8-i16cg和δpbp1a/pcg8-i64cg在高密度发酵条件下，菌株生长曲线、考马斯亮蓝染色相对定量总蛋白分泌量/蛛丝蛋白分泌量/蛛丝蛋白分泌水平及胞外蛋白sds-page分析；
48.图8为重组菌δpbp1a/pcg8-i16cg和δpbp1a/pcg8-i64cg高密度发酵上清纯化过程中的sds-page检测结果，1,4代表发酵上清；2,5代表酸沉淀杂蛋白；3,6代表硫酸铵沉淀目标蛋白。
具体实施方式
实施例1
49.本实施例构建重组蛛丝蛋白8聚体、16聚体、32聚体和64聚体的基因序列，具体步骤如下：参考文献(teul
é
f,cooperar,furin wa,bittencourt d,rech el,brooks a,lewis rv.nat.protoc.,2009,4(3):341-355.)，采取“首尾相接”的策略，即使用nhei和spei两个同尾酶将maspi蛋白单体核苷酸序列进行拼接。由金唯智公司合成的上述单体基因片段的5`端添加有ndei和nhei酶切位点，3`端添加有spei和xhoi位点。将合成的基因片段通过ndei和xhoi位点连接构建于过渡质粒载体pet28a4，获得携带蛛丝蛋白单体核苷酸序列的质粒pet28a4-i1cg，通过nhei和spei两个同尾酶“首尾相接”的策略进一步构建2聚体、4聚体、8聚体、16聚体、32聚体和64聚体的目的基因质粒，分别为pet28a4-i2cg、pet28a4-i4cg、pet28a4-i8cg、pet28a4-i16cg、pet28a4-i32cg、pet28a4-i64cg，其中：maspii重组蛛丝蛋白8-64聚体基因序列的构建方法同上。
50.所述的过渡质粒载体pet28a4是指：在pet28a( )表达载体(novagen公司购买)的多克隆位点修饰添加bamhi限制性酶切位点，所用上下游引物为f28a4ba和r28a4，序列如seq id no.46和seq id no.47所示，参考文献(wei sp,qian zg,hu cf,pan f,chen mt,lee sy,xia xx.nat chem biol.2020oct；16(10):1143-1148.)。实施例2
51.本实施例构建蛛丝蛋白分泌表达载体步骤包括：
52.1)提取谷氨酸棒状杆菌res167基因组dna，以此为模板，通过引物fcg1514hi和rcg1514sa序列号如seq id no.48和seq id no.49所示，进行pcr反应，扩增得到序列如seq id no.5的信号肽cg1514，并在其5`和3`端分别引入hindiii和sali位点。对信号肽序列与质粒pxmj19利用hindiii和sali进行双酶切，酶切片段经过纯化后利用t4 dna连接酶连接，转化e.coli dh5α。挑取重组菌进行培养，提取质粒酶切验证，构建得到重组质粒pcg2。
53.2)对重组质粒pcg2与实施例1中构建的质粒pet28a4-i16cg利用ndei和bamhi进行双酶切，分别获得质粒载体片段及重组蛛丝蛋白maspi16基因片段，酶切片段经纯化后通过t4 dna连接酶连接，转化e.coli dh5α。挑取重组菌进行培养，提取质粒进行酶切验证，构建
得到分泌表达质粒pcg2-i16cg，如图1所示。
54.maspi蛋白32聚体、64聚体，及maspii蛋白8聚体、16聚体、32聚体、64聚体蛋白分泌表达质粒构建方法同上。
55.本实施例进一步构建类节肢弹性蛋白分泌表达载体，步骤包括：
56.1)实验室已有研究(hu x,xiaxx,huang sc,qian zg.biomacromolecules,2019,20(9):3283-3293.)构建含有类节肢弹性蛋白r16或r32基因的表达载体pet19b-r16/pet19b-r32，利用ndei和xhoi对pet19b-r16或pet19b-r32以及质粒载体pet28a4进行双酶切，分别获得质粒载体片段及类节肢弹性蛋白基因片段，酶切片段经纯化后通过t4 dna连接酶连接，转化e.coli dh5α。挑取重组菌进行培养，提取质粒进行酶切验证，构建得到过渡质粒pet28a4-r16或pet28a4-r32。
57.2)对重组质粒pcg2与上述构建的质粒pet28a4-r16或pet28a4-r32利用ndei和bamhi进行双酶切，分别获得质粒载体片段及类节肢弹性蛋白r16或r32的基因片段，酶切片段经纯化后通过t4 dna连接酶连接，转化e.coli dh5α。挑取重组菌进行培养，提取质粒进行酶切验证，构建得到分泌表达质粒pcg2-r16或pcg2-r32，如图1所示。
58.利用实验室已有研究(huang sc,qian zg,dan ah,hu x,zhou ml.acs biomater.sci.eng.,2017,3,1576-1585.)构建的含有类丝节肢弹性蛋白(r4s4)5基因的表达载体pr4s4-5构建得到分泌表达质粒pcg2-r4s4-5的方法同上。
59.本实施例进一步验证重组蛋白的表达分泌，将上述各重组蛋白表达质粒分别电转至谷氨酸棒状杆菌res167，对各重组菌株进行蛋白表达分泌验证。将上述重组菌株接种至4ml bhi培养基(含有10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中，30℃，220rpm振荡培养16h后，按1％接种量转接至20ml bhi培养基(含有10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中，30℃，220rpm振荡培养至od
600
≈4.0，加入iptg至终浓度为1.0mm诱导6h，取发酵液上清进行sds-page分析，如图2和3所示。实施例3
60.本实施例通过以下操作验证融合不同信号肽的分泌表达质粒pcg
n-i16cg的构建及蛋白表达分泌水平：
61.所选信号肽序列如seq id no.6-21和23所示，并设计对应上下游引物，以谷氨酸棒状杆菌res167基因组dna为模板，进行pcr扩增获得信号肽序列，且在序列5`端和3`端分别引入hindiii和ndei位点。各信号肽序列和pcg2-i16cg质粒利用hindiii和ndei进行双酶切，酶切片段经纯化后通过t4 dna连接酶连接，转化e.coli dh5α，其中：信号肽序列cg2195、cg3393通过引物退火方式获得各自dna片段，并直接与pcg2-i16cg质粒hindiii和ndei双酶切片段进行连接后转化e.coli dh5α。挑取重组菌进行培养，提取质粒酶切验证，构建得到融合不同信号肽的重组表达质粒pcg
n-i16cg。
62.将上述表达质粒通过电转化的方法转入到谷氨酸棒状杆菌res167，并对各重组菌株进行蛋白表达分泌验证。将上述重组菌株接种至4ml bhi培养基(含有10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中，30℃，220rpm振荡培养16h后，按1％接种量转接至20ml bhi培养基(含有10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中，30℃，220rpm振荡培养至od
600
≈4.0，加入iptg至终浓度为1.0mm诱导6h，取发酵液上清进行sds-page分析，结果如图4所示，本实施例结果表明使用信号肽cg2196的重组蛛丝蛋白表达分泌能力最佳，除了信号肽cg0316及2402外，其余
所筛选的信号肽均可表达分泌重组蛛丝蛋白。
63.采用不融合蜘蛛牵引丝蛋白基因序列的重组菌株res167/pcg2作为对照菌株。实施例4
64.为进一步提高宿主菌株的表达分泌水平，本实施例以谷氨酸棒状杆菌res167为出发菌株对其进行基因改造，分别对其基因组中重组酶reca编码基因reca、rna聚合酶σ因子sigd蛋白编码基因sigd、青霉素结合蛋白pbp1a编码基因pbp1a等，序列如seq id no.25-40所示的基因进行敲除或双敲除；另外分别对序列如seq id no.33-36及41-45所示的基因进行过表达。
65.本实施例以突变菌株δreca菌株为例进行基因敲除，具体步骤包括：
66.步骤1)pk19-δreca质粒的构建：用于基因改造的原始菌株是谷氨酸棒状杆菌res167菌株，根据基因组reca基因序列如seq id no.25所示，设计两对引物，用于扩增基因组reca基因上游1000bp片段和下游1000bp片段，两对引物(recaup-f/r、recado-f/r)序列如seq id no.52-55所示。
67.以谷氨酸棒状杆菌res167菌株基因组dna为模板，利用上述两对引物分别进行pcr反应，获得reca基因上游片段和下游片段，同时为方便后续连接，引物末端要加上用于同源重组的20bp基因片段。将质粒pk19mobsacb利用sali和bamhi进行双酶切，回收5705bp片段。将上述获得的三个片段使用in-fusion hd cloning kit(clontech laboratories,inc.,mountain view,ca)进行同源重组，构建reca基因敲除所用质粒pk19-δreca。
68.步骤2)将上述敲除质粒通过电转化导入谷氨酸棒状杆菌res167菌株中，涂布于bhis(含25mg/l卡那霉素)平板30℃下培养。挑取阳性克隆对点至bhi-suc10(含25mg/l卡那霉素，10％蔗糖)平板和bhi(含25mg/l卡那霉素)平板上划线，30℃下培养。挑取在bhi-suc10平板上呈现阴性，在bhi平板上呈现阳性的重组子至无抗bhi试管中并置于30℃，220rpm摇床中过夜培养。将无抗bhi试管中的菌液稀释为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
稀释液，分别取200μl涂布于bhi-suc10平板，30℃倒置培养24小时。以recaup-f和recado-r为引物，对从上述平板挑取的克隆进行pcr，筛选reca基因敲除成功的重组子，从而得到谷氨酸棒状杆菌δreca宿主菌，如图5所示。
69.所述的序列号seq id no.26-40基因敲除菌株的构建均采用上述方法。
70.所述的bhis培养基成分为：bhi 38.5g/l，山梨醇91g/l。
71.此外，本实施例以过表达glyvxy和ncgl2316基因为例进行基因过表达处理，具体包括：
72.步骤1)质粒ptrc-gly2的构建：以文献(x.x.xia,z.g.qian,c.s.ki,y.h.park,d.l.kaplan,s.y.lee.proc.natl.acad.sci.u.s.a.,107(2010)14059
–
14063)中所提到的ptetgly2为模板，设计引物ptetgly2-f/ptetgly2-r序列如seq id no.58和seq id no.59所示进行pcr反应。为方便后续分子操作在扩增产物3`端引入sali酶切位点。将上述pcr产物利用sali进行酶切，将质粒ptrcmob进行ecorv-sali双酶切，纯化产物并使用t4 dna连接酶连接，转化e.coli dh5α，挑取重组菌进行培养，提取质粒酶切验证，构建得到ptrc-gly2过表达质粒。
73.步骤2)质粒ptrc2316的构建：将步骤1中构建所得ptrc-gly2质粒用ecorv和sali进行双酶切，琼脂糖凝胶回收6019bp基因片段；根据谷氨酸棒状杆菌res167基因组
ncgl2316基因序列如seq id no.33所示，设计一对引物over2316-f和over2316-r序列如seq id no.56-57所示，以谷氨酸棒状杆菌res167基因组为模板扩增ncgl2316基因，并使扩增产物3`端携带sali位点，利用sali酶切并进行琼脂糖凝胶回收；将上述两个基因片段通过t4 dna连接酶连接，转化e.coli dh5α。挑取重组菌进行培养，提取质粒酶切验证，构建得到过表达质粒ptrc2316。
74.步骤3)将上述过表达质粒通过电转化分别导入携带有蛛丝蛋白表达质粒的谷氨酸棒状杆菌res167菌株中，涂布于bhis(含有10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸，25mg/l卡那霉素)平板，30℃下培养。挑取阳性克隆得到过表达重组菌wt/ptrc-gly2及wt/ptrc2316。
75.所述的序列号seq id no.34-36及41-45基因过表达菌株的构建均采用ptrc2316质粒的构建方法。
76.所述的包含过表达质粒ptrc-x(x代表过表达基因)的重组菌株培养时均需额外加入终浓度为25mg/l的卡那霉素。实施例5
77.本实施例利用实施例4所构建的基因工程菌株，分别转入重组蛛丝蛋白maspi16和maspi64表达质粒，进行摇瓶发酵测试蛛丝蛋白分泌水平，具体包括：将质粒pcg8-i16cg或pcg8-i64cg(含cg2196信号肽)转入基因工程改造菌株，进行摇瓶发酵，分析蛋白表达分泌水平。将上述重组菌株接种至4ml bhi培养基(含有10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中，30℃，220rpm振荡培养16h后，按1％接种量转接至20ml bhi培养基(含有10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中，30℃，220rpm振荡培养至od
600
≈4.0，加入iptg至终浓度为1.0mm诱导6h，取发酵液上清进行sds-page分析，并利用imagej软件对蛛丝蛋白条带进行灰度分析，对各重组菌株的蛛丝蛋白相对表达分泌水平进行测定，结果如图6所示。
78.通过本实施例可见，敲除reca，pbp1a，sigd，ncgl1480，ncgl0535，ncgl1095，ncgl2717，所改造得到的δreca，δpbp1a，δsigd，δncgl1480，δncgl0535，δncgl1095，δncgl2717菌株，相比原始菌株(wt)对蛛丝蛋白maspi16和maspi64均有更优的表达分泌水平；过表达glyvxy，ncgl2356，ncgl0546，ncgl1382，ncgl2716，所得菌株相比原始菌株(wt)对蛛丝蛋白maspi16和maspi64均有更优的表达分泌水平。实施例6
79.本实施例利用重组菌株δpbp1a/pcg8-i16cg及δpbp1a/pcg8-i64cg进行高密度发酵分泌生产重组蛛丝蛋白maspi16和maspi64，具体包括：
80.步骤1)从冷冻状态下将重组菌接种至新鲜的bhi培养基(含有10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中，30℃，220rpm振荡培养16h，此为一级种子液。
81.步骤2)将一级种子液按照1％的接种量转接到200ml半合成培养基(含20g/l葡萄糖，10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中，30℃，220rpm振荡培养至od
600
≈28，此为二级种子液。
82.步骤3)将制备好的二级种子液接种至2l半合成培养基(含10mg/l氯霉素，50mg/l萘啶酮酸)中进行分批补料高密度发酵培养。具体步骤包括：将二级种子液按10％的接种量转接到无菌发酵罐中，设定发酵温度为30℃，ph为7.0，do设定为30％(通过转速/溶氧联动进行控制)。随后发酵开始，定期取样进行od
600
测定，待do曲线出现急剧上升时表明培养基中葡萄糖耗尽，开始进行补料。待菌体生长至od
600
≈60时，向发酵罐中加入iptg至终浓度为
1.0mm进行诱导，诱导15-18h结束培养。发酵结束后，发酵液于7,024g，4℃，离心20min，收集上清进行sds-page分析。菌体生长曲线、蛛丝蛋白分泌量和蛛丝蛋白分泌水平分析结果如图7所示。
83.采用转入空白质粒的重组菌株wt/pcg8作为对照菌株。
84.所述的半合成培养基主要成分包括：磷酸氢二钾3g/l，磷酸二氢钾1g/l，尿素2g/l，硫酸铵10g/l，硫酸镁2g/l，生物素0.2mg/l，硫铵素5mg/l，泛酸钙10mg/l，硫酸亚铁10mg/l，硫酸锰1mg/l，硫酸锌1mg/l，氯化钙10mg/l，酵母浸粉2g/l，酪蛋白氨基酸7g/l，葡萄糖20g/l。
85.所述的补料液为700g/l葡萄糖溶液。
86.上述任何用于菌体培养的器皿和培养基均在使用前进行过滤除菌或湿热灭菌。该实施例中所述的蛛丝蛋白分泌量是利用考马斯亮蓝染色估算所得，由于蛛丝蛋白中精氨酸和芳香族氨基酸氨基酸含量较低，使用该方法估算值会偏低，后续通过纯化目的蛋白，进一步准确计算分泌产量。实施例7
87.本实施例阐明对谷氨酸棒状杆菌发酵生产得到的目的蛋白进行两步沉淀法纯化的方法及步骤，通过该方法可计算出目的蛋白的分泌量最高可达2.2g/l，能够得到的重组蛛丝蛋白纯度(电泳纯)可达到47-93％，且蛋白可溶于水，后续经过浓缩浓度可以达到400-600mg/ml。纯化过程中的sds-page检测结果如图8所示，具体步骤包括：
88.步骤1)取高密度发酵结束后的发酵液，使用低温离心机7,024g，4℃，离心20min，收集发酵液上清；
89.步骤2)取上述上清，利用1.32m hcl调节ph为4.0，室温搅拌2h；
90.步骤3)取上述溶液进行离心，15,422g，4℃，离心10min，收集上清；
91.步骤4)收集上述上清，加入终浓度为10％或25％(w/v)的饱和硫酸铵，室温搅拌1h；
92.步骤5)取上述溶液进行离心，15,422g，4℃，离心10min，收集沉淀，冷冻干燥称重计算蛋白质量及浓度，将沉淀使用去离子水重悬，即为目的蛋白溶液。
93.与现有技术相比，采用本方法实现重组蛛丝蛋白、类节肢弹性蛋白或类丝节肢弹性蛋白等序列高度重复蛋白在谷氨酸棒状杆菌中的表达分泌，通过对信号肽序列的筛选及谷氨酸棒状杆菌atcc13032 res167的宿主代谢改造，成功构建可以高效表达分泌重组蛛丝蛋白的表达载体及谷氨酸棒状杆菌重组菌，并建立高密度发酵工艺实现重组蛛丝蛋白的高效表达分泌，分泌产量最高达约2.2g/l。本发明采用的谷氨酸棒状杆菌表达分泌体系，使目的蛋白直接分泌到胞外，并实现两步沉淀法快速分离纯化得到可水溶的重组蛛丝蛋白，大大减化纯化流程及成本，为后续蜘蛛牵引丝蛋白的应用奠定基础。
94.综上，本发明通过筛选可用于目的蛋白分泌型表达的信号肽，系统改造谷氨酸棒状杆菌提升目的蛋白的表达分泌水平，在革兰氏阳性菌(谷氨酸棒状杆菌)中首次实现类蛛丝蛋白、类弹性蛋白、类丝弹性蛋白的分泌型表达，所得最优菌株分泌蛛丝蛋白的能力可达2.2g/l，是目前所有宿主分泌蛛丝蛋白的最高水平；由于蛛丝蛋白在分泌培养基中的含量高，因而可通过两步简单沉淀纯化方法获得纯度高达93％及水溶性高达660mg/ml的蛛丝蛋白。
95.上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。