人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法及应用与流程

技术特征：
1.一种人baf45d融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：构建人baf45d原核表达载体，获得重组质粒pgex-5x-1-baf45d；gst-baf45d融合蛋白的原核表达：将所述重组质粒pgex-5x-1-baf45d转入rosetta(de3)大肠杆菌，经iptg诱导表达，获得菌体沉淀；破碎细菌，收集上清；gst-baf45d融合蛋白的纯化：将经过原核表达获得的上清经gst resin离心纯化。2.如权利要求1所述的人baf45d融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述iptg诱导表达的参数为：采用终浓度为0.3mm iptg，30℃、250rpm震荡培养诱导表达5h。3.如权利要求1所述的人baf45d融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述iptg诱导表达的步骤，具体为：挑取已转入质粒大肠杆菌菌种gst-baf45d-rosseta接种于lb液体培养基中，震荡过夜，获得过夜培养物；将所述过夜培养物接种到lb液体培养基中，震荡培养至od
600
＝0.4-0.8后，加入100mm iptg至终浓度为0.3mm，30℃、250rpm震荡培养诱导表达5h后，离心培养物，弃去上清，获得菌体沉淀。4.如权利要求1所述的人baf45d融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述破碎细菌的步骤，具体为：预冷细菌裂解液，以100ml菌液沉淀比6-8ml细菌裂解液的比例将菌体沉淀悬起，收集后进行冰浴超声破碎细菌，收集上清。5.如权利要求4所述的人baf45d融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述细菌裂解液的组成为50mm tris、1mm edta、1％tritonx100、5mm dtt、2mm pmsf，ph＝8。6.如权利要求4所述的人baf45d融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述超声的参数具体为：40％-60％功率425w，超声4s，停8s，工作4-6min。7.如权利要求1所述的人baf45d融合蛋白表达和纯化方法，其特征在于，所述gst resin离心纯化的步骤，具体为：取30-50μl gst resin与1500-2000μl gst-baf45d-rosseta细菌裂解的gst-baf45d总蛋白，4℃孵育3小时，收集沉淀；使用1000-2000μl细菌裂解液洗杂质蛋白，在冰上振摇5min,收集沉淀；重复清洗杂质蛋白3次，收集沉淀，获得纯化后的gst-baf45d融合蛋白。8.一种寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤：提供纯化的gst-baf45d融合蛋白，其采用如权利要求1-7任一项所述的人baf45d融合蛋白表达和纯化方法获得；采用gst-pull down方法将所述gst-baf45d纯化蛋白与人胚胎干细胞来源的真核总蛋白结合，寻找鉴定人胚胎干细胞来源的结合蛋白。9.如权利要求8所述的寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞来源的真核总蛋白选自h9细胞蛋白、nccit细胞蛋白或纯化后的his-smad3蛋白。10.如权利要求8所述的寻找并鉴定人胚胎干细胞来源的真核蛋白的结合蛋白的方法，其特征在于，所述gst-pull down方法的步骤具体为：将所述gst-baf45d融合蛋白和600-1000μl人胚胎干细胞来源的真核总蛋白于4℃旋转孵育过夜，收集沉淀；沿壁缓慢加入1-2ml np-40裂解液清洗beads，收集沉淀，并重复清洗
beads 5-6次；向收集的沉淀中加入sds上样缓冲液，连同input一起100℃煮沸4-6min；经sds-page处理后ib验证。

技术总结
本发明公开了一种人BAF45D融合蛋白表达和纯化方法及应用，包括：构建人BAF45D原核表达载体，获得重组质粒pGEX-5X-1-BAF45D；GST-BAF45D融合蛋白的原核表达：将所述重组质粒pGEX-5X-1-BAF45D转入Rosetta(DE3)大肠杆菌，经IPTG诱导表达，获得菌体沉淀；破碎细菌，收集上清；GST-BAF45D融合蛋白的纯化：将经过原核表达获得的上清经GST Resin离心纯化。该方法可实现菌体的高效表达，并获得高活性的GST-BAF45D融合蛋白，从而能够将其与人胚胎干细胞裂解总蛋白结合孵育，可简便的筛选出与目的蛋白结合的人胚胎干细胞来源的蛋白，具有实际应用价值。用价值。用价值。


技术研发人员：刘超 陈雪莹 刘丽华
受保护的技术使用者：安徽医科大学
技术研发日：2021.11.02
技术公布日：2022/3/7