一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法与流程

1.本发明属于生物技术检测领域，尤其涉及一种快速高效提取和检测人血浆中二十五种色氨酸及其代谢产物的新方法。


背景技术：

2.肠道微生物群在人体生理学中起着重要作用，其中许多都是通过肠道菌群本身产生的代谢物，或由环境或宿主的分子通过肠道菌群转化而来的代谢物介导的。在这些代谢产物中，有一种是必需的芳香族氨基酸色氨酸(trp)。在肠道菌群直接或间接作用下，肠道中有三种主要trp代谢途径，其代谢产物有血清素(5-羟色胺)、犬尿氨酸(kyn)和吲哚类衍生物。trp代谢的紊乱与炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征和相关并发症(糖尿病、肥胖症，非酒精性脂肪肝(nafld)、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化，以及神经精神特性(尤其是焦虑、抑郁和孤独症)等密切相关，因此成为是近年来研究最多的一类肠道菌群代谢物。
3.然而，目前对这类物质存在着前处理制备方法成本较高、提取耗费时间较长且样品得率少导致检测困难等问题。因此如何开发一种低成本、快捷、能够提高目标产物的得率，提高质谱检测限、降低检测噪声的方法是现有技术有待解决的关键技术问题。


技术实现要素：

4.基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种快速高效提取和检测人血浆中二十五种色氨酸及其代谢产物的新方法，通过优化提取方法步骤，质谱上机检测参数等因素，解决目前对这类物质检测存在着的一些关键技术问题。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法，其先向生物样品加入同位素标记的色氨酸及代谢物作为内标，再通过液-液萃取法提取样品混合物中的色氨酸及其代谢物，使用高效液相将样本中的色氨酸及其代谢物分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析。
7.根据以上方案，使用到的稳定性同位素内标物有9种，分别是犬尿氨酸-d4(l-kynurenine-d4)，2-吡啶-d4-甲酸(2-picolinic-d4 acid)，5-羟基吲哚-3-乙酸-2,2-d2(5-hydroxyindole-3-acetic-2，2-d2 acid)，3-羟基邻氨基苯甲酸-d3(3-hydroxyanthranilic acid-d3)，色胺盐-d4(tryptamine-d4 hydrochloride)，褪黑激素-d4(melatonin-d4)，3-硫酸吲哚酚-d4-钾盐(3-indoxyl sulfate-d4 potassium salt)，盐酸血清素-d4(serotonin-d4 hydrochloride)，吲哚-d7(indole-d7)。
8.根据以上方案，所述的一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法包括以下详细步骤：
9.步骤s1，配制系列浓度的标准品溶液和内标工作液；
10.步骤s2，分别向待测样本和系列浓度的标准品溶液加4倍体积的甲醇乙腈溶液，再分别加入内标工作液，涡旋混合，冰浴中超声处理30min，超声波功率：600w，超声波频率
40khz；
11.步骤s3，取纯甲醇过hlb板，采用正压过滤，弃滤液；再取提取液过hlb板，采用正压过滤，弃滤液；
12.步骤s4，取步骤s2中获得的各待测样本和标准品，经14000rcf 4℃离心15min，再过经步骤s3处理的hlb板，收集滤液并冷冻干燥，得冻干粉末备用；
13.步骤s5，取步骤s4中获得的冻干粉末用含1％甲酸的40％甲醇溶液复溶，涡旋混匀，14000rcf 4℃离心15min，离心后取上清液上样进行lc-ms/ms分析。
14.根据以上方案，所述的步骤s2中的甲醇乙腈溶液的比例是甲醇：乙腈＝1：1；所述的步骤s3中的提取液是各组分体积比为水/甲醇/乙腈＝1:2:2的溶液。
15.根据以上方案，所述的步骤s4中，最后获得的冻干粉末采用-80℃保存。
16.根据以上方案，所述的液相色谱的条件如下：
17.流动相：a相：20mm甲酸铵 0.2％fa水溶液(称取630mg甲酸铵溶于500ml纯水中)，加入0.2％甲酸溶液(约加入1ml甲酸)，室温保存，有效期5天；b相：0.2％fa甲醇溶液(量取500ml甲醇溶液，加入1ml甲酸)，室温保存，有效期30天。
18.洗脱梯度(a相 b相＝100％)：
19.0-2min，b相维持在15％；
20.2-9min，b相从15％线性变化至98％；
21.9-11min，b相维持在98％；
22.11-11.5min，b相从98％线性变化至15％；
23.11.5-14min，b相维持在15％；
24.流速：400μl/min；柱温：40℃；进样量：5μl。
25.根据以上方案，所述的质谱条件如下：
26.esi源离子源温度(temperature(tem))：450℃；离子源雾化气(ion source gas1(gs1))：45psi；离子源加热辅助气(ion source gas2(gs2))：45psi；气帘气(curtain gas(cur))：40psi；喷雾毛细管电压(ionspray voltage(is))：4500v(-4500v)；apci源离子源温度(temperature(tem))：550℃；离子源雾化气(ion source gas1(gs1))：50psi；离子源加热辅助气(ion source gas2(gs2))：0psi；气帘气(curtain gas(cur))：40psi；喷雾毛细管电压(ionspray voltage(is))：4500v。
27.本发明的有益效果是：
28.1、本发明提供的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理方法简单。
29.2、对体液类样本只需要简单的液液萃取就可以完成样本的预处理步骤，使用waters acquity uplc i-class系统能够有效分离25种色氨酸，通过99种同位素内标进行定量，能够准确检测人血浆中的重要色氨酸及其代谢产物，方法精密度和准确度较高，可用于临床多种样本的定量分析，而且实验操作简单、实验周期短，为临床上色氨酸水平的健康评估提供了一种可靠的检测方法，为科研提供了一种有效的研究手段。
附图说明
30.图1是实施例中色氨酸及其代谢产物标准品xic图。
31.图2是实施例中l-kynurenine标准曲线结果图。
32.附图均为lc-ms/ms检测分析结果图，为实施例中的结果展示，图中文字均为结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行说明。
34.一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法，其先向生物样品加入同位素标记的色氨酸及代谢物作为内标，再通过液-液萃取法提取样品混合物中的色氨酸及其代谢物，使用高效液相将样本中的色氨酸及其代谢物分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析，包括以下详细步骤：
35.步骤s1，配制系列浓度的标准品溶液和内标工作液；
36.步骤s11配制内标工作液母液，分别称取同位素内标品色氨酸及代谢物，加入50％甲醇溶液溶解，配制成溶液后，混合并用50％甲醇配制成200ug/ml混合内标工作液，备用；所述的同位素内标品色氨酸及代谢物包括l-kynurenine-d4(犬尿氨酸-d4)，2-picolinic-d4acid(2-吡啶-d4-甲酸)，5-hydroxyindole-3-acetic-2，2-d2 acid(5-羟基吲哚-3-乙酸-2,2-d2)，3-hydroxyanthranilic acid-d3((3-羟基邻氨基苯甲酸-d3)，tryptamine-d4hydrochloride(色胺盐-d4)，melatonin-d4(褪黑激素-d4)，3-indoxyl sulfate-d4 potassium salt(3-硫酸吲哚酚-d4-钾盐)，serotonin-d4 hydrochloride(盐酸血清素-d4)，indole-d7(吲哚-d7)；
37.步骤s12配制混合标准品溶液母液，分别称取色氨酸及代谢物标准品，加入50％甲醇溶液溶解后混合均匀，配制成23种标准品浓度为100ug/ml，剩余2种浓度为1000ug/ml的混合标准品溶液，配置的混标用50％甲醇稀释20倍后使用。所述的标准品色氨酸包括l-kynurenine(犬尿氨酸)，picolinic acid(吡啶甲酸)，5-hydroxyindole-3-acetic acid(5-羟基吲哚-3-乙酸)，3-hydroxyanthranilic acid(3-羟基邻氨基苯甲酸)，tryptamine(色胺)，indole(吲哚)，melatonin(褪黑激素)，3-indoxyl sulfate(3-硫酸吲哚酚)，xanthurenate(黄尿酸)，quinolinic acid(喹啉酸)，n-formyl-kynurenine(n-甲酰基犬尿氨酸)，cinnavalininate(朱砂酸)，3-hydroxyl-l-kynurenine(3-羟基犬尿氨酸)，indole-3-carboxaldehyde(吲哚-3-甲醛)，3-methyl-indole(3-甲基吲哚)，indole-3-propionic acid(吲哚-3-丙酸)，kynurenate(犬尿胺酸)，indole-3-lactic acid(吲哚-3-乳酸)，indoxyl-β-d-glucuronide(3-吲哚基-β-d-葡糖苷酸)，5-hydroxyl-l-tryptophan(5-羟基-l-色氨酸)，serotonin(血清素)，indoleacetate(iaa，吲哚乙酸)，indole-3-acetaldehyde(吲哚-3-乙醛)，tryptophan(色氨酸)，nad(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，色氨酸标准品的混合溶液成分配制如下方表1所示：
38.表1色氨酸25种标准品混合溶液配制成分浓度表。
[0039][0040][0041]
步骤s13配制系列浓度的标准品溶液，使用50％甲醇溶液将步骤s12获得的混合标准品母液首先稀释至5000ng/ml，再分梯度稀释12个点至1ng/ml，得到系列浓度的标准品溶液，如下表2。
[0042]
表2色氨酸标准品溶液梯度稀释表
[0043][0044]
步骤s2，分别取待测样本和各系列浓度的标准品溶液各100ul，加入400ul预冷的
甲醇乙腈溶液(甲醇:乙腈＝1:1)，使用50％甲醇溶液将步骤s11获得的内标工作液母液首先稀释至2μg/ml，再向待测样本和各系列浓度的标准品溶液分别加入10μl浓度为2μg/ml的内标工作液，涡旋混匀30s，冰浴中超声30min，超声波功率：600w，超声波频率40khz。
[0045]
步骤s3，用排枪吸取400ul纯甲醇过hlb板，采用正压装置正压(切勿压干)，弃去滤液；用排枪吸取400μl提取液(水/甲醇/乙腈＝1:2:2，v/v)过hlb板，采用正压装置正压(切勿压干)，弃去滤液。
[0046]
步骤s4，取步骤s2中获得的各待测样本和标准品，经14000rcf 4℃离心15min，再取离心后的上清液400μl过经步骤s3处理的hlb板，收集滤液并冷冻干燥，得冻干粉末备用，非立即使用的冻干粉末可以采用-80℃保存。
[0047]
步骤s5，取步骤s4中获得的冻干粉末用150μl含1％甲酸的40％甲醇溶液复溶，涡旋混匀30s，14000rcf 4℃离心15min，离心后取上清液上样进行lc-ms/ms分析；所述的液相色谱的条件如下：
[0048]
流动相：a相：20mm甲酸铵 0.2％fa水溶液(称取630mg甲酸铵溶于500ml纯水中)，加入0.2％甲酸溶液(约加入1ml甲酸)，室温保存，有效期5天；b相：0.2％fa甲醇溶液(量取500ml甲醇溶液，加入1ml甲酸)，室温保存，有效期30天。
[0049]
洗脱梯度(a相 b相＝100％)：
[0050]
0-2min，b相维持在15％；
[0051]
2-9min，b相从15％线性变化至98％；
[0052]
9-11min，b相维持在98％；
[0053]
11-11.5min，b相从98％线性变化至15％；
[0054]
11.5-14min，b相维持在15％；
[0055]
采用uplc系统进行分离，各样品置于4℃自动进样器中；流速：400μl/min；柱温：40℃；进样量：5μl。
[0056]
根据以上方案，所述的质谱条件如下：
[0057]
采用5500qtrap质谱仪(sciex)在正/负离子模式下进行质谱分析。5500qtrap esi源正离子条件如下：离子源温度(temperature(tem))：450℃；离子源雾化气(ion source gas1(gs1))：45psi；离子源加热辅助气(ion source gas2(gs2))：45psi；气帘气(curtain gas(cur))：40psi；喷雾毛细管电压(ionspray voltage(is))：4500v；5500qtrap esi源负离子条件如下：离子源温度(temperature(tem))：450℃；离子源雾化气(ion source gas1(gs1))：45psi；离子源加热辅助气(ion source gas2(gs2))：45psi；气帘气(curtain gas(cur))：40psi；喷雾毛细管电压(ionspray voltage(is))：-4500v。5500qtrap apci源条件如下：离子源温度(temperature(tem))：550℃；离子源雾化气(ion source gas1(gs1))：50psi；离子源加热辅助气(ion source gas2(gs2))：0psi；气帘气(curtain gas(cur))：40psi；喷雾毛细管电压(ionspray voltage(is))：4500v；采用mrm模式检测待测离子对以及同位素内标色氨酸离子对。
[0058]
各离子对及其对应的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数如下：
[0059]
色氨酸物mrm参数-esi正离子：
[0060][0061]
[0062][0063]
色氨酸物mrm参数-esi负离子：
[0064]
[0065][0066]
色氨酸物mrm参数-apci：
[0067]
q1q3timeanalytedpepce117.991.22024_indole_q891027117.9652024_indole89104413177.12025_3-methyl-indole_q9210461311032025_3-methyl-indole_192103813077.12025_3-methyl-indole_219010451301032025_3-methyl-indole_3190103812496.120is9_indole-d6_1111103012497.120is9_indole-d6_210010291246920is9_indole-d6_31201046
[0068]
q1、q3为mrm检测离子对，dp是去簇电压，ep是碰撞电压，ce是碰撞池出口电压。
[0069]
25种色氨酸在c18色谱柱上的rt值及对应内标如下：
[0070]
[0071][0072][0073]
质谱分析结果如图1所示，有效分离25种色氨酸及代谢物，并进行定量分析，其中系列浓度标准品的分析结果用于绘制标准曲线，如图2。
[0074]
下面对本实施例的检测结果作进一步的分析，以验证本发明专利提供的方法可行
性：
[0075]
采用同位素内标定量法，以色氨酸标准品浓度为x轴，色氨酸标准品峰面积与内标物峰面积比为y轴，建立标准曲线。根据该曲线计算血浆中色氨酸的浓度。结果如下：
[0076][0077]
结果表面：25种色氨酸在各自浓度线性范围内呈良好的线性关系，满足定量要求，且能快速、方便、稳定和准确地定量检测血浆中的色氨酸。
[0078]
本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。