用于检测生物分子的探针测定的制作方法

用于检测生物分子的探针测定
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年5月24日提交的sg临时申请号10201904711x的优先权权益，其内容以全文引用的方式并入本文以用于所有目的。
技术领域
3.本发明一般涉及分子生物学领域。特别地，本发明涉及基于核酸的检测探针的用途。


背景技术：

4.使用实验测定法检测和鉴定样品中的分子在实验室中发挥着重要作用。生物分子相互作用，例如用于信号转导的细胞受体聚集、感染过程中的宿主-细胞相互作用以及蛋白质复合物内的相互作用，参与到许多生物过程中。尽管具有生物学意义，但缺乏用于直接检测此类多目标活动的简单分子工具箱。传统的分析方法通常需要人工对应物来捕获相互作用的配偶配偶体，或大量的样品处理以将生物分子与其原始环境分离，例如下拉测定(pull-down assays)和凝胶阻滞测定。dna电路是一种多功能且高度可编程的工具箱，其可用于动态事件例如生物分子相互作用的自主感知。然而，计算机电路设计(in silico circuit designs)的实验实施受到电路泄漏问题的阻碍。因此，需要具有降低的电路泄漏率的基于探针的测定以用于检测生物分子。


技术实现要素：

5.在一个方面，本公开涉及一种用于检测一种或多种目的靶标的存在的组合物，其中所述组合物包含以下组分：根据结构i的第一发夹引发剂分子，其中所述结构包含结构域a、b1*、b2、b2*、e、e*、s和x*；其中相邻结构域彼此直接连接或通过连接子连接；其中结构域x*与一种或多种目的靶标结合或互补；其中结构域b1*形成发夹环；其中结构域b2*和b2具有相同的长度并且彼此互补；其中结构域b2*和b2的长度至少为2个核苷酸；其中结构域e和e*具有相同的长度，长度至少为2个核苷酸，并且彼此互补；其中结构域a的长度至少为3个核苷酸；其中结构域s是间隔子；和根据结构ii的第二引发剂分子，其中所述结构包含结构域a*、c*、e*、s’和y*；其中结构域y*与一种或多种目的靶标互补或结合；其中结构域a和a*彼此互补；其中结构ii的结构域e*长度至少为2个核苷酸并且在结合目的靶标后与结构i的结构域e结合，其中结构域c*能够结合至信号产生分子/信号产生复合物；并且其中结构域s’是间隔子，其中选择结构域s和s’的长度以允许结构域b1*、b2*和c*在结合时彼此相邻。
6.在另一方面，本公开涉及一种用于检测样品中的一种或多种目的靶标的方法，所述方法包括提供被认为包含所述一种或多种目的靶标的样品并使用如本文公开的组合物检测所述一种或多种目的靶标，其中每种组合物对一个目的靶标是特异性的。
7.在又一方面，本公开涉及一种用于检测样品中一种或多种目的靶标的存在的方法，所述方法包括将一种或多种如本文公开的组合物添加到所述样品中；允许所述一种或
多种组合物与被认为包含在所述样品中的所述一种或多种目的靶标结合；测量由所述组合物与所述目的靶标结合产生的一种或多种信号；其中一种或多种信号的产生检测到所述样品中存在所述目的靶标中的一种或多种。
8.在另一方面，本公开涉及一种鉴定疾病的方法，所述方法包括将一种或多种如本文公开的组合物添加到从怀疑患有所述疾病的受试者获得的样品中；允许所述一种或多种组合物与所述一种或多种目的靶标结合；测量由所述组合物与所述目的靶标结合产生的一种或多种信号；和鉴定所述疾病，其中一种或多种信号的存在指示所述样品中存在所述目的靶标中的一种或多种；并且其中所述目的靶标中的一种或多种是疾病特异性的。
9.在另一方面，本公开涉及一种包含本文定义的组合物的试剂盒。
附图说明
10.当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细说明将更好地理解本发明，其中：
11.图1显示了动态伸长的缔合立足点的概念示意图，以及图中所示的每个结构域的相互作用配偶体。现有技术中已知的用于常规缔合立足点设计的引发剂被修饰为包含发夹锁，在该图中被称为发夹引发剂(hp-i1)。发夹锁的特征在于存在额外的结构域e和使用先前公开的结构域b*的一部分(现在表示为结构域b2*)作为夹子，以在没有触发事件的情况下保持发夹亚稳定性。(步骤1)在两个识别位点(表示为结构域x和y)处的靶标结合后，(步骤2)将两个引发剂(分别表示为hp-i1和i2，或结构i和ii)接近以稳定结构域a处的杂交。(步骤3)然后发夹锁被i2(结构ii)上的结构域e*部分置换，然后(步骤4)解离结构域b2*。初始状态具有较短的缔合区域(结构域a)，泄漏率较低；而在靶标结合时打开发夹锁后的最终状态被更长的缔合区域(结构域a e)有效地稳定，因为这种伸长机制产生更强的信号。
12.图2显示了针对不同构型的发夹引发剂1(hp-i1；也称为结构i)设计获得的福斯特共振能量转移(fret)比率的比较结果。每个发夹设计的结构域b2、e和a的长度分别显示在图表的左侧。浅灰色条是指没有添加靶标(表示潜在的背景噪声或泄漏)，而深灰色条是指添加了20nm靶标(指示信号产生)。每个设计的信噪比(s/n)都被呈现为折线-散点图。n.s.不显著；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。目的是实现最低可能的(背景)噪声，同时实现最高可能的信号。因此，s/n值越高，信号相比噪声越高。
13.图3显示了描绘不同发夹引发剂1(hp-i1)设计的信噪比(s/n)的曲线图。绘制了一根截止线以突出显示两组s/n——例如通过hp3、hp7和hp9设计获得高s/n，这些设计被入选用于进一步调查。该曲线图显示了不同发夹引发剂1设计对“信噪比”(s/n)的影响，从而如上所述，目的是实现最低可能的(背景)噪声，同时实现最高可能的信号。因此，s/n值越高，信号相比噪声越高。
14.图4显示了使用动态伸长的缔合立足点概念的泄漏抑制的结果，其一般原理在图1中例证。(a)显示在不存在靶标的情况下，当各个引发剂用于分离式接近电路(spc)反应时，电路泄漏的演变。与具有等同的有效缔合长度的常规引发剂设计相比，发夹引发剂显示出显著抑制泄漏。(b)显示发夹引发剂设计的信噪比(s/n)高于常规引发剂设计，无论缔合区域的长度如何。
15.图5显示的数据说明了使用伸长缔合立足点的动力学和热力学。(a)将发夹引发剂设计(结构域a
→
a e)的性能与先前设计的单链引发剂设计(仅有结构域a)和伸长后(结构
域a e)进行比较。与常规引发剂设计相比，发夹引发剂设计改善了分离式接近电路(spc)的动力学和热力学，并且非常接近伸长缔合域的性能，(b)有效缔合长度是4
→
6个核苷酸(nt)，(c)是5
→
8个核苷酸，(d)是6
→
9个核苷酸。所有数据都显示为平均值
±
s.d.(n＝3)。
16.图6显示了由分离式接近电路(spc)产生的分析性能的数据。(a)当用0-10nm的分离触发剂(split trigger，st)滴定时，a6-9发夹引发剂设计的分离式接近电路(spc)的动力学。(b)福斯特共振能量转移(fret)比率线性依赖于a4-6、a5-8和a6-9设计的分离触发剂(st)浓度。所有数据都显示为平均值
±
s.d.(n＝3)。(c)显示了针对所描绘的表中公开的发夹引发剂设计的每个缔合域确定的检测限(lod；以nm显示)的概述。(c)中所示的该信息也被呈现为表1。
17.图7显示的数据说明了在25℃使用hp3设计在1x pbs(ph 7.4)中的不同mg
2
浓度下评估的分离式接近电路(spc)的动力学。所有数据均显示为平均值
±
s.d(n＝3)。随着mg
2
浓度的增加，信背(s/b)比显著提高，并且5mm mg
2
获得最佳s/b比。本实验中使用的最终缓冲液组合物是1x pbs(ph 7.4)和5mm mgcl2，用于20nm hp-i1、20nm i2、40nm hp1和20nm hp2。
18.图8提供的示意图显示本文公开的基于dna的测定是基于模块化设计，其由三个关键步骤组成：1)靶标识别、2)信号转导和3)信号产生。作为读出信号的一个实例，使用杂交链反应，其通过包含两个发夹单体(hp1和hp2)来指示，用于放大信号。在本实例中，四种寡核苷酸(或缀合物)探针混合并直接添加到样品中，以在存在靶标的情况下产生荧光信号(fret)。
19.图9显示了与可以使用本文公开的组合物检测的其他类别的生物分子的实例有关的数据。这表明本技术中公开的主题的普遍应用。(a)显示了当不同的引发剂组合与不同的病毒链分别反应30分钟时获得的福斯特共振能量转移(fret)比率的热图。(b)显示了在分析以下七(7)个g6pd模型时获得的fret比率结果：canton、riverside、union、mahidol、mediterranean(med)、a 和kaiping。“nc”是指阴性对照设置，其中没有将目标链添加到反应中。*p《0.05；**p《0.01(单尾学生t检验)。(c)显示的数据表明电路区分了let-7家族成员的微小rna，其中存在对let-7a的高选择性，而探针是为了let-7a而被设计的。**是指p《0.01(n＝3)；***是指p《0.005(n＝3)。(d)显示的数据表明电路检测到her2:her3异源二聚体(亮点)，它们是存在于乳腺癌细胞(au565)上的细胞表面蛋白受体。该图像是在孵育30分钟后使用共聚焦显微镜获得的。在任何相关的地方，所有数据都显示为平均值
±
s.d.(n＝3)。
20.图10显示了使用本文公开的组合物产生信号的一个实例。继图1所示的最后一个构建体之后，当hp-i1和i2接近时，现在呈现出完整的触发链(由结构域c*和b*表示)。然后使用完整的触发链通过下游dna杂交反应产生读出信号。在这个实例中，它以级联方式触发两个亚稳态发夹(例如hp1和hp2)的打开，以通过称为杂交链反应的过程形成一条长的、扩增的dna链，并在这个实例中产生福斯特共振能量转移(fret)信号作为读出信号，表明存在目的靶标并结合至目的靶标。
具体实施方式
21.本文讨论了一种基于分离式接近电路(spc)概念设计的分子。分离式接近电路是
一种多功能且高度可编程的工具箱，其可用于自主感知靶分子(如核酸、蛋白质和蛋白质复合物)或动态事件(如生物分子相互作用)。此类电路可以使用核酸产生，例如但不限于dna和rna。人们认为开发分离式接近电路可以提高结合动力学而不会引起额外的电路泄漏。如本文所用，术语“电路泄漏”是指在不存在一种或多种目的靶标的情况下由dna链之间的随机杂交产生的背景信号。
22.缔合立足点是一个灵活的概念，其中立足点和分支迁移域在分开的dna链上解开，然后可以在稍后被激活以响应于特定的杂交事件进行重新组装。它建立在远程立足点的概念之上，其中以立足点介导的链置换可以跨非相邻结构域进行，尽管对动力学不利。传统的缔合立足点涉及在添加特定输入后在分开的单链dna链上发现的完整触发域的动态重组。通常，限速步骤是短结合区的杂交。由于期望信号和不期望的泄漏反应(引起背景噪声)都可以由单个参数(即缔合域的长度)确定，因此此类系统存在固有限制，其中更长的缔合域必然导致更强的信号产生和更高的背景噪声。如本文所用，术语“立足点”是指将反应物dna分子共定位并引发链置换反应的短单链核酸片段。术语“缔合立足点”是指一种形式的立足点设计，其中活性电路域位于分开的核酸链上，并通过激活事件(例如靶标结合)进入相邻位置。
23.本文公开了使用先前报道的分离式接近电路(spc)基于改进型缔合立足点的概念的分子和组合物。改进型缔合立足点的特点是当由特定靶标触发时缔合区域的动态伸长，从而协调期望反应率和泄漏率之间的权衡(图1)。举例来说，这种动态伸长是通过在引发剂1(i1)中添加发夹锁设计来实现的，所述发夹锁设计包括额外的结构域e(对应于伸长的程度)和先前公开的立足点结构域b*的一部分(在本文中表示为结构域b2*)作为保持发夹亚稳定性的夹子(参见ang等人,nucleic acids research,2016,第44卷,第14e121期)。ang等人公布的分离式接近电路(spc)是基于传统的缔合立足点设计，当缔合长度增加时，所述设计会在增加的信号产生和增加的电路泄漏之间进行权衡。因此，ang等人(2016)报道的旧设计也涉及线性引发剂，而不是本文公开的发夹引发剂，所述旧设计的电路动力学和信噪比缓慢，这限制了其实际应用。本公开中引入的发夹引发剂设计能够在由发夹锁介导的伸长之后使用更长的缔合域，这将电路动力学加速了四倍以上(使用基于本公开的设计)并将信噪比增加了高达10倍。
24.自由溶液中暴露缔合区域的初始长度对应于结构域a的长度。在靶标结合后，根据分离式接近电路设计使两条引发剂的链紧密接近。这通过与结构域a和e结合促进了i1上发夹锁的打开，其有效地成为了新的、伸长的缔合区域。结构域b2*夹子自发解离以暴露剩余的立足点结构域b1*。最终组件保留了先前公开的触发域(c*b*)，尽管在i1的3’端有一个结构域e*突出端，由于更长的缔合区(它是结构域a和e的组合长度)，所述结构域e*突出端使st-i1-i2组件具有提高的稳定性。
25.因此，在一个实例中，公开了一种用于检测一种或多种目的靶标的存在的组合物。在一个实例中，组合物包含根据结构i的第一发夹引发剂分子：
[0026][0027]
其中所述结构包含结构域a、b1*、b2、b2*、e、e*、s和x*。为清楚起见，用星号表示的结构域表示结合到具有相同名称但没有星号的结构域的结构域。例如，如图1所示，结构域a和结构域a*相互结合；结构域x结合到结构域x*，并且结构域y结合到结构域y*。在一个实例中，相邻结构域彼此直接连接或通过连接子连接；结构域x*与一种或多种目的靶标结合或互补；结构域b1*形成发夹环；结构域b2*和b2具有相同的长度并且彼此互补，结构域b2*和b2的长度至少为2个核苷酸；结构域e和e*具有相同的长度并且彼此互补；结构域e和e*的长度至少为2个核苷酸；结构域a的长度至少为3个核苷酸；结构域s是可变长度的间隔子，其中选择间隔子长度以允许第二引发剂分子的结构域x*和结构域y*与一种或多种目的靶标结合。在另一个实例中，结构域b1*、b2*和c*将彼此相邻。例如，在靶标结合时就是这种情况。也就是说，靶标结合用于使结构域b1*、b2*和c*彼此相邻。
[0028]
本文还公开了根据结构ii的第二引发剂分子，
[0029][0030]
其中所述结构包含结构域a*、c*、e*、s’和y*。在一个实例中，结构域y*与结构域x
相邻或下游的一种或多种目的靶标互补或结合，其中结构域x位于目的靶标上；结构域a和a*彼此互补；结构域e*如本文所定义；结构域c*被构造成与信号产生分子/信号产生复合物结合；并且其中结构域s’如本文所定义。
[0031]
在另一个实例中，所述组合物包含以下组分：根据结构i的第一发夹引发剂分子，其中所述结构包含结构域a、b1*、b2、b2*、e、e*、s和x*；其中相邻结构域彼此直接连接或通过连接子连接；其中结构域x*与一种或多种目的靶标结合或互补；其中结构域b1*形成发夹环；其中结构域b2*和b2具有相同的长度并且彼此互补；其中结构域b2*和b2的长度至少为2个核苷酸；其中结构域e和e*具有相同的长度并且彼此互补；其中结构域e和e*的长度至少为2个核苷酸；其中结构域a的长度至少为4个核苷酸；其中结构域s是可变长度的间隔子，其中选择间隔子长度以允许第二引发剂分子的结构域x*和结构域y*与一种或多种目的靶标结合；和根据结构ii的第二引发剂分子，其中所述结构包含结构域a*、c*、e*、s和y*；其中结构域y*与结构域x相邻或下游的一种或多种目的靶标互补或结合，其中结构域x位于目的靶标上；其中结构域a和a*彼此互补；其中结构域e*如本文所定义，其中结构域c*被构造成结合至信号产生分子/信号产生复合物；并且其中结构域s如本文所定义。
[0032]
在又一个实例中，所述组合物包含以下组分：根据结构i的第一发夹引发剂分子，其中所述结构包含结构域a、b1*、b2、b2*、e、e*、s和x*；其中相邻结构域彼此直接连接或通过连接子连接；其中结构域x*与一种或多种目的靶标结合或互补；其中结构域b1*形成发夹环；其中结构域b2*和b2具有相同的长度并且彼此互补；其中结构域b2*和b2的长度至少为2个核苷酸；其中结构域e和e*具有相同的长度，长度至少为2个核苷酸，并且彼此互补；其中结构域a的长度至少为3个核苷酸；其中结构域s是间隔子；和根据结构ii的第二引发剂分子，其中所述结构包含结构域a*、c*、e*、s’和y*；其中结构域y*与一种或多种目的靶标互补或结合；其中结构域a和a*彼此互补；其中结构ii的结构域e*长度至少为2个核苷酸并且在结合目的靶标后与结构i的结构域e结合，其中结构域c*能够结合至信号产生分子/信号产生复合物；并且其中结构域s’是间隔子，其中选择结构域s和s’的长度以允许结构域b1*、b2*和c*在结合时彼此相邻。
[0033]
此类引发剂分子可包含二级结构，例如但不限于茎环、螺旋、双链体结构、发夹环等。在一个实例中，引发剂分子可包含双链体结构和发夹环。在另一个实例中，本文公开的引发剂分子具有线性结构。
[0034]
本文公开的结构与一种或多种目的靶标的结合依赖于靶标识别域x*和y*(也称为靶标结合域)。如本领域技术人员所理解的，结构i和ii彼此紧密接近的结合闭合电路并产生信号。在这种情况下，术语“接近度”是指结构i和ii之间的距离。术语“紧密接近”表示结构i和ii之间允许彼此结合的距离。如果没有给出结构i和ii彼此的结合以及与目的靶标的结合，则认为这些结构彼此没有紧密接近。
[0035]
应当理解，如本文所公开的，电路的闭合，即引发剂分子与目的靶标的结合，指示此类靶标的存在。因此，在一个实例中，一种或多种目的靶标的存在指示疾病的存在。在另一个实例中，一种或多种目的靶标的存在可以指示疾病的不存在。此外，当以定量方式使用时，由引发剂分子与目的靶标结合产生的信号可以指示或直接转化为目的靶标浓度的增加或降低。这可以与例如基线测量进行比较(例如，在比较全局表达或代谢变化时)，或者在另一个实例中，可以用于比较无病或健康受试者中目的靶标的浓度与带病受试者中的相同目
的靶标的浓度。
[0036]
因此，本文还公开了一种检测/鉴定疾病存在的方法。在另一个实例中，公开了一种鉴定疾病的方法，所述方法包括将一种或多种如本文公开的组合物添加到从怀疑患有所述疾病的受试者获得的样品中；允许所述一种或多种组合物与怀疑在所述样品中包含的一种或多种目的靶标结合；测量由所述组合物与所述目的靶标结合产生的一种或多种信号；和鉴定所述疾病，其中一种或多种信号的存在指示所述样品中存在所述目的靶标中的一种或多种；并且其中所述目的靶标中的一种或多种是疾病特异性的。
[0037]
在一些实例中，靶标识别或结合域x*和y*可以通过例如本文所公开的间隔序列s或s’连接至剩余结构。在目的靶标如此庞大以至于靶标识别域x*和y*的结合会导致例如空间位阻的情形下就是这种情况。或者，例如，在某些情况下，目的靶标上的结构域x*和y*的结合位点相距甚远，以至于一旦与目的靶标结合，结构i和ii就无法彼此结合。在这些情况下，间隔序列s的使用可以克服直接由空间位阻或结构i和ii之间的距离导致的问题或限制，一旦与目的靶标结合，就使本文公开的结构具有灵活性以实现彼此结合和结合目的靶标的双重功能。本领域技术人员会理解，选择间隔序列s和s’以允许结构域b1*、b2*和c*彼此相邻，这通过结构域a和e的激活被促进。因此，在一个实例中，结构i和ii中的间隔序列是相同的。在另一个实例中，结构i和ii中存在的间隔序列彼此不同。在一个实例中，间隔序列s和s’是对称的。在另一个实例中，间隔序列s和s’不对称。
[0038]
在一个实例中，结构域s和s’各自是间隔子。在另一个实例中，结构域s和s’是可变长度的。在另一个实例中，选择间隔子长度(其是结构域s和/或结构域s’的长度)以允许第二引发剂分子的结构域x*和结构域y*与一种或多种目的靶标结合。换句话说，结构域s和s’的长度将被选择为允许结构域b1*、b2*和c*彼此相邻，这通过结构域a和e的激活被促进(也就是说，以促进结构域a和e分别结合至结构域a*和e*)。这意味着，为了满足这个要求，在一些实施方案中，结构域s和s’的长度可以不同。在另一个实例中，结构域s的长度在1到50nm之间。在另一个实例中，结构域s’的长度在1到50nm之间。在一个实例中，间隔子长度范围为1nm(大致相当于3个胸腺嘧啶间隔子)至10nm(大致相当于30个胸腺嘧啶间隔子)。
[0039]
间隔序列的功能在于使引发剂(结构i和ii)能够在空间上相互到达。因此，例如，更大的靶分子(即包含靶结合位点结构域x和结构域y的分子)可以利用更长的间隔子长度来产生信号。值得注意的是，结构域之间的序列称为连接子，但结构域a和x*之间的序列以及结构域a*和y*之间的序列称为间隔子，而不是连接子。
[0040]
在一个实例中，本文公开的间隔序列可部分或完全包含核酸分子。因此，在一个实例中，间隔序列包含胸腺嘧啶。在另一个实例中，本文公开的间隔序列不包含核酸分子。在此类实例中，间隔序列可包含聚乙二醇(peg)和其他烃链。此类烃链的实例可以是但不限于3-碳间隔子、己二醇、三甘醇、8-环氧乙烷和18原子六-乙二醇。
[0041]
这种间隔序列也可用于构成结构i和ii的其他结构域之间。如前所述，每个结构域之间的序列称为连接子。根据间隔序列的功能，如上所述，连接子同样可用于克服一旦与目的靶标结合后结构i和ii之间的空间位阻或距离直接导致的问题或限制。在一个实例中，这些连接序列彼此不互补，也不与本文公开的结构内的任何其他序列互补。这可能导致引发剂(例如结构i和ii)的过度稳定，进而导致即使在没有靶标的情况下也会产生信号。
[0042]
因此，在一个实例中，结构i和ii中的相邻结构域通过连接子彼此连接。在另一个
实例中，结构i和ii中的相邻结构域直接彼此连接，这意味着相邻结构域之间不存在连接子。
[0043]
还注意到对于间隔序列和连接序列，它们的确切序列(或者它是否甚至是自然界中的核酸)是无关紧要的。确切的长度在本领域技术人员显而易见的限度内也不是重要的。也就是说，间隔子和/或连接子的长度相对于靶标尺寸不应过长，否则两个引发剂彼此相遇的速率可能会不利地降低(就动力学而言)。因此，在一个实例中，总间隔子长度(即结构域s和s’加在一起)可以至少与靶标分子的估计大小一样长。另一方面，在一些实例中，具有长达1nm(或长达3个胸腺嘧啶)的短连接序列可以有助于放松拥挤的环境并改善电路热力学。在三向接合点、即三条dna链相遇的点处尤其如此。
[0044]
如本文所公开的，根据结构i的第一发夹引发剂分子包含发夹环和夹子结构域，如图1所示。这些发夹环和夹子结构域包含结构域e、e*、b2、b2*和b1*。也就是说，本领域中已知的用于缔合立足点设计的引发剂1被修饰为包含发夹锁。此外，以先前公开的结构域b*为基础的夹子结构域(现在在本文中表示为结构域b2*)通过掺入额外的结构域e进行了延伸，以便在没有触发事件的情况下保持发夹亚稳定性。该触发事件是指本文公开的组合物与一种或多种目的靶标的结合。
[0045]
如本文中所指，结构域e和e*均指代伸长域，其表示缔合区域在靶标触发时延伸的长度。结构域b2和b2*是指取自完整立足点结构域b*的一部分的夹子结构域。它是形成发夹锁(i1)的茎的一部分的结构域，以在没有靶标触发的情况下保持其亚稳定性。结构域b1是指将部分立足点结构域b分配为结构域b2*后的剩余序列。在靶标触发时，发夹引发剂(hp-i1；也称为结构i)打开，并且结构域b1*和b2*以其完整的单链形式或其原始结构域b*形式暴露。本文公开的结构域之间的关系也在随本文一起提供的图1中示出。另外，需要注意的是，本文中使用的星号表示各个结构域是彼此互补的结构域(也称为从5’到3’方向以线性形式观察时彼此反向互补的序列)，而不是具有独立功能的新结构域。
[0046]
在一个实例中，结构域b1*形成发夹环。如本领域技术人员所理解的，结构域b1*的长度取决于结构域b1*的长度是否足够长以形成必需的发夹环。因此，在另一个实例中，结构域b1*至少有3个核苷酸长。另一方面，大发夹环的形成可能会影响发夹环/立足点结构域(即结构域b1*)的稳定性。因此，在另一个实例中，结构域b1*的长度在3个核苷酸到10个核苷酸之间。作为解释，例如，结构域b1*可以有效地为结构域b*的长度减去结构域b2*的长度。因此，结构域b1*的最大长度为结构域b*的最大长度减去2(本文中定义为结构域b2*的最小长度)。根据本领域目前的理解，立足点长度的上限是12个核苷酸。因此，在一个实例中，结构域b1*的长度最高达10个核苷酸。
[0047]
如上所述，结构域b2*与结构域b2一起形成夹子结构域，其功能是在没有触发事件的情况下防止发夹环过早打开。因此，在一个实例中，结构域b2*和b2具有相同的长度并且彼此互补。由于结构域b2和b2*的功能是在没有触发事件的情况下防止发夹环过早打开，因此当结构域b2和b2*之间的结合(互补或其他方式)足够强以防止发夹环过早打开，但又足够弱以允许在存在触发事件的情况下打开发夹环时，结构域b2和b2*的长度被认为是足够的。因此，在另一个实例中，结构域b2*和b2的长度至少为2个核苷酸。在另一个实例中，结构域b2*的长度在2到6个核苷酸之间。在另一个实例中，结构域b2*(因此结构域b2)为2、3、4、5或6个核苷酸长。在又一个实例中，结构域b2*的长度为2或3个核苷酸。
[0048]
如本文所用，术语“部分结合”或“部分互补于”是指两个或更多个结合配偶体彼此结合或互补的能力。这可以在一定程度上满足要求，例如，两个序列彼此充分连接以允许结合序列的进一步下游功能。两个结合配偶体之间的结合(例如在结合配偶体是核酸序列的情况下)可以是完全互补的(意味着结合序列中不存在错配的核苷酸)或部分互补的(意味着结合序列中存在一些错配)。在一个实例中，部分互补序列可以指与相应互补序列相比在其序列中具有多达5个错配(1、2、3、4或5)的序列。在另一个实例中，错配的数量可以显示为完整序列的百分比。例如，序列中存在的错配量可以表达为任何给定序列的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或高达25％。本领域技术人员在考虑参考序列是否是部分互补序列时将理解并能够确定任何给定序列可以包含多少错配(基于例如序列长度)。
[0049]
术语“核酸序列”和“核苷酸”在本公开中可以并且被互换使用，因为这两个术语均指给定空间内的大量核酸。
[0050]
如本文所公开的第一发夹引发剂分子进一步包含额外的伸长域e，其功能是在靶标结合时延伸缔合域的有效长度。
[0051]
在一实例中，结构域e和e*彼此互补。在另一个实例中，结构域e和e*具有相同的长度。在又一个实例中，结构域e和e*具有相同长度并且彼此互补。在另一个实例中，结构域e和e*的长度至少为2个核苷酸。在另一个实例中，结构域e*或e的长度在2到8个核苷酸之间。在又一个实例中，结构域e*或e的长度为2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸或8个核苷酸。
[0052]
根据结构域e*的位置，表示为e*的相同序列可以出现多次。这是因为，在发夹引发剂分子与靶序列结合后，结构ii的结构域e*取代结构i的结构域e*。这在图1中进行了说明。因此，在一个实例中，结构ii的结构域e*长度至少为2个核苷酸并且在结合目的靶标时与结构i的结构域e结合。
[0053]
如本文所公开的，结构i和ii还分别包含缔合域a或a*。该缔合域a(发现于结构i上)与结构ii上的对应结构域a*结合。由于结构域a和a*之间需要结合，因此在一个实例中，这些结构域部分或完全彼此互补。在一个实例中，结构域a和a*彼此互补。
[0054]
当结构域a的长度达到6个核苷酸时，先前已经报道了电路泄漏的增加。因此，为了减少在较长缔合长度下发生的泄漏量，测试了结构域a的各种长度，如例如图2所示。将缔合长度从4个核苷酸(hp4)增加到5个核苷酸(hp5)可以进一步增加泄漏。因此，在一个实例中，使用较短的缔合长度，导致较低的背景泄漏。较长的缔合长度被理解为增加信号和泄漏。然而，当夹子长度增加1个核苷酸(hp6)时，福斯特共振能量转移(fret)信号增加，而泄漏显著减少，从而得到相当的信噪比(s/n)。
[0055]
因此，在一个实例中，结构域a的长度至少为3个核苷酸。在另一个实例中，结构域a的长度在3到10个核苷酸之间。在又一个实例中，结构域a的长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在另一个实例中，结构域a和结构域a*具有相同的长度。因此，在一个实例中，结构域a*的长度至少为3个核苷酸。在另一个实例中，结构域a*的长度在3至10个核苷酸之间。在又一个实例中，结构域a*长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
[0056]
为了能够定量或定性本文公开的组合物与一种或多种目的靶标的结合，本文公开的组合物可以例如通过允许信号分子或信号产生复合物的结合而进一步包含一种或多种用于产生信号的结构。因此，本文公开的组合物进一步包含一种或多种信号产生分子/信号
产生复合物。为此，根据结构ii的引发剂分子包含结构域c*，其进而被结构化或能够结合至信号产生分子/信号产生复合物。这允许产生稍后可以测量并且可以从中推断出信息的信号。根据所使用的信号产生分子/信号产生复合物的类型，结构域c将是合适的类型。也就是说，例如，如果缀合抗体用于信号产生，那么结构域c*可以是但不限于抗原或抗体结合片段。因此，结构域c*的长度也取决于所用信号的概念或类型。
[0057]
关于核酸靶标，对于本领域技术人员来说，本文公开的要求保护的方法可用于检测除本文举例说明的核酸靶标之外的其他核酸靶标(dna和rna)是合理的，因为靶标识别通过watson-crick碱基配对被促进。这个概念很好理解，并且可以根据实验者的需要设计目的靶标所需的互补序列。
[0058]
本文所提到的蛋白质检测是通过识别部分(即结构域x*和y*)与目的蛋白质的结合来实现的。可能的识别部分包括但不限于适体(如通过凝血酶检测举例说明的)和抗体(如通过登革热抗原和il-6举例说明的)，它们与本公开中描述的dna探针缀合。进一步的实例如本公开的表2所示。相反，如果目的靶标是抗体(也是一种类型的蛋白质)，则对该靶标类别(例如二级抗体或抗原)具有结合亲和力的识别部分，可以与dna探针缀合以促进本文所述的检测机制。一旦识别部分能够与靶标结合，如本文所公开的检测机制就能够发生。也就是说，结合事件导致引发剂探针(hp-i1和i2)物理接近，然后触发读出信号的产生。有理由相信，任何抗体都对其(特异性)目的靶标具有结合亲和力，因此本文所述的检测机制可以继续进行。
[0059]
本文公开的组分和方法能够检测对小分子具有结合亲和力的蛋白质，如本文例如表3所示。此外，所述组分和方法能够以竞争性结合形式检测小分子。例如，链霉亲和素是与生物素(一种小分子)相互作用的蛋白质。小分子与dna探针缀合并允许与链霉亲和素蛋白结合。可以将内源性小分子添加到反应中以竞争与蛋白质的结合并取代当前结合的用dna探针修饰的小分子。
[0060]
作为本文中针对单一蛋白质靶标显示的实例之一的扩展，本领域技术人员可以合理推断本文公开的组分和方法也适用于蛋白质复合物，即两种相互作用的蛋白质或具有修饰区域(例如但不限于磷酸化)的蛋白质。在一个实例中，两个结合事件用于本文公开的方法和组分。因此，每个dna探针都可以与每个蛋白质或修饰区域的识别部分(在抗体、适体或小分子中)缀合。在蛋白质复合物形式中，然后使这对dna探针物理接近以触发本文所述的机制。
[0061]
在另一个实例中，结构域c*至少是结构域b1*的长度。可能出现这种情况的一个实例是所使用的读出是杂交链反应(hcr)的情形，如例如图10所示。在一个实例中，当使用杂交链反应时，结构域c*可以根据长度来定义，由此结构域c*的限制可以是它至少与结构域b1*一样长。这一要求来自之前使用杂交链反应作为读出方法的工作中获得的见解(ang等人,chem.commun.2016,52,4219)。该出版物侧重于hcr设计，即讨论了hp1和hp2的设计，没有涉及i1(或当前的hp-i1，在本文中公开为结构i)和i2(在本文中公开为结构ii)，或本技术所要求的缔合立足点概念。在参考出版物中，讨论了hcr中所涉及的结构域的长度和cg内容的设计。在本公开中，公开了将靶标结合事件转换成激活形式以触发任何形式的相容读出信号的设计引发剂探针，由此可以使用hcr产生读出信号之一。
[0062]
本文公开的组合物还可包括使用一种或多种分子来产生信号。举例来说，本文公
开的组合物还可包含一对核酸发夹，所述核酸发夹包含第一发夹报告子和第二发夹报告子(分别为结构i和ii)。这些发夹报告分子与组合物的“打开”形式结合，即这些结构与目的靶标结合以及彼此结合的状态或形式，从而释放由结构域b1*制成的发夹基序，从而产生信号。
[0063]
本公开的目的靶标可以是本领域技术人员希望检测的任何靶标。这些靶标可能存在于溶液中，也可能存在于固体样品上。在一个实例中，样品是固体样品。在另一个实例中，样品是液体样品。在另一个实例中，靶标可以锚定或嵌入固体表面。在这些情况下，本文公开的方法和组分将与样品结合，条件是有足够的靶标表面从固体表面突出。此类实例包括但不限于固定细胞、包埋细胞和成像中使用的细胞或组织。
[0064]
为此，靶标识别或结合域x*和y*各自至少部分地与一种或多种目的靶标互补。在一些实例中，结构域x*和y*与一种或多种目的靶标完全互补。在一个实例中，结构域y*与结构域x相邻或下游的一种或多种目的靶标互补或结合。在另一个实例中，结构域y*与结构域x相邻或上游的一种或多种目的靶标互补或结合。在另一个实例中，结构域x*与一种或多种目的靶标结合或互补。在另一个实例中，本文公开的组合物与一种或多种目的靶标的结合不需要酶。
[0065]
为了约定俗成，结构域x*和y*在目的靶标上的结合位点分别称为结构域x和y。
[0066]
鉴于本文公开的结构i和ii的“接近性”的上述定义，这不需要靶标结合位点x和y必须彼此相邻，以便使结构i和ii能够彼此结合。本文描述了结构域x和y彼此相邻、处于下游或上游或彼此相关。在一些实例中，结构域x和y可以彼此相邻。然而，这并不意味着将结构域x和y在目的靶标上的物理位置限制为彼此物理上相邻。例如，如果目的靶标是双链dna，那么结构域x可以在5’链上，并且结构域y可以在3’链上。这与靶标dna是否作为双链dna分子存在，或者双链dna是否作为变性分子存在(意味着5’链和3’链不彼此结合)无关。术语“相邻”的范围还涵盖以下情况：目的靶标的二级或三级结构使目的靶标上的结构域x和y彼此接近，因此如果序列的靶标以线性序列(也称为一级结构)的形式呈现，则结构域x和y不会被认为彼此接近或靠近。换句话说，在一个实例中，当被视为线性序列时，靶序列上的结构域x和y在蛋白质上可以相距很远。然而，蛋白质的折叠导致结构域x和y彼此足够接近，而不是本文公开的结构i和ii能够彼此结合并且分别结合结构域x和y。
[0067]
如本文所用，术语“靶序列”和“目的靶标”是同义词，是指待使用本文公开的方法和组合物检测的靶分子的一部分。此类靶标可以是但不限于dna、rna、单核苷酸多态性(snp)、微小rna(mirna)、基因组dna、病毒dna、蛋白质、翻译后修饰的蛋白质、细胞表面受体、代谢物、脂质、碳水化合物和小分子。在另一个实例中，目的靶标是但不限于dna、单核苷酸多态性(snp)、微小rna(mirna)、rna、单一蛋白质、蛋白质复合物、小分子、蛋白质-小分子及其组合。因此，在一个实例中，目的靶标是rna。rna靶标的实例是但不限于mir-21、mir-let-7a、mir-9、mir-29和sars-cov-2或其他冠状病毒。在另一个实例中，目的靶标是单一蛋白质。蛋白质靶标的实例是但不限于凝血酶、白细胞介素6(il-6)和登革热ns1。在另一个实例中，目的靶标是蛋白质-小分子，例如链霉亲和素-生物素。在另一个实例中，目的靶标是蛋白质复合物。蛋白质复合物的实例是但不限于her2/2复合物、her2/3复合物以及her2/2和her2-3复合物。
[0068]
本文公开的组合物还可用于检测例如蛋白质-蛋白质相互作用、小分子-蛋白质相
互作用或全细胞，如表2所示。
[0069]
如上所述，为了能够与所述靶标结合，结构域x*和y*必须是能够与所述靶标结合的分子。换句话说，本领域技术人员在识别出目的靶标之后，将能够基于目的靶标的特征产生结构域x*和y*。因此，在一个实例中，结构域x*和y*是但不限于核酸序列、蛋白质序列(包括其翻译后修饰形式)、抗体、抗原和小分子。
[0070]
本文公开的组合物，即第一发夹引发剂分子和第二引发剂分子及其任何变体，可包含核酸序列。也就是说，各个分子中公开的结构域可以包含核酸序列。在一个实例中，这里公开的结构域是核酸序列。在另一个实例中，除结构域x*和y*之外的所有结构域都是核酸序列。换句话说，在一个实例中，结构域x*和y*不是核酸序列。在这些情况下，本文公开的其余结构可包含核酸序列或由核酸序列组成。
[0071]
在另一个实例中，公开的组合物可包含以下结构域，其中结构域a*的长度在3至10个核苷酸之间；其中结构域b1*的长度至少为3个核苷酸；其中结构域b2*的长度在2至6个核苷酸之间；其中结构域c*至少是结构域b1*的长度；其中结构域d*的长度在6至12个核苷酸之间；并且其中结构域e*的长度在2至8个核苷酸之间。在另一个实例中，本文公开的组合物包含以下结构域，其中结构域a*的长度在3至10个核苷酸之间；其中结构域b1*的长度至少为3个核苷酸；其中结构域b2*的长度在2至6个核苷酸之间；其中结构域c*至少是结构域b1*的长度；其中结构域d*的长度在6至12个核苷酸之间；其中结构域e*的长度在2至8个核苷酸之间；并且其中结构域s的长度在1-50nm之间。
[0072]
本文还公开了一种用于检测样品中一种或多种目的靶标的存在的方法，所述方法包括：将至少一种如本文定义的第一发夹引发剂分子和至少一种如本文定义的第二引发剂分子添加到被认为包含一种或多种目的靶标的样品中(靶标识别步骤)；使第一发夹引发剂分子和第二引发剂分子结合到目的靶标上，这使第二引发剂分子与第一发夹引发剂分子接近，从而使第一发夹引发剂分子进入激活形式以呈现三向信号产生接合点，从而允许结构域b1*和b2*结合(信号转导步骤)；添加至少一种如本文定义的信号产生分子/信号产生复合物(例如，第一报告分子和第二报告分子，其可分别具有根据结构iii和iv的结构)，由此在与三向信号产生接合点结合后，至少信号产生分子/信号产生复合物的结合产生信号；并且其中信号的存在表明样品中存在一种或多种目的靶标。如本文所用，激活形式的术语“激活”是指结构域b1*和b2*的释放，使得这些结构域可用于下游杂交反应。参见例如图1，其中灭活形式在第二张图中由包含b1*和b2*的发夹结构表示，并且激活形式在第三张图中由结构域b*和c*显示。
[0073]
上面概述的实例说明了使用信号产生复合物的一种情况，所述复合物使用一对报告分子(也称为“报告子”)。这些报告分子的功能是检测本文公开的组合物与目的靶标的结合，从而产生可被定量或定性的信号(也称为读出信号)。为此，产生的信号可以是任何类型的可测量信号，最常见的实例是光信号。通过使用例如但不限于荧光分子、荧光团、生色团、酶、蛋白质、染料、色素、缀合抗体、小分子和无机纳米材料、纳米颗粒等，可以直接或间接地产生此类光信号。如本文所用，术语“直接”和“间接”描述报告分子的结合类型。直接结合表示报告分子与本文公开的组合物直接结合。间接结合表示报告分子通过中间体与要求保护的组合物结合。可用于检测所产生的信号的可视化原理是但不限于福斯特共振能量转移(fret)、发光、荧光、光学测量、光谱分析及其组合。基于所选择的可视化原理，本领域技术
人员将能够确定要使用的适当染料、缀合物或反应物以可视化所产生的信号。
[0074]
以使用金纳米颗粒(也称为aunp)举例说明，在其非触发形式中，hp1和hp2具有自由的单链末端(分别为结构域b和d*)。自由末端与aunp结合并稳定颗粒。反应溶液因此保持红色。当hp1和hp2通过杂交链反应(hcr)长成一条长dna链时，自由末端的可用性会急剧下降。当受到更高盐浓度的激发时，金纳米颗粒会聚集，然后在反应中导致颜色变化为紫色/灰色。
[0075]
如本文所用，术语“信号产生分子”和“信号产生复合物”是指能够产生信号输出的物质，例如，用于评估测定或实验结果的目的。该读出可以是一种或多种信号产生分子与给定靶标反应的反应，和/或信号产生复合物与给定靶标反应的结果。本领域技术人员将能够根据待放大的靶标或信号的类型选择和利用合适的信号产生分子和/或信号产生复合物。信号产生分子或信号产生复合物的非限制性实例是核酸序列、蛋白质、抗体、小分子、其组合等，以及组合或系统，例如抗体/辣根过氧化物酶检测系统等。在一个实例中，杂交链反应(hcr)被用作信号产生复合物，也就是说hcr被用于产生读出信号。在另一个实例中，福斯特共振能量转移(fret)用于产生和定量读出信号。
[0076]
如本文所用，术语“检测部分”是指存在于信号产生分子上并且能够在信号产生分子与靶标结合后产生信号或读出的部分。检测部分的非限制性实例是荧光团、生色团、小分子、蛋白质、无机纳米材料及其组合。在另一个实例中，检测部分可以包含一对分子，例如荧光团-猝灭剂对。当存在时，可以沿着本文公开的任何一种报告分子的任何位置发现检测部分，只要它满足其能够检测被触发的构建体的目的。此外，报告分子可以包含一种或多种检测部分。在一个实例中，可以在结构域b、c和d之间发现检测部分。在另一个实例中，可以在结构域d*的自由末端或沿着任何其他结构域，例如结构域c’发现检测部分。在一个实例中，报告分子包含2个检测部分。本文还包括其中报告分子不包含任何检测部分的实例。在此类实例中，信号产生分子的结合是使用其他方式完成的，例如但不限于靶分子本身的结构或任何其他特征的变化。
[0077]
在一个实例中，本文公开的组合物还包含一种或多种报告分子。在一个实例中，如本文所公开的报告分子用于信号产生和/或放大。在另一个实例中，本文公开的组合物包含一对报告分子。在又一个实例中，报告分子是第一发夹报告子和第二发夹报告子。发夹报告子的结构的实例可以在本文公开的hp1和hp2中找到。在另一个实例中，报告分子是分别包含根据结构iii和iv的核酸发夹：
[0078][0079]
在这个实例中，第一发夹报告子包含结构域b、c、d和c*。在一个实例中，结构域b是长度在6至12个核苷酸之间的5’核酸突出端。在另一个实例中，结构域d是长度在6至12个核苷酸之间的发夹环。在一个实例中，第一发夹报告子包含第一检测部分；任选地在结构域c’和d之间。在另一个实例中，结构iii的结构域c*如本文所定义。在另一个实例中，结构域b是长度在6到12个核苷酸之间的5’核酸突出端，结构域d是长度在6到12个核苷酸之间的发夹环，并且结构域c*如本文所定义。
[0080]
在另一个实例中，第二发夹报告子包含结构域d*、c、b3*和c*’。在一个实例中，结构域b3*是与结构域b长度相同的发夹环。在一个实例中，结构域b3*至少部分地与结构域b互补。这是因为一旦在触发状态下与发夹引发剂分子结合，第一和第二发夹报告分子就会展开并与发夹引发剂分子结合，如例如图10所示。
[0081]
在另一个实例中，结构域d*是与结构域d长度相同的核酸突出端。在另一个实例中，结构域d*的长度在6至12个核苷酸之间。在另一个实例中，结构域c’和c*’具有相同的长度，并且能够相互结合。在另一个实例中，结构域b3*和d各自形成发夹环。在另一个实例中，结构域d和d*彼此互补。在一个实例中，结构域c’和c*’彼此互补。在另一个实例中，第二发夹报告子包含第二检测部分；任选地在结构域d*的自由末端或沿着结构域c’。在另一个实例中，结构域b3*是与结构域b长度相同的发夹环，其中结构域b3*与结构域b至少部分互补，结构域d*是与结构域d长度相同的核酸突出端，结构域c’和c*’长度相同并且能够彼此结合，并且结构域b3*和d各自形成发夹环。
[0082]
因此，在一个实例中，第一发夹报告子包含结构域b、c、d和c*；结构域b是长度在6到12个核苷酸之间的5’核酸突出端；结构域d是长度在6到12个核苷酸之间的发夹环；第二发夹报告子包含结构域d*、c’、b3*和c*’；结构域b3*是与结构域b长度相同的发夹环，其中结构域b3*至少部分地与结构域b互补；结构域d*是与结构域d长度相同的核酸突出端；结构域c’和c*’长度相同并且能够彼此结合；并且结构域b3*和d各自形成发夹环。
[0083]
关于报告分子的结构，例如，结构域b*和d*是立足点，其在本领域中被接受为具有6至12个核苷酸范围内的长度。发明人之前通过模拟和实验验证(数据未显示)发现茎长度或结构域c*至少与立足点长度一样长，以稳定发夹结构。
[0084]
在一个实例中，本文公开的组合物包含如但不限于seq id no:1到77中定义的一种或多种核酸序列。在另一个实例中，包含如seq id no:28到45中所定义但不限于它们的一种或多种核酸序列。在另一个实例中，组合物包含以下对中的任何一个或多个：seq id no.28和29，seq id no.30和31，seq id no.32和33，seq id no.34和35，seq id no.36和37，seq id no.38和39，seq id no.40和41，seq id no.42和43，和seq id no.44和45。在另一个实例中，组合物包含以下对中的任何一个或多个：seq id no.28和29，seq id no.42和43，和seq id no.44和45。
[0085]
此外，信号产生分子/信号产生复合物的非限制性实例可在以下部分中找到。
[0086]
对于使用福斯特共振能量转移(fret)读出的杂交链反应(hcr)：
[0087]
hp1:hp2:
[0088]
需要注意的是，荧光团的位置(由上图中的星号表示)不是固定的，并且可以在沿着整个序列的任何地方发生变化，只要星号彼此之间的相对位置产生可读的信噪比即可。
[0089]
对于使用hrp模拟脱氧核酶的hcr：
[0090]
hp1:hp2:
[0091]
折叠成具有hrp模拟催化功能的二级结构的示例性dna序列被分裂成两个实体并
附加在hp1的结构域b和c*或hp2的结构域d*和c*的末端。激活后，分裂的序列重新组合形成完整的脱氧核酶，其催化读出信号的形成。
[0092]
对于使用分裂酶基序的hcr：
[0093][0094]
催化酶，例如β-半乳糖苷酶，可以分裂成两个实体，它们仅在信号激活时重组。在这种情况下，分裂的β-半乳糖苷酶可以缀合到发夹单体上以产生这种效果。
[0095]
对于荧光团-猝灭剂(f-q)读出：
[0096]
f-q复合物:
[0097]
需要注意的是，这里描述的荧光团用星号表示，猝灭剂用圆圈表示，它们可以在两条链之间交换。它们的位置可以在沿着结构域c的任何位置发生改变，只要它们彼此相邻。
[0098]
对于x-探针读出：
[0099][0100]
xq-pc:xf-p:x探针-f:x探针-q:
[0101]
x-探针可以被使用，其中x探针-f和x探针-q是通用的序列，并且xq-pc和xf-p链的序列可以相应地改变。不管使用哪种靶序列/探针序列，这都允许标记的寡核苷酸可以重复使用，代表探针设计优化过程中的成本节约和周转时间减少。
[0102]
双链和/或发夹结构的非限制性实例
[0103][0104]
在本文所公开的示例性方法中使用的组分链的比率可以变化。例如，可以使用1:1到2:1之间的hp1:hp2的比率，其依赖于预定的靶标。举例来说，当检测核酸靶标时，hp-i1和i2之比可以是1:1。在其他实例中，针对其他靶标类别的hp-i1和i2的相对比率依赖于识别部分x*和y*的相对结合亲和力。识别部分x*和y*的相对结合亲和力将根据特定靶标而不同(例如，可以使用检测蛋白质靶标时推荐用于商业抗体的相对稀释比)。[hp1/hp2]与[hp-i1/i2]的比率被取作一组，也就是说读出链与引发剂链的比率，该比率在1:1(通常使用)至5:1(可用于改善测定动力学)的范围内。绝对浓度可以从亚纳摩尔到微摩尔范围使用。在一个实例中，使用比率为1:1:1:1的所有4种组分，得到显式浓度为20nm。对于在该实例中所示的实验结果，已经使用1:1:2:1(结构i-iv，按顺序)的比率，得到显式浓度为20nm hp-i1、20nm i2、40nm hp1和20nm hp2。然而，如本领域技术人员将理解的，这些浓度和比率可以根据本文公开的方法的预期靶标所规定的要求而优化。
[0105]
在一个实例中，如本文所公开的组合物包含4个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，2个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，2个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在另一个实例中，如本文所公开的组合物包含4个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，2个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含5个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，2个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含5个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，3个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含5个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，4个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，3个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含6个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，3个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含6个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，4个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6
个核苷酸长度的结构域d，5个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含8个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，5个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，5个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含6个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，5个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，5个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含6个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，6个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，5个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含6个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，5个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，6个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含4个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，5个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，8个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含6个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，3个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含5个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，3个核苷酸长度的结构域e和6个核苷酸长度的结构域s(长度大致约2nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含5个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，3个核苷酸长度的结构域e和6个核苷酸长度的结构域s(长度大致约2nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含5个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，3个核苷酸长度的结构域e和6个核苷酸长度的结构域s(长度大致约2nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含5个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，3个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，3个核苷酸长度的结构域e和6个核苷酸长度的结构域s(长度大致约2nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含4个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，2个核苷酸长度的结构域b2，12个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，2个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含4个核苷酸长度的结构域a，9个核苷酸长度的结构域b1，2个核苷酸长度的结构域b2，11个核苷酸长度的结构域c，6个核苷酸长度的结构域d，2个核苷酸长度的结构域e和15个核苷酸长度的结构域s(长度大致约5nm)。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含9个核苷酸的结构域b1和12个核苷酸的结构域c。在又一个实例中，如本文所公开的组合物包含9个核苷酸的结构域b、12个核苷酸的结构域c和6个核苷酸的结构域d。在另一个实例中，如本文所公开的组合物包含3个核苷酸的结构域a，7个核苷酸的结构域b1，2个核苷酸的结构域b2，
12个核苷酸的结构域c，9个核苷酸的结构域d，3个核苷酸的结构域e和15个核苷酸的结构域s(长度大致约5nm)。
[0106]
鉴于本文的公开内容，如果本文公开的结构所需的其他序列未明确提及(例如，定义了序列k但未定义序列k*)，则本领域技术人员将理解，星号结构域是对应的非星号结构域的反向互补版本(从5’到3’方向看)，与对应的非星号结构域的结合是互补的，无需明确提及。在一个实例中，星号结构域的长度与非星号对应项的长度相同。本指南的一个例外是结构域x*，因为结构域x和结构域x*的长度可能不同。这是因为结构域x*的长度取决于目的靶标上的结合位点，也就是结构域x。也就是说，结构域x*的长度可以比结构域x的长度短，这也适用于结构域y和y*，其中结构域y*的长度可以比结构域y的长度短，如上文对于结构域x所示的。
[0107]
在一个实例中，如本文所定义的一种或多种组合物的每一组分同时或依次添加。在另一个实例中，本文公开的组合物的所有组分可以与包含一种或多种目的靶标的样品一起全部同时添加，从而导致所谓的“一锅反应”。因此，在另一个实例中，如本文所公开的方法在单个反应容器中进行。
[0108]
伸长缔合立足点概念利用发夹锁在触发时将缔合区域长度从初始的较短长度动态调整为最终的较长长度。因此，这种设计能够通过具有更长的缔合区域来改善动力学和热力学，而无需权衡会导致更高的电路泄漏率。进行了详细研究以了解此修改后的设计中每个附加结构域的贡献，最终形成了一套设计指南。使用具有4
→
6个核苷酸、5
→
8个核苷酸和6
→
9个核苷酸的伸长缔合长度的三个发夹锁定引发剂设计来表征该设计对平衡信号(热力学)和整体电路动力学的影响。结果表明，动态伸长的缔合立足点设计将平衡信号提高了许多倍，其动力学接近每个最终缔合长度可能的上限，而发夹锁可有效抑制电路泄漏。这转化为提高了实际性能，同时降低了检测限并提高了检测速度。
[0109]
本文还公开了一种用于检测样品中的一种或多种目的靶标的方法，所述方法包括提供被认为包含所述一种或多种目的靶标的样品并使用如本文公开的组合物检测所述一种或多种目的靶标，其中每种组合物对一个目的靶标是特异性的。在另一个实例中，本文公开的组合物可以对一个以上目的靶标具有特异性。在又一个实例中，组合物可以同时与一个以上目的靶标结合。在另一个实例中，如本文所定义的第一发夹引发剂分子和第二引发剂分子与至少一个目的靶标结合。
[0110]
在另一个实例中，公开了一种用于检测样品中一种或多种目的靶标的存在的方法，所述方法包括将一种或多种如本文公开的组合物添加到所述样品中；允许所述一种或多种组合物与被认为包含在所述样品中的所述一种或多种目的靶标结合；测量由所述组合物与所述目的靶标结合产生的一种或多种信号；其中一种或多种信号的产生检测到所述样品中存在所述目的靶标中的一种或多种。
[0111]
本文中还说明了本文公开的方法在单个温度下(即等温法中)进行，这和本领域已知的需要多个温度的方法相反。在一个实例中，如本文所公开的方法在单个温度下进行。在另一个实例中，进行本文公开的方法的温度是所得复合物(即包含目的靶标、第一发夹引发剂分子和第二引发剂分子的复合物)保持稳定的温度。在另一个实例中，本文公开的方法在室温下进行。在另一个实例中，所述方法在单个温度下进行，在该温度下，与目的靶标结合的组合物是稳定的。也就是说，本文公开的方法可以在高达60℃的温度下进行。超出60℃的
实验设置需要更长的结构域长度，以确保复杂的稳定性。
[0112]
潜在的解释是，在一些实例中，所述方法由dna杂交驱动。基于此，可以说dna复合物将保持稳定至60℃，这是在聚合酶链反应(pcr)中使用的常见退火温度，pcr是一种也已知基于dna杂交的方法。dna杂交的稳定性由其熔融温度表示，熔融温度又由例如所用引物的长度决定。引物长度通常是但不限于18至22个核苷酸，而负责驱动信号产生步骤的结构域b*和c*的组合长度大于18个核苷酸，以用于本文公开的最短设计实例。其他结构域a和e(伸长缔合长度)或e和b2*(hp-i1(也称为结构i)中的发夹锁的茎)相对较短。然而，它们以高局部浓度存在，即，在前者(即结构域a和e)的情况下，靶标使hp-i1和i2(分别是结构i和ii)紧密接近，以及在后者(即结构域e和b2*)的情况下，靶标使hp-i1和i2处于发夹结构内。它们的结构在结构域a和e的情况下采用高浓度双链体或在结构域e和b2*的情况下处于发夹结构中，所述结构在高达60℃的温度下保持完整，即便是对于模拟中使用的4个核苷酸的最短实例长度。这里，4个核苷酸的最短长度是指对于4个核苷酸的总长度来说，结构域e和b2*各自的长度为2个核苷酸。
[0113]
本文公开的方法是对认为包含一种或多种目的靶标的样品进行的。这些样品可以是但不限于生物样品和非生物样品。生物样品的非限制性实例是但不限于来自生物或以前的生物的任何数量的物质。此类生物包括但不限于人、小鼠、猴子、大鼠、兔子和其他动物。这些物质包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、细胞、器官、组织、患病组织、骨骼、骨髓、淋巴、淋巴结、内皮细胞、血管组织和皮肤。非生物样品的非限制性样品包括但不限于药物样品、液体样品和不是从生物或以前的生物中获得的样品。在另一个实例中，样品还可以包含细菌、病毒、真菌等。
[0114]
本文还公开了本文公开的组合物或方法在药物筛选和/或药物发现中的用途。这将是在非生物样品上使用本文所述的组合物的一个实例。在此类实例中，如本文所公开的方法可用于测量药物和目的靶标之间的相互作用。作为使用细胞表面标记作为靶标的一个实例，引发剂探针之一可以缀合到抗体或小分子候选药物上，而另一个引发剂探针可以缀合到对目的靶标具有特异性的抗体上，例如细胞表面受体蛋白。当候选药物与目的靶标结合时，通过本文所述方法的机制产生信号。作为使用溶液相的另一个实例，一些药物发现平台或方法涉及细胞因子(它们是蛋白质靶标)的测量，细胞与药物接触时会分泌这些细胞因子。本文公开的方法可用于药物发现中以实时定量细胞的细胞因子分泌水平，作为与一种或多种药物接触的效果。
[0115]
本文还公开了一种包含本文定义的组合物的试剂盒。该试剂盒将根据本文公开的方法使用。因此，在一个实例中，试剂盒至少包含如本文公开的结构i、ii、第一报告分子和第二报告分子。在另一个实例中，这些组分是分开保存的。在另一个实例中，本文公开的试剂盒包含第一发夹引发剂分子和第二引发剂分子，其中引发剂分子被进一步修饰以适合缀合。在另一个实例中，试剂盒任选地包含i)用于进行亲和缀合的试剂，或ii)用于与选自但不限于dna、抗体和蛋白质的分子进行共价缀合的试剂。
[0116]
在一个实例中，在如本文所述的试剂盒中，组合物的每一组分以冻干粉末的形式或作为浓缩储备溶液单独提供。组分以何种形式提供取决于各种考虑因素，主要的考虑因素是组分的稳定性。例如，为了更容易处理和减少对冷链的依赖，dna和rna可以作为冻干粉末提供，然后在使用前用水或合适的缓冲液复原。
[0117]
为了获得本文公开的组合物，建立了用于缔合立足点的稳定伸长的设计指南，并且确定了被修饰的结构域的不同配置如何影响所提议设计的整体性能。三组发夹引发剂涉及不同程度的缔合长度伸长，有效地分别为结构域a和e或结构域a*和e*的总和。(4
→
6个核苷酸，5
→
8个核苷酸和6
→
9个核苷酸)从设计框架中入围。已经使用4
→
6个核苷酸、5
→
8个核苷酸和6
→
9个核苷酸(结构域a的长度
→
结构域和e的组合长度)的实例确定了这些发夹引发剂设计在提高电路性能而没有招致大量电路泄漏的惩罚方面的直接实验证据(参见图4到6)。基于反应速度、达到的平衡状态和检测限来评估电路性能。
[0118]
用于设计动态伸长的缔合立足点的考虑因素
[0119]
在设计动态伸长的缔合立足点时需要克服的困难是在发夹修饰的引发剂1(hp-i1)上具有结构域配置的良好平衡。hp-i1与传统i1设计的不同之处在于i)额外的伸长域e和ii)源自部分立足点结构域b的结构域b2*夹子。与任何电路设计一样，首要考虑的是确保电路不会大量泄漏。在这种情况下，泄漏条件取决于发夹锁(由结构域b2*和e定义的“关闭”状态)是否能够在没有触发事件的情况下保护伸长域e免于暴露自身(由结构域a和e定义的“打开”状态)。
[0120]
图2比较了hp-i1中结构域a、e和b2*的不同组合，其中结构域a和e各具有相等的4个核苷酸长度。在一个实例中，从4个核苷酸的缔合长度开始，添加了相等长度的结构域e，这也是稳定发夹环设计的最小长度。这种泄漏被观察到(hp1)并且直到结构域e的2个核苷酸被去除并被结构域b2*形式的2个核苷酸夹子替换(hp3)后才消退(hp2)。
[0121]
需要注意的是，以上段落指的是发夹茎(不是环)，它包含4个核苷酸。hp-i1(例如结构i)上发夹茎的长度是结构域b2*和e的组合长度，它与结构域b1*(发夹环)的长度无关。这也与本文公开的结构域b2*和e的限定范围一致，其中两个结构域中的每一个必须至少有2个核苷酸长，使其总共有4个核苷酸长，这在本实例中用于稳定发夹的茎。
[0122]
在这种情况下，夹子充当缓冲域，以避免将结构域e作为缔合步骤的分支迁移域(有利于“打开”状态)和整个发夹茎(有利于“关闭”状态)的矛盾情况，这被证明对电路泄漏有害(如设计hp1所示)。立足点结构域b的一部分被用作夹子结构域，以避免在缔合时在c*b*触发域之间引入额外的间隙(图1)。在夹子结构域就位后，尝试通过在设计hp4中将伸长域e增加1个核苷酸来增强平衡信号，但由于泄漏随着时间的推移而增加，这反而导致“信噪比”(s/n)降低。
[0123]
当至少在研究的反应条件下并使用特定的序列集，缔合域a的长度达到6个核苷酸时，先前已经报道了电路泄漏的增加。研究在存在发夹锁作为竞争性杂交反应的一种形式下，是否有可能减少在较长缔合长度下发生的泄漏量。将缔合长度从4个核苷酸(hp4)增加到5个核苷酸(hp5)预期会进一步加剧泄漏。然而，当伴随着夹子长度增加1个核苷酸(hp6)时，福斯特共振能量转移(fret)信号增强，而泄漏显著减少，从而提供相当的信噪比(s/n)作为4个核苷酸缔合长度(hp3)的泄漏最少的设计。
[0124]
然后质疑是否可以通过重新设计序列或增加夹子长度(以进一步抑制泄漏)来进一步提高信噪比(s/n)。伸长域e从ggc(hp6)变为gtg(hp7)，这被认为削弱了有利于“关闭”和“打开”状态的反应。有趣的是，这种修改导致福斯特共振能量转移(fret)信号的净增加和电路泄漏的减少，表明结构域e的序列设计作为分支迁移域比作为发夹茎的一部分发挥了更突出的作用。当夹子长度(即分别为结构域b2和b2*)增加1个核苷酸至4个核苷酸(hp8)
时，信号和泄漏都显著下降。这表明，过长的发夹茎长度会阻碍缔合反应，尤其是由于夹子长度过长而对“打开”状态没有促进作用。因此，在一个实例中，对于本文所示的实例，夹子长度(由结构域b2*和b2定义)保持在2至3个核苷酸。在另一个实例中，结构域b2和b2*的长度在2至6个核苷酸之间，或者是2、3、4、5或6个核苷酸。
[0125]
有了对影响hp-i1设计的因素的这种理解，就有可能为6个核苷酸的初始缔合长度(hp9)设计一个伸长的缔合立足点，否则这将是最具挑战性的设计要求。所做的观察可以总结为以下设计指南：
[0126]
在一个实例中，夹子结构域b2*可用于稳定的“关闭”状态。在另一个实例中，夹子结构域b2*的长度是2到6个核苷酸。
[0127]
在另一个实例中，伸长域e的长度在2和8个核苷酸之间。在另一个实例中，伸长域e的长度为2、3、4、5、6、7或8个核苷酸。
[0128]
本文公开的设计之一，例如hp3(表示为a4-6，其代表4个核苷酸的初始缔合长度伸长至6个核苷酸的最终有效长度)、hp7(a5-8)和hp9(a6-9)入围，以便在接下来的章节中对传统的缔合立足点和动态伸长的缔合立足点设计之间进行更彻底的比较研究(图3)。
[0129]
改进对电路泄漏的控制
[0130]
提议的伸长缔合立足点的前提是调和期望反应率和泄漏率之间的权衡。因此，只有当电路可以从具有更长缔合区域的改进反应率中受益而不会导致显著的泄漏和随之而来的背景噪声时，它才会被认为是一个适用的概念。为了测试这些标准，比较了hp-i1和传统i1设计之间的泄漏程度及其对信噪比(s/n)的影响，其中hp-i1中缔合长度等于最终的伸长缔合长度。
[0131]
当使用8个核苷酸和9个核苷酸的长缔合长度时发生了显著的泄漏，使用动态伸长的缔合立足点概念大大抑制了这种泄漏(图4a)。这转化为电路信噪比(s/n)的明显改善(图4b)。由于稳定但慢得多的泄漏反应，伸长的缔合立足点系统的信噪比在60分钟后随时间逐渐降低。此外，应该记住，使用伸长的缔合立足点可以快速(在60分钟内)获得平衡信号。考虑到恒定的信号和以泄漏形式缓慢演变的噪声，信噪比将在信号平衡点之后在数学上下降。换句话说，本文公开的结构利用更长的缔合区域来改善信号产生，而不会导致显著的泄漏。
[0132]
使用伸长缔合立足点改进动力学和热力学
[0133]
接下来，研究了伸长的缔合立足点是否受益于改进的动力学和热力学，正如根据最终更长的缔合立足点长度所假设的那样。也就是说，hp-i1打开后的额外动力学步骤不应对整体电路性能产生负面影响。在伸长缔合立足点设计(结构域a
→
a和e)中存在分离触发剂(st)的情况下，福斯特共振能量转移(fret)信号的演变与具有初始(仅结构域a)和最终(结构域a和e)缔合长度的传统缔合立足点设计进行了比较(图5a)。
[0134]
在获得的平衡信号量和反应动力学方面，伸长的缔合立足点设计优于具有初始缔合长度的传统设计(图5b-d)。其平衡信号接近最终的伸长缔合长度设计所达到的信号，这在预期范围内，因为最终的st-i1-i2组件在两种设计中几乎相同(hp-i1中的结构域e*突出端除外)。电路动力学比更长的缔合长度设计慢，这是可以理解的，因为额外的发夹锁意味着额外的动力学，并且通常在这种伸长的缔合立足点设计中涉及竞争步骤。换句话说，与线性引发剂设计中的初始较短缔合区域相比，发夹引发剂设计改进了信号产生，现在其性能
接近线性引发剂设计中较长缔合区域的性能，但不会导致电路泄漏。
[0135]
改进分析性能
[0136]
使用动态伸长的缔合域分析分离式接近电路(spc)的分析性能，以评估其优越的动力学和热力学是否可以转化为实际应用。由改进的分离式接近电路产生的福斯特共振能量转移(fret)信号取决于滴定的分离触发剂(st)的浓度(图6a)。对于大约0.2至10nm的浓度范围观察到线性剂量关系(图6b)。该动态范围与之前关于杂交链反应(hcr)的工作一致，其读出信号用于本文的实验。发夹引发剂产生与目标浓度直接相关的可量化信号。
[0137]
通过在反应一小时后评估4-6个核苷酸的三种缔合长度的两种设计中的检测限(lod)，将改进的分离式接近电路设计的性能与本领域已知的基于较短的初始缔合长度的设计(参见ang等人，2016年)进行比较(表2)。值得注意的是，由于大量泄漏，与较长的最终缔合长度进行比较没有意义。改进的分离式接近电路中的检测限平均比本领域已知的分离式接近电路提高了一个数量级(参见ang等人，2016)。进一步注意到，检测限随着hp-i1设计的缔合长度的增加而提高，而这原本被认为对传统设计不利，因为泄漏程度随缔合长度增加而增加。通过优化分离式接近电路(spc)反应物的浓度，可以进一步提高检测限。在这里，发夹引发剂设计提高了测定灵敏度，这是根据检测限来衡量的。
[0138]
这种改进的性能归因于不同因素的组合，例如，增加的电路动力学导致产生数量显著更多的福斯特共振能量转移(fret)信号，这超过了明显更慢的泄漏反应的影响。在明显更短的时间范围内获得平衡信号的一个警告是分析要保持简短(例如，在一小时内)；否则由改进的动力学和热力学引起的信噪比的提高很快就会被电路泄漏的逐渐增加所侵蚀。在短时间范围内执行的能力被认为是本公开的范围内考虑的应用的有利特征。换句话说，发夹引发剂在更短的时间内产生了更强的信号，以改进靶标检测。
[0139]
表1.使用本领域已知的引发剂1(i1)(参见ang等人，2016)和发夹引发剂1(hp-i1)设计在t＝60分钟时实现的检测限(lod)的比较。初始的较短缔合域长度用于表征i1系统。
[0140][0141]
nt-核苷酸
[0142]
本文中说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛地阅读而不受限制。另外，本文中使用的术语和表达已被用作描述的术语而不构成限制，并且在这些术语和表达的使用中无意排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但应认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采取本文所公开的在其中实现的本发明的修改和变化，并且此类修改和变化被视为处在本发明的范围内。
[0143]
如本技术中所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一”和“所述”包括复
数个引用对象。例如，术语“遗传标记”包括多个遗传标记，包括其混合物和组合。
[0144]
如本文所用，在制剂组分的浓度的上下文中的术语“约”典型地表示所述值的 /-5％，更典型地所述值的 /-4％，更典型地所述值的 /-3％，更典型地所述值的 /-2％，甚至更典型地所述值的 /-1％，且甚至更典型地所述值的 /-0.5％。
[0145]
在本公开全文中，某些实施方案可以范围格式公开。应了解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应当被解释为对于所公开范围的范畴的固定限制。因此，范围的描述应被视为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。举例来说，例如从1到6的范围的描述应被视为已经具体地公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
[0146]
某些实施方案也可以在本文中被广泛地和一般性地描述。属于通用公开范围内的更窄种类和亚属分组中的每一个也形成本公开的部分。这包括实施方案的一般描述，附带条件或负面限制是从该属中去除任何主题，无论是否在本文中具体叙述了切除的材料。
[0147]
本发明已经在本文中广泛地和一般地进行了描述。属于一般公开内容内的每个较窄的物种和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，附带条件或负面限制是从该属中去除任何主题，无论是否在本文中具体叙述了切除的材料。
[0148]
其他实施方案处在以下权利要求书和非限制性实施例内。此外，当根据马库什组(markush group)描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本发明因而也根据马库什组的任何个别成员或成员子群而被描述。
[0149]
实验部分
[0150]
除非另有说明，否则本研究中使用的所有dna和rna寡核苷酸均购自integrated dna technologies(idt)，并由idt进行hplc纯化。核酸序列展示于表3。冻干的dna在1x tris-edta缓冲液(1x te，ph 8.0)中复原，得到约100μm储备液并在4℃下储存长达一年，但cy3/cy5修饰的dna储存在-20℃并避光。冻干的dna在无核酸酶的水中复原，得到约100μm储备液等分试样并储存在-80℃。以下化学品按原样使用：氯化钠(nacl，≥99.5％)和氯化镁(mgcl2，≥98％)购自sigma aldrich。10x磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph 7.4)和1x tris-etda(te，ph 8.0)购自1st base。在整个实验过程中使用电阻》18.2mp/cm的milli-q水。
[0151]
nupack模拟
[0152]
nupack网页服务器用于核酸结构和系统的设计和分析。在25℃下对n个相互作用的dna物种进行nupack分析，以形成n条链的最大复合物尺寸。值得注意的是，这种设置并不能充分代表在其中可能形成更高阶dna复合物的溶液中的实际相互作用，尤其是当涉及hcr时。然而，这种简单的分析足以捕获初始电路事件和背景噪声形成。na

和mg
2
的浓度被设置为在各自的实验中使用的相同值。
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分离式接近电路组分的制备
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杂交链反应(hcr)发夹是在实验即将开始前制备的。将1μm用cy5标记的发夹1(hp1)和用cy3标记的发夹2(hp2)在反应缓冲液中分别加热至95℃维持5分钟，并在冰上快速冷却至少15分钟。
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反应缓冲液的基本成分是1x pbs(ph 7.4)，并且可以补充其他盐，例如1-10mm mgcl2。也可以使用其他缓冲液，例如tris、hepes和生理盐水-柠檬酸钠。此后，将电路组分
混合至例如20nm hp-i1、20nm i2、40nm hp1和20nm hp2的典型的最终反应浓度。在这种情况下，所用组分的比例为1:1:2:1(结构i:结构ii:结构iii:结构iv)。
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hcr-fret读出的荧光测量
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所有反应均在室温下在384孔黑色板中进行，反应体积为20μl。
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福斯特共振能量转移(fret)读出在酶标仪上测量或在共聚焦显微镜下成像。z位置和增益使用软件工具针对每组dna读出浓度进行优化，并在整个分析过程中保持恒定。
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序列
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表3提供了在本文公开的实验中使用的dna序列的列表。从先前的分离式接近电路
(spc)设计获得序列，而使用具有序列约束的nupack网页服务器部分设计额外的结构域。
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