突变体xSUMO、突变体xE1和xSUMO-xE1组合突变体及其相关产品和用途的制作方法

突变体xsumo、突变体xe1和xsumo-xe1组合突变体及其相关产品和用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及突变体xsumo、突变体xe1和xsumo-xe1组合突变体及其相关产品和用途。


背景技术：

2.类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier，sumo)是真核生物细胞内存在的一种非常重要的小分子量蛋白质(～12kda)。sumo作为一种翻译后修饰分子，能传递到超过1000种底物蛋白上。
3.与泛素(ubiquitin，ub)类似，sumo需要经过一系列特定的酶传递到底物，这个过程称作sumo化。细胞中表达的sumo最初都是以前体的形式存在，经特异性蛋白酶剪切后，暴露出c-末端的双甘氨酸残基，变成具有功能的sumo。在atp的参与下，sumo被sumo激活酶e1(sumo activating enzyme，sae)催化激活，e1是由sae1和uba2异构形成的二聚体，暴露的c-末端的双甘氨酸残基与uba2的半胱氨酸残基形成硫酯键。接着，活化的sumo从e1转移到细胞中唯一的sumo结合酶e2(sumo conjugating enzyme，ubc9)的半胱氨酸残基上，形成第二个硫酯键。然后，sumo连接酶e3(sumo ligase enzyme)结合并催化sumo连接到底物蛋白上。
4.与ub不同的是，sumo传递到底物蛋白有两条途径：第一种是在没有sumo连接酶e3的条件下，ubc9直接与底物蛋白结合，将sumo传递到底物并催化sumo的c-末端的双甘氨酸残基与底物蛋白的赖氨酸ε-氨基形成异肽键，这样的底物被称为ubc9的特异性底物；第二种途径是在sumo连接酶e3的参与下，ubc9先与sumo连接酶e3结合，将sumo直接传递到底物蛋白上，这样的底物被称为e3的特异性底物。到目前为止，没有明确的文献报道，这些底物哪些是ubc9的特异性底物，哪些是e3的特异性底物。
5.cn110845596b公开了一种突变体xsumo5(r70e，y91a，e93r)，xsumo5和野生型wtsae(即野生型激活酶e1)经western blot检测，发现xsumo5与wtsae没有反应活性，检测不到直接作用。但后续的研究发现，在野生型结合酶e2存在的条件下，xsumo5仍可以通过野生型激活酶e1传递到野生型结合酶e2上。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供突变体xsumo、突变体xe1和xsumo-xe1组合突变体及其相关产品和用途，用于构建正交sumo传递途径，解决现有技术中xsumo5虽与野生型激活酶e1检测不到直接作用，但仍与野生型激活酶e1具有微弱结合力，从而导致xsumo5依然可以通过野生型激活酶e1传递到野生型结合酶e2上，以及无法有效区分e3特异性底物和ubc9特异性底物的问题。
7.本发明目的之一在于提供突变体xsumo，所述突变体为如下(1)或(2)的蛋白：
8.(1)由如seq id no.1或如seq id no.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
9.(2)将如seq id no.1或如seq id no.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
10.本发明目的之二在于提供与所述的突变体xsumo相关的生物材料，包括如下任一种：
11.a)编码如所述的突变体xsumo的多核苷酸；
12.b)含有a)所述的多核苷酸的重组表达载体；
13.c)含有a)所述的多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的生物工程菌。
14.根据本技术的技术方案，a)中，所述的多核苷酸包括如seq id no.2或seq id no.4所示的核苷酸序列。
15.本发明中的重组表达载体由所述多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成，表达载体通常指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
16.本发明中的生物工程菌含有如所述的重组表达载体或基因组内整合有所述的多核苷酸。生物工程菌可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。
17.本发明目的之三在于提供突变体xe1，所述的突变体为sumo激活酶e1亚基uba2的突变体，所述的突变体为如下(1)或(2)的蛋白：
18.(1)由如seq id no.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
19.(2)将如seq id no.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
20.sumo激活酶e1(sumo activating enzyme，sae)是由亚基sae1和亚基uba2异构形成的二聚体。其中，亚基sae1的氨基酸序列和核苷酸序列分别如seq id no.8和seq id no.9所示。
21.本发明目的之四在于提供与如所述的突变体xe1相关的生物材料，包括如下任一种：
22.a)编码如所述的突变体xe1的多核苷酸；
23.b)含有a)所述的多核苷酸的重组表达载体；
24.c)含有a)所述的多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的生物工程菌。
25.根据本技术的技术方案，a)中，所述的多核苷酸包括如seq id no.6所示的核苷酸序列。
26.本发明目的之五在于提供xsumo-xe1组合突变体，所述的xsumo-xe1组合突变体包括所述的突变体xsumo；
27.和/或，所述的xsumo-xe1组合突变体包括所述的突变体xe1。
28.本发明目的之六在于提供与如所述的xsumo-xe1组合突变体相关的生物材料，包括如下任一种：
29.a)编码如所述的xsumo-xe1组合突变体的多核苷酸；
30.b)含有a)所述的多核苷酸的重组表达载体；
31.c)含有a)所述的多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的生物工程菌。
32.本发明目的之七在于提供如如所述的突变体xsumo或如所述的与突变体xsumo相关的生物材料或如所述的突变体xe1或如所述的与突变体xe1相关的生物材料或如所述的xsumo-xe1组合突变体或如所述的与xsumo-xe1组合突变体相关的生物材料用于鉴别ubc9底物或e3底物中的用途。
33.本发明目的之八在于提供如所述的突变体xsumo或如所述的与突变体xsumo相关的生物材料或如所述的突变体xe1或如所述的与突变体xe1相关的生物材料或如所述的xsumo-xe1组合突变体或如所述的与xsumo-xe1组合突变体相关的生物材料作为靶蛋白，在筛选抗神经退行性疾病或抗癌药物中的用途。
34.本技术的突变体xsumo或突变体xe1或xsumo-xe1组合突变体可筛选与ubc9或sumo连接酶e3发生特异性结合的底物蛋白，这些底物蛋白与神经退行性疾病，如阿尔兹海默症或帕金森等，以及癌症相关，深入研究这些底物蛋白对应的e3，可以使e3成为潜在的药物靶点。
35.本技术中，sumo激活酶e1(sae)标记为e1，sumo结合酶e2(ubc9)标记为e2，sumo连接酶e3标记为e3。
36.本发明具有以下有益效果：
37.1)本发明首先通过噬菌体展示技术，在分子水平构建全部突变体，包括突变体xsumo、突变体xe(xe1，xe2，xe3)以及xsumo-xe组合突变体(xsumo-xe1-xe2或xsumo-xe1-xe2-xe3)，并通过蛋白质水平sumo化检测这些突变体之间的活力，以及检测突变体与野生型wtsumo、野生型wte1、野生型e2以及e2的特异性底物之间的活力，从而提供了一种特异性鉴别sumo结合酶e2(ubc9)底物的方法，同时也为鉴别sumo连接酶e3(e3)底物奠定了理论基础。
38.2)本技术中的技术方案不仅可以首次区分sumo结合酶e2(ubc9)的特异性底物，有利于加深对整个sumo化信号转导通路的理解，而且为进一步发现特定sumo连接酶e3(e3)的新底物，以及开发针对e3的药物奠定了理论基础。
附图说明
39.图1显示为本发明的实施例1中构建的突变体xe1-1的测序对比结果图。
40.图2显示为本发明的实施例1中构建的突变体xe1-1的测序对比结果图。
41.图3显示为本发明的实施例1中的突变体xe1-1的western blot检测结果图。
42.图4显示为本发明的实施例1中的突变体xe1-2的western blot检测结果图。
43.图5显示本发明的实施例1中的突变体xe1-3的western blot检测结果图。
44.图6显示本发明的实施例2中的突变体xsumo-1、突变体xsumo-2和质粒pet28a经酶切后的酶切产物的电泳图。
45.图7显示为本发明的实施例2中的突变体xsumo-1与突变体xsumo5的序列对比图。
46.图8显示为本发明的实施例2中的突变体xsumo-2与突变体xsumo5的序列对比图。
47.图9显示为本发明的实施例2中的突变体xsumo-1和突变体xsumo-2经ni-beads亲和层析纯化得到的上清液、流穿液和洗脱液的电泳图。
48.图10显示为本发明的实施例2中的xsumo5-xe1-1组合突变体的western blot检测结果图。
49.图11显示为本发明的实施例2中的xsumo5-xe1-1组合突变体中加入野生型e2后的western blot检测结果图。
50.图12显示为本发明的实施例2中突变体xsumo-1和突变体xsumo-2的western blot检测结果图。
51.图13显示为本发明的实施例2中突变体xsumo-1和突变体xsumo-2加入了e2特异性底物的rangtp酶激动蛋白(rangap)后的western blot检测结果图。
52.图14显示为正交泛素化传递途径的示意图。
53.图15显示为本发明的实施例2采用bca法测定蛋白浓度时的标准曲线图。
54.图10至图13中附图说明如下
55.xe1代表实施例1得到的突变体xe1-1。
具体实施方式
56.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
57.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
58.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
59.申请人前期在细胞中构建一条全新的正交泛素化途径，以确定e3的底物，泛素化传递途径详见图14。构建了泛素化途径中的突变体xub、突变体xe1、突变体xe2和突变体xe3，这些突变体均不与细胞中任何野生型e1、e2和e3或者野生型ub反应，而只在突变体之间发生反应，从而在细胞中产生了一条和野生型途径并存又互不干扰的泛素途径，此途径将突变体xub传递到底物上，再通过检测xub上所携带的tag，就可以确定xub与哪些蛋白结合，则这些蛋白就是此特定e3的底物，随后再采用细胞生物学手段来验证这些底物。
60.本发明借鉴前期的研究基础，在细胞中构建正交sumo传递途径，简称ost.，即首先构建了突变体xsumo、xe1，通过构建如xsumo-xe1组合突变体、xe1-xe2组合突变体来确定ubc9的特异性底物，增加构建如xe2-xe3组合突变体，来确定e3的特异性底物。
61.本发明，第一方面构建ost中只与突变体xsumo5反应，而不与野生型wtsumo反应的突变体xe1。依据xsumo5的突变位点，在e1中引入相应的突变位点恢复与xsumo5的活力。通
过分析wtsumo与wte1的结构，确定e1中与xsumo5突变位点作用的关键位点，并对这些位点进行突变，获得与突变体xsumo5反应的突变体xe1，且突变体xe1不和野生型wtsumo反应。
62.本发明，第二方面构建ost中不与野生型wte1发生反应的突变体xsumo-1和突变体xsumo-2，而突变体xsumo-1和突变体xsumo-2均与第一方面构建的突变体xe1发生反应，且均不会通过野生型wte1传递到野生型e2，但是可以通过突变体xe1传到野生型e2上，且野生型wtsumo和野生型wte1不会干扰ost.途径。
63.本发明，第三方面构建正交的xsumo-xe1组合突变体，可将突变体xsumo通过突变体xe1传到野生型e2上，再从野生型e2传到e2特异性底物rangap上，来鉴别ubc9的特异性底物；增加构建如xe2-xe3组合突变体，可进一步确定e3的特异性底物。
64.本技术的实施例中，材料如下：
65.2x taq pcr mastermix试剂盒，购买于少辛生物科技有限公司；
66.plasmid mimi kit、gel extraction kit，购买于omega bio-tech公司；
67.bca蛋白含量检测试剂盒，购买于凯基生物；
68.lb液体培养基：称量10g胰蛋白胨(tryptone)，5g酵母提取物(yeast extract)，10g nacl于1l玻璃瓶中，加入ddh2o定容至1l。
69.lb固体培养基：称量5g胰蛋白胨(tryptone)，2.5g酵母提取物(yeast extract)，5g nacl，5g琼脂(agar)于1l圆底摇瓶中，加入ddh2o定容至500ml。
70.soc液体培养基：称量10g胰蛋白胨(tryptone)、2.5g酵母提取物(yeast extract)和0.25g nacl于500ml玻璃瓶中，用ddh2o溶解，加入0.25m kcl溶液5ml，2m mgcl2溶液2.5ml，定容至490ml，高温高压灭菌。室温冷却后，加入经0.22μm滤膜过滤除菌后的1m葡萄糖(glucose)溶液10ml，混合均匀，4℃保存。
71.50x tae buffer：称量242.2g tris base和37.2g na2edta
·
2h2o于1l玻璃瓶中，加入800ml ddh2o，置于搅拌器上，在磁石转子的搅拌下使固体充分溶解，加入57.1ml冰醋酸，充分混匀，再加ddh2o定容至1l，室温保存。使用时加入ddh2o稀释50倍至1x tae buffer。
72.dna琼脂糖凝胶(1％)：称量琼脂糖粉末1g于小摇瓶中，加入1ml 1x tae buffer，微波炉中高火加热2min使其彻底溶解。冷却至50℃时，加入10μl dured染料(10000x)，混合均匀后倒入dna胶槽中，立即插入合适孔大小及孔数量的梳子，静置约0.5h至凝固即可。
73.实施例1构建突变体xe1
74.本实施例中，以e1为研究对象，构建了突变体xe1以及进行了突变体xe1的表达和纯化。包括如下：
75.1、构建突变体xe1
76.首先设计含有相应突变点的上下游引物并利用相应的引物，通过pcr得到xe1的前后两个片段，然后通过overlap pcr将前后两片段整合一起，获得xe1的基因片段；构建进入petduet质粒中，得到重组质粒petduet-xe1，然后电转化进入xl-1-blue感受态细胞中。
77.(1)以提取的cdna为模板，进行pcr扩增
78.xsumo5的核苷酸序列包括如seq id no.7所示序列，基于上述突变位点的信息，先后依次设计了3个不同的突变体xe1-1、xe1-2和xe1-3，突变位点及引物见表1和表2。
79.表1
80.mutantpcr templateprimerrestriction enzyme
xe1-1petduet-wte1lin9(f),lin11(or),lin12(of),lin10(r)nhei,mfeixe1-2petduet-xe1-1lin13(f),lin14(or),lin15(of),lin16(r)stui,xhoixe1-3petduet-xe1-2lin13(f),lin17(or),lin18(of),lin16(r)stui,xhoi
81.注：f指xe1片段的上游引物，r指xe1片段的下游引物；or指xe1前段overlap片段的下游引物，of指xe1后段overlap片段的上游引物。xe1-1用的质粒模板是petduet-wte1，形成petduet-xe1-1。xe1-2用的质粒模板是petduet-xe1，形成petduet-xe1-2。xe1-3用的质粒模板是petduet-xe1-2，形成petduet-xe1-3。
82.表2
[0083][0084]
反应体系见表3。将反应体系所需样品加好并混匀后，放入pcr仪中进行扩增，程序如下：预变性94℃反应5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，反应35个循环，最后72℃延伸5min，4℃暂存。
[0085]
表3
[0086][0087][0088]
(2)凝胶电泳
[0089]
pcr扩增产物进行电泳(根据dna分子量大小，配置1％琼脂糖凝胶)，115v，30min。跑胶完成后在紫外成像仪中观察，切取目的条带(约为300bp)，然后使用omega gel exstraction kit回收纯化pcr产物，具体操作按照说明书进行；最后用nanodrop测定pcr产物浓度。
[0090]
(3)将步骤(1)得到的突变体xe1-1、xe1-2和xe1-3的pcr产物和质粒petduet分别用限制性内切酶stui和xhoi进行酶切
[0091]
采用neb公司的限制性内切酶试剂盒进行酶切，具体操作根据说明书进行。酶切反应体系见表4。反应体系在37℃水浴反应3h。
[0092]
表4
[0093][0094]
对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，在紫外成像仪下切取目的条带，然后使用omega gel exstraction kit回收纯化pcr产物，具体操作按照说明书进行；最后用微量分光光度计测定pcr产物浓度。
[0095]
(4)酶连反应
[0096]
利用t4 dna连接酶(thermo scientific)对酶切片段和酶切质粒进行连接，10μl连接体系如下：10μl的xe1-1、xe1-2或xe1-3酶切片段，1μl的petduet酶切片段，1μl的10x t4 buffer，1μl的t4 ligase。混匀后室温反应1h，得到酶连反应产物。
[0097]
(5)重组质粒的构建
[0098]
取3μl步骤(4)得到的酶连反应产物，通过电转化于xl-1-blue感受态细胞。具体如下：
[0099]
将3μl连接产物与50μl左右的xl-1-blue感受态细胞小心混匀，冰敷30min后，42℃热激90s，之后置于4℃复苏2min，加入500μl的soc培养基，于37℃摇晃培养1h，取400μl复苏液体涂布于含有100μmol/l氨苄霉素的lb固体培养基上，并在37℃培育过夜。
[0100]
第2天，挑取单菌落于5ml含有100μmol/l氨苄霉素的lb液体培养基中，37℃，220r/min振摇过。
[0101]
第3天，取800μl的菌液与200μl的50％甘油混合制备菌种，剩余菌液使用质粒小提试剂盒小量制备质粒dna；采用nanodrop测定重组质粒浓度；取重组质粒进行测序(金唯智)，然后将测序结果与模板序列比对，确定目标序列是否成功构建。
[0102]
图1和图2为构建的突变体xe1-1的测序对比结果图。
[0103]
从图1和图2可知，突变体xe1-1的四个突变点(e157r，d435r，r119e，y159e)皆正确引入，且未引入其他突变点，表明重组质粒petduet-xe1-1成功构建。
[0104]
2、突变体xe1的蛋白表达及纯化
[0105]
2.1原核表达
[0106]
以突变体xe1-1为例，取3μl步骤1构建成功的重组质粒petduet-xe1-1与50μl的bl21(de3)感受态细胞小心混匀，进行化学转化，最后取400μl复苏液体涂布于氨苄抗生素板子，并在37℃细菌培养箱培育过夜。过夜后，挑一个单克隆进入5ml含氨苄霉素的lb液体培养基中，经37℃过夜摇晃后，然后转入1l含氨苄霉素的lb液体培养基中，37℃摇晃培养至细菌密度od600＝0.6-0.8，加入1ml的iptg(1m)，16℃低温过夜诱导16h。
[0107]
突变体xe1-2和突变体xe1-3的原核表达同突变体xe1-1。
[0108]
2.2蛋白纯化
[0109]
以突变体xe1-1为例，取1l步骤2.1得到的过夜诱导后的菌液，于8000r/min离心10min；沉淀用lysis buffer重悬，用高压破碎仪充分裂解菌体，将所得裂解液于12000r/min离心30min，收集上清液。
[0110]
取上述上清液40ml与1mlni-beads(biorad)于4℃充分混合，将混合物放入层析柱中，先用lysis buffer润洗，保留40ml的流穿液。然后用wash buffer清洗三遍，最后用3ml的elution buffer洗脱，保留15ml洗脱液。使用3.5kd透析袋4℃过夜透析。
[0111]
突变体xe1-2和突变体xe1-3的蛋白纯化同突变体xe1-1。
[0112]
2.3活性检测
[0113]
采用体外酶联反应结合western blot来验证突变体xe1-1、xe1-2和xe1-3的活性。体外酶联反应体系见表5，37℃反应1h。
[0114]
表5
[0115]
种类浓度wtsumo或xsumo54μmwte1或xe1-1或xe1-2或xe1-31μm野生型e21μmatp10mmmgcl210mmtbs buffer补足至50μl
[0116]
western blot检测方法：上述体外酶联反应的反应液体中，加入12.5μl的5x loading dye，于100℃，加热10min使蛋白变性。按照每孔10μl蛋白变性后的产物于sds-聚丙烯酰胺凝胶(其中sns的浓度为4wt％，聚丙烯酰胺的浓度为15wt％)，在浓缩胶90v和分离胶120v的电压进行电泳。电泳完成后取出page胶，浸泡于transfer buffer，待转膜。转膜时按照“黑胶白膜”的原则，依次将page胶、nc膜、滤纸和海绵垫放入转膜槽中，调节电压为110v，转膜80min。转膜完成后，在5％脱脂牛奶中室温封闭1h，洗净牛奶后将tnet配制的一抗(rabbit anti-ha antibody)加入膜中，置于4℃摇床将膜孵育过夜。隔日用1x tnet溶液洗膜3次，每次10min；再加入tnet配制的二抗(anti-rabbit igg r-800)，室温下置于摇床中孵育1h，用1x tnet溶液洗膜3次，每次10min。最后使用odyssey成像系统进行扫膜。
[0117]
图3为本实施例中突变体xe1-1的western blot检测结果图。
[0118]
从图3可知，在泳道7和8中，约130kd处有ha-sumo～e1(“～”表示硫酯键，下同)的结合条带，突变体xe1-1与野生型wtsumo和突变体xsumo5皆具有反应活性，说明引入的突变恢复了突变体xe1-1与突变体xsumo5的活力，但却无法消除与野生型wtsumo的活性。
[0119]
图4为本实施例中突变体xe1-2的western blot检测结果图。
[0120]
从图4可知，除了泳道5所显示的ha-wtsumo-wte1结合条带外；从泳道7和8可知，突变体xe1-2与野生型wtsumo和突变体xsumo5都没有结合条带，说明突变体xe1-2同时失去了与野生型wtsumo和突变体xsumo5的反应活性。
[0121]
图5为本实施例中突变体xe1-3的western blot检测结果图。
[0122]
从图5可知，除了泳道1所显示的ha-wtsumo-wte1结合条带外；从泳道2和3可知，突变体xe1-3与野生型wtsumo和突变体xsumo5都没有结合条带，说明突变体xe1-3同时失去了
与野生型wtsumo和突变体xsumo5的反应活性。
[0123]
从图3、4和5可知，只有突变体xe1-1(e157r，d435r，r119e，y159e)可以恢复与突变体xsumo5的反应活性，突变体xe1-2和突变体xe1-3都无法与突变体xsumo5反应，活性检测的总结表见下表6。因此，突变体xe1-1可以作为ost途经中xsumo-xe1组合突变体中的e1突变体；其中，突变体xe1-1包括sumo激活酶e1亚基uba2的突变体，氨基酸序列包括如seq id no.5所示的氨基酸序列，多核苷酸包括如seq id no.6所示的核苷酸序列。
[0124]
以本实施例1得到的突变体xe1-1进行后续试验研究。
[0125]
表6
[0126][0127]
实施例2构建突变体xsumo-1、突变体xsumo-2以及xsumo-xe1-1组合突变体
[0128]
本实施例中，构建突变体xsumo-1和xsumo-2以及突变体xsumo-1和xsumo-2的原核表达与纯化，然后分别与实施例1构建的突变体xe1-1形成xsumo-xe1-1组合突变体，通过western blot验证xsumo-xe1-1的反应活性，以鉴别e2的特异性底物。包括如下：
[0129]
1、构建突变体xsumo-1和xsumo-2
[0130]
利用相应引物pcr得到xsumo-1和xsumo-2的片段，通过酶切连接的方式将目的片段插入内切酶消化后pet28a-ha载体中，构建得到重组质粒pet28a-ha-xsumo-1和pet28a-ha-xsumo-2，并进行原核表达和纯化，测定蛋白质的浓度；进行体外酶联反应，最后通过westernblot验证其与实施例1构建的突变体xe1-1的反应活性。
[0131]
1.1以提取的cdna为模板，进行pcr扩增
[0132]
以突变体xsumo5为对象引入突变，突变原则是改变电荷种类、改变亲疏水性质或改变氨基酸分子量大小来以影响其与ubc9的相互作用，从而消除ost途径中xsumo5与野生型ubc9的结合。最终选择了e67、g68这两个氨基酸残基作为突变位点，基于以上突变位点的信息，先后依次设计了2个不同的sumo突变体，即xsumo-1和xsumo-2。
[0133]
突变位点及引物见表7和表8。
[0134]
表7
[0135]
名称新突变位点(相对于xsumo5)总突变位点(相对于wtsumo)xsumo-1e67r，g68ye67r，g68y,r70e,y91a,e93rxsumo-2g68yg68y,r70e,y91a,e93r
[0136]
表8
[0137]
[0138]
50μl反应体系为：1μl的xsumo-1或xsumo-2，1μl的上游引物(10μm)，1μl的下游引物(10μm)，25μl的rtaq mix，22μl的ddh20。将pcr反应体系的样品加好并混匀后，放入pcr仪中，程序如下：预变性94℃反应2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，反应35个循环，最后72℃延伸7min，4℃暂存。
[0139]
1.2将突变体xsumo-1和xsumo-2的pcr产物和质粒pet28a-ha分别用限制性内切酶ecor i和xhoi进行酶切，并t4连接酶连接
[0140]
用限制性内切酶ecor i和xho i分别对步骤1.1)得到的pcr产物和质粒pet28a-ha进行酶切及片段回收，并用酶切片段和酶切质粒进行连接，构建获得重组质粒pet28a-ha-xsumo-1和pet28a-ha-xsumo-2。
[0141]
30μl酶切体系如下：200ng的上述突变体xsumo-1的pcr产物或突变体xsumo-2的pcr产物1μg的pet28a-ha，1μl的ecor i，1μl的xhoi，3μl的10x buffer，加ddh20补齐至30μl。于37℃水浴反应3h。
[0142]
10μl的连接体系如下：7μl的xsumo-1或xsumo-2酶切片段，1μl的pet28a-ha酶切片段，1μl的10x t4 buffer，1μl的t4 ligase。
[0143]
然后将构建的重组质粒pet28a-ha-xsumo-1和pet28a-ha-xsumo-2分别转化于dh5α感受态细胞中涂布于卡那lb板子中，隔日挑取3个单克隆小摇，提取质粒送测序，直至获得引入所设计突变位点的xsumo-1和xsumo-2，突变体xsumo-1包括如seq id no.1所示的氨基酸序列，突变体xsumo-1包括如seq id no.2所示的核苷酸序列；突变体xsumo-2包括如seq id no.3所示的氨基酸序列，突变体xsumo-2包括如seq id no.4所示的核苷酸序列。
[0144]
图6为本实施例中突变体xsumo-1、突变体xsumo-2和质粒pet28a-ha经酶切后的酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。
[0145]
从图6可知，pcr产物和质粒经酶切后结果正常，泳道1、2是突变体xsumo-1的条带，大小约100bp；泳道3和4是突变体xsumo-2的条带，大小约100bp；泳道5和6是酶切质粒pet28a-ha后的条带，大小约为5300bp。
[0146]
两个重组质粒pet28a-ha-xsumo-1和pet28a-ha-xsumo-2提交测序后利用megalign软件与模板序列比对，结果见图7和图8。
[0147]
从图7和图8可知，突变体xsumo-1中新引入e67r和g68y两个突变位点，在突变体xsumo-2中新引入g68y一个突变位点，说明突变体xsumo-1和突变体xsumo-2均构建成功。
[0148]
2、突变体xsumo-1和突变体xsumo-2的原核表达与纯化
[0149]
将构建成功的重组质粒pet28a-ha-xsumo-1和pet28a-ha-xsumo-2，分别化学转化进入bl21(de3)感受态细胞，经涂布平板、挑单克隆、小摇扩增、大摇扩增、诱导表达、高压破碎、ni-beads亲和层析和离心收集得到两种蛋白的上清液、流穿液和洗脱液进行电泳；洗脱液，经过过夜透析，得到最终纯化蛋白，并检测蛋白的浓度。sds-page蛋白电泳和考马斯亮蓝染色，以检测其表达和纯化的情况。
[0150]
图9为本实施例中突变体xsumo-1和突变体xsumo-2经ni-beads亲和层析纯化得到的上清液、流穿液和洗脱液的电泳图。
[0151]
从图9可知，泳道1和5是突变体xsumo-1和突变体xsumo-2的上清液条带，可以清楚地看到17kd附近的目的蛋白条带颜色较深。泳道2和6是突变体xsumo-1和突变体xsumo-2的流穿液条带，可以看到目的蛋白条带颜色很浅，这表明它们已经和ni-beads结合。泳道3、4
和7、8是突变体xsumo-1和突变体xsumo-2的洗脱液条带，可以很明显地看到目的条带的颜色很深，并且其他位置的杂带颜色很浅，表明洗脱液成功地将与ni-beads结合着的目标蛋白洗脱下来，其他杂蛋白则很少，蛋白纯度较高。
[0152]
ni亲和层析纯化后的洗脱液，经过过夜透析，得到最终纯化蛋白。按照bca试剂盒的说明书测定了两种蛋白的浓度。图15是采用bca法测定蛋白浓度时获得的标准曲线。可以算出突变体xsumo-1的浓度为23μm，突变体xsumo-2的浓度为75μm。突变体xsumo-1蛋白和突变体xsumo-2蛋白的浓度有差异，究其原因可能是洗脱时用的elution buffer的量有差别，突变体xsumo-1洗脱时洗脱液的体积较大，导致终浓度较低。
[0153]
3、构建xsumo-xe1-1组合突变体并通过western blot验证反应活性
[0154]
图10为本实施例中xsumo5-xe1-1组合突变体的western blot检测结果图。
[0155]
从图10可知，突变体xsumo5不会和野生型wte1结合，但是可以和突变体xe1-1结合，证明成功构建了xsumo5-xe1-1组合突变体。
[0156]
图11为本实施例中xsumo5-xe1-1组合突变体中加入野生型e2的western blot检测结果图。
[0157]
从图11可知，突变体xsumo5仍能通过野生型wte1传递到野生型e2上。原因为：从图10看出突变体xsumo5和野生型wte1的结合很弱，但是两者仍有极弱的结合能力，在xsumo5-wte1-1中加入野生型e2，由于野生型e2的聚sumo化反应，使得突变体xsumo5在野生型wte1的少量传递现象被放大。
[0158]
图12为本实施例中突变体xsumo-1和突变体xsumo-2的western blot检测结果图。
[0159]
从图12可知，泳道1和泳道2是野生型wtsumo的活性验证，泳道1的130kd处的条带是wtsumo和wte1结合的条带；泳道2的弥散条带是wtsumo通过wte1传递到wte2的聚sumo反应条带，这个泳道证明了所用的野生型蛋白都是有反应活性的。泳道3到泳道7是突变体xsumo-1的活性验证，泳道3的15kd处的条带是xsumo-1，证明ha标签与目的蛋白一起成功表达了；泳道4是突变体xsumo-1与野生型wte1的反应，130kd处没有条带，证明其没有与野生型wte1结合的活性；泳道5是突变体xsumo-1与突变体xe1-1的反应，130kd的条带证明二者是有反应活性的；泳道6没有条带，证明突变体xsumo-1不会通过野生型wte1传递到野生型e2上；泳道7的弥散条带是突变体xsumo-1通过突变体xe1-1结合到野生型e2的聚sumo化反应条带，证明xsumo-1与突变体xe1-1之间是有反应活性的，可以正常传至野生型e2上，并且野生型wtsumo和野生型wte1不会干扰突变途径。泳道8到泳道12是突变体xsumo-2的活性验证，反应情况与突变体xsumo-1十分相似，但是泳道12的弥散条带很淡，证明突变体xsumo-2与野生型e2的结合活性较弱。
[0160]
图13在杂交验证实验中加入了e2特异性底物的rangtp酶激动蛋白，即rangap。
[0161]
从图13可知，泳道1、2、4、5，再一次证明突变体xsumo-1和突变体xsumo-2不会通过野生型wte1途径传递到野生型e2上，但是可以通过突变体xe1-1传到野生型e2上。泳道3和泳道6的结果表明突变体xsumo-1和突变体xsumo-2可以通过突变体xe1-1传到野生型e2上，再从野生型e2传到e2特异性底物rangap上，表明突变体xsumo-1和突变体xsumo-2分别与突变体xe1-1形成合格的组合突变体，xsumo-1-xe1-1和xsumo-2-xe1-1均具有传递到底物rangap的活性，而不受野生型wte1或野生型wtsumo的影响，特异性强，能用于鉴别ubc9的特异性底物，以及鉴别e3的特异性底物。
[0162]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。