使用整联蛋白激动剂的改进培养方法与流程

1.本发明涉及用于培养干细胞或类器官的体外细胞培养方法。本发明涉及适合与所述方法一起使用的培养基；通过所述方法可获得的或所获得的类器官；以及所述培养方法、培养基和类器官在药物发现和验证、毒性测定、诊断和治疗中的用途。


背景技术：

2.用于在培养物中培养干细胞或类器官的当前方法一般需要使用细胞外基质。细胞外基质由分布于全身的纤维状、凝胶状材料的多功能网络组成，对所有组织提供结构和生物化学支持。基质蛋白与许多细胞过程相关，包括细胞粘附、增殖、分化和凋亡。细胞外基质蛋白的实例包括：层粘连蛋白、胶原蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖，所述细胞外基质蛋白在细胞间的间隙空间中自组装或自组装为基底膜。这些细胞外基质蛋白可通过各种各样的细胞受体来影响细胞功能，所述细胞受体能够与一些基质成分结合[1]。
[0003]
可用于培养上皮干细胞的可商购获得的细胞外基质的实例包括由engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞得到的基底膜制备物(例如基底膜提取物(basement membrane extract)(trevigen,inc.)或matrigel
tm
(bd biosciences))。然而，这些细胞外基质的确切组成和它们影响细胞功能的机制仍然未知[2]。由于这些细胞外基质的确切成分没有明确定义，其可能在培养干细胞时引入可变性来源。
[0004]
因此，本领域需要针对这些细胞外基质的合成替代物，其中基质的成分是可控的和可重复的。合成基质可由多种材料(诸如经过化学处理的培养皿塑料或沉积的蛋白层)制成，任选地补充细胞外基质蛋白。然而，本领域的合成基质仅含有主要的细胞外基质蛋白并且不适用于所有细胞类型[2]。此外，尽管这些合成基质可以支持一些干细胞生长，但它们并不如细胞外基质高效。
[0005]
因此，本领域需要培养干细胞的改进方法。特别地，需要在合成基质的情况下改善干细胞生长的培养方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供用于培养上皮干细胞或包含上皮干细胞的类器官的方法，其中所述方法包括在适用于上皮干细胞的培养基中培养所述上皮干细胞，其中所述培养方法还包括使细胞或类器官与整联蛋白激动剂接触。发明人已有利地确定，在细胞外基质存在或不存在的情况下，在用于培养上皮干细胞或类器官的方法中使用整联蛋白激动剂(诸如抗体)导致细胞生长改善。
[0007]
本发明还提供一种在本发明的方法中使用的培养基，所述培养基适用于上皮干并且包含在本发明的方法中使用的wnt激动剂、bmp抑制剂、促有丝分裂生长因子和tgf-β抑制剂中的一种或多种。本发明还提供通过本发明的任何方法可获得或所获得的类器官。
[0008]
本发明的其他方面提供包含如本发明所定义的适用于上皮干的培养基的组合物，以及通过本发明的任何方法可获得或所获得的类器官。本发明还提供包含如本发明所定义
的适用于上皮干的培养基以及细胞外基质或合成基质的组合物。本发明还提供如本发明所定义的细胞外基质或合成基质，其中所述基质还包含如本发明所定义的整联蛋白激动剂。
[0009]
在另外的方面，本发明提供如本发明所定义的整联蛋白激动剂用于培养细胞的用途。这些包括整联蛋白激动剂用于在移植入受试者之前预处理细胞的用途，以及整联蛋白激动剂在细胞移植方法中用作细胞粘附增强剂的用途。
[0010]
本发明还提供本发明的类器官用于药物筛选、靶点验证、靶点发现或毒理学的用途。此外，本发明提供本发明的类器官在治疗中使用或在诊断中使用的用途。
附图说明
[0011]
图1-整联蛋白活性和非活性形式的结构[3]。
[0012]
图2-人源化ts2/16抗体的nupage分析。泳道1：预染色标记物、泳道2-4示出分别为1:1、1:1.4和1:3的重链与轻链构建体比率。
[0013]
图3-利用人源化ts2/16的k562细胞的免疫荧光。
[0014]
图4-人源化ts2/16抗体的功能活性确认。
[0015]
图5-在不存在细胞外基质的情况下使用人源化ts2/16的上皮干细胞的增强的生长。
[0016]
图6-在包含人源化ts2/16抗体的培养基中生长的类器官的实例。
[0017]
图7-使用ts2/16和matrigel的上皮干细胞的增强的生长。
[0018]
图8-使用matrigel的人源化ts2/16-dyna珠粒富集的上皮干细胞的增强的生长。条形1是使用人源化ts2/16抗体的处理并且条形2未经处理。
[0019]
图9-在不存在细胞外基质的情况下使用人源化ts2/16或小鼠huts-4抗体的上皮类器官片段(人结肠)的增强的生长。条形1未经处理，条形2是使用人源化ts2/16抗体的处理并且条3形是使用huts-4抗体的处理。
[0020]
图10-在不存在细胞外基质的情况下使用人源化ts2/16的上皮类器官片段(人结肠)的增强的生长。条形1未经处理并且条形2是使用人源化ts2/16抗体的处理。
[0021]
图11-在包含人源化ts2/16抗体、huts-4抗体和不含抗体的培养基中生长的类器官的实例。所有培养条件均不含matrigel。
[0022]
图12-在包含人源化ts2/16抗体的培养基(顶部)和不含抗体的培养基中从类器官片段开始生长的类器官的实例。
[0023]
图13-(a)在aiib2抗体存在的情况下上皮干细胞生长的缺乏；(b)在包含人源化aiib2抗体的培养基(右)和不含抗体的培养基(左)中的类器官的实例。
[0024]
图14-(a)在aiib2抗体存在的情况下上皮干细胞生长的缺乏；(b)在包含人源化aiib2抗体的培养基(右)和不含抗体的培养基(左)中的类器官的实例。
[0025]
图15-(a)在aiib2抗体存在的情况下上皮干细胞生长的缺乏；(b)在包含人源化aiib2抗体的培养基(右)和不含抗体的培养基(左)中的类器官的实例。
[0026]
图16-(a)在包含人源化ts2/16抗体和matrigel的培养基中生长的胰腺类器官的实例；(b)使用人源化ts2/16和matrigel的胰腺上皮干细胞的增强的生长。
[0027]
图17-(a)使用人源化ts2/16和matrigel的肺上皮干细胞的增强的生长；(b)在包含人源化ts2/16抗体和matrigel的培养基中生长的肺类器官的实例。
[0028]
图18-(a)在包含人源化ts2/16抗体和matrigel的培养基中生长的头颈类器官的实例；(b)使用人源化ts2/16和matrigel的头颈上皮干细胞的增强的生长。
[0029]
图19-在asc8抗体存在的情况下上皮干细胞生长的缺乏。
[0030]
图20-β1整联蛋白激动剂ts/16和β4整联蛋白激动剂3e1对上皮干细胞生长的协同效应。条形1是对照；条形2是使用0.1μg/ml ts2/16的处理；条形3是使用0.1μg/ml ts2/16和0.1μg/ml 3e1的处理；条形4是使用0.1μg/ml ts2/16和1μg/ml 3e1的处理。
具体实施方式
[0031]
如实施例部分详细解释的，发明人假设，抗整联蛋白抗体在上皮干细胞培养的背景下可能有用，以模拟细胞外基质的信号传导和结构功能。为了检验此假设，发明人产生了整联蛋白激动剂，并且在细胞外基质不存在的情况下培养上皮干细胞的方法中对这种整联蛋白激动剂进行了测试。发明人惊讶地发现，这种整联蛋白激动剂在细胞外基质不存在的情况下改善了上皮干细胞的生长和类器官的形成，并且提高了生长效率，因此它与涉及细胞外基质(诸如matrigel或bme)的现有技术方法更具可比性。此外，他们发现当被包括在涉及细胞外基质的培养方法中时，添加整联蛋白激动剂也改善了生长。因此惊人地，发明人证明，添加整联蛋白激动剂改进了具有和不具有细胞外基质两者的用于培养上皮干细胞的方法。不希望受理论的束缚，发明人假设整联蛋白激动剂激活信号传导通路和/或提供结构支持，促进上皮干细胞附着到细胞外基质或合成基质材料。此外，发明人假设整联蛋白激动剂能够模拟细胞外基质的结构功能和信号传导功能，因为添加整联蛋白激动剂能够惊人地使上皮干细胞在细胞外基质不存在的情况下生长。整联蛋白激动剂在细胞外基质不存在情况下增强上皮干细胞生长的能力是特别有利的，因为这是迈向明确的(defined)、受控的和可重复的培养方法的又一步。
[0032]
改善上皮干细胞或类器官的生长速率也是有利的，因为这能获得大量的细胞以用于各种应用(例如药物筛选，其中需要大量的材料来测试各种不同的药物)。从单一起始来源产生细胞的能力对有必要比较实验之间的结果的此类应用是有利的。类似地，这意味着可获得许多细胞以在移植物中使用，并且可以向多个患者移植从有用的供体中获得的细胞。在培养基中培养细胞使得细胞扩增，同时保留其干细胞表型。形成包含这些干细胞的类器官。因此，使用培养基有利于增加这些有用干细胞的数量并且有利于获得含有这些细胞的类器官。
[0033]
因此，本发明涉及使用整联蛋白激动剂来培养上皮干细胞的或包含上皮干细胞的类器官的方法。具体地，本发明提供用于培养上皮干细胞或包含上皮干细胞的类器官的方法，其中所述方法包括在适用于上皮干细胞的培养基中培养所述上皮干细胞或类器官，其中所述培养方法还包括使所述细胞或类器官与整联蛋白激动剂接触。
[0034]
整联蛋白激动剂
[0035]
整联蛋白是异源二聚体跨膜粘附受体，支持细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用。它们通过α和β亚基的非共价缔合形成，存在于所有后生动物中。每种亚基都是i型跨膜糖蛋白，具有介导配体结合的相对较大的细胞外结构域和短胞质尾(β4亚基除外)。哺乳动物有18种α亚基和8种β亚基，它们可以组合以产生至少24种不同的异源二聚体，每种都有自己的结合特异性[3][9]。
[0036]
整联蛋白的结构在图1中示出，并且包括由两条棒状“腿部”支撑的“头部”区域(两个亚基之间的主要接触点)。整联蛋白采用对整联蛋白配体具有不同结合亲和力的不同构象。整联蛋白配体的实例包括胶原蛋白、层粘连蛋白、血小板反应蛋白和纤粘蛋白[4]。在弯曲关闭和扩展关闭构象中，下部的
‘
腿部’和跨膜区域保持缔合，并且配体结合关闭。采用高亲和力的扩展开放构象涉及一系列的形状变化，包括受体的伸直和各种模块间和模块内移动。从弯曲关闭/扩展关闭构象到扩展开放构象的转变被称为“整联蛋白激活”。整联蛋白激活可通过α或β亚基发生。许多刺激整联蛋白激活和配体结合的抗整联蛋白抗体(包括ts2/16)具有别构功能。抗体结合通过稳定活性整联蛋白的信号传导构象形式，将整联蛋白的构象平衡从非活性形式转变为活性形式。因此，结果是活性整联蛋白分子的比例增加[5]。探索β1整联蛋白亚家族的研究显示，ts2/16、12g10和huts-4fabs抗体诱导对环状rgd肽几乎相同的高亲和力，表明它们稳定了β1结构域中的配体结合位点的相同构象[6]。
[0037]
因此，整联蛋白激动剂是激活整联蛋白的剂。换句话讲，整联蛋白激动剂是诱导整联蛋白的构象变化并因此增加整联蛋白对整联蛋白配体的结合亲和力的剂。在一些实施方案中，整联蛋白激动剂不是胶原蛋白、层粘连蛋白、血小板反应蛋白或纤粘蛋白。在一些实施方案中，整联蛋白激动剂激活整联蛋白并且模拟与整联蛋白结合的整联蛋白配体的活性。在一些实施方案中，整联蛋白激动剂可独立于整联蛋白的构象状态来激活整联蛋白，并且也模拟与整联蛋白结合的整联蛋白配体的活性。
[0038]
预期这些整联蛋白激动剂在本发明的背景下特别有用。技术人员使用如实施例3和参考[17]中所述的细胞粘附测定法可容易地鉴定整联蛋白激动剂。技术人员使用如实施例4中所述的测定法可鉴定还可以模拟与整联蛋白结合的配体的活性的整联蛋白激动剂。
[0039]
在一些实施方案中，整联蛋白激动剂具有和整联蛋白激动剂ts2/16相同或相似的对环状rgd肽的亲和力。例如，整联蛋白激动剂在如[7]中所述的荧光偏振测定法中与fitc-crgd结合，fp
max
为0.2-0.3、0.20-0.25或0.21-0.23或更优选地fp
max
为0.21-0.22。在一些实施方案中，整联蛋白激动剂能够和ts2/16稳定相同的整联蛋白开放头部构象。
[0040]
技术人员使用如[7]中所述的测定法可鉴定具有和整联蛋白激动剂ts2/16相似或相同的对环状rgd肽的亲和力的整联蛋白激动剂。技术人员使用如参考[6]中所述的电子显微镜测定法可鉴定能够和ts2/16稳定相同的整联蛋白开放头部构象的整联蛋白激动剂。本领域熟知许多整联蛋白激动剂，包括抗整联蛋白抗体、踝蛋白(talin)、kindlin蛋白、还原剂(诸如二硫苏糖醇)和脂质(诸如25-羟基胆固醇)[8-][9]][10][11]。在优选的实施方案中，整联蛋白激动剂通过其细胞外结构域来激活整联蛋白。这类整联蛋白激动剂包括抗整联蛋白抗体和还原剂(诸如二硫苏糖醇)以及脂质(诸如25-羟基胆固醇)。相比之下，踝蛋白和kindlin蛋白通过与整联蛋白细胞内结构域的相互作用来激活整联蛋白。
[0041]
针对整联蛋白的抗体可具有激活或抑制性质中的一种。术语整联蛋白激动剂仅包含具有刺激或激活作用的抗整联蛋白抗体。所有刺激性或激活特异性的抗整联蛋白单克隆抗体似乎都通过降低解离速率来增加配体结合亲和力，并且可以分为两类。第一亚类识别受配体和阳离子结合调控的表位(称为配体诱导结合位点“libs”)，诸如抗β1单克隆抗体huts-4，而第二亚类不受配体或阳离子结合的影响(包括抗β1单克隆抗体ts2/16)。
[0042]
激活性抗整联蛋白抗体的实例包括：
[0043][0044]
表1-刺激性抗整联蛋白抗体的总结
[0045]
发明人已证明在不需要细胞外基质的情况下，向细胞培养基中添加整联蛋白激动剂可改善上皮干细胞的生长。实施例显示，在不需要细胞外基质的情况下，向细胞培养基中添加人源化ts2/16抗整联蛋白抗体改善了上皮干细胞的生长。此外，发明人已证明添加整联蛋白激动剂可与细胞外基质matrigel(一种基底膜提取物)组合改善上皮干细胞的生长。因此，本文所述的整联蛋白激动剂对培养上皮干细胞特别有用。
[0046]
在一些实施方案中，整联蛋白激动剂选自由抗整联蛋白抗体、踝蛋白、kindlin蛋白、二硫苏糖醇和氧固醇25-羟基胆固醇组成的组。
[0047]
不希望受任何特定理论的束缚，整联蛋白激动剂可在不需要细胞外基质的情况下有利地改善上皮干细胞的生长，因为整联蛋白激动剂可以诱导通常与配体结合相关的整联蛋白的构象状态。整联蛋白激动剂可诱导整联蛋白的高亲和力构象并且激活通常被ecm成分激活的信号传导通路。实施例证明，受配体和阳离子结合调控的抗整联蛋白抗体(诸如huts-4)和那些不受配体或阳离子结合影响的抗整联蛋白抗体(诸如ts2/16)对培养上皮干细胞都可以特别有用。整联蛋白激动剂可通过整联蛋白α或β亚基来互相作用，例如通过与α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3、β4或β7相互作用。在一些实施方案中，整联蛋白激动剂与β亚基β1、β2、β3、β4或β7相互作用。在优选的实施方案中，整联蛋白激动剂与β1亚基相互作用。
[0048]
整联蛋白激动剂可以是抗整联蛋白抗体。为避免任何疑问，本发明的抗整联蛋白抗体是刺激性抗整联蛋白抗体。抗整联蛋白抗体的实例包括：jbs2、hp1/3、snaka51、pts25-2、pmi-1、mem-83、nki-l16、496b、12g10、8a2、ts2/16、15/7、huts-4、8e3、n29、9eg7、mab 24、mem-148、kim127、cbr lfa-1/2、mem-48、kim185、ap3、ap5、libs6、libs2、10f8、2b8和2g3抗体。在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体与β1亚基相互作用，诸如ts2/16、12g10、8a2、15/7、huts-4、8e3、n29和9eg7抗体。在一个实施方案中，抗整联蛋白抗体与β1亚基相互作用并且是mab1778(目录号#mab1778，可从此网站获得：https://www.rndsystems.com/products/human-integrin-beta1-cd29-antibody-4b7r_mab1778)。
[0049]
已知ts2/16、12g10或8a2抗体与βa结构域相互作用。实施例证明了ts2/16抗整联
蛋白抗体用于培养上皮干细胞的有利性质。因此，本发明的抗整联蛋白抗体可优选地与βa结构域相互作用。在优选的实施方案中，抗整联蛋白抗体是ts2/16、12g10或8a2。在其他优选的实施方案中，抗整联蛋白抗体是ts2/16、12g10或huts-4。在进一步优选的实施方案中，抗整联蛋白抗体是ts2/16(或人源化ts2/16)或huts-4(或人源化huts-4)。在进一步优选的实施方案中，抗整联蛋白抗体是ts2/16或人源化ts2/16。在进一步优选的实施方案中，抗整联蛋白抗体是huts-4或人源化huts-4。表2提供了已知的激活性抗整联蛋白β1链抗体表位的总结。这些表位分成两组，第一组由位于预测的配体结合结构域中的非常短的残基(残基207-218)序列组成，并且另一组在位于整联蛋白的膜近侧茎状区域的富含半胱氨酸的重复序列(残基442-629)中或附近具有表位。一些激活性抗整联蛋白β1链抗体仅在整联蛋白具有特定构象时发挥作用，并且人们认为这些抗体(诸如huts-4、huts-7和huts-21)与仅在某些生理条件下[13]暴露的表位结合[12]。
[0050]
激活性抗体表位位置构象依赖性ts2/16207-218否8a2207-218否a1a5207-218否ag89426-587是15/7355-425是huts-4355-425是huts-7355-425是huts-21355-425是9eg7495-602是qe.2e5426-587未确定tasc(鸡β1)304-602未确定jb1b671-703未确定b3b11657-670未确定
[0051]
表2-激活性抗整联蛋白抗体的总结[13]和[12]
[0052]
因此，在一些实施方案中，整联蛋白激动剂(任选地，抗整联蛋白抗体)与β1亚基上的残基207-218的至少一部分相互作用。在一些实施方案中，整联蛋白激动剂(任选地，抗整联蛋白抗体)与β1亚基上的残基442-629的至少一部分相互作用。在一些实施方案中，整联蛋白激动剂(任选地，抗整联蛋白抗体)与β1亚基上的残基335-425的至少一部分相互作用。在一些实施方案中，独立于整联蛋白的构象进行结合的整联蛋白激动剂是优选的，因为它们激活整联蛋白的能力不依赖于生理条件。在优选的实施方案中，整联蛋白抗体的表位不是配体诱导的结合位点。抗整联蛋白抗体可包含seq id no:1的重链可变区(vh)和seq id no：2的轻链可变区(vl)。
[0053]
抗整联蛋白抗体也可以是人源化的，例如抗整联蛋白抗体可以是如实施例中所证明的人源化ts2/16抗体。人源化ts2/16抗体可包含seq id no:3的重链可变区(vh)和seq id no:4的轻链可变区。在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体包含分别为seq id no:5、6和7的重链cdr hcdr1、hcdr2和hcdr3，和分别为seq id no:8、9和10的轻链cdr lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0054]
实施例证明了激动性抗β1整联蛋白抗体(ts2/16)与激动性抗β4抗体(3e1)组合用于培养上皮干细胞的有利和协同性质。因此，可以组合地使用整联蛋白激动剂来培养上皮干细胞。例如，可使用多种抗整联蛋白抗体来培养上皮干细胞。在一些实施方案中，两种抗整联蛋白抗体靶向整联蛋白的同一亚基，例如使用两种或更多种β1整联蛋白激动剂抗体来培养上皮干细胞。在一些实施方案中，两种或更多种β1整联蛋白激动剂抗体选自ts2/16、12g10、8a2、15/7、huts-4、8e3、n29和9eg7，或优选地选自ts2/16、12g10和8a2。在一些实施方案中，ts2/16与huts-4组合地使用。
[0055]
或者，两种抗整联蛋白抗体靶向整联蛋白的不同亚基。抗整联蛋白抗体的可能组合包括：(1)β1整联蛋白激动剂抗体与β2整联蛋白激动剂抗体的组合；(2)β1整联蛋白激动剂抗体与β3整联蛋白激动剂抗体的组合；(3)β1整联蛋白激动剂抗体与β4整联蛋白激动剂抗体的组合；(4)β1整联蛋白激动剂抗体与β7整联蛋白激动剂抗体的组合；(5)β1整联蛋白激动剂抗体与α2整联蛋白激动剂抗体的组合；(6)β1整联蛋白激动剂抗体与α4整联蛋白激动剂抗体的组合；(7)β1整联蛋白激动剂抗体与α5整联蛋白激动剂抗体的组合；(8)β1整联蛋白激动剂抗体与α11b整联蛋白激动剂抗体的组合；(9)β1整联蛋白激动剂抗体与αl整联蛋白激动剂抗体的组合；或(10)β1整联蛋白激动剂抗体与αx整联蛋白激动剂抗体的组合。
[0056]
在优选的实施方案中，β1整联蛋白激动剂抗体与β4整联蛋白激动剂抗体组合地使用以培养上皮干细胞。在优选的实施方案中，β1整联蛋白激动剂抗体是ts2/16、12g10或8a2。在优选的实施方案中，β4整联蛋白激动剂抗体是3e1。在进一步优选的实施方案中，组合地使用ts2/16和3e1以培养上皮干细胞。
[0057]
在一些实施方案中，β1整联蛋白激动剂抗体和β4整联蛋白激动剂抗体以及与α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β2、β3和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。
[0058]
在一些实施方案中，β1整联蛋白激动剂抗体与以下组合地使用：(i)β4整联蛋白激动剂抗体和(ii)两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8或9种)整联蛋白激动剂抗体，其每一种都与选自α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β2、β3和β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0059]
在一些实施方案中，β2整联蛋白激动剂抗体和与α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β3、β4和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，β2整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β3、β4和β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0060]
在一些实施方案中，β3整联蛋白激动剂抗体和与α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β4和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，β3整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β4和β7的不同整联蛋白亚基结合。
[0061]
在一些实施方案中，β4整联蛋白激动剂抗体和与α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，β4整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3和β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0062]
在一些实施方案中，β7整联蛋白激动剂抗体和与α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3和β4中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，β7整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3和β4的不同整联蛋白亚基结合。
[0063]
在一些实施方案中，α2整联蛋白激动剂抗体和与α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3、β4和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，α2整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3、β4或β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0064]
在一些实施方案中，α4整联蛋白激动剂抗体和与α2、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3、β4和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，α4整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3、β4和β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0065]
在一些实施方案中，α5整联蛋白激动剂抗体和与α2、α4、α11b、αl、αx、β1、β2、β3、β4和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，α5整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α4、α11b、αl、αx、β1、β2、β3、β4和β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0066]
在一些实施方案中，α11b整联蛋白激动剂抗体和与α2、α4、α5、αl、αx、β1、β2、β3、β4和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，α11b整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α4、α5、αl、αx、β1、β2、β3、β4和β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0067]
在一些实施方案中，αl整联蛋白激动剂抗体和与α2、α4、α5、α11b、αx、β1、β2、β3、β4和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，αl整联蛋白激动剂抗体与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α4、α5、α11b、αx、β1、β2、β3、β4和β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0068]
在一些实施方案中，αx整联蛋白激动剂抗体和与α2、α4、α5、α11b、αl、β1、β2、β3、β4和β7中的一种结合的激动性抗整联蛋白抗体组合使用。在一些实施方案中，αx整联蛋白激动剂与两种或更多种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)整联蛋白激动剂抗体组合使用，所述两种或更多种整联蛋白激动剂抗体中的每一种都与选自α2、α4、α5、α11b、αl、β1、β2、β3、β4和β7的不同的整联蛋白亚基结合。
[0069]
在其他优选的实施方案中，整联蛋白激动剂的结合依赖于整联蛋白的构象。在其他实施方案中，整联蛋白抗体的表位是配体诱导结合位点。抗整联蛋白抗体可以是huts-4。在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体与ts2/16抗体结合的表位相同。因此，在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体与包含seq id no:3的重链可变区(vh)和seq id no:4的轻链可变区
(vl)的抗体结合的表位相同。在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体与huts-4抗体结合的表位相同。
[0070]
在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体与ts2/16抗体竞争结合β1亚基。因此，在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体与包含seq id no:3的重链可变区(vh)和seq id no:4的轻链可变区(vl)的抗体结合的表位相同。在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体与huts-4抗体竞争结合β1亚基。在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体与3e1抗体竞争结合β4亚基。
[0071]
常规抗体由通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链构成。每条重链和轻链含有恒定区和可变区。每个可变区含有3个主要负责结合靶抗原的表位的cdr。它们被称为cdr1、cdr2和cdr3，从n端开始按顺序编号，其中cdr3区包含最可变的区域，并且通常提供很大部分的对靶标的接触残基。所述可变区的更高保守性的部分被称为"框架区"。在一些实施方案中，抗体部分包含至少一条重链和至少一条轻链。在一些实施方案中，抗体部分由一条重链和一条轻链组成。
[0072]
术语抗体在本文中以最广泛的意义使用，并且具体涵盖但不限于：任何同种型的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，诸如igg、igm、iga、igd和ige；多克隆抗体，包括重组多克隆抗体；寡克隆(oligoclonic)；多特异性抗体；嵌合抗体；纳米抗体；双抗体；bite；tandab；模拟体(mimetobody)；双特异性抗体；人源化抗体；人抗体；去免疫化抗体；以及抗体片段。此外，该术语将涵盖支架，诸如anticalin、ankarin等。可通过重组方法(诸如选择噬菌体或类似载体中的重组抗体文库)或通过用编码靶表位的靶核酸使动物免疫来产生与靶分子的特定表位反应的抗体。
[0073]
在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是双特异性的，包含对整联蛋白亚基中的第一表位的第一结合特异性，以及对整联蛋白亚基中的第二表位的第二结合特异性，其中第一和第二表位是不同的和不重叠的。在某些实施方案中，双特异性抗体结合同一整联蛋白亚基(例如β1亚基)上的不同表位。在其他实施方案中，双特异性抗体结合不同整联蛋白亚基上的表位，例如双特异性抗体对β1整联蛋白亚基中的第一表位具有第一结合特异性，并且对β3整联蛋白亚基中的第二表位具有第二结合特异性。
[0074]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体由以下组成或包含：单结构域抗体(也被称为sdab或纳米抗体)、f(ab')2、fab、fab'、facb或单链fv(scfv)片段。scfv片段是表位结合片段，其含有与抗体轻链可变区(vl)的至少一个片段连接的抗体重链可变区(vh)的至少一个片段。接头可以是短的柔性的肽，其被选择来确保vl和vh区域一旦连接就发生正确的三维折叠，以便保持单链抗体片段所来源的整个抗体的靶分子结合特异性。可通过接头将vl或vh序列的羧基末端共价连接至互补vl或vh序列的氨基酸末端。
[0075]
在一些实施方案中，融合蛋白的抗体部分包含恒定区或fc区。fc区可以由从人和其他动物中(包括牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠和豚鼠)分离的天然形式获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物中获得的重组体或其衍生物。可以通过从人或动物生物体中分离完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶对其进行处理来从天然免疫球蛋白获得fc区。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成fab和fc区域，胃蛋白酶处理导致pf'c和f(ab)2片段的产生。可以对这些片段进行例如尺寸排除色谱法以分离fc。
[0076]
在一些实施方案中，fc区是被修饰的。例如，本发明的免疫球蛋白fc区可以呈具有天然糖链的形式、具有与天然形式相比增加的糖链的形式或与天然形式相比减少的糖链的
形式，或者可以呈去糖基化的形式。可通过本领域的常用方法(诸如化学方法、酶方法和使用微生物的基因工程方法)实现免疫球蛋白fc糖链的增加、减少或去除。从fc区中去除糖链导致与补体(c1q)的结合亲和力显著减小，以及抗体依赖性细胞介导细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)的减小或损失，从而不会在体内诱导不必要的免疫应答。就这一点而言，根据本发明可使用去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白fc区(后者例如由原核生物、优选大肠杆菌(e.coli)产生)。
[0077]
此外，免疫球蛋白fc区可以是来源于igg、iga、igd、ige和igm的fc区，或是由它们的杂交体(编码两种或更多种不同来源的免疫球蛋白fc区的序列，存在于单链免疫球蛋白fc区中)形成的fc区。在本发明中，可以是各种类型的杂交体。即，结构域杂交体可以由选自由igg fc、igm fc、iga fc、ige fc和igd fc的ch1、ch2、ch3和ch4组成的组的一至四种结构域构成并且可以包括铰链区。因此，在一些实施方案中，fc区是杂交体。优选地，fc区来源于igg或igm，igg或igm是人血液中含量最丰富的蛋白质之一，并且最优选地来源于igg，已知fc区可提高配体结合蛋白的半衰期。此外，igg被分成igg1、igg2、igg3和igg4亚类，并且本发明包括它们的组合或杂交体。igg2和igg4亚类是优选的。
[0078]
在一些实施方案中，fc区是同种型的igg，例如igg1，优选人igg或人igg1。
[0079]
在一些实施方案中，fc区被修饰以沉默或减少adcc和/或补体效应子功能。在一些实施方案中，fc区被修饰用于增加fcrn亲和力(可延长半衰期)。合适的修饰在monnet,c
é
line,等人,"selection of igg variants with increased fcrn binding using random and directed mutagenesis:impact on effector functions."frontiers in immunology6:39(2015)中有所描述。在一些实施方案中，抗体含有与fcrn受体结合的fc结构域或其部分。作为非限制性实例，合适的fc结构域可来源于免疫球蛋白亚类，诸如iga、ige、igg或igm。在一些实施方案中，合适的fc结构域来源于igg1、igg2、igg3或igg4。特别合适的fc结构域包括来源于人抗体的fc结构域。
[0080]
在一些实施方案中，被修饰的fc区是具有突变e294del、t307p和n434y中的一种或多种、优选所有突变的igg变体(例如，参见表6，monnet等人的条目“c6a-66”)。这些特定突变预期可沉默adcc和补体效应子功能并增加半衰期。
[0081]
在一些实施方案中，本发明的抗体是多克隆、单克隆、多特异性、小鼠、人、人源化、灵长类化或嵌合抗体或单链抗体。在一些实施方案中，抗体可以是人或人源化抗体。在优选的实施方案中，抗体是人源化抗体。
[0082]
在一些实施方案中，抗体以10-7
m或更小、10-8
m或更小、10-9
m或更小、或10-10
m或更小的kd与整联蛋白结合。例如，抗体可与整联蛋白的α或β亚基(诸如α2、α4、α5、α11b、αl、αx、β1、β2、β3、β4和β7)结合。在一些实施方案中，抗体与整联蛋白的β1、β2、β3、β4或β7亚基结合，并且在优选的实施方案中，抗体与整联蛋白的β1亚基结合。因此，在优选的实施方案中，抗体以10-7
m或更小、10-8
m或更小、10-9
m或更小或10-10
m或更小的kd与整联蛋白的β1亚基结合。在另一个实施方案中，将第一抗体与第二抗体组合，所述第一抗体以10-7
m或更小、10-8
m或更小、10-9
m或更小或10-10
m或更小的kd与整联蛋白的β1亚基结合，所述第二抗体以10-7
m或更小、10-8
m或更小、10-9
m或更小或10-10
m或更小的kd与整联蛋白的β4亚基结合。例如，在一个实施方案中，将以10-8
m或更小的kd与整联蛋白的β1亚基结合的第一抗体与以10-8
m或更小的kd与整联蛋白的β4亚基结合的第二抗体组合。
[0083]
在一些实施方案中，使用red96系统(fortebio,inc.)来测定抗体结合亲和力。例如，可将带flag标签的β1亚基、带flag标签的β2亚基、带flag标签的β3亚基或带flag标签的β7亚基固定到抗flag生物传感器上并与溶液中不同浓度的抗体一起孵育，然后收集结合数据。在一些实施方案中，通过表面等离子共振来测定抗体结合亲和力。
[0084]
在一些实施方案中，使用体外结合竞争测定法来确定测试抗体是否与参考抗体竞争结合整联蛋白。例如，可将带flag标签的β1亚基、带flag标签的β2亚基、带flag标签的β3亚基或带flag标签的β7亚基固定到抗flag生物传感器上，然后测量参考抗体与固定化的带flag标签的β1、β2、β3或β7亚基的缔合(例如使用red96系统，fortebio,inc.)，然后通过在参考抗体存在的情况下将固定化的带flag标签的β1、β2、β3或β7亚基暴露于测试抗体来评估额外结合的程度。
[0085]
在一些实施方案中，抗整联蛋白抗体是只有重链的抗体。术语“抗体”包括完整的四聚体抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，其抗原结合片段选自由vh结构域、fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、单链fv(scfv)和二硫键连接的fv(sdfv)。
[0086]
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可为具有任何大小或氨基酸组成的结构域，并且一般应包含与一个或多个框架序列相邻或同框的至少一个cdr。在具有与v
l
结构域缔合的vh结构域的抗原结合片段中，vh结构域和v
l
结构域可以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可为二聚的并含有vh-vh、vh-v
l
或v
l-v
l
二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单体vh或v
l
结构域。
[0087]
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段中发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)vh-ch1；(ii)vh-ch2；(iii)vh-ch3；(iv)vh-c
h1–ch
2；(v)vh
–ch1–ch
2-ch3；(vi)vh-ch2-ch3；(vii)vh-c
l
；(viii)v
l-ch1；(ix)v
l-ch2；(x)v
l-ch3；(xi)v
l-ch1-ch2；(xii)v
l-ch1-ch2-ch3；(xiii)v
l-ch2-ch3；和(xiv)v
l-c
l
。
[0088]
在任何可变结构域和恒定结构域的构型(包括上列任何的示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可直接彼此连接或可通过全或部分铰链区或接头区连接。铰链区或接头区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，从而在单一多肽分子中相邻的可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性键联。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含相互和/或与一个或多个单体vh或v
l
结构域(例如，通过二硫键)呈非共价缔合的任何上列可变结构域和恒定结构域构型的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。
[0089]
就全抗体分子来说，抗原结合片段可为单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地与单独抗原结合或与同一抗原上的不同表位结合。任何多特异性抗体型式，包括本文中所公开的示例性双特异性抗体型式，可使用本领域中可利用的常规技术来改编，使其适用于本发明抗体的抗原结合片段情形。
[0090]
用于鉴定hcvr和lcvr氨基酸序列内的cdr的方法和技术是本领域所熟知的并可用于鉴定本文中所公开的指定hcvr和/或lcvr氨基酸序列内的cdr。可用于鉴定cdr的边界的示例性惯例包括例如kabat定义、chothia定义和abm定义。一般来说，kabat定义以序列变异性为基础，chothia定义以结构环区的位置为基础，而abm定义为kabat方法与chothia方法
间的折衷方法。参见例如kabat,"sequences of proteins of immunological interest,"national institutes of health,bethesda,md.(1991)；al-lazikani等人,j.mol.biol.273:927-948(1997)；和martin等人,proc.natl.acad.sci.usa 86:9268-9272(1989)。也可利用公开的数据库供鉴定抗体内的cdr序列。
[0091]
在其他实施方案中，整联蛋白激动剂不是抗体。例如，整联蛋白激动剂是踝蛋白或整联蛋白激动剂可以是kindlin蛋白。整联蛋白激动剂也可以是踝蛋白与kindlin蛋白组合使用。在另一个实例中，整联蛋白激动剂可以是还原剂(诸如二硫苏糖醇)或脂质(诸如氧固醇25-羟基胆固醇)。在一些实施方案中，使用多于一种的整联蛋白激动剂，包括本文提及的整联蛋白激动剂的任何组合。
[0092]
在一些实施方案中，与使用实施例的人源化ts2/16抗体(例如，如在实施例4中提供的方法中测试的)进行的相同方法相比，整联蛋白激动剂在所要求保护的培养方法中导致至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞生长。在一些实施方案中，与使用实施例的小鼠huts-4抗体(例如，如在实施例6中提供的方法中测试的)进行的相同方法相比，整联蛋白激动剂在所要求保护的培养方法中导致至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞生长。在一些实施方案中，相对于不使用整联蛋白激动剂的相同方法，本发明的方法导致4天内上皮干细胞生长至少增加10％、20％、50％。在一些实施方案中，相对于不使用整联蛋白激动剂的相同方法，本发明的方法导致4天内上皮干细胞生长至少增加2倍、3倍、4倍或5倍。上皮干细胞生长可定义为类器官的数量，并且可根据实施例3、4或5中的方法进行测试。
[0093]
在一些实施方案中，本发明的方法导致新类器官的生长。在一些实施方案中，本发明的方法导致现有类器官的扩增。
[0094]
整联蛋白激动剂可以作为培养基的一部分、作为细胞外基质或合成基质的成分或作为添加到培养容器中的单独成分与上皮干细胞或包含上皮干细胞的类器官接触。
[0095]
细胞外基质和合成基质
[0096]
上皮干细胞通常在具有已知支持细胞生长的外源性细胞外基质的培养中生长(例如参见[20]，其描述了如何将细胞铺种在基底膜提取物(bme；amsbio)或matrigel(bd biosciences)中)。基底膜提取物(amsbio)和matrigel
tm
(bd biosciences)是来源于由engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞得到的基底膜制备物的可商购获得的细胞外基质的实例。然而，这些细胞外基质的确切成分没有明确定义，这会在培养上皮干细胞时产生不期望的可变性来源[14]。
[0097]
尚未完全确定细胞外基质的组成成分和这些成分的作用机制。细胞外基质的合成替代物(诸如聚合物和水凝胶)无法忠实地复制上皮干细胞培养中细胞外基质实现的生长效率。使用细胞外基质蛋白(诸如层粘连蛋白和纤粘蛋白)代替细胞外基质也未能复制上皮干细胞培养中细胞外基质实现的生长效率。
[0098]
出乎意料地，实施例证明，包含整联蛋白激动剂的培养基可以在细胞外基质存在或不存在的两种情况下，改善培养基中上皮干细胞的生长。不希望受任何具体理论的束缚，功能性细胞外基质包括结构成分和信号传导成分。单独的合成基质被认为仅提供结构成分。因此，整联蛋白激动剂被提议充当长期寻而不得的信号传导成分，并且也可以提供额外的结构支持。
[0099]
实施例证明包含整联蛋白激动剂的培养基可惊人地改善在无外源性细胞外基质
的培养中的上皮干细胞生长。因此，在一些实施方案中，培养方法不涉及将细胞与外源性细胞外基质接触。例如，培养方法不涉及将细胞与包含糖蛋白的外源性细胞外基质接触，例如培养方法不涉及将细胞与基底膜提取物或matrigel接触。
[0100]
整联蛋白激动剂特别适用于和合成基质一起使用。因此，在一些实施方案中，本发明的培养方法可包括培养与合成基质接触的上皮干细胞。可以控制合成基质的成分，这减少了培养上皮干细胞时可能的可变性，可帮助改善培养中的上皮干细胞的生长速率、扩增和/或分化。合成基质可包含任何聚合物，例如聚酯、聚乙二醇或水凝胶。在一些实施方案中，合成基质包含聚乙二醇和/或水凝胶。在一些实施方案中，合成基质包含交联聚乙二醇(peg)水凝胶。
[0101]
可以提供任何合适形式的合成基质，包括在表面、珠粒上或作为涂层(例如在培养板、培养容器或珠粒上)。珠粒优选为微珠。在实施例中使用了超低附着表面(ultra-low attachment surface)(sigma aldrich)。这种表面是共价结合的水凝胶层，具有亲水性和中性电荷。因此，在一些实施方案中，合成基质是水凝胶层。
[0102]
在一些实施方案中，合成基质包含生物材料，优选地细胞外基质成分。例如，生物材料可包含一种或多种糖蛋白(任选地选自胶原蛋白、层粘连蛋白、串珠蛋白聚糖(perlecan)、纤连蛋白或纤连蛋白的rgd附着配体)和/或一种或多种碳水化合物(任选地透明质酸)。可以使用的合成基质的一个实例是pronectin(例如sigma z378666)。pronectin包含非动物来源的聚合物，所述聚合物并入了人纤连蛋白的rgd附着配体的多个拷贝，间隔在重复的结构肽单元之间。其可以以pronectin-f包被的珠粒形式提供。芯珠是直径大小为125-212微米的固体共聚物。因此，在一些实施方案中，合成基质包含纤粘蛋白的rgd附着配体。在一些实施方案中，peg凝胶可以富含细胞外基质成分，诸如纤连蛋白、层粘连蛋白-111、胶原蛋白iv、透明质酸和串珠蛋白聚糖。在一些实施方案中，peg凝胶中的纤连蛋白可以用rgd(arg-gly-asp)肽代替[15]。
[0103]
合成基质的另一个实例是如[16]中所述的基于四臂、马来酰亚胺封端的聚(乙二醇)大分子单体的合成水凝胶。大分子单体用粘附肽功能化，并在细胞存在的情况下交联以产生peg-4mal水凝胶。水凝胶聚合物密度可在3.5-6.0重量/体积之间，优选地水凝胶聚合物密度为4％。水凝胶聚合物可以配制成包括rgd粘附肽或gpq-w交联肽。
[0104]
可使用蛋白质a/g来配制水凝胶聚合物。蛋白质a/g是重组融合蛋白，组合了蛋白质a和蛋白质g的igg结合结构域。蛋白质a/g通过接头与水凝胶连接并提供抗体可附着的框架。然后可以用抗整联蛋白抗体使水凝胶饱和，这使得抗体以多价的方式存在。这种合成ecm的配制帮助重建细胞中发现的自然ecm环境，因为ecm的结构成分和信号传导成分两者是一起提供的。可由葡聚糖聚合物或苯-1,3,5-三甲酰胺聚合物制得水凝胶凝胶。在优选的实施方案中，水凝胶由n端(z33肽)具有抗体结合单元的类弹性蛋白(elp)制成。
[0105]
这些实施例还证明，即使在外源性细胞外基质存在的情况下，整联蛋白激动剂也改善了培养中的上皮干细胞的生长速率。因此，在一些实施方案中，本发明的方法可包括培养与细胞外基质(ecm)接触的上皮干细胞。ecm由上皮细胞、内皮细胞、体壁内胚层样细胞(例如hayashi等人(2004)matrix biology 23:47 62中描述的englebreth holm swarm体壁内胚层样细胞)和结缔组织细胞分泌。它可通过培养分泌ecm的细胞并分离ecm来制备，或通过商购获得(例如，作为matrigel或bme)。它包含多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白，其中
糖蛋白包含胶原蛋白、entactin(nidogen)、纤粘蛋白和层粘连蛋白。本文所指的ecm由分泌ecm的细胞自然产生。在一些实施方案中，ecm是来源于englebreth holm swarm体壁内胚层样细胞的基底膜制备物(如hayashi等人(2004)matrix biology 23:47 62中所述)。
[0106]
ecm在本发明的背景下使用时是外源性ecm(意思是当与本发明的培养基接触时，它是除了由上皮干细胞自然分泌的任何细胞外基质蛋白之外的，换句话讲，它是由在本发明的方法中培养的上皮干细胞之外的细胞产生的)。
[0107]
在一些实施方案中，ecm是三维的基质。在一些实施方案中，细胞嵌入ecm中。在一些实施方案中，细胞附着于ecm。本发明的培养基可以扩散到三维ecm中。在其他实施方案中，ecm是呈悬浮液，即细胞在悬浮系统中与ecm接触。在一些实施方案中，ecm在悬浮液中的浓度为至少1％、至少2％或至少3％。在一些实施方案中，ecm在悬浮液中的浓度为1％至约10％或1％至约5％。悬浮法对于升级(upscale)方法可具有优势。
[0108]
在一些实施方案中，本发明的培养方法包括培养与细胞外基质和/或合成基质接触的上皮干细胞。“接触”是指物理或机械或化学接触，这意味着为了将所述得到的类器官或上皮细胞群与所述基质分离，需要使用力。培养基和/或细胞可以放置在细胞外基质或合成基质上，嵌入细胞外基质或合成基质中，或与细胞外基质或合成基质混合。
[0109]
在一些实施方案中，培养基置于细胞外基质或合成基质的顶部。然后可以在需要时去除和补充培养基。在一些实施方案中，培养基每1、2、3、4、5、6或7天补充一次。如果在培养基中“添加”或“去除”成分，那么这在一些实施方案中可意味着从细胞外基质或合成基质去除培养基本身，然后将含有“添加”的成分或排除“去除”的成分的新培养基置于细胞外基质或合成基质上。
[0110]
三维基质支持三维上皮类器官的培养。因此在一些实施方案中，细胞外基质或合成基质是三维基质。
[0111]
细胞外基质或合成基质还可包含如上文所述的整联蛋白激动剂。
[0112]
培养上皮干细胞或类器官
[0113]
随着上皮干细胞扩增和/或分化以产生类器官，它们通常根据本领域已知的方法以规则的间隔传代(即分裂)。传代通常涉及用机械方式分离类器官，任选地将它们从细胞外基质或合成基质去除，收集，洗涤，以及以合适的比率(例如1:5到1:20)铺种，以允许高效长出或新的类器官。根据需要，通常还以规则的间隔补充培养基。
[0114]
因此，在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞每周传代两次、每周传代一次、每10天传代一次、每两周传代一次、每5-20天传代一次，优选地每7-14天传代一次。
[0115]
在一些实施方案中，所述方法还包括以1:5和1:20之间的比率铺种细胞。
[0116]
在一些实施方案中，所述方法还包括每1-3天补充一次培养基、每1-2天补充一次培养基、每隔一天补充一次培养基或每天补充一次培养基。在优选的实施方案中，所述方法还包括每1-3天补充一次培养基、每1-2天补充一次培养基。
[0117]
在一些实施方案中，所述方法包括将上皮干细胞培养至少5代，例如至少6代、至少7代、至少8代、至少9代、至少10代、至少11代、至少12代、至少13代、至少14代、至少15代、至少16代、至少17代、至少18代、至少19代、至少20代、至少25代、至少30代、至少40代、至少50代、至少60代，或培养6-40代之间，例如约8-35代、约10-30代或约12-25代。在一些实施方案中，所述方法包括将上皮干细胞培养8-50代、10-50代、15-50代、20-50代或20-40代。在一些
实施方案中，所述方法包括将上皮干细胞培养至少2周、至少1个月、至少2个月，更优选地至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少15个月、至少20个月、至少24个月、至少25个月、至少30个月或更多个月，例如3年或更多年。
[0118]
用于培养的上皮干细胞及其制备
[0119]
上皮干细胞可以是单个细胞或上皮干细胞群的一部分。上皮干细胞可以包含在类器官和/或上皮组织外植体中。在某些实施方案中，上皮干细胞是哺乳动物上皮干细胞，任选地人或小鼠上皮干细胞。在优选的实施方案中，上皮干细胞是人上皮干细胞。在一些实施方案中，上皮干细胞的特征在于lgr5的表达。
[0120]
上皮干细胞从成体组织获得，即上皮干细胞是成体上皮干细胞。在此背景下，“成体”是指成熟组织，即包括新生婴儿或儿童，但不包括胚胎或胎儿。或者，上皮干细胞不来源于胚胎干细胞或胚胎干细胞系，例如其已在体外分化。
[0121]
上皮干细胞可来源于结肠直肠、小肠、胃、胰腺、肝、肺、乳腺、前列腺、肾、口腔、鼻咽、咽喉、下咽、喉、气管、皮肤、输卵管、卵巢、唾液腺、食道、毛囊和/或耳蜗组织。在一些实施方案中，上皮干细胞是结肠直肠细胞。先前已经描述了用于培养来自各种组织的上皮干细胞的方法(例如在wo2009/022907、wo2010/090513、wo2012/014076、wo2012/168930、wo2015/173425、wo2016/083613和wo2016/083612以及clevers,cell 165(7)1586-1597,(2016)中)。
[0122]
直接取自组织的细胞，即新鲜分离的细胞，也称为原代细胞。在一些实施方案中，上皮干细胞是原代上皮干细胞。
[0123]
原代细胞培养物可以传代以形成次代细胞培养物。除癌细胞外，传统的次代细胞培养物的寿命有限。在一定次数的群体倍增(例如50-100世代)后，细胞会经历衰老过程并停止分裂。来自次代培养物的细胞可以永生化以成为连续的细胞系。永生化可以自发发生，或者可以由病毒或化学诱导。永生化细胞系也称为转化细胞。相比之下，本发明的方法允许上皮干细胞通过类器官生长来连续传代，而无需永生化或转化。因此在一些实施方案中，上皮干细胞不是永生化或转化细胞，或者不来源于永生化细胞系或转化细胞系。本发明的优点是，经过多轮扩增和传代的上皮干细胞保留了原代细胞的特征，并且具有最小的或没有基因型或表型变化。本发明方法中的上皮干细胞起始群可因此获得自或来源于现有的类器官，并且可以进一步培养和扩增以产生新的细胞和类器官。因此在一些实施方案中，上皮干细胞群中的上皮干细胞是类器官的一部分或分离自类器官，或者其中上皮干细胞群是类器官、类器官的一部分或分离自类器官。
[0124]
在一些实施方案中，上皮干细胞是正常细胞。在另选的实施方案中，上皮干细胞是癌症干细胞。因此，如果需要，可以从肿瘤获得细胞。
[0125]
在一些实施方案中，方法包括培养包含上皮的组织片段。在一些实施方案中，上皮干细胞分离自组织片段。
[0126]
类器官优选地使用来自成体组织的上皮细胞，任选地来自成体组织的表达lgr5的上皮干细胞获得。
[0127]
在一些实施方案中，类器官源自单个细胞，任选地表达lgr5的单个细胞。有利地，这允许形成同质的细胞群。可用机械方式产生包含上皮干细胞的单细胞悬浮液。在一些实
施方案中，使用机械过程和/或酶消化来产生包含上皮干细胞的单细胞悬浮液。机械过程包括但不限于解剖、显微解剖和过滤。
[0128]
在一些实施方案中，起始培养物是细胞团块或细胞群，例如结肠直肠片段中含有的细胞群。因此，本发明的方法不限于使用单个细胞作为起始点。
[0129]
可以通过本领域已知的任何合适的分离方法来获得上皮干细胞。在一些实施方案中，从组织样本，诸如手术标本或活检标本将上皮层显微解剖、用酶消化、过滤并且将所得细胞悬浮液铺种。在一些实施方案中，显微解剖是为了去除其他组织类型，诸如脂肪和肌肉。在一些实施方案中，酶是胰蛋白酶、胶原酶或accutase。在一些实施方案中，酶是胰蛋白酶，任选地0.125％的胰蛋白酶。在一些实施方案中，样本在37℃下孵育，任选地然后，例如用移液管，以重复的时间间隔(诸如每2、5、10或15分钟)破坏样本。在一些实施方案中，样本在37℃下在0.125％胰蛋白酶中孵育，并使用移液管大约每10分钟一次剪切样本。在一些实施方案中，酶消化进行约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些实施方案中，通过在合适的培养基中稀释来完成酶消化。在一些实施方案中，使用100μm的过滤器来进行过滤步骤。在一些实施方案中，将由机械过程或酶消化产生的所得细胞悬浮液与ecm和培养基接触。
[0130]
获得用于培养的上皮干细胞的一种方法基于上皮干细胞在其表面表达lgr5和/或lgr6的事实；这些蛋白质属于大g蛋白偶联受体(gpcr)超家族(参见例如wo 2009/022907，其内容以全文引用的方式并入本文)。lgr亚家族在携带对配体结合很重要的大的富含亮氨酸的胞外域方面是独特的。优选的方法因此包括由如上文所述的所述上皮组织制备细胞悬浮液，使所述细胞悬浮液与lgr5和/或6结合化合物(诸如抗体，例如抗lgr5单克隆抗体，例如，如wo 2009/022907中所述)接触，分离lgr5和/或6结合化合物，并从所述结合化合物中分离干细胞。
[0131]
培养后，方法还可包括获得和/或分离一种或多种上皮干细胞或类器官。例如，在培养干细胞之后，从培养基中去除在培养基中培养的一种或多种干细胞和/或一种或多种类器官以用于后续应用可能是有用的。例如，分离单个细胞用于后续分化可能是有用的。
[0132]
本发明方法中获得和/或分离的类器官可再现起始上皮干细胞的特征。例如，在培养基中培养的细胞保留相同的基因型和表型，并且包括具有干细胞样性质的细胞(例如特征在于lgr5表达的细胞)。这意味着取自患病组织(例如，来自癌组织)的细胞忠实地模拟了所讨论的疾病。或者，在分化培养基中培养的细胞可导致包含更成熟、分化的细胞类型(与起始细胞相比时)的类器官。
[0133]
上皮干细胞之外的细胞
[0134]
本发明的方法可有利于所有细胞类型，而不仅有利于上皮干细胞和上皮类器官。具体地说，整联蛋白激动剂可改善许多细胞类型的细胞培养。例如，整联蛋白激动剂可有利于其他干细胞，特别是已证实会受益于使用细胞外基质(诸如matrigel或bme)培养的其他干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(例如参见clevers,cell 165(7)1586-1597,(2016))。胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的培养经常涉及将干细胞分化为更成熟的细胞类型。因此，使用整联蛋白激动剂的胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的培养在分化方法的背景下可能特别有用。整联蛋白激动剂在造血干细胞培养中也可能特别有用——尽管造血干细胞已在许多医院中常规使用了几十年，但仍无法在培养中有效地扩增这些细胞。添加
整联蛋白激动剂预期可改善造血干细胞培养。
[0135]
因此，在本公开描述了关于上皮干细胞的实施方案的情况下，也公开了此实施方案用于干细胞(一般而言)，或用于胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。在本公开描述了关于上皮干细胞的实施方案的情况下，也公开了相同的实施方案用于造血干细胞。
[0136]
共培养
[0137]
方法还可包括与非上皮细胞类型、任选地免疫细胞共培养。方法包括在体外培养中将如本文所述的类器官与免疫细胞混合的步骤。在优选的实施方案中，在如本文所述的共培养培养基中维持类器官共培养。
[0138]
在一些实施方案中，用于制备类器官-免疫细胞共培养物的方法包括以下步骤的一个或多个：通过在类器官培养基中培养上皮干细胞来制备至少一种类器官；和/或在免疫细胞扩增培养基中培养免疫细胞。在一些实施方案中，方法还包括从不纯的免疫样本中获得免疫细胞的步骤。本领域已知从不纯的免疫样本中分离免疫细胞的方法。
[0139]
本发明还提供通过上述方法获得的类器官-免疫细胞共培养物。本发明还提供所述类器官-免疫细胞共培养物在药物筛选、毒理学筛选、研究和药物开发中的用途。
[0140]
培养基
[0141]
本领域熟知适用于上皮干细胞的培养基，例如如wo2009/022907、wo2010/090513、wo2012/014076、wo2012/168930、wo2015/173425、wo2016/083613、wo2016/083612和wo2017/149025中所述。这些文件中提及的培养基以引用方式并入本文，并且这些培养基中的任何一种都可以在本发明的背景下使用。
[0142]
在一些实施方案中，适用于培养上皮干细胞的培养基可包含wnt激动剂、bmp抑制剂、促有丝分裂生长因子和tfg-β抑制剂中的一种或多种。例如，适用于上皮干细胞的培养基包含wnt激动剂。适用于上皮干细胞的培养基还可包含促有丝分裂生长因子和/或bmp抑制剂。
[0143]
在优选的实施方案中，适用于上皮干细胞的培养基包含wnt激动剂、bmp抑制剂、促有丝分裂生长因子和tfg-β抑制剂。适用于上皮干细胞的培养基还可包含p38抑制剂、camp激动剂、前列腺素通路激活剂、烟酰胺、胃泌素、b27和n-乙酰半胱氨酸中的一种或多种。
[0144]
在一些实施方案中，培养基包含人或动物细胞的基础培养基(诸如任选地包括b27的dmem/f12)、r-spondin家族蛋白、促有丝分裂生长因子(诸如egf)、bmp抑制剂(诸如头蛋白(noggin))、tgf-β抑制剂(诸如a83-01)、p38抑制剂(诸如sb202190)以及任选地烟酰胺和n-乙酰半胱氨酸。
[0145]
在一些实施方案中，培养基包含高级dmem/f12培养基，其包括b27、烟酰胺、n-乙酰半胱氨酸、头蛋白、r-spondin 1、egf、wnt条件培养基(50％，使用稳定转染的l细胞产生)、tgf-b i型受体抑制剂a83-01和p38抑制剂sb202190。
[0146]
在一些实施方案中，适用于上皮干细胞的培养基是适用于扩增上皮干细胞的培养基。技术人员将理解上文提及的培养基对于扩增上皮干细胞特别有用。
[0147]
在其他实施方案中，适用于上皮干细胞的培养基是适用于分化上皮干细胞的培养基。
[0148]
本发明提供如本文所定义的适用于培养上皮干细胞的培养基，其中所述培养基还包含如本文所定义的整联蛋白激动剂。
[0149]
wnt激动剂
[0150]
适用于培养上皮干细胞的培养基可包含一种或多种wnt激动剂。wnt激动剂在本文中定义为激活或增强细胞中tcf/lef介导的转录的剂。
[0151]
典型的wnt信号传导通路由在包含frizzled(fzd)受体和lrp的细胞表面wnt受体复合物被激活(通常通过细胞外信号传导分子，诸如分泌糖蛋白wnt家族的成员)时发生的一系列事件定义。这导致激活dishevelled家族蛋白，所述蛋白抑制包括axin、gsk-3和apc蛋白的蛋白复合物降解细胞内β-连环蛋白。由此产生的富集核β-连环蛋白增强了通过tcf/lef家族转录因子的转录(driehuis&clevers,british journal of pharmacology(2017)174 4547
–
4563)。
[0152]
r-spondin/rnf43/lgr模块进一步调控典型的wnt信号传导。在没有r-spondin的情况下，e3连接酶rnf43/znrf3将fzd泛素化，由此对其进行标记以被蛋白酶体降解并抑制wnt信号传导。在细胞外r-spondin存在的情况下，它可以通过lgr受体与跨膜e3连接酶rnf43/znrf3相互作用，阻止e3连接酶的作用。lgr受体，包括lgr4、lgr5和lgr6，尤其是lgr5，在上皮干细胞上表达。r-spondin被这些干细胞标记物募集以增强wnt信号传导，因此r-spondin和lgr相互作用以促进增殖并保留干细胞多能性。由于这些原因，r-spondin家族蛋白已被证明在用于获得长寿命的类器官培养物的上皮干细胞培养中特别有用。
[0153]
因此，培养基中的一种或多种wnt激动剂可选自：来自分泌糖蛋白wnt家族的wnt配体、细胞内β-连环蛋白降解抑制剂、gsk-3抑制剂、tcf/lef激活剂、rnf43或znrf3抑制剂以及r-spondin家族蛋白。在一些实施方案中，培养基中的wnt激动剂包含r-spondin家族蛋白和gsk-3抑制剂，并且任选地还包含来自分泌糖蛋白wnt家族的wnt配体。
[0154]
r-spondin家族蛋白(本文也称为“r-spondin”)可选自r-spondin 1、r-spondin 2、r-spondin 3、r-spondin 4和类似物、片段、变体和它们的衍生物。在此背景下，片段、变体或衍生物能够阻止e3连接酶rnf43/znrf3对wnt受体复合物的作用。r-spondin 1、r-spondin 2、r-spondin 3和r-spondin 4(本文也称为“r-spondin 1-4”)均有以下特征：对wnt信号强化作用是必要的和充分的两个氨基末端弗林蛋白酶样重复序列，和更靠近羧基末端成员的血小板反应蛋白结构域(lau等人genome biol.2012；13(3):242(2012)。技术人员已知适合在本发明中使用的r-spondin片段、变体和衍生物的实例(例如参见wo 2012/140274的实施例2，其描述了能够增强wnt信号传导的弗林蛋白酶结构域片段并且其通过引用方式并入本文)。r-spondin家族蛋白类似物的实例包括，例如与rnf43/znrf3/lgr相互作用的抗体。本领域已知能够增强wnt信号传导的激动性抗lgr5抗体(例如参见在wo 2012/140274的实施例3中描述的抗体1d9)。
[0155]
许多gsk-3抑制剂是本领域已知的(例如参见greengard,p.,和meijer,l.(2004)structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3and cyclin-dependent kinases.j med chem 47:935-946；和thomas kramer,boris schmidt,和fabio lo monte,“small-molecule inhibitors of gsk-3:structural insights and their application to alzheimer's disease models,”international journal of alzheimer's disease,2012卷,论文id 381029,32页,2012.https://doi.org/10.1155/2012/381029)并且可通过商购获得(例如参见在此可购自santa cruz biotechnology的列表：https://www.scbt.com/
scbt/browse/gsk-3-beta-inhibitors/_/n-x6oud)。这些gsk-3抑制剂中的任一种都适合在本发明的背景下使用，并且技术人员将能够使用ic50值来确定合适的浓度。
[0156]
chir-99021(cas:252917-06-9；6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1h-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-氰基吡啶；ct99021)是有效的和选择性的gsk-3抑制剂。ic50值为0.6nm至7nm的其他氨基嘧啶抑制剂包括chir98014(axon,目录号1126)、chir98023、chir99021(参见上文)、tws119(tocris,目录号3835)。因此，在一些实施方案中，gsk-3抑制剂是氨基嘧啶抑制剂，任选地选自chir98014、chir98023、chir99021或tws119。在一些实施方案中，gsk-3抑制剂是chir-99021。
[0157]
可使用任何合适浓度的gsk-3抑制剂(例如chir-99021)，例如10nm和500μm之间、10nm和400μm之间、10nm和300μm之间、10nm和200μm之间、10nm和100μm之间或20nm和50μm之间，或者其中最终浓度为约3μm。
[0158]
来自分泌糖蛋白wnt家族的wnt配体可选自wnt-l/int-1、wnt-2/irp(inm-related protein)、wnt-2b/13、wnt-3/int-4、wnt-3a(r&d systems)、wnt-4、wnt-5a、wnt-5b、wnt-6(kirikoshi h等人2001biochem biophys res com 283 798-805)、wnt-7a(r&d systems)、wnt-7b、wnt-8a/8d、wnt-8b、wnt-9a/14、wnt-9b/14b/15、wnt-10a、wnt-10b/12、wnm i和wnt-16。"the wnt family of secreted proteins",r&d systems catalog,2004中提供了人wnt蛋白的综述。在一些实施方案中，wnt配体是wnt-3a、wnt-5或wnt-6a或任选地是wnt-3a。添加可溶性wnt配体已被证明对人上皮干细胞的扩增特别有利(例如，如wo2012/168930中所述)。
[0159]
wnt激动剂优选地以以下量添加到培养基中：如在相同细胞类型中评估的，相对于在所述分子不存在情况下的wnt活性水平，所述量有效地刺激细胞中的wnt活性至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少50％，更优选至少70％，更优选至少90％，更优选至少100％。如技术人员已知的，可例如使用ptopflash和pfopflash tcf荧光素酶报告基因构建体，通过测量wnt的转录活性来确定wnt的活性(korinek等人,1997.science 275:1784
–
1787)。
[0160]
可以以wnt条件培养基的形式提供可溶性wnt激动剂，诸如wnt-3a。例如，可使用约10％至约30％，例如约10ng/ml至约10μg/ml，优选地约1μg/ml的wnt条件培养基。在其他实施方案中，可使用替代的wnt激动剂(例如，如[19]和实施例中所述)。
[0161]
可以以r-spondin条件培养基的形式或以重组蛋白的形式提供r-spondin。例如，可以使用约10ng/ml至约500ng/ml、约10ng/ml至约400ng/ml、约10ng/ml至约300ng/ml、约10ng/ml至约250ng/ml、约50ng/ml至约250ng/ml、约100ng/ml至约250ng/ml，或约150ng/ml至约250ng/ml，优选地约150ng/ml至约250ng/ml的r-spondin。例如，培养基中的r-spondin的最终浓度可以是约10ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约450ng/ml、或约500ng/ml。
[0162]
可以在培养基中使用一种或多种(例如2、3、4或更多种)wnt激动剂。
[0163]
促有丝分裂生长因子
[0164]
适用于培养上皮干细胞的培养基可包含促有丝分裂生长因子。促有丝分裂生长因子通常通过丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路来诱导细胞分裂。许多受体酪氨酸激酶配体
是促有丝分裂生长因子。在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子可与受体酪氨酸激酶结合。在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子可与多于一种受体酪氨酸激酶结合。在一些实施方案中，一种或多种促有丝分裂生长因子与受体酪氨酸激酶诸如egfr、fgfr或hgfr结合，任选地其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子选自egf、fgf和hgf。
[0165]
表皮生长因子受体(egfr)，也称为erbb1或her1，是细胞外蛋白配体的表皮生长因子(egf)家族的成员的细胞表面受体。egfr是受体酪氨酸激酶并且属于包含四种相关蛋白(egfr(her1/erbb1)、erbb2(her2)、erbb3(her3)和erbb4(her4))的her受体家族。已知her受体通过与包括egf、tgf-α、肝素结合型egf样生长因子、神经调节蛋白、双调蛋白、β细胞蛋白(betacellulin)和上皮调节蛋白(epiregulin)的不同配体结合而被激活。配体与受体的细胞外结构域结合后，受体形成功能活性二聚体(egfr-egfr(同源二聚体)或egfr-her2、egfr-her3、egfr-her4(异源二聚体))。二聚化诱导酪氨酸激酶结构域的激活，这导致受体在多个酪氨酸残基上的自磷酸化。这会导致募集一系列衔接蛋白(诸如shc、grb2)并激活一系列细胞内信号传导级联以影响基因转录。因此，在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子与egfr、her1、her2、her3或her4结合。在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子与egfr结合。在一些实施方案中，除了egfr配体之外，培养基中还包括her2-4配体。例如，在一些实施方案中，除了egf之外，培养基中还包括神经调节蛋白。神经调节蛋白已被证明对肺和乳腺组织的培养有利(例如，参见wo2016/083613和wo2016/083612)。在一些实施方案中，培养基中的一种或多种促有丝分裂生长因子是egf。可使用任何合适的egf，例如从peprotech购得的egf。egf优选地以0.1ng/ml和500ng/ml之间、0.1ng/ml和400ng/ml之间、0.1ng/ml和300ng/ml之间、0.1ng/ml和200ng/ml之间、0.1ng/ml和100ng/ml之间、1ng/ml和100ng/ml之间的最终浓度添加到基础培养基中，或者其中促有丝分裂生长因子的最终浓度为大约1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、250ng/ml或500ng/ml并且不高于500ng/ml。更优选的浓度为至少50ng/ml并且不高于100ng/ml。甚至更优选的浓度为约50ng/ml。fgf通过与细胞表面酪氨酸激酶受体(fgfr)相互作用来刺激细胞。已经鉴定了四种密切相关的受体(fgfr1-fgfr4)。因此，在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子与fgf受体家族成员结合。fgf受体家族成员包括(但不限于)fgfr1、fgfr2、fgfr3或fgfr4。fgfr1-fgfr3基因已被证明可编码多种同工型，并且这些同工型能够对确定配体特异性很关键。有几种与fgf受体家族成员结合的fgf，包括(但不限于)fgf2、fgf4、fgf7和fgf10。这些可通过商购获得。因此，在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子是fgf。在一些实施方案中，fgf选自fgf2、fgf4、fgf7和fgf10。在优选的实施方案中，fgf是fgf2和/或fgf10。在最优选的实施方案中，fgf是fgf2和fgf10。
[0166]
大多数fgf结合多于一种受体(ornitz j biol chem.1998feb 27；273(9):5349-57)。然而，fgf10和fgf7在fgf中是独特的，因为它们仅与fgfr2的特定同工型(命名为fgfr2b)相互作用，所述特定同工型仅由上皮细胞表达(igarashi,j biol chem.1998 273(21):13230-5)。因此，在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子与fgfr2b结合。fgf10已被证明在培养基中特别有用。fgf10能够与fgfr2或fgfr4结合。因此，在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子与fgfr2或fgfr4结合。fgf2与全部的fgfr1、fgfr2、fgfr3和fgfr4结合。因此，在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子与全部的fgfr1、fgfr2、fgfr3和fgfr4结合。
[0167]
在一些实施方案中，fgf的最终浓度在0.1ng/ml和500ng/ml之间、0.1ng/ml和400ng/ml之间、0.1ng/ml和300ng/ml之间、0.1ng/ml和200ng/ml之间、0.1ng/ml和100ng/ml之间、1ng/ml和100ng/ml之间，或者其中促有丝分裂生长因子的最终浓度为约1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、250ng/ml或500ng/ml。
[0168]
在一些实施方案中，培养基中的一种或多种促有丝分裂生长因子是fgf10。优选的fgf10浓度大约在0.1ng/ml和500ng/ml之间、0.1ng/ml和400ng/ml之间、0.1ng/ml和300ng/ml之间、0.1ng/ml和200ng/ml之间、0.1ng/ml和100ng/ml之间、1ng/ml和100ng/ml之间，或者其中促有丝分裂生长因子的最终浓度为大约1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、250ng/ml或500ng/ml并且不高于500ng/ml。更优选的fgf10浓度为约10ng/ml。
[0169]
在一些实施方案中，培养基中的一种或多种促有丝分裂生长因子是fgf2。优选的fgf2浓度大约在0.1ng/ml和500ng/ml之间、0.1ng/ml和400ng/ml之间、0.1ng/ml和300ng/ml之间、0.1ng/ml和200ng/ml之间、0.1ng/ml和100ng/ml之间、1ng/ml和100ng/ml之间，或者其中促有丝分裂生长因子的最终浓度为大约1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、250ng/ml或500ng/ml并且不高于500ng/ml。更优选的fgf2浓度为约5ng/ml。
[0170]
肝细胞生长因子/散射因子(hgf/sf)是形态发生因子，通过在与原癌基因hgfr结合后激活酪氨酸激酶信号传导级联来调控细胞生长、细胞运动和形态发生。hgfr也称为c-met受体。hgf已被证明在上皮干细胞培养中有用。因此，在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子与hgfr结合。在一些实施方案中，促有丝分裂生长因子是hgf。可使用任何合适的hgf，例如从peprotech购得的hgf。hgf的优选浓度为约1、10、20、25、50ng/ml，不高于50ng/ml。
[0171]
在一些实施方案中，培养基中包括多于一种的促有丝分裂生长因子，例如两种或三种促有丝分裂生长因子。例如，在一些实施方案中，培养基中的一种或多种促有丝分裂生长因子是egf和fgf。在一些实施方案中，培养基中的一种或多种促有丝分裂生长因子是egf、fgf2和fgf10。在一些实施方案中，培养基中的一种或多种促有丝分裂生长因子是egf，任选地以约50ng/ml的最终浓度；fgf2，任选地以约5ng/ml的最终浓度；和fgf10，任选地以约10ng/ml的最终浓度。
[0172]
在一些实施方案中，在egf和/或fgf存在或不存在的情况下还存在肝细胞生长因子(hgf)。
[0173]
在一些实施方案中，每种促有丝分裂生长因子的最终浓度在0.1ng/ml和500ng/ml之间、0.1ng/ml和400ng/ml之间、0.1ng/ml和300ng/ml之间、0.1ng/ml和200ng/ml之间、0.1ng/ml和100ng/ml之间、1ng/ml和100ng/ml之间，或者其中促有丝分裂生长因子的最终浓度为约1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、250ng/ml或500ng/ml。
[0174]
bmp抑制剂
[0175]
适用于培养上皮干细胞的培养基可包含bmp抑制剂。bmp作为二聚体配体与由两种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶i型和ii型受体组成的受体复合物结合。ii型受体使i型受
体磷酸化，导致此受体激酶的激活。i型受体随后使特异性受体基底(smad)磷酸化，导致形成产生转录活性的信号转导通路。
[0176]
bmp抑制剂被定义为与bmp分子结合以形成复合物的剂，其中bmp活性例如通过阻止或抑制bmp分子与bmp受体结合而被中和。或者，所述抑制剂是充当拮抗剂或反向激动剂的剂。这种类型的抑制剂与bmp受体结合并阻止bmp与所述受体结合。后一种剂的实例是与bmp受体结合并阻止bmp与抗体结合受体结合的抗体。
[0177]
bmp抑制剂可以以下量添加到培养基中：如在相同细胞类型中评估的，相对于在所述抑制剂不存在的情况下的bmp活性，所述量有效地将细胞中的bmp依赖性活性抑制到至多90％，更优选至多80％，更优选至多70％，更优选至多50％，更优选至多30％，更优选至多10％，更优选至多0％。如技术人员已知的，可例如在zilberberg等人,2007.bmc cell biol.8:41中所举例说明，通过测量bmp的转录活性来测定bmp的活性。
[0178]
已知几类天然bmp结合蛋白，包括头蛋白(peprotech)、脊索发生素(chordin)和包含脊索发生素结构域的脊索发生素样蛋白(r&dsystems)、卵泡抑素和包含卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白(r&dsystems)、dan和包含dan半胱氨酸节结构域的dan样蛋白(r&dsystems)、骨硬化蛋白(sclerostin)/sost(r&d systems)、核心蛋白聚糖(decorin)(r&d systems)和α-2巨球蛋白(r&d systems)。
[0179]
因此，在一些实施方案中，bmp抑制剂选自头蛋白、dan和包括cerberus和gremlin的dan样蛋白(r&d systems)。这些可扩散蛋白能够以不同程度的亲和力结合bmp配体，并抑制它们与信号传导受体的接触。将这些bmp抑制剂中的任何一种添加到基础培养基中可防止干细胞的损失。头蛋白是优选的bmp抑制剂。
[0180]
在一些实施方案中，bmp抑制剂(例如头蛋白)的最终浓度为约10ng/ml至约500ng/ml、约10ng/ml至约400ng/ml、约10ng/ml至约300ng/ml、约10ng/ml至约250ng/ml、约50ng/ml至约250ng/ml、约50ng/ml至约150ng/ml，或其中最终浓度为约100ng/ml。
[0181]
tgf-β抑制剂
[0182]
适用于培养上皮干细胞的培养基可包含tgf-β抑制剂。扩增培养基中存在tgf-β抑制剂对提高人体类器官的形成效率特别有利。tgf-β信号传导通常始于tgf-β超家族配体与募集并磷酸化i型受体的ii型受体结合。然后i型受体使在细胞核中充当转录因子并调控靶基因表达的smad磷酸化。
[0183]
tgf-β超家族配体包含骨形态发生蛋白(bmp)、生长和分化因子(gdf)、抗缪勒管激素(amh)、激活素、nodal和tgf-β。一般来说，smad2和smad3在tgf-β/激活素通路中被alk4、5和7受体磷酸化。相比之下，smad1、smad5和smad8作为骨形态发生蛋白(bmp)通路的一部分被磷酸化。然而，在本发明的背景下，技术人员将理解“tgf-β抑制剂”或“tgf-β信号传导抑制剂”是涉及alk4、5和7并且涉及smad2和smad3的tgf-β通路的抑制剂。tgf-β抑制剂不是bmp抑制剂，即技术人员将理解在本公开的背景下头蛋白不是tgf-β抑制剂。在一些实施方案中，除了tgf-β抑制剂之外，还向培养基中添加bmp抑制剂(见下文)。
[0184]
因此，tgf-β抑制剂是任何减少tgf-β信号传导通路(本文也称为alk4、alk5或alk7信号传导通路)活性的剂。本领域已知许多破坏tgf-β信号传导通路的方法，并且其可以与本发明结合使用。例如，可通过以下破坏tgf-β信号传导：通过小干扰rna策略抑制tgf-β表达；抑制弗林蛋白酶(furin)(tgf-β激活蛋白酶)；通过生理抑制剂抑制通路；使用单克隆抗
体中和tgf-β；使用tgf-β受体激酶1(也称为激活素受体样激酶，alk5)、alk4、alk7的小分子抑制剂进行抑制；抑制smad2和smad3信号传导，例如通过其生理抑制剂smad7的过表达，或通过使用硫氧还蛋白作为禁止smad激活的smad锚着蛋白(fuchs,o.inhibition of tgf-signaling for the treatment of tumor metastasis and fibrotic diseases.current signal transduction therapy,第6卷,第1期,2011年1月,第29-43页(15))。
[0185]
已知用于确定物质是否是tgf-β抑制剂的各种方法，并且其可与本发明结合使用。例如，可使用细胞测定法，测定法中使用包含人pai-1启动子或smad结合位点的报告基因构建体来稳定地转染细胞，驱动荧光素酶报告基因。相对于对照组的荧光素酶活性抑制可用作化合物活性的量度(de gouville等人,br j pharmacol.2005年5月；145(2):166-177)。
[0186]
根据本发明的tgf-β抑制剂可以是蛋白质、肽、小分子、小干扰rna、反义寡核苷酸、适体或抗体。抑制剂可以是天然存在的或合成的。
[0187]
在一些实施方案中，tgf-β抑制剂是小分子抑制剂，诸如a83-01。a83-01是alk4、alk5和alk7的可商购获得的选择性抑制剂(tocris目录号2939)。它在目录中被描述为tgf-βi型受体alk5激酶、i型激活素/nodal受体alk4和i型nodal受体alk7的有效抑制剂(ic
50
值分别为12、45、7.5nm)，其阻断smad2的磷酸化，并且smad2仅微弱地抑制alk-1、-2、-3、-6和mapk的活性。其他具有类似性质的可商购获得的抑制剂包括但不限于a77-01、ly2157299、ly2109761、ly3200882、gw788388、pirfenidone、repsox、sb431542、sb505124、sb525334、ly364947、sd-208和vactosertib。本领域已知这些抑制剂的ic50值，并且技术人员将能够基于本技术的实施例中提供的教导来选择合适浓度的合适抑制剂。
[0188]
因此，在一些实施方案中，tgf-β抑制剂是alk4、alk5和alk7抑制剂，任选地alk4、alk5或alk7的选择性抑制剂。例如，tgf-β抑制剂可以结合并直接抑制alk4、alk5和/或alk7。在一些实施方案中，tgf-β抑制剂是阻断smad2磷酸化的抑制剂。在一些实施方案中，tgf-β抑制剂选自a83-01、a77-01(tocris目录号6712)ly2157299(selleckchem目录号s2230)、ly2109761(selleckchem目录号s2704)、ly3200882(selleckchem目录号s8772)、gw788388(tocris目录号3264)、pirfenidone、repsox(tocris目录号3742)、sb431542(tocris目录号1614)、sb505124(tocris目录号3263)、sb525334(tocris目录号3211)、ly364947(tocris目录号2718)、sd-208(tocris目录号3269)和vactosertib(selleckchem目录号s7530)。在一些实施方案中，tgf-β抑制剂是a83-01。
[0189]
在一些实施方案中，培养基中存在不多于一种tgf-β抑制剂。在一些实施方案中，培养基中存在多于一种(例如2、3、4或更多种)tgf-β抑制剂。
[0190]
在一些实施方案中，tgf-β抑制剂的最终浓度为1nm和100μm之间、10nm和100μm之间、100nm和10μm之间或约1μm，例如其中一种或多种抑制剂的最终浓度为10nm和100μm之间、100nm和10μm之间或约500nm。在一些实施方案中，tgf-β抑制剂的最终浓度为至少5nm，例如至少50nm、至少100nm、至少300nm、至少450nm、至少475nm，例如5nm-500mm、10nm-100mm、50nm-700μm、50nm-10μm、100nm-1000nm、350-650nm或更优选地约500nm。在一些实施方案中，tgf-β抑制剂是最终浓度为约500nm的a83-01。
[0191]
技术人员将认识到，tgf-β抑制剂的适当最终浓度取决于所讨论的tgf-β抑制剂，并且技术人员将知道如何确定用于本发明的其他tgf-β抑制剂的浓度。
[0192]
烟酰胺
[0193]
在一些实施方案中，适用于上皮干细胞的培养基还包含烟酰胺。烟酰胺是维生素b3的酰胺衍生物，是聚(adp-核糖)聚合酶(parp)抑制剂，并且代表nad 的主要前体。它可通过商购获得(例如来自stemcell technologies目录号07154)。在一些实施方案中，烟酰胺以7-15mm、例如约10mm存在。
[0194]
前列腺素通路激活剂
[0195]
前列腺素信号传导通路激活剂(也称为前列腺素通路激活剂)可以是选自包含以下的列表中的任何一种或多种化合物：磷脂、花生四烯酸(aa)、前列腺素e2(pge2)、前列腺素g2(pgg2)、前列腺素f2(pgf2)、前列腺素h2(pgh2)、前列腺素d2(pgd2)。在一些实施方案中，前列腺素信号传导通路激活剂是peg2和/或aa。在一些实施方案中，前列腺素信号传导通路激活剂是peg2。
[0196]
在一些实施方案中，前列腺素信号传导通路激活剂(例如pge2)的最终浓度为10nm和500μm之间、10nm和400μm之间、10nm和300μm之间、10nm和200μm之间、10nm和100μm之间或20nm和50μm之间，或者其中最终浓度为约1μm。
[0197]
技术人员将认识到，前列腺素信号传导通路激活剂的适当最终浓度取决于所讨论的前列腺素信号传导通路激活剂，并且技术人员将知道如何确定用于本发明的其他前列腺素信号传导通路激活剂的浓度。
[0198]
camp激活剂
[0199]
camp通路激活剂可以是提高细胞中camp水平的任何合适的激活剂。camp通路涉及激活多种类型的激素和神经递质g蛋白偶联受体。激素或神经递质与其膜结合受体的结合会诱导受体的构象变化，其导致g蛋白的α亚基的激活。激活的g亚基刺激腺苷酸环化酶，同时非激活的g亚基抑制腺苷酸环化酶。腺苷酸环化酶的刺激催化细胞质atp向camp的转化，因此提高细胞中camp的水平。
[0200]
因此，在一些实施方案中，camp通路激活剂是腺苷酸环化酶激活剂或camp类似物。合适的腺苷酸环化酶激活剂的实例包括毛喉素、毛喉素类似物和霍乱毒素。毛喉素类似物的实例是本领域已知的，并且包括nkh477(例如目录号tocris 1603)。camp类似物的实例也是本领域已知的，并且包括例如8-溴-camp。8-溴-camp是可渗透细胞的camp类似物，其与camp相比具有对磷酸二酯酶水解的更大抗性。在一些实施方案中，camp通路激活剂因此选自毛喉素、霍乱毒素、nkh477和8-溴-camp。在一些实施方案中，camp通路激活剂是毛喉素。在一些实施方案中，camp通路激活剂不是霍乱毒素。
[0201]
使用本领域已知的方法，例如使用测量camp水平的竞争性免疫测定法，可以鉴定camp通路激活剂。环磷酸腺苷荧光测定试剂盒(cyclic-amp fluorescent assay kit)(molecular devices llc)是用于进行这种免疫测定法的可商购获得的试剂盒的实例。样本或标准品中的camp与辣根过氧化物酶(hrp)标记的camp缀合物竞争抗camp抗体上的结合位点。在camp不存在的情况下，大部分hrp-camp缀合物与抗体结合。增加camp的浓度会竞争性地减少结合的缀合物的量，因此降低测量的hrp活性。与对照相比，camp通路激活剂将导致camp的水平提高和测量的hrp活性降低。
[0202]
在一些实施方案中，camp通路激活剂(例如毛喉素)的最终浓度为10nm和500μm之间、10nm和400μm之间、10nm和300μm之间、10nm和200μm之间、10nm和100μm之间或20nm和50μm之间，或者其中最终浓度为约1μm。在一些实施方案中，camp通路激活剂是毛喉素。在一些
laboratories gmbh提供的n2补充剂为100倍液体浓缩物，其含有500μg/ml人转铁蛋白、500μg/ml牛胰岛素、0.63μg/ml孕酮、1611μg/ml腐胺和0.52μg/ml亚硒酸钠。n2补充剂可以作为浓缩物添加到培养基中，也可以在添加到培养基之前稀释。可以以1倍最终浓度或以其他最终浓度使用。使用n2补充剂是将转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺和亚硒酸钠并入本发明培养基中的方便方法。当然还设想将这些成分的一些或全部单独地添加到培养基中，而不是使用n2补充剂。因此，培养基可包含这些成分的一些或全部。在培养基包含b27的一些实施方案中，它还不包含n2。在一些实施方案中，n-乙酰半胱氨酸的最终浓度为约1nm至约100nm、约5nm至约50nm、约10nm至约50nm、约10nm至约30nm或约25nm。
[0209]
在一些实施方案中，培养基还包含rock抑制剂(rho激酶抑制剂)。在建立新的培养物和/或使细胞分裂(“传代”)时，rock抑制剂对于细胞附着特别有用。合适的rock抑制剂是本领域已知的并且可通过商购获得(包括但不限于gsk 269962、gsk 429286、h 1152二盐酸盐、glycyl-h 1152二盐酸盐、sr 3677二盐酸盐、sb 772077b二盐酸盐和y-27632二盐酸盐，全部可购自tocris)。在一些实施方案中，rock抑制剂的最终浓度在1μm和100μm之间、1μm和50μm之间或5μm和20μm之间。在一些实施方案中，rock抑制剂是y-27632，任选地最终浓度为约10μm。
[0210]
在优选实施方案中，培养基不包含促血小板生成素。
[0211]
培养基中不包含不明确的成分(诸如胎牛血清(fetal bovine serum)或胎牛血清(fetal calf serum))是优选的。各种不同的血清替代物制剂是可商购获得的并且是技术人员已知的。在使用血清替代物的情况下，根据常规技术，可以以培养基体积的约1％至约30％使用血清替代物。在一些实施方案中，培养基不含血清。
[0212]
本发明的优选的培养方法也是有利的，因为不需要饲养细胞。经常使用饲养细胞层来支持干细胞的培养并抑制干细胞的分化。使用饲养细胞是不期望的，因为其使细胞传代复杂化(每次传代都必须将细胞与饲养细胞分开，每次传代都需要新的饲养细胞)。使用饲养细胞还可能导致期望的细胞被饲养细胞污染。这对于任何医学应用显然都是有问题的，并且即使在研究背景下，也会使对细胞进行的任何实验结果的分析复杂化。
[0213]
因此，在一些实施方案中，本发明的方法、培养基和组合物不含饲养细胞。如果组合物中的细胞已经在不存在饲养细胞层的情况下培养至少一代，那么通常认为该组合物是不含饲养细胞的。本发明的不含饲养细胞的组合物将通常包含少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％的饲养细胞(表示为组合物中细胞总数的百分比)或优选地完全不含饲养细胞。
[0214]
本发明的培养基将通常在去离子蒸馏水中配制。本发明的培养基将通常在使用前灭菌以防止污染，例如通过紫外光、加热、辐射或过滤。可以冷冻(例如在-20℃或-80℃下)培养基以供储存或运输。培养基可含有一种或多种抗生素以防止污染。培养基的内毒素含量可以低于每毫升0.1内毒素单位，或者内毒素含量可以低于每毫升0.05内毒素单位。本领域已知用于确定培养基的内毒素含量的方法。
[0215]
优选的细胞培养基是用基于碳酸盐的缓冲液缓冲至ph7.4(优选地ph7.2-7.6，或至少7.2且不高于7.6)的限定合成培养基，同时细胞在包含5％至10％co2，或至少5％且不高于10％co2，优选地5％co2的气氛中培养。
[0216]
本发明还提供一种组合物或细胞培养容器，其包含根据上述本发明任一方面的细
胞和/或类器官，和根据上述本发明任一方面的培养基。例如，这种组合物或细胞培养容器可在如上所述的培养基中包含根据本发明方法培养的任何数量的细胞或类器官。
[0217]
根据本发明的另一方面，提供了一种含有本发明培养基的密封容器。在一些实施方案中，培养基是扩增培养基。在一些实施方案中，培养基是分化培养基。对于培养基的运输或储存可优选密封容器，以防止污染。容器可以是任何合适的容器，诸如烧瓶、板、瓶、广口瓶、小瓶或袋。
[0218]
用于本发明的示例性培养基
[0219]
在一些实施方案中，本发明的培养基包含整联蛋白激动剂、一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如egf和/或hgf)、bmp抑制剂(诸如头蛋白)和tgf-β抑制剂(例如a83-01)。此培养基任选地还包含一种或多种wnt激动剂(例如lgr5激动剂)。这些培养基适用于所有组织，例如肠、胃、胰腺、肝、前列腺、乳腺和肺。
[0220]
在一些实施方案中，本发明的培养基包含：(i)fgf7和/或fgf10、(ii)头蛋白、(iii)lgr5激动剂和(iv)整联蛋白激动剂。在一些实施方案中，本发明的培养基包含：(i)fgf7和/或fgf10、(ii)头蛋白、(iii)lgr5激动剂、(iv)一种或多种另外的受体酪氨酸激酶配体(例如egf)和(v)整联蛋白激动剂。在一些实施方案中，培养基还包含erbb3/4配体(即人神经调节蛋白β-1)。这是特别适用于但不限于培养乳腺干细胞的培养基。
[0221]
在一些实施方案中，本发明的培养基包含整联蛋白激动剂、egf、fgf(例如fgf10)、hgf、tgf-β抑制剂(例如a83-01)、烟酰胺、一种或多种wnt激动剂(例如lgr5激动剂)、camp通路激活剂(例如毛喉素)和胃泌素。此培养基任选地还包括:(i)bmp抑制剂(例如头蛋白)、wnt激动剂(例如wnt条件培养基)和rock抑制剂(例如y27632)或(ii)bmp激活剂(例如bmp7)。这些培养基特别适用于但不限于培养肝干细胞。
[0222]
在一些实施方案中，本发明的培养基包含整联蛋白激动剂、一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如egf)、bmp抑制剂(例如头蛋白)和一种或多种wnt激动剂(例如lgr5激动剂)。此培养基任选地还包含睾酮。这些培养基特别适用于但不限于培养前列腺干细胞。
[0223]
在一些实施方案中，本发明的培养基还包含一种或多种选自p38map激酶抑制剂(例如sb 202190)、胃泌素和/或烟酰胺的成分。
[0224]
在一些实施方案中，本发明的培养基还包含rock抑制剂(例如y27632)。已观察到添加rock抑制剂对启动或分裂培养物有用。
[0225]
在一些实施方案中，本发明的培养基还包含b27和/或n-乙酰半胱氨酸。这些额外的成分通常作为基础培养基的成分添加到培养基中。
[0226]
在一些实施方案中，本发明的培养基包含：整联蛋白激动剂、lgr5激动剂、bmp抑制剂(例如头蛋白)、b27、m-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、rock抑制剂、tgf-β抑制剂(例如a83-01)、p38 map激酶抑制剂(例如sb 202190)、fgf7和fgf10，并且任选地一种或多种选自以下的额外成分：一种或多种另外的受体酪氨酸激酶配体(例如egf、双调蛋白、tgf-α、pdgf)、p53稳定剂和wnt激动剂(例如wnt3a)。
[0227]
在一些实施方案中，本发明的培养基包含：(i)整联蛋白激动剂、(ii)一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如egf和/或hgf)、(iii)bmp抑制剂(例如头蛋白)和(iv)tgf-β抑制剂(例如a83-01)、p38抑制剂(例如sb202190)和/或rock抑制剂(例如y-27632)，并且任选地还包含一种或多种wnt激动剂(例如lgr5激动剂)。
[0228]
在一些实施方案中，培养基还包含：(i)胃泌素和/或烟酰胺、(ii)notch抑制剂(例如dapt和/或dbz)和/或(iii)前列腺素通路激活剂(例如pge2和/或aa)。例如，在一些实施方案中，本发明的培养基包含：(i)整联蛋白激动剂、(ii)一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如egf和/或hgf)、(iii)bmp抑制剂(例如头蛋白)和(iv)胃泌素、烟酰胺、notch抑制剂(例如dapt和/或dbz)和/或前列腺素通路激活剂(例如pge2和/或aa)。
[0229]
在一些实施方案中，培养基还包含camp通路激活剂(例如毛喉素)和/或bmp通路激活剂(例如bmp7)。在一些实施方案中，培养基包含bmp通路激活剂(例如bmp7)并且不包含bmp通路抑制剂(例如头蛋白)。这些培养基特别适用于但不限于培养肝干细胞或胰腺干细胞。
[0230]
在一些实施方案中，一种或多种受体酪氨酸激酶配体是egf和/或一种或多种(例如1、2、3、4或超过4种)fgfr2b配体，诸如fgf7和/或fgf10。
[0231]
在一些实施方案中，bmp抑制剂是头蛋白。
[0232]
在一些实施方案中，一种或多种wnt激动剂是lgr5激动剂、lgr4激动剂、lgr6激动剂或wnt3a。在一些实施方案中，lgr5激动剂是rspondin，例如rspondin1-4的任何一种。
[0233]
在一些实施方案中，培养基还包含erbb3/4配体(即人神经调节蛋白β-1)。
[0234]
在培养人上皮干细胞时，可有利地将wnt3a添加到培养基中。
[0235]
在一些实施方案中，培养基是包含基础培养基，并且还包含整联蛋白激动剂、一种或多种受体酪氨酸激酶配体(例如选自egf、fgf和hgf)、notch抑制剂(例如dapt)、糖皮质激素(例如地塞米松(dexamethasone))、tgf-β抑制剂(例如a83-01)和一种或多种wnt抑制剂(例如(i)porc抑制剂，任选地选自iwp 2、lgk974和iwp 1和/或(ii)β-连环蛋白靶基因表达抑制剂，任选地选自icrt3、cgp049090、pkf118310、pkf115 584、ztm000990、pnu 74654、bc21、icrt5、icrt14和fh535)的分化培养基。在一些实施方案中，分化培养基还包含gsk-3抑制剂(例如chir99201)。在一些实施方案中，分化培养基还包含ap-1刺激剂(例如卡巴胆碱(carbachol))。因此，在一些实施方案中，培养基包含egf、fgf19、hgf、dapt、iwp2、icrt3、地塞米松、chir99021和卡巴胆碱。
[0236]
在一些实施方案中，培养基是包含基础培养基，并且还包含整联蛋白激动剂、一种或多种egfr通路抑制剂(例如吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、mek抑制剂(例如pd0325901)和/或erk抑制剂(例如sch772984))、notch抑制剂(例如dapt)和一种或多种wnt抑制剂(例如(i)porc抑制剂，任选地选自iwp 2、lgk974和iwp 1和/或(ii)β-连环蛋白靶基因表达抑制剂，任选地选自icrt3、cgp049090、pkf118310、pkf115 584、ztm000990、pnu 74654、bc21、icrt5、icrt14和fh535)的分化培养基。
[0237]
对于本发明的任何培养基，针对癌细胞可以省去某些成分。
[0238]
类器官
[0239]
本发明提供通过本发明的培养方法可获得或所获得的类器官。因此，在一些实施方案中，培养上皮干细胞的方法还包括获得和/或分离类器官。如上所述，在一些实施方案中，类器官是肿瘤类器官。包含上皮干细胞的类器官在本文中也称为“上皮类器官”。上皮类器官在现有技术中有所描述(例如参见022907、wo2010/090513、wo2012/014076、wo2012/168930、wo2015/173425、wo2016/083613、wo2016/083612和wo2017/149025)。
[0240]
使用适用于扩增的培养基可获得的或所获得的或培养的上皮类器官包含至少一
种上皮干细胞，其能够分裂并产生另外的上皮干细胞或能够产生分化的后代。上皮类器官还包含一些分化的(或更成熟的)细胞类型。这些分化的细胞类型在类器官形成过程中自发产生，并且有助于类器官的特征性结构特征，如下所述。上皮类器官的优势在于它们维持类器官内扩增的上皮干细胞群，同时还包含更多属于起源上皮组织特有的分化的细胞类型。上皮类器官可在维持上皮干细胞的核心存在并且同时维持细胞基因型和表型完整性的同时继续扩增的时间长度是上皮类器官使其区别于本领域中许多类器官的重要特征。上皮类器官还具有随着细胞在体外扩增、分化和自组织而迅速出现的独特结构。以下详细地描述这些特征。上皮类器官也可随后在如本文所述适合分化的培养基中培养，并且这增加了上皮类器官中分化细胞的比例。
[0241]
可使用图像分析来评估培养中的细胞的特征，诸如细胞形态；细胞结构；细胞凋亡或细胞裂解的证据；以及类器官的组成和结构。本领域熟知许多类型的成像分析，诸如电子显微镜(包括扫描电子显微镜和透射电子显微镜)、共聚焦显微镜、立体显微镜、荧光显微镜。组织学分析可以揭示出基本架构和细胞类型。
[0242]
在一些实施方案中，上皮类器官具有三维结构，即类器官是三维类器官。在一些实施方案中，类器官仅包含上皮细胞，即类器官中不存在非上皮细胞。这是因为适用于扩增上皮干细胞的培养基是被专门设计来扩增上皮干细胞的。因此，即使其他细胞类型暂时存在于培养基中(例如在本发明起始材料的组织片段中)，这些细胞也不太可能存活，而是将被产生纯上皮细胞群的干细胞的长期扩增所替代。
[0243]
在一些实施方案中，类器官中的上皮细胞围绕管腔。在一些实施方案中，类器官不包含管腔(特别是，肿瘤类器官通常不具有管腔)。在一些实施方案中，上皮细胞是极化的(意味着蛋白质在上皮细胞的顶端或基底外侧差异表达)。在一些实施方案中，管腔是密封的管腔(意味着连续的细胞屏障将管腔的内容物与围绕类器官的培养基分开)。在一些实施方案中，类器官包含能够主动分裂并且优选地能够分化为存在于对应体内组织中的所有主要分化细胞谱系的干细胞(例如当类器官或细胞被转移到分化培养基中时)。在一些实施方案中，类器官在外部包含基底细胞，在中心包含更多分化的细胞。
[0244]
在一些实施方案中，类器官包含复层上皮。“复层”意味着存在多个(多于一个)细胞层。这类细胞经常趋于使它们的细胞核位于细胞更中央，即非极化。多层部分中的细胞可以自我组织以包括细胞之间的间隙或管腔。
[0245]
在一些实施方案中，类器官包含折叠(或内陷)以形成干细胞和分化细胞区室的单个单层。在此实施方案中，不必要存在被上皮层围绕的中央密封管腔—相反，围绕三维类器官的上皮已有效地展开并呈现为单个层。有时会很难区分折叠(或内陷)单层和复层细胞区域。在一些实施方案中，类器官包含复层细胞区域和折叠单层区域两者。在一些实施方案中，本发明的类器官具有由多个层形成的部分和包含单个细胞单层的部分。在一些实施方案中，本发明的类器官包含单个细胞单层，或由单个细胞单层组成。在一些实施方案中，类器官不包含单层。
[0246]
根据本发明的类器官可包括具有至少一个芽和中央管腔的细胞层。
[0247]
在一些实施方案中，本发明的类器官包含上皮细胞，或由上皮细胞组成。在一些实施方案中，类器官包含单层上皮细胞，或由单层上皮细胞组成。在一些实施方案中，类器官中不存在非上皮细胞。
[0248]
在一些实施方案中，类器官在本发明的扩增培养基中已培养或能够培养至少2个月，例如至少10周、至少12周、至少14周、至少16周、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少9个月、至少1年。
[0249]
在一些实施方案中，类器官已培养或能够培养至少5代、至少10代、至少15代或至少20代。在一些实施方案中，类器官或上皮干细胞群培养至少10代。
[0250]
在一些实施方案中，类器官的细胞数经过5代、10代、15代、20代指数地增加。在优选的实施方案中，类器官或上皮干细胞群的细胞数经过五代指数地增加。
[0251]
在一些实施方案中，类器官最宽处的直径为至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm、至少100μm、至少125μm、至少150μm、至少175μm、至少200μm、至少250μm或更大。
[0252]
在本发明的背景下，组织片段是成体组织、优选地人成体组织的一部分。相比之下，类器官通过体外扩增形成结构特征，因此与组织片段不同。
[0253]
在优选的实施方案中，类器官可以培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10周或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个月或更长时间。在一些实施方案中，类器官在培养中扩增或维持至少3个月，优选地至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少9个月或至少12个月或更多时间。有利地，使用本发明提供的培养方法导致形成如下的类器官和/或细胞群：其中当长期培养细胞或类器官时，染色体的数量保持稳定。因此，在一些实施方案中，本发明的类器官或上皮干细胞群在本发明培养基中培养2、4、6、8、10、12或14周或4、5、6或更多个月之后具有稳定的染色体数量。优选地，在本发明培养基中培养2、4、6、8、10、12或14周或4、5、6或更多个月之后，至少65％、至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％的细胞具有正确数量的染色体。对于人上皮细胞，正确的染色体数是46。在一些实施方案中，类器官具有正常的核型。确定核型的一种方法是通过中期扩散分析。当然，应理解肿瘤类器官中的肿瘤细胞(例如来源于肿瘤干细胞)不一定具有正确数量的染色体，因为基因组不稳定性是某些癌症的特征。
[0254]
在一些实施方案中，本发明的类器官是肿瘤类器官。在一些实施方案中，肿瘤类器官是致密结构，类似于从非癌性上皮干细胞的培养得到的类器官。在其他实施方案中，肿瘤类器官是囊性结构。在一些实施方案中，来源于不同患者的肿瘤类器官表现出不同的形态。可使用诸如图像分析的技术(包括明视场显微镜)来评估类器官形态。
[0255]
在一些实施方案中，本发明的肿瘤类器官保留肿瘤特异性组织病理学变化或特征。可通过对来自同一患者的肿瘤组织和相邻上皮的类器官进行比较，和/或通过对肿瘤类器官与原生组织标本进行比较来确定此类变化。
[0256]
在一些实施方案中，肿瘤类器官是致密或囊性结构。在一些实施方案中，肿瘤类器官包含转化的上皮肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤类器官主要包含转化的上皮肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤类器官仅含有转化的上皮肿瘤细胞(即肿瘤类器官中不存在未转化的上皮细胞)。在一些实施方案中，肿瘤类器官不包含免疫元件、结缔组织元件和/或血管元件。技术人员将认识到，可通过包括角蛋白(krt5)免疫染色在内的各种方法来评估转化的上皮肿瘤细胞的存在。
[0257]
在一些实施方案中，通过在还包含mdm2激动剂诸如nutlin-3的本发明培养基中培养来选择本发明的肿瘤类器官。mdm2激动剂可以在整个培养过程或部分培养过程中存在。
在一些实施方案中，nutlin-3以约10μm的浓度存在。nutlin-3阻止p53野生型细胞的生长。p53是肿瘤抑制基因。因此，例如由p53基因突变或p53的其他错误调节造成的p53功能降低是肿瘤发生的常见原因。因此，在nutlin-3存在的情况下培养类器官选择了p53水平降低或p53活性降低的类器官，并且可用作选择肿瘤类器官的方法。
[0258]
在一些实施方案中，本发明的类器官和肿瘤类器官具有不同的转录组谱。在一些实施方案中，基于转录组分析的主成分分析，本发明的类器官聚集在一起并且本发明的肿瘤类器官聚集在一起。在一些实施方案中，本发明的类器官和肿瘤类器官具有差异基因表达。例如，klk6和/或ehf在hnscc肿瘤类器官中下调。而slcob1、hoxc13、calb1、nts和/或bche在hnscc肿瘤类器官中上调。可在非肿瘤类器官和肿瘤类器官之间表现出差异表达的其他基因包括sdc2、hoxa1、nxpe3和/或hoxc10。在一些实施方案中，当对相应的非肿瘤类器官和肿瘤类器官进行比较时，存在超过50个差异表达基因、超过100个差异表达基因、超过200个差异表达基因或超过300个差异表达基因。
[0259]
在一些实施方案中，本发明的肿瘤类器官具有检测到的与肿瘤相关的突变的变异等位基因频率富集。变异等位基因频率是指在样本中检测到突变的频率，例如，这可以表示为来自测序分析的含有特定突变的读数的百分比。
[0260]
在一些实施方案中，本发明的肿瘤类器官的基因改变再现了类器官所来源的肿瘤的基因改变。基因改变包括单核苷酸变异和小的插入和缺失。在一些实施方案中，本发明的不是来源于癌细胞的类器官比本发明的来源于癌细胞的肿瘤类器官含有更少的基因改变。
[0261]
染色体误分离是在人肿瘤中经常观察到的非整倍体的基础。染色体分离错误包括后期桥和经历多极分裂的双核细胞。误分离率的增加导致称为染色体不稳定性的表型，这在癌症中很常见。在一些实施方案中，肿瘤类器官展现出染色体不稳定性。在一些实施方案中，与源自非癌细胞的类器官相比，肿瘤类器官具有增加的染色体分离错误率。在一些实施方案中，肿瘤类器官具有增加的染色体分离错误率，包括后期桥和/或经历多极分裂的双核细胞。
[0262]
在一些实施方案中，本发明的肿瘤类器官不具有正常核型。在一些实施方案中，肿瘤类器官显示出非整倍性。可通过中期扩散分析确定类器官的核型(即染色体数量)。
[0263]
在一些实施方案中，本发明的肿瘤类器官在皮下移植时是致瘤的。可通过将人的类器官皮下移植到小鼠体内来确定所述类器官的致瘤潜力。通常，非肿瘤类器官的皮下移植不会导致肿瘤形成或至少类器官的长出。在一些实施方案中，本发明的肿瘤类器官在培养中保留其致瘤潜力，并且能够在皮下移植后形成具有与亲本肿瘤相似特征的肿瘤。此类特征可包括被视为癌性的异型性水平、三极有丝分裂象、核多态性(nuclear polymorphism)和/或肌肉浸润。
[0264]
本发明的扩增类器官优选地包含至少50％活细胞，更优选至少60％活细胞，更优选至少70％活细胞，更优选至少80％活细胞，更优选至少90％活细胞。可以在facs中使用hoechst染色或碘化丙啶染色来评估细胞的活力。在一些实施方案中，提供一种或多种本发明的冷冻类器官。还提供了一种用于制备冷冻的类器官的方法，其包括分离类器官培养物并且将它们与冷冻培养基诸如recovery细胞培养冷冻培养基(cell culture freezing medium)(gibco)混合以及按照标准程序冷冻。还提供一种用于解冻冷冻的类器官的方法，其包括解冻冷冻的类器官、将解冻的类器官嵌入细胞外基质(例如matrigel)中以及在本发
明的培养基中培养类器官。有利地，最初解冻后，可以向培养基补充y-27632，例如约10um y-27632。在一些实施方案中，在解冻后的前1、2、3、4、5或更少天内，优选在前3或4天向培养基补充y-27632。在一些实施方案中，在前3、4、5、6或更多天后，优选在前3或4天后，培养基中不存在y-27632。此冷冻方法可以用于本发明的扩增类器官。
[0265]
在一些实施方案中，本发明的类器官或肿瘤类器官是冷冻保存的。
[0266]
分化
[0267]
可将类器官或来自类器官的细胞转移至分化培养基中，并允许或诱导其分化成所有主要的分化细胞谱系。
[0268]
在一些实施方案中，本发明的方法包括在扩增培养基中培养上皮干细胞或干细胞群的第一步，以及在分化培养基中培养扩增细胞或扩增类器官的第二步。在一些实施方案中，整联蛋白激动剂仅在这些步骤的一个步骤中被包括在培养基中。在其他实施方案中，整联蛋白激动剂在这些步骤的两者中被包括在培养基中。
[0269]
在一些实施方案中，分化培养基包含如本文所公开的培养基，其中不包括以下一种或多种：促有丝分裂生长因子、tgf-β抑制剂、前列腺素信号传导通路激活剂、wnt激动剂、camp通路激活剂、bmp抑制剂和烟酰胺(例如，如wo2012/168930中所述)。在一些实施方案中，分化培养基包含用于动物或人细胞的基础培养基。在一些实施方案中，分化培养基还包含以下一种或多种：egfr通路抑制剂、notch抑制剂、wnt抑制剂或bmp通路激活剂(例如，如wo2017220586中所述)。
[0270]
在一些实施方案中，在分化培养基中培养上皮干细胞群增加成熟上皮细胞标记物的表达水平。技术人员知道用于确定基因或蛋白质表达的包括定量pcr在内的不同技术。
[0271]
类器官的用途
[0272]
本发明的类器官忠实地代表了体内情况。对于从正常组织生长的类器官和从患病组织生长的类器官两者都是这样。因此，本发明的类器官可用于医学和诊断学，以及研究和药物开发。除了提供正常的离体细胞/器官模型外，本发明的类器官还可用作疾病和/或感染的离体模型。因此，本发明的类器官可用于药物筛选，包括药物发现和验证、靶点发现和验证、毒理学、感染模型和其他研究目的。本发明的类器官可以研究的疾病包括但不限于遗传疾病、代谢疾病、致病性疾病和炎性疾病。类器官还适合移植，因此具有用于再生医学的潜力。此外，类器官可以从任何个体的细胞快速生长，因此可用于确定合适的治疗方案，例如在个性化医疗的背景下。早期申请中描述了类器官的若干用途(例如在wo2009/022907、wo2010/090513、wo2012/014076、wo2012/168930、wo2015/173425、wo2016/083613和wo2016/083612中)并且这些用途也适用于本发明的类器官。
[0273]
实施例提供了类器官的使它们适用于这些用途的性质的细节，并且下文提供进一步的具体实施例。
[0274]
药物筛选
[0275]
本发明提供类器官(或直接从所述类器官中获得的细胞)在药物筛选、靶点验证、靶点发现、毒理学或毒理学筛选中的用途。
[0276]
优选地将细胞暴露于多种浓度的测试剂持续一定时间段。在暴露阶段结束时，评估培养物。类器官还可用于鉴定特异性地靶向上皮癌细胞的药物。技术人员应当理解，本发明的类器官将广泛适合用作感染性、炎症性和赘生性病理的药物筛选工具。在一些实施方
案中，本发明提供类器官在药物筛选、靶点验证、靶点发现、毒理学、毒理学筛选或离体细胞/器官模型中的用途。在一些实施方案中，本发明提供了类器官在离体方法中用于预测临床结果的用途。在一些实施方案中，本发明的类器官可以用于筛选抗癌药物。
[0277]
在一些实施方案中，本发明的类器官可用于测试化学品、抗体、天然产物(植物提取物)等的文库用作药物、化妆品和/或预防药物的适用性。例如，在一些实施方案中，可以使用本发明的培养基和方法培养来自所关注患者的细胞活检标本(诸如来自癌症患者的肿瘤细胞)，然后用化学化合物或化学文库处理。然后可以确定哪些化合物有效地修饰、杀死和/或治疗患者的细胞。这允许测试具体患者对特定药物的反应性，因此允许针对具体患者定制治疗。因此，这允许个性化医疗方法。在一些实施方案中，药物筛选方法是指导个性化理论和/或预测临床结果的离体方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种在指导个性化治疗的方法中使用的类器官。以这种方式使用类器官鉴定药物的额外优势在于，可以筛选正常类器官(来源于健康组织的类器官)以检查哪些药物和化合物对健康组织的影响最小。这允许筛选出具有最小脱靶活性或非需要副作用的药物。
[0278]
在一些实施方案中，本发明提供一种用于测试候选化合物效果的方法，其中所述方法包括：
[0279]
根据本发明的方法培养上皮干细胞或上皮干细胞群，任选地少于21天；
[0280]
将所得细胞群或所得类器官暴露于一种候选化合物或候选化合物文库；
[0281]
评估所述扩增类器官的任何效果；
[0282]
将引起所述效果的候选分子确定为潜在药物；并且任选地
[0283]
提供所述候选分子，例如作为药物。
[0284]
在一些实施方案中，用于测试候选化合物效果的方法包括在存在或不存在候选化合物的情况下将类器官暴露于辐射。在一些实施方案中，在测试候选化合物效果的方法中评估的效果选自包括以下的清单：增殖的减少或损失、形态变化、细胞死亡或基因或蛋白质表达的变化。
[0285]
候选分子文库包含多于一种的候选分子。
[0286]
在一些实施方案中，本发明提供一种方法，其包括：
[0287]
根据本发明的方法培养上皮干细胞或上皮干细胞群，任选地少于21天；
[0288]
将所得类器官或来源于所得类器官的细胞群暴露于诸如辐射的治疗和/或一种候选分子或候选分子文库；
[0289]
评估候选分子对所述类器官或细胞群的任何效果；并且
[0290]
将所述效果与类器官的特征相关联，所述类器官的特征例如存在一种或多种基因突变，诸如egfr信号传导通路中的突变，包括pik3ca、kras、hras或braf。
[0291]
在一些实施方案中，本发明提供一种方法，其包括：
[0292]
根据本发明的方法培养上皮干细胞或上皮干细胞群，任选地少于21天；
[0293]
将所得类器官或来源于所得类器官的细胞群暴露于诸如辐射的治疗和/或一种候选分子或候选分子文库；
[0294]
评估候选分子对所述类器官或细胞群的任何效果；
[0295]
将所述效果与标准值和/或之前的观察进行比较；并且任选地预测临床结果和/或选择个性化医疗。
[0296]
在一些实施方案中，类器官来源于患者活检。在一些实施方案中，向所述患者施用对类器官或来源于所述类器官的细胞群产生期望效果的候选分子。因此，在一个方面，提供了一种治疗患者的方法，其包括：
[0297]
a)从患者的所关注患病组织中获得活检标本；
[0298]
b)培养活检标本以获得类器官，优选地使用如本文描述的用于培养上皮干细胞的方法；
[0299]
c)使用本发明的筛选方法鉴定合适的药物；并且
[0300]
d)用步骤(c)中获得的药物治疗所述患者。
[0301]
在一些实施方案中，本发明提供一种用于为患者选择治疗方案的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0302]
任选地从患者的组织中获得活检标本；
[0303]
培养活检标本、活检标本的组织片段、活检标本的上皮干细胞或活检标本的上皮干细胞群以获得类器官，优选地使用如本文所述的用于培养上皮干细胞的方法；
[0304]
将所得类器官暴露于治疗方案，包括辐射和/或一种或多种候选化合物；
[0305]
评估所述类器官的任何效果；
[0306]
鉴定产生所述效果的治疗方案；并且
[0307]
任选地向患者提供所述治疗。
[0308]
移植和医学
[0309]
本发明提供类器官在再生医学和/或移植中的用途。本发明还提供治疗方法，其中所述方法包括将类器官移植到动物或人中。
[0310]
在一些实施方案中，本发明提供在诊断或医学中使用的类器官。在一些实施方案中，本发明提供在诊断或医学中使用的类器官，任选地在个性化医疗或诊断或再生医学中。在一些实施方案中，本发明提供包括施用本发明的类器官的步骤的疾病治疗方法。在一些实施方案中，本发明提供了本发明的类器官在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
[0311]
整联蛋白激动剂的用途
[0312]
本发明提供如本文所定义的整联蛋白激动剂用于培养细胞的用途，任选地使用如本文所述的任何培养方法和/或培养基。
[0313]
在将细胞移植入受试者之前，在体外将细胞与本文所定义的整联蛋白激动剂接触也可以是有用的。因此，本发明提供了整联蛋白激动剂用于在移植入受试者之前预处理细胞的用途。
[0314]
将整联蛋白激动剂直接施用于受试者以改善细胞移植也可以是有用的。因此，本发明还提供如本文所定义的在细胞移植方法中用作细胞粘附增强剂的整联蛋白激动剂。本发明还提供一种用于将细胞移植入受试者的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所定义的整联蛋白激动剂。
[0315]
在这种背景下，使用整联蛋白激动剂进行预处理或施用整联蛋白激动剂预期可增强细胞粘附并提高移植疗法的成功率。这在再生医学中可以有用，例如治疗肝脏疾病、糖尿病或可受益于细胞移植疗法的任何其他疾病。
[0316]
整联蛋白激动剂的这些用途预期可有利于所有细胞类型，而不仅有利于上皮干细胞。特别地，预期有利于干细胞，包括造血干细胞、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。使用整
联蛋白激动剂预期可在造血干细胞培养中特别有用——尽管造血干细胞已在许多医院中常规使用了几十年，但仍无法在培养中有效地扩增这些细胞。因此，在一些实施方案中，细胞为造血干细胞。因此，在一些实施方案中，细胞是干细胞，任选地上皮干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
[0317]
定义
[0318]
如本文所用，动词“包括”和其变位以其非限制性意义使用，意指包括该词之后的项，但不排除未具体提及的项。此外，如有必要，动词“由
……
组成”可以替换为“基本上由
……
组成”，意指如本文所定义的产品可以包含除具体确定的成分之外的额外成分，所述额外成分不改变本发明的独特特征。此外，如本文所定义的方法可以包括除具体确定的步骤之外的额外步骤，所述额外步骤不改变本发明的独特特征。此外，通过不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”对元素的引用不排除存在多于一个所述元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个所述元素。因此，不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”通常表示“至少一个”。
[0319]
如本文所用，术语“约”或“大约”意指所呈现的值可变化 /-10％。该值也可以读作精确值，因此可以省略术语“约”。例如，术语“约100”包括90-110和100。
[0320]
本说明书中引用的所有专利和参考文献特此通过全文引用并入本文。
[0321]
对包括向患者施用剂的治疗方法的任何提及，还涵盖在所述治疗方法中使用的剂，以及剂在所述治疗方法中的用途，以及剂在制造药物中的用途。
[0322]
仅出于说明目的提供以下实施例，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。
[0323]
实施方案
[0324]
本发明包括以下编号的实施方案。
[0325]
1.一种用于培养上皮干细胞或包含上皮干细胞的类器官的方法，其中所述方法包括在适用于上皮干细胞的培养基中培养所述上皮干细胞，其中所述培养方法还包括使细胞或类器官与整联蛋白激动剂接触。
[0326]
2.如实施方案1所述的方法，其中所述整联蛋白激动剂与整联蛋白的β亚基相互作用。
[0327]
3.如实施方案2所述的方法，其中所述β亚基为β1、β2、β3或β7。
[0328]
4.如实施方案3所述的方法，其中所述整联蛋白激动剂与β1亚基相互作用。
[0329]
5.如实施方案1所述的方法，其中所述整联蛋白激动剂与整联蛋白的α亚基相互作用。
[0330]
6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述整联蛋白激动剂选自抗整联蛋白抗体、踝蛋白、kindlin蛋白、二硫苏糖醇和氧固醇25-羟基胆固醇。
[0331]
7.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述整联蛋白激动剂是抗整联蛋白抗体。
[0332]
8.如实施方案7所述的方法，其中所述抗整联蛋白抗体是：jbs2、hp1/3、snaka51、pt25-2、pmi-1、mem-83、nki-l16、496b、12g10、8a2、ts2/16、15/7、huts-4、8e3、n29、9eg7、mab 24、mem-148、kim127、cbr lfa-1/2、mem-48、kim185、ap3、ap5、libs6、libs2、10f8、2b8、2g3。
[0333]
9.如实施方案8所述的方法，其中所述抗整联蛋白抗体是ts2/16、12g10、8a2、15/
7、huts-4、8e3、n29或9eg7。
[0334]
10.如实施方案9所述的方法，其中所述抗整联蛋白抗体是ts2/16、12g10或8a2。
[0335]
11.如实施方案7-10中任一项所述的方法，其中所述抗体是人源化的。
[0336]
12.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述整联蛋白激动剂是踝蛋白。
[0337]
13.如实施方案12所述的方法，其中所述踝蛋白与kindlin蛋白组合使用。
[0338]
14.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述整联蛋白激动剂是还原剂，诸如二硫苏糖醇。
[0339]
15.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述整联蛋白激动剂是脂质，诸如氧固醇25-羟基胆固醇。
[0340]
16.如实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述方法导致类器官的生长。
[0341]
17.如实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述方法导致相对于不使用整联蛋白激动剂的相同方法，所述方法导致4天内上皮干细胞生长至少增加10％、20％、50％。
[0342]
18.如任一前述实施方案所述的方法，其中所述方法还包括培养与细胞外基质接触的细胞。
[0343]
19.如实施方案18所述的方法，其中所述细胞外基质是基底膜提取物或matrigel。
[0344]
20.如任一前述实施方案所述的方法，其中所述方法还包括培养与合成基质接触的细胞。
[0345]
21.如实施方案20所述的方法，其中所述合成基质包含聚合物，任选地聚酯、聚乙二醇或水凝胶。
[0346]
22.如实施方案20或实施方案21所述的方法，其中所述合成基质包含交联聚乙二醇(peg)水凝胶。
[0347]
23.如实施方案20-22所述的方法，其中所述合成基质包含生物材料，优选地细胞外基质成分。
[0348]
24.如实施方案23所述的方法，其中所述生物材料是一种或多种糖蛋白(任选地选自胶原蛋白、层粘连蛋白、串珠蛋白聚糖、纤连蛋白或纤连蛋白的rgd附着配体)和/或一种或多种碳水化合物(任选地透明质酸)。
[0349]
25.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质或合成基质是三维的。
[0350]
26.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质或合成基质是呈悬浮液。
[0351]
27.如实施方案1-17和20-26中任一项所述的方法，其中所述培养方法不涉及使细胞与外源性细胞外基质接触。
[0352]
28.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述上皮干细胞是上皮干细胞群的一部分，任选地包含在类器官和/或上皮组织外植体中。
[0353]
29.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法包括与非上皮细胞类型、任选地免疫细胞共培养。
[0354]
30.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述上皮干细胞是哺乳动物细胞。
[0355]
31.如实施方案30所述的方法，其中所述上皮干细胞是人细胞。
[0356]
32.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述上皮干细胞选自结肠直肠、小
肠、胃、胰腺、肝、肺、乳腺、前列腺、肾、口腔、鼻咽、咽喉、下咽、喉、气管、皮肤、输卵管、卵巢、唾液腺、食道、毛囊和/或耳蜗细胞。
[0357]
33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述上皮干细胞是结肠直肠细胞。
[0358]
34.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述适用于上皮干细胞的培养基包含wnt激动剂、bmp抑制剂、促有丝分裂生长因子和tfg-β抑制剂中的一种或多种。
[0359]
35.如实施方案34所述的方法，其中所述适用于上皮干细胞的培养基包含wnt激动剂。
[0360]
36.如实施方案35所述的方法，其中所述适用于上皮干细胞的培养基还包含促有丝分裂生长因子和/或bmp抑制剂。
[0361]
37.如实施方案34-36所述的方法，其中所述适用于上皮干细胞的培养基包含wnt激动剂、bmp抑制剂、促有丝分裂生长因子和tfg-β抑制剂。
[0362]
38.如实施方案34-37所述的方法，其中所述wnt激动剂选自r-spondin家族蛋白、来自分泌糖蛋白wnt家族的wnt配体、细胞内β-连环蛋白降解抑制剂、gsk-3抑制剂、tcf/lef激活剂以及rnf43或znrf3抑制剂中的一种或多种。
[0363]
39.如实施方案34-38所述的方法，其中所述促有丝分裂生长因子与诸如egfr、fgfr或hgfr的受体酪氨酸激酶结合。
[0364]
40.如实施方案34-39所述的方法，其中所述促有丝分裂生长因子是egf、fgf和hgf中的一种或多种。
[0365]
41.如实施方案34-40所述的方法，其中所述bmp抑制剂是头蛋白。
[0366]
42.如实施方案34-41所述的方法，其中所述tgf-β抑制剂是alk4、alk5或alk7信号传导通路的抑制剂。
[0367]
43.如实施方案34-42所述的方法，其中所述tgf-β抑制剂是小分子抑制剂，诸如a83-01。
[0368]
44.如实施方案34-43所述的方法，其中所述适用于上皮干细胞的培养基还包含烟酰胺、胃泌素、b27和n-乙酰半胱氨酸中的一种或多种。
[0369]
45.如任一前述实施方案所述的方法，其中所述适用于上皮干细胞的培养基适用于扩增上皮干细胞。
[0370]
46.如任一前述实施方案所述的方法，其中所述适用于上皮干细胞的培养基适用于分化上皮干细胞。
[0371]
47.一种如实施方案34-46中任一项所定义的培养基，其中所述培养基还包含如实施方案2-15中所定义的整联蛋白激动剂。
[0372]
48.一种如实施方案18-27中任一项所定义的细胞外基质或合成基质，其中所述基质还包含如实施方案2-15中所定义的整联蛋白激动剂。
[0373]
49.一种类器官，其是通过实施方案1-46中任一项所述的方法可获得的或所获得的。
[0374]
50.如实施方案49所述的类器官，其中所述类器官具有正常的核型。
[0375]
51.如实施方案49或实施方案50所述的类器官，其中所述类器官具有花环状(rosette-like)结构。
[0376]
52.如实施方案49所述的类器官，其中所述类器官是肿瘤类器官。
[0377]
53.一种组合物，其包含根据实施方案47所述的培养基，和根据实施方案49-52中任一项所述的类器官。
[0378]
54.一种组合物，其包含47的培养基，和细胞外基质或合成基质，所述基质任选地如实施方案18-27中任一项所定义。
[0379]
55.整联蛋白激动剂用于培养细胞的用途。
[0380]
56.整联蛋白激动剂用于在移植入受试者之前预处理细胞的用途。
[0381]
57.一种在细胞移植方法中用作细胞粘附增强剂的整联蛋白激动剂。
[0382]
58.根据实施方案53或实施方案54所述的用途，或根据实施方案56所述使用的整联蛋白激动剂，其中所述细胞是干细胞，任选地上皮干细胞、造血干细胞、诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
[0383]
59.根据实施方案49-52中任一项所述的类器官用于药物筛选、靶点验证、靶点发现或毒理学的用途。
[0384]
60.根据实施方案49-52中任一项所述的类器官，其在治疗中使用或在诊断中使用。
[0385]
实施例
[0386]
实施例1-人源化ts2/16抗体的生产
[0387]
人源化ts2/16抗体由荷兰utrecht的u-protein express bv生产。这涉及通过合成基因设计和密码子优化来产生抗体可变结构域的编码序列。通过使用5'和3'末端的bsmbi限制性位点，与重链和轻链的恒定区同框地将抗体可变结构域合成片段连接到抗体表达载体中来产生表达载体。通过rpex技术在hek293细胞或cho细胞中瞬时产生抗体表达载体，然后随后通过亲和色谱(蛋白a)、离子交换色谱和/或凝胶过滤色谱来纯化重组抗体。
[0388]
在非还原条件下使用nu-page tris-乙酸凝胶/sds缓冲系统(invitrogen)分析人源化抗体，并且所得nupage凝胶可参见图2。以1:1和1:1.5的比率进行重链和轻链的表达质粒转染，在凝胶上产生比1:3的比率更强的蛋白质谱带。对人源化抗体的重链和轻链进行测序，发现其分别为seq id no 3和4。重链和轻链的cdr区分别被鉴定为seq id no 5-7和8-10。
[0389]
实施例2-测试人源化ts2/16抗体对整联蛋白β1的识别
[0390]
在条件培养基中将k562细胞(人永生化骨髓性白血病细胞系)和人源化ts2/16抗体一起孵育。人红细胞白血病细胞系k562仅在表面表达α5β1作为βl类整联蛋白[17]。通过将细胞与以1:250稀释度在pbs 1％bsa中的缀合到alexa 488(life technologies(a11013))的山羊抗huigg1一起孵育，观察抗体结合(图3)。结果表明，抗体成功地与细胞表面的整联蛋白结合。
[0391]
实施例3
–
确认人源化ts2/16抗体的功能活性
[0392]
如[17]中所述，测试人源化ts2/16抗体诱导细胞与纤连蛋白粘附的能力。简而言之，用bsa或纤粘蛋白(pbs中5μg/ml)涂覆96孔板过夜。随后用含1％bsa的pbs封闭所有非特异性结合位点30分钟。在人源化ts2/16存在或不存在的情况下，将人红细胞白血病细胞系k562(105细胞/孔)在37℃下孵育1小时。以三个重复份进行实验。通过用pbs冲洗孔两次来去除未结合的细胞。使用细胞atp驱动的celltiterglo测定法(promega)来对结合的细胞进行定量。简而言之，测定法基于对存在的atp的定量来确定培养中的活细
胞数量，所述存在的atp表明存在代谢活性细胞。
[0393]
图4证明，人源化ts2/16抗体能够诱导细胞与纤连蛋白粘附(如之前对于非人源化抗体版本所证明的那样)，但不能诱导细胞与对照bsa粘附。
[0394]
使用另一种靶向β1整联蛋白亚基的抗整联蛋白激动剂抗体，mab1778抗体，进行类似的实验。mab1778也能够诱导这些细胞的粘附。
[0395]
实施例4-在不含任何细胞外基质成分的培养基中培养上皮干细胞
[0396]
发明人测试了添加整联蛋白激动剂是否会允许上皮干细胞在不包含任何外源添加的细胞外基质成分的培养基中生长。如先前所提及的，培养基中存在细胞外基质是上皮干细胞高效生长的已知要求。
[0397]
如[19]中所述，使用单个人上皮结肠干细胞。将单个人上皮结肠干细胞铺种到含有如下所述培养基的corning超低附着(ultralowattachment)96孔平底板中。corning超低附着表面是共价结合到聚苯乙烯容器表面的亲水的、带中性电荷的涂层。水凝胶抑制特异性和非特异性固定，迫使细胞进入悬浮状态，使得形成3d球体。涂层是稳定的、无细胞毒性的、生物惰性的且不可降解的。
[0398]
培养基含有高级dmem/f12培养基，其包括b27、烟酰胺、n-乙酰半胱氨酸、头蛋白、r-spondin 1、egf、wnt替代品[19]、tgf-b i型受体抑制剂a83-01和p38抑制剂sb202190。值得注意的是，培养基不含细胞外基质。
[0399]
然后将单个人上皮结肠干细胞在以1:100、1:200和1:400稀释度补充有ts2/16条件培养基(upe)或无抗体的人结肠类器官培养基中培养。每种处理条件进行三个重复份。在处理后第4天和第7天，通过计数类器官的总数来测量上皮干细胞的生长速率(图5)。
[0400]
与不含人源化ts2/16抗体的培养基相比，添加整联蛋白激动剂导致上皮干细胞生长增加(参见图5)。在1:400的最低稀释度下观察到整联蛋白激动剂的最佳效果，但在所有测试的稀释度中都观察到了增加的生长速率。在包含人源化ts2/16抗体的培养基中生长的类器官的实例可参见图6。
[0401]
发明人已惊人地证明向不含任何细胞外基质成分的培养基中添加整联蛋白激动剂能够成功地导致高效的上皮干细胞生长。如在阴性对照中所观察到的，在没有任何细胞外基质成分存在的情况下，上皮干细胞不会显著生长。因此，可使用包括使细胞或类器官与整联蛋白激动剂接触的培养方法来改进用于培养上皮干细胞或类器官的方法。
[0402]
发明人假设整联蛋白激动剂能够模拟细胞外基质的结构功能和信号传导功能，因为添加整联蛋白激动剂能够惊人地使上皮干细胞在细胞外基质不存在的情况下生长。不希望受任何特定理论的束缚，整联蛋白激动剂可改变整联蛋白的构象状态，从而将它激活为整联蛋白配体。整联蛋白激动剂然后还模拟整联蛋白配体激活信号传导通路并促进上皮干细胞生长的作用。
[0403]
实施例5-向包含细胞外基质的培养基中添加人源化ts2/16抗体
[0404]
如实施例4中所述分离结肠上皮干细胞。如[20]中所述，在包含高级dmem/f12培养基的培养基中培养单个细胞，所述高级dmem/f12培养基包括b27、烟酰胺、n-乙酰半胱氨酸、头蛋白、r-spondin 1、egf、wnt条件培养基(50％，使用稳定转染的l细胞产生)、tgf-b i型受体抑制剂a83-01和p38抑制剂sb202190。细胞在圆底96孔板中悬浮在10μl matrigel液滴/孔中。
[0405]
细胞用上文所述的培养基作为对照进行处理(图7上的条形1)或用补充有2倍稀释的人源化ts2/16抗体的相同的人结肠类器官培养基进行处理(图7上的条形2-4)。使用如上所述的发光细胞活力测定法(promega)来测量上皮干细胞的生长。
[0406]
结果表明，将此整联蛋白激动剂添加到培养基中与细胞的matrigel悬浮相组合增加了上皮干细胞的生长。因此，整联蛋白激动剂也能够与来源于细胞外基质的信号传导相组合改善上皮干细胞的生长。
[0407]
这些结果在使用富含dyna珠粒的matrigel的进一步实验中得到确认。如上分离并培养结肠上皮干细胞，不同之处是通过添加protg包被的dyna珠粒(invitrogen/thermofischer scientific ref 10003d)或添加人源化ts2/16抗体饱和的protg包被的dyna珠粒来修改所使用的matrigel。图8示出了使用(条形2)或不使用(条形1)人源化ts2/16抗体的两种处理的结果。这些数据还表明，此处通过protg包被的dyna珠粒呈现为多价性的这种整联蛋白激动剂的添加增强了经典matrigel驱动的上皮细胞生长的生长。
[0408]
总而言之，无论是否外源添加细胞外基质，整联蛋白激动剂都能够通过将其作为可溶性成分添加到培养基中来刺激上皮干细胞或类器官的生长。整联蛋白激动剂在并入到细胞外基质中时也能够刺激生长，例如当它在载体上交联并直接与matrigel混合时。
[0409]
实施例6-huts-4对在不含任何细胞外基质成分的培养基中培养上皮干细胞的影响
[0410]
如上文所讨论的，研究已发现fab整联蛋白激活性抗体ts2/16、12g10和huts-4能够诱导几乎相同的对环状rgd肽的高亲和力。此观察结果表明，这些抗体稳定了β1结构域中配体结合位点的相同构象。发明人测试了添加另一种整联蛋白激动剂huts-4是否会允许上皮干细胞在不含任何外源添加的细胞外基质成分的培养基中生长。
[0411]
在corning超低附着96孔平底板中如实施例4中所述分离并培养人结肠类器官片段。然后将这些人结肠来源的类器官片段在补充了最终浓度为1μg/ml的ts2/16或huts-4的人结肠类器官培养基中培养，或者无抗体地培养。每种处理条件进行三个重复份。在处理后第7天，通过使用基于atp的celltiterglo测定法定量活细胞来测量上皮干细胞的生长速率(图9)。
[0412]
与不含整联蛋白激动剂抗体的对照培养基相比，添加两种不同的整联蛋白激动剂导致上皮干细胞生长增加(参见图9)。在所有三种培养基测试中生长的类器官的实例可参见图11。
[0413]
发明人已惊人地证明向不含任何细胞外基质成分的培养基中添加两种不同的整联蛋白激动剂能够成功地导致高效的上皮干细胞生长。因此，可使用包括使细胞或类器官与整联蛋白激动剂接触的培养方法改进用于培养上皮干细胞或类器官的方法。这些数据表明使用整联蛋白激动剂时本文所述的培养方法可以特别有效，所述整联蛋白激动剂对环状rgd肽的亲和力类似于整联蛋白激动剂ts2/16、12g10和huts-4，和/或能够稳定和ts2/16、12g10和huts-4相同的整联蛋白开放头部构象。
[0414]
实施例7-在没有matrigel的情况下从剪切的类器官开始的人结肠生长
[0415]
发明人测试了整联蛋白激动剂是否能够改善在不含外源添加的细胞外基质成分的培养基中从类器官片段(剪切的类器官)而不是如实施例4中所用的单个细胞开始的上皮干细胞生长。
[0416]
穿过狭窄的移液器吸头重复地前后移动类器官，以机械方式获得类器官片段。用显微镜观察片段化程度。将人上皮结肠类器官的片段铺种到含有如实施例4中所述的培养基的corning超低附着96孔平底板中。
[0417]
然后在补充有人源化ts2/16或不含抗体的人结肠类器官培养基中培养人上皮结肠类器官的片段。每种处理条件进行五个重复份。在处理后第7天，通过计数类器官的总数来测量上皮干细胞的生长速率。
[0418]
与不含人源化ts2/16抗体的培养基相比，向从类器官片段开始的培养物中添加整联蛋白激动剂导致上皮干细胞生长增加(参见图10)。在包含人源化ts2/16抗体和不含抗体的培养基中生长的类器官的实例可参见图12。使用类器官的片段而非单个上皮干细胞开始上皮干细胞培养具有相关优势。例如，在以类器官片段而非单个细胞开始的培养中，类器官的生长通常得到改善。此外，通常通过使用能够从细胞表面切割整联蛋白受体的胰蛋白酶消化类器官来获得单个上皮干细胞。因此，在整联蛋白激动剂进行激活之前，细胞需要时间来替换其表面的整联蛋白受体。
[0419]
发明人已惊人地证明向不含任何细胞外基质成分的培养基中添加整联蛋白激动剂能够成功地导致从单个上皮干细胞和类器官片段开始的培养中高效的上皮干细胞生长。
[0420]
实施例8-在matrigel和抗体aiib2存在的情况下人结肠的生长
[0421]
aiib2是已知的可以结合整联蛋白的β1亚基的整联蛋白拮抗剂抗体。与实施例3中测试的整联蛋白激动剂相反，aiib2已证实可抑制细胞附着于ecm成分纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白iv[21]。
[0422]
如实施例6中所述分离p26n和stem159n的人结肠来源类器官片段。在实施例5中所述的人结肠类器官培养基中培养人结肠来源类器官片段。在一些测试条件下，片段悬浮在10μl matrigel液滴/孔中。测试了以下条件：
[0423]
a)在存在matrigel，含有aiib2或不含抗体的情况下的p26n类器官片段
[0424]
b)在不存在matrigel，含有aiib2或不含抗体的情况下的p26n类器官片段；以及
[0425]
c)在存在matrigel，含有aiib2或不含抗体的情况下的stem159n类器官片段。
[0426]
每种处理条件进行两个重复份。在处理后第7天，通过计数类器官的总数来测量上皮干细胞的生长速率。
[0427]
图13-15表明培养基中存在aiib2阻止了上皮干细胞生长。不希望受任何特定理论的束缚，在aiib2存在的情况下这种上皮干细胞生长的缺乏是由于aiib2能够阻断matrigel中的配体激活整联蛋白。如果没有如上所述，ecm中的配体或整联蛋白激动剂来激活整联蛋白，上皮干细胞不会在培养中生长和扩增。
[0428]
类器官中的上皮干细胞具有基底out表型，其中细胞的顶端膜面向类器官的管腔。如参考文献[22]中所述，当类器官在matrigel不存在的情况下生长时，由于缺乏整联蛋白β1受体的配体，这种极化反转成顶端out。这种顶端out表型也在具有ttc7a突变的患者中观察到，其中整联蛋白相关的rock信号传导受到干扰[23]。在含有aiib2的matrigel培养物中也可以诱导这种极性反转，因为抗体阻断了itgb1受体与matrigel中细胞外基质成分的相互作用。aiib2诱导极性反转的这一原理首先在mdck囊肿中显示[24]。
[0429]
总之，细胞外基质成分中的整联蛋白β1受体对于确保具有基底out表型的类器官的生长至关重要。发明人已惊人地证明向不含任何细胞外基质成分的培养基中添加整联蛋
白激动剂能够成功地导致具有基底out表型的上皮干细胞生长。
[0430]
实施例9-在不含任何细胞外基质成分的培养基中培养胰腺上皮干细胞
[0431]
发明人测试了整联蛋白激动剂是否能够改善在不含任何外源添加的细胞外基质成分的培养基中的胰腺上皮干细胞的生长。
[0432]
使用实施例6中描述的方法来获得两个独立胰腺类器官系w15-50040和w15-50020的片段。如[25]中所述，胰腺细胞在补充有以下的高级dmem/f12培养基中培养：hepes(1x)、glutamax(1x)、青霉素/链霉素(1x)、b27(1x)、primocin(1mg/ml)、n-乙酰基-l-半胱氨酸(1mm)、wnt3a条件培养基(50％v/v)、rspo1条件培养基(10％v/v)、头蛋白条件培养基(10％v/v)或重组蛋白(0.1μg/ml)、上皮生长因子(egf，50ng/ml)、胃泌素(10nm)、成纤维细胞生长因子10(fgf10，100ng/ml)、烟酰胺(10mm)和a83-01(0.5μm)。
[0433]
然后将这些人胰腺来源的类器官片段在补充了最终浓度为1μg/ml的ts2/16或不含抗体的人胰腺类器官培养基中培养。每种处理条件进行三个重复份。在处理后第6天，通过使用基于atp的celltiterglo测定法定量活细胞来测量上皮干细胞的生长速率(图16b)。生长的胰腺类器官的实例可参见图16a。
[0434]
与不含人源化ts2/16抗体的培养基相比，添加整联蛋白激动剂导致胰腺上皮干细胞生长增加(参见图16)。
[0435]
实施例10-在包含细胞外基质的培养基中培养肺上皮干细胞
[0436]
发明人测试了整联蛋白激动剂是否能够改善在包含细胞外基质的培养基中的肺上皮干细胞的生长。
[0437]
使用实施例6中所述的方法来获得肺类器官的片段。如[26]中所述，在包含以下的培养基中培养肺类器官片段：高级dmem/f12、hepes、primocin、青霉素/链霉素、glutamax 100x、r-spondin 1、fgf7、fgf 10、头蛋白、a83-01、y-27632、sb202190、b27补充剂、n-乙酰半胱氨酸和烟酰胺。细胞在圆底96孔板中悬浮在10μl matrigel液滴/孔中。
[0438]
然后将这些人肺来源的类器官片段在补充了最终浓度为1μg/ml的ts2/16或不含抗体的人肺类器官培养基中培养。每种处理条件进行三个重复份。在处理后第12天，通过使用基于atp的celltiterglo测定法定量活细胞来测量上皮干细胞的生长速率(图17a)。生长的肺类器官的实例可参见图17b。
[0439]
与不含人源化ts2/16抗体的培养基相比，添加整联蛋白激动剂导致肺上皮干细胞生长增加(参见图17)。
[0440]
实施例11-在包含细胞外基质的培养基中培养头颈上皮干细胞
[0441]
发明人测试了整联蛋白激动剂是否能够改善在不含任何外源添加的细胞外基质成分的培养基中的头颈上皮干细胞的生长。
[0442]
使用实施例6中所述的方法来获得头颈类器官的片段。在包含以下的培养基中培养头颈类器官片段：高级dmem / / 和1x b27补充剂、1mm n-乙酰基-l-半胱氨酸、10mm烟酰胺505、50ng/ml人egf、500nm a83-01、10ng/ml人fgf10、5ng/ml人fgf2、1μm前列腺素e2、3μm chir-99021、1μm毛喉素、4％r-spondin和4％头蛋白。细胞在圆底96孔板中悬浮在10μl matrigel液滴/孔中。
[0443]
然后将这些人头颈来源的类器官片段在补充了最终浓度为1μg/ml的ts2/16或不含抗体的人头颈类器官培养基中培养。每种处理条件进行三个重复份。在处理后第7天，通
过使用基于atp的celltiterglo测定法定量活细胞来测量上皮干细胞的生长速率(图18b)。生长的头颈类器官的实例可参见图18a。与不含人源化ts2/16抗体的培养基相比，添加整联蛋白激动剂导致头颈上皮干细胞生长增加(参见图18)。
[0444]
实施例12-在抗体asc8存在的情况下人结肠的生长
[0445]
asc8是已知的结合整联蛋白的β4亚基的整联蛋白拮抗剂抗体。asc8阻断细胞粘附并且已被证明可抑制伤口闭合[27]。
[0446]
如实施例4中所述分离结肠上皮干细胞并且在根据实施例5的培养基中进行培养。细胞在圆底96孔板中悬浮在10μl matrigel液滴/孔中。细胞用上述培养基作为对照进行处理或用以下处理：
[0447]
(a)最终浓度为0.3μg/ml的asc8。
[0448]
(b)最终浓度为1.2μg/ml的asc8。
[0449]
(c)最终浓度为5μg/ml的asc8。
[0450]
(d)最终浓度为1μg/ml的ts2/16。
[0451]
使用如上所述的发光细胞活力测定法(promega)来测量上皮干细胞的生长。
[0452]
图19表明培养基中存在asc8阻止了上皮干细胞生长。此观察结果与实施例8中所述的aiib2观察到的结果相似。同样，不希望受任何特定理论的束缚，在asc8存在的情况下这种上皮干细胞生长的缺乏被认为是由于此抗体能够阻断matrigel中的配体激活整联蛋白。
[0453]
实施例13-多种整联蛋白激动剂的协同效应
[0454]
3e1是β4整联蛋白激动剂抗体。整联蛋白β4与其天然配体或激活性抗体的接合导致β4细胞质酪氨酸磷酸化，其调控对肿瘤发展很重要的多种信号传导通路[28]。已证实磷酸化的src响应于增加src激酶活性的层粘连蛋白或3e1刺激，与a431细胞中的整联蛋白β4缔合。
[0455]
3e1从memorial sloan kettering cancer centre antibody&bioresource core facility获得。该抗体也由sigma aldrich以目录号为mab1964出售。如实施例4中所述分离结肠上皮干细胞并且在根据实施例5的培养基中进行培养。细胞在圆底96孔板中悬浮在10μlmatrigel液滴/孔中。细胞用上述培养基作为对照进行处理(条形1)或用以下处理：
[0456]
(a)最终浓度为0.1μg/ml的ts2/16(条形2)。
[0457]
(b)最终浓度为0.1μg/ml的ts2/16和0.1μg/ml的3e1(条形3)。
[0458]
(c)最终浓度为0.1μg/ml的ts2/16和1μg/ml的3e1(条形4)。
[0459]
使用如上所述的发光细胞活力测定法(promega)来测量上皮干细胞的生长。图20展示了β1整联蛋白激动剂ts/16和β4整联蛋白激动剂3e1对上皮干细胞生长的协同效应。因此，多种整联蛋白激动剂能够与来源于细胞外基质的信号传导相组合改善上皮干细胞的生长。
[0460]
上述实施例中提供的数据证明了整联蛋白激动剂在存在和不存在细胞外基质成分的情况下在多种细胞类型中成功实现高效上皮干细胞生长的惊人能力。
[0461]
序列
[0462]
seq id no:1-ts2/16h链
[0463][0464]
seq id no:2-ts2-16 kl链
[0465][0466]
seq id no:3-人源化ts2/16h链
[0467][0468]
seq id no:4-人源化ts2/16l链
[0469][0470]
seq id no:5-人源化ts2/16h链hcdr1：
[0471]
seq id no:6-人源化ts2/16h链hcdr2：tissggsyty ypdsvkg
[0472]
seq id no:7-人源化ts2/16h链hcdr3：
[0473]
seq id no:8
–
人源化ts2/16l链lcdr1：
[0474]
seq id no:9
–
人源化ts2/16l链lcdr2：
[0475]
seq id no:10
–
人源化ts2/16l链lcdr3：
[0476]
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