1.本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一种大肠杆菌及应用。
背景技术：
2.熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid)，化学名3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸。熊去氧胆酸作为一种名贵的药材，可促进内源性胆汁酸的分泌，减少重吸收；拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒作用，保护肝细胞膜；溶解胆固醇性结石，并具有免疫调节作用，是保肝抗炎的常用药品。2015年我国熊去氧胆酸市场有8.5亿左右，但95％医院市场为进口产品，德国福克大药厂市场占有率最大，2015年其熊去氧胆酸(商品名为优思弗)在中国的销售额达6.6亿人民币。因此提供一种高效、简便的制备熊去氧胆酸的方法是非常必要的。
3.近年来，鉴于化学法合成的低效性和对环境的严重污染，生物法成为新兴的熊去氧胆酸的合成方法，胆酸、鹅去氧胆酸、脱氢胆酸作为合成熊去氧胆酸的底物也备受关注。其中，以胆酸为底物合成熊去氧胆酸是最为廉价的方法。使用胆酸为底物合成熊去氧胆酸的合成方案是首先将胆酸的12位的羟基进行氧化，再通过黄鸣龙反应除去12位的羰基氧生成鹅去氧胆酸，接着，使用7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶对7位的羟基进行差向异构化，最终获得鹅去氧胆酸的差向异构体——熊去氧胆酸。
4.目前将胆酸12位的羟基氧化合成12-oxo-鹅去氧胆酸 (12-oxo-cdca) 所采用的生物方法为利用12α-羟基类固醇脱氢酶使胆酸12位的羟基氧化从而合成12-oxo-鹅去氧胆酸。
5.大肠杆菌是应用最为广泛的外源基因表达系统之一。e.coli dh5α由于转化率高是基因工程中最常用的宿主菌之一。本发明中所用大肠杆菌可以将胆酸氧化合成12-oxo-鹅去氧胆酸。
技术实现要素：
6.本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种大肠杆菌及其应用。
7.本发明是通过如下技术方案实现的：一种大肠杆菌，其特征在于：采用购自生工生物工程（上海）股份有限公司的大肠杆菌dh5α作为原始菌株，将其按千分之一的接种量接种至lb培养基中，种瓶装量100ml/500ml，放入摇床中，于37℃、200rpm条件下培养24h，得到大肠杆菌。
8.本发明还公开了上述大肠杆菌在胆酸转化为12-oxo-鹅去氧胆酸中的应用。
9.优选的，所述大肠杆菌在ph6.0-8.0、温度30-37℃，将胆酸转化为12-oxo-鹅去氧胆酸。
10.进一步优选的，胆酸量在10g/l时，3g大肠杆菌dh5α菌体，胆酸转化反应完全需要2.5h。
11.本发明提供了一种大肠杆菌dh5α，其可将胆酸12位的羟基氧化，合成12-oxo-鹅去氧胆酸，转化率可达到100%。
附图说明
12.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
13.图1为本发明反应产物的薄层层析检测图；图2为本发明反应产物的蒸发光检测图谱；图3为本发明反应产物的质谱法检测图谱；图4为本发明反应产物的核磁共振普法检测图谱。
14.图1中，ca为胆酸对照，1-6为不同反应时间的样品。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，以便于对本发明的理解，但并不是对本发明的限制。
16.本发明涉及的培养基如下：lb培养基：胰胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，ph自然。
17.下列实施例中的材料来源为：大肠杆菌dh5α购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
18.实施例1：大肠杆菌dh5α粗酶液制备将大肠杆菌dh5α按千分之一的接种量接种至lb培养基中，种瓶装量100ml/500ml，放入摇床中，37℃、200rpm培养至24小时后，将培养液以4000rpm转速离心，收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞。
19.将1g如上方法所得的静息细胞悬浮于40ml的磷酸缓冲液（100mm，ph8.0）中，冰水浴中进行超声破碎，即为大肠杆菌dh5α粗酶液。
20.实施例2：大肠杆菌dh5α催化以胆酸为底物的转化反应在500ml三角瓶中，依次加入20ml磷酸缓冲液（100mm，ph8.0），1mm胆酸、1mm nad ，和实施例1获得的大肠杆菌dh5α粗酶液。37℃条件下，150rpm反应，间歇取样检测，反应1.5小时，终止反应。
21.在上述反应液中加入两倍体积的无水乙醇萃取，去沉淀；将上清抽滤三次得澄清乙醇溶液。利用旋转蒸发仪，65℃旋蒸得浓缩液。将乙醇浓缩液加入三倍乙酸乙酯萃取，65℃旋蒸浓缩得产物为白色晶体，即为反应产物。
22.实施例3：大肠杆菌dh5α催化转化反应产物的鉴定（1）薄层层析法检测产物取实施例2中产物样品少量用乙酸乙酯溶解，备用点样。采用薄层层析法进行定性分析，展开剂组成比例为：三氯甲烷：丙酮：冰醋酸=1.2ml:0.6ml:30μl。显色剂配置比例为mncl
2 :浓h2so4:甲醇=0.2g:17ml:60ml。
23.分别配置胆酸标准品用于定性参比，距离层析板底边1cm点样2μ（直径不超过4mm），而后放于层析缸中展开，待展开剂距层析板上沿1cm处时取出，于显色剂中显色，吹干。再置于105℃烘烤。结果如附图1所示。
24.（2）蒸发光检测产物取实施例2中产物样品少量用乙酸乙酯溶解，蒸发光检测反应产物出峰时间。结果如附图2所示。
25.（3）质谱法检测产物取实施例2中产物样品少量用乙酸乙酯溶解，质谱法检测反应产物出峰时间。结果如附图3所示。
26.（4）核磁共振谱法检测产物取实施例2中产物样品少量用乙酸乙酯溶解，核磁共振谱法检测反应产物分子量。结果如附图4所示。
27.实施例4：大肠杆菌dh5α催化胆酸合成12-oxo-鹅去氧胆酸条件优选将1g实施例1所得的静息细胞悬浮于40ml的磷酸缓冲液（100mm，ph8.0）中，冰水浴中进行超声破碎，即为大肠杆菌dh5α粗酶液。在500ml三角瓶中，依次加入20ml磷酸缓冲液（100mm，ph8.0），1-8g/l胆酸、1mm nad ，和大肠杆菌dh5α粗酶液。37℃条件下，150rpm反应，间歇取样检测，反应2小时，胆酸反应完全，即转化率为100%。
28.反应体系中胆酸为10g/l时，胆酸反应完全需要3小时。
29.胆酸量在10g/l时，增加菌体量，增加至3g菌体，胆酸反应完全需要2.5小时。
30.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种大肠杆菌，其特征在于：采用购自生工生物工程（上海）股份有限公司的大肠杆菌dh5α作为原始菌株，将其按千分之一的接种量接种至lb培养基中，种瓶装量100ml/500ml，放入摇床中，于37℃、200rpm条件下培养24h，得到大肠杆菌。2.如权利要求1所述大肠杆菌在胆酸转化为12-oxo-鹅去氧胆酸中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述大肠杆菌在ph6.0-8.0、温度30-37℃，将胆酸转化为12-oxo-鹅去氧胆酸。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：胆酸量在10g/l时，3g大肠杆菌dh5α菌体，胆酸转化反应完全需要2.5h。
技术总结
本发明涉及微生物应用领域，特别公开了一种大肠杆菌及应用。该大肠杆菌，其特征在于：采用购自生工生物工程（上海）股份有限公司的大肠杆菌DH5α作为原始菌株，将其按千分之一的接种量接种至LB培养基中，种瓶装量100mL/500mL，放入摇床中，于37℃、200rpm条件下培养24h，得到大肠杆菌。本发明提供了一种大肠杆菌DH5α，其可将胆酸12位的羟基氧化，合成12-oxo-鹅去氧胆酸，转化率可达到100%。转化率可达到100%。转化率可达到100%。
技术研发人员：刘翠英 李俊霞 赵杏蕊 董庆茹 任文杰 孙婧 王月梅 陈翠 刘敬
受保护的技术使用者：山东睿智医药科技有限公司
技术研发日：2021.10.19
技术公布日：2022/3/4
再多了解一些
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