一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法与流程

1.本发明属于食品消化与细胞生物学技术领域，具体涉及一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法。


背景技术：

2.液态乳中含有各种基础营养及功能活性物质，同时还可能含有致敏原、农/药残等物质。要了解或评价液态乳中各组分对人体的营养价值、生理学作用以及卫生安全风险，除了采用一般的化学测定，也要采用“生物消化 生物评价”的方法。动物模型和人体临床试验成本高、操作复杂，受环境干扰大，且伴随有伦理(动物福利)问题。体外模拟消化作为上述过程的一种简易替代方法，已经被研究者广泛使用，但不同试验对真实的胃肠消化模拟程度存在差异，降低了试验结果的重复性和参照性。
3.m.minekus等人(food&function，2014，5：1113-1124)建立了一套基于“国际共识”的食品体外消化体系，andr
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brodkorb等人(nature protocols，2019，14：991-1014)对此体系又进行了更新升级。但由于食品状态、质构和受试对象的不同会显著影响消化进程，该体系中相关消化参数(ph、时间、酶量等)的取值主要是对现有数据的平均化或一般化，准确度有限。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，该方法利用液态乳以及wistar大鼠精细调整体外的消化参数，可以达到更好的消化模拟效果。此外，在液态乳的消化阶段后增加合适且有效的胰酶消除步骤，使消化产物能够继续用于肠道细胞培养。
5.本发明的上述目的可以通过如下技术方案来实现：一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，包括以下步骤：
6.(1)选取脱脂生牛乳作为液态乳；
7.(2)模拟胃消化
8.建立不同年龄段wistar大鼠的胃消化参数，包括指定胃消化ph值、酶解时间、胃消化酶/底物质量比；
9.配制胃消化缓冲液和胃蛋白酶母液；
10.胃消化处理：选取步骤(1)中的脱脂生牛乳，将其酸度调至指定胃消化ph值，再加入胃消化缓冲液和胃蛋白酶母液至指定胃消化酶/底物质量比，混匀，消化至指定胃消化时间，冷却，得胃消化液，备用；
11.(3)模拟肠消化
12.建立不同年龄段wistar大鼠的肠消化参数，包括指定肠消化ph值、酶解时间、肠消化酶/底物质量比；
13.配制肠消化缓冲液和胰酶母液；
14.肠消化处理：将步骤(2)制备的胃消化液调至指定肠消化ph值，再加入肠消化缓冲液和胰酶母液至指定肠消化酶/底物质量比，混匀，消化至肠消化指定时间，冷却，得肠消化液，备用；
15.(4)将步骤(3)中的肠消化液离心，取上清液，得可溶性消化产物；
16.(5)将步骤(4)的可溶性消化产物进行预处理，以去除或失活胰酶；
17.(6)将步骤(5)预处理后的可溶性消化产物的渗透压调至等渗，然后除菌，得液态乳消化液；
18.(7)将步骤(6)中的液态乳消化液用于后续肠道细胞培养。
19.本发明根据具体的研究材料(本发明的液态乳)以及具体的受试动物(本发明中的wistar大鼠)而精细调整体外的消化参数，具有更好的消化模拟效果，这是本发明的创新点之一。此外，还需要根据实验者的研究目的，在液态乳的消化阶段后增加合适且有效的胰酶消除步骤，使消化产物能够继续用于肠道细胞培养，这是本技术的另外一个创新点。本发明的方法可为液态乳的体外生物学评价提供方法学支持，作为体内研究的替代试验或预备试验，改善动物福利、降低试验成本开销。
20.在上述模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化的方法中：
21.优选的，步骤(1)中脱脂生牛乳可以是直接购买脱脂生牛乳，也可以是购买新鲜牛乳，然后通过离心进行脱脂处理。
22.作为本发明一种优选的实施方式，步骤(1)中液态乳的脱脂处理包括：采用新鲜生牛乳作为液态乳材料，经8000g 4℃离心10分钟(重复2次)，用医用棉签刮去上层乳脂，得脱脂生牛乳。
23.优选的，步骤(2)所述wistar大鼠为spf级雄性大鼠。
24.优选的，步骤(2)中建立不同年龄段wistar大鼠的胃消化参数，包括指定胃消化ph值、酶解时间、胃消化酶/底物质量比，其中胃消化酶是指胃蛋白酶，底物为生牛乳中牛乳蛋白，根据不同年龄段分为：a.模拟幼年wistar大鼠，1～2周龄，ph＝3.9，时间2.0～2.5小时，胃消化酶/底物质量比1∶120～180；b.模拟成年wistar大鼠，6～8周龄，ph＝2.8，时间2.0小时，胃消化酶/底物质量比1∶80～100；c.模拟老年wistar大鼠，20～22周龄，ph＝3.0，时间2.0小时，胃消化酶/底物质量比1∶85～100。
25.本发明中底物是指牛乳蛋白，即生牛乳中蛋白含量。
26.优选的，步骤(2)中胃消化缓冲液的用量为生牛乳总体积的0.5～1倍。
27.作为本发明一种优选的实施方式，步骤(2)中胃消化缓冲液主要含有kcl6.9mm、kh2po40.9mm、nahco325mm、nacl47.2mm、mgcl20.1mm、(nh4)2co30.5mm、cacl20.15mm，酸碱度调至指定胃消化ph值。
28.优选的，步骤(2)中胃蛋白酶母液采用胃消化缓冲液溶解胃蛋白酶配制获得。
29.作为本发明一种优选的实施方式，配制胃蛋白酶母液时：使用胃消化缓冲液溶解胃蛋白酶(美国sigma公司，货号p6887)，现配现用。
30.优选的，步骤(2)中混匀为37℃恒温水浴摇晃混匀，转速为100～150rpm，冷却为采用冰水中冷却。
31.作为作为本发明一种优选的实施方式，胃消化步骤包括：用玻璃锥形瓶承装牛乳，
用1n盐酸将牛乳酸度调至指定ph(滴加，晃匀)，加入生牛乳0.5～1倍体积的胃消化缓冲液，加入胃蛋白酶母液至指定的胃消化酶(胃蛋白酶)/底物(牛乳蛋白)质量比(晃匀)，37℃恒温水浴摇晃(100～150rpm转速)，消化指定时间后，取出锥形瓶置于冰水中冷却，得到胃消化液产物，备用。
32.优选的，步骤(3)所述wistar大鼠为spf级雄性大鼠。
33.优选的，步骤(3)中建立不同年龄段wistar大鼠的肠消化参数，包括指定肠消化ph值、酶解时间、肠消化酶/底物质量比，其中肠消化酶是指胰酶，底物是指生牛乳中牛乳蛋白，根据不同年龄段分为：a.模拟幼年wistar大鼠，1～2周龄，ph＝7.0，时间1.5～2.0小时，肠消化酶/底物质量比1∶50；b.模拟成年wistar大鼠，6～8周龄，ph＝7.0，时间1.5～2.0小时，肠消化酶/底物质量比1∶50；c.模拟老年wistar大鼠，20～22周龄，ph＝7.0，时间1.5～2.0小时，肠消化酶/底物质量比1∶50。
34.优选的，步骤(3)中加入的肠消化缓冲液的体积与所述胃消化液的体积相同。
35.作为作为本发明一种优选的实施方式，步骤(3)中肠消化缓冲液主要包含：kcl6.8mm、kh2po40.8mm、nahco385mm、nacl38.4mm、mgcl20.33mm、cacl20.6mm，酸碱度调至指定肠消化ph值。
36.优选的，步骤(3)中胰酶母液采用肠消化缓冲液溶解胰酶配制获得。
37.作为本发明一种优选的实施方式，配制胰酶母液时：使用肠消化缓冲液溶解胰酶(美国sigma公司，8
×
usp)，现配现用。
38.优选的，步骤(3)中混匀为37℃恒温水浴摇晃混匀，转速为100～150rpm，冷却为采用冰水中冷却。
39.作为作为本发明一种优选的实施方式，步骤(3)中的肠消化步骤包括：用2m氢氧化钠溶液将步骤(2)制备的胃消化液调至指定ph(滴加，晃匀)，加入胃消化液同等体积的肠消化缓冲液，加入胰酶母液至指定的肠消化酶(胰酶)/底物(牛乳蛋白)质量比(晃匀)。37℃恒温水浴摇晃(100～150rpm转速)，消化指定时间后，取出锥形瓶置于冰水中冷却，得到肠消化液产物，备用。
40.作为本发明的一种优选的实施方式，步骤(4)中将步骤(3)中的肠消化液以10,000g离心10分钟，取上清液，即为可溶性消化产物。
41.由于消化液中存在的胰酶对后续细胞培养有较强的毒性，会阻碍细胞的贴壁，因此需要在细胞培养前将胰酶消除。
42.步骤(5)中根据实验目的，所述预处理可择优选取高温煮沸法、超滤截留法、蛋白酶抑制法和血清中和法中的任一种方法。
43.进一步的，步骤(5)中所述高温煮沸法、超滤截留法、蛋白酶抑制法和血清中和法具体如下：
44.a.高温煮沸法：将可溶性消化产物95～100℃水浴加热3～5分钟，使胰酶变性失活；
45.b.超滤截留法：将可溶性消化产物使用超滤管对消化液进行过滤，收集滤过液，其中超滤管截留分子量为3kd(可购自美国amicon公司)，过滤以4000g离心30分钟；
46.c.蛋白酶抑制法：向可溶性消化产物中加入胰酶抑制剂，对胰酶中的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性进行非竞争性抑制，其中所述胰酶抑制剂为bowman-birk inhibitor(可采用
美国sigma公司货号为t9777的胰酶抑制剂)所述胰酶抑制剂的添加量为步骤(3)所用胰酶总质量的1/5～1/10；
47.d.血清中和法：向可溶性消化产物中加入胎牛血清(可购自美国gibco公司)，对胰酶中的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性进行中和，其中所述胎牛血清的添加量为可溶性消化产物总体积的1/2～1/3。
48.优选的，步骤(5)的实验目的可分为以下几种类别：
49.(5.1)研究对象为非热敏性物质(如可溶性消化产物中的盐类、酪蛋白)，受高温不会损失或明显沉淀，此时可采用高温煮沸法；
50.(5.2)研究对象为＜3kd(针对可溶性消化产物中待研究牛乳某成分的分子量)的低分子量物质(如牛乳中的维生素、或受热易发生化学反应的乳糖/乳寡糖等)，经离心后＞95％可透过超滤膜，此时可采用超滤截留法；
51.(5.3)研究对象为＞3kd的大分子物质或包含有＞3kd的大分子物质(如可溶性消化产物中的乳蛋白、酶类等)，且抑制剂的存在不会干扰相关试验结果，此时可采用蛋白酶抑制法；
52.(5.4)研究对象为＞3kd的大分子物质或包含有＞3kd的大分子物质，且研究对象不含有与血清中相同或相似的物质(如牛血清白蛋白、牛免疫球蛋白)，此时可采用血清中和法。
53.优选的，步骤(6)中采用饱和nacl溶液或超纯水将步骤(5)预处理后的可溶性消化产物的渗透压调至等渗，等渗时的渗透压为300～310mosm/l，然后采用孔径为0.22μm的混合纤维素酯膜微滤除菌。
54.优选的，步骤(7)中所述液态乳消化液用于后续肠道细胞培养时，可以单独使用或与基础培养基混合后使用，培养时间为24小时以内。
55.优选的，所述液态乳消化液单独使用时需加入葡萄糖，所述葡萄糖终浓度为5～20mm。
56.优选的，所述液态乳消化液与所述基础培养基混合使用时，二者的体积份配比为1～9∶1。
57.即液态乳消化液可直接单独使用(只需添加少量葡萄糖)或与基础培养基以一定比例混合后使用，处理时间24小时内为宜。
58.本发明通过构建一种模拟大鼠消化生理环境的静态消化方法，所适用对象为液态乳。通过参考体内消化过程，对体外消化体系参数作了优化调整。其主要优势特征体现在：高度模拟大鼠对液态乳的胃肠消化终点结果；实际操作方便快捷，耗费成本低，受外界干扰小，不存在伦理学(动物福利)问题。同时，针对不同研究者的实验目的，设计了相应的可溶性消化产物预处理方法(以去除或失活反应体系中的消化酶类)，使可溶性消化产物能够继续用于下游的肠道细胞培养(生物学评价)。当研究者期望了解、评价液态乳中(某)组分的营养、功能或风险作用，可首先选择采用本发明中所涉及的技术内容，部分替代动物活体试验，或基于体外试验数据预测动物模型的试验结果。
59.体外静态消化虽不能完全等同于体内动态消化，但试验材料经体外水解处理后纯度/浓度高，水解产物易分离回收，适用于单独分析液态乳中某种(类)组分的生理学(细胞生物)作用与机理。此外，体外消化结合细胞生物学评价，也可作为动物活体试验的前期研
究基础，分析后期动物试验设计方案的可行性、预判试验可能出现的结果。然而，目前现有技术中有关液态乳的体外消化体系与真实的胃肠消化环境有较大区别。
60.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
61.(1)本发明通过模拟wistar大鼠的胃肠效果环境，使液态乳的体外消化终点更加接近wistar大鼠的体内消化结果，提高体外消化的可靠性和真实性；
62.(2)本发明可以使液态乳的消化产物能够用于体外肠道细胞培养，从而根据研究者的不同实验目的来开展各类生物评价试验。
附图说明
63.以下通过附图对本发明作进一步说明。
64.图1为实施例1中ph值-时间变化趋势图；
65.图2为实施例1中酶活-时间变化趋势，其中a，胃蛋白酶；b，胰蛋白酶，注：胃消化3小时、4小时，以及肠消化15分钟、3小时、4小时，因食糜收集不足无法测定酶活；
66.图3为实施例1中总氮-时间变化趋势图；
67.图4为实施例2中使用各种牛乳消化液培养caco-2细胞(24小时后)的形态图，其中a，煮沸处理；b，超滤处理；c，抑制剂处理；d，血清中和；e，无预处理；
68.图5为实施例2中使用各种牛乳消化液培养ncm460细胞(24小时后)的形态图，其中a，煮沸处理；b，超滤处理；c，抑制剂处理；d，血清中和；e，无预处理；
69.图6为实施例2中cck-8检测细胞活力测定，不同牛乳消化液处理细胞24小时后，以pbs对照组作为100％；
70.图7为实施例2中erk1/2总蛋白与磷酸化蛋白表达量分析，其中a为erk总蛋白(t-erk)与磷酸化蛋白(p-erk)印迹发光条带，b为erk总蛋白与磷酸化蛋白印迹发光条带灰度分析，从左至右：pbs对照组、高温煮沸组、超滤组、抑制剂组、血清中和组。
具体实施方式
71.下面通过具体实施案例对本发明做进一步详细说明。
72.实施例1
73.模拟液态乳在大鼠胃肠中的消化过程
74.试验分别购买了3个年龄阶段的wistar雄性大鼠(spf级)。其中“组1，幼龄”周龄为1-2周，64只；“组2，成年”周龄为6-8周64只，“组3，老龄”周龄为20-22周，64只。预先对所有大鼠禁食12小时，将生鲜脱脂牛乳(2.5ml，乳蛋白总含量约75mg)人工灌胃大鼠(为确保起始时间基本统一，每组由4名熟练实验员同时操作，另配有2人编号与计时)。分别在灌胃后的15分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时等8个时间点解剖大鼠(用于ph、酶活试验，每个时间点取4只；用于总氮试验，每个时间点另外取4只)，具体如下：
75.a.分别测定胃腔和空肠腔近端的ph，绘制ph值-时间变化趋势图(图1)；
76.b.从胃腔和空肠腔近端分别取一定质量的食糜内容物，加入0.1ml的超纯水并轻微振荡混匀，以10,000rpm离心5分钟取上清液；使用牛血红蛋白(hb，胃蛋白酶底物)和对甲苯磺酰-l-精氨酸甲酯(tame，胰蛋白酶底物)分别测定上清液中胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶活力(换算为u/g内容物)，并绘制酶活-时间变化趋势图(图2)；
77.c.使用pbs将胃部和小肠腔内容物分别冲洗下来并收集，使用凯氏定氮法测定总氮含量，绘制总氮-时间变化趋势图(图3)。
78.从图1可以看出，幼龄wistar鼠的胃ph值在1.5～2小时达到最低值，然后保持基本恒定；成年wistar鼠和老年wistar鼠在1.0～1.5小时达到最低值，然后保持基本恒定。三个组别中的肠道ph较为平稳，基本维持在7.0左右。因此，将幼龄wistar鼠的胃ph(体外)设定为3.9(取30分钟至2小时的ph平均值)，成年wistar鼠的胃ph(体外)设定为2.8(取30分钟至2小时的ph平均值)，老年wistar鼠的胃ph(体外)设定为3.0(取30分钟至2小时的ph平均值)；三个年龄段的肠道ph(体外)均设定为7.0。
79.从图2可以看出，对于三个组别的wistar鼠，单位质量食糜中的胃蛋白酶总活力在30分钟时达到高水平，基本维持到1.5小时(取组内平均值，分别是：1050，1575，1465u/g)。自牛乳灌胃至1.5小时，胃排空速度约为0.5～1.0g/30分钟，胃腔中食糜内容物(含胃液)质量约在0.5～1.5g左右(1.5小时内)。经计算，胃蛋白酶(sigma p6887，2500u/mg)/底物(牛乳蛋白)的质量比为：1∶120～1∶180(幼龄)，1∶80～1∶100(成年)，1∶85～1∶100(老龄)。小肠内容物胰酶活力在80～100tame u/g之间(幼鼠、成年鼠、老龄鼠较为相近)，8
×
usp胰酶酶活经测定在1000～1200tame u/mg，因此将胰酶/底物(牛乳蛋白)质量比设定为1∶50。
80.从图3可以看出，幼龄wistar鼠的胃内容物总氮在2～3小时达到最低值，成年wistar鼠和老年wistar鼠的胃内容物总氮在2小时达到最低值。因此，将幼龄wistar鼠的胃消化(体外)时间设定为2.0～2.5小时，成年和老年wistar鼠的胃消化(体外)时间设定为2.0小时。三个组别wistar鼠的肠道内容物总氮均在灌胃30分钟时开始升高，2～3小时后恢复禁食期的初始水平；由于胃-肠消化实际上是一个连续动态过程，因此将肠消化(体外)时间设定为1.5～2.0小时。
81.实施例2
82.采用实施例1中构建的参数，以成年wistar鼠为例，采用高温煮沸法预处理可溶性消化产物使胰酶失活，进而用于肠道细胞培养。
83.具体为：
84.①
取100ml的生牛乳(经测定牛乳粗蛋白含量为3200mg)，离心脱脂处理。
85.②
牛乳的体外模拟胃消化步骤。使用玻璃锥形瓶承装牛乳，将ph调至2.8。配制肠消化缓冲液(ph＝2.8)：kcl 6.9mm，kh2po
4 0.9mm，nahco
3 25mm，nacl 47.2mm，mgcl
2 0.1mm，(nh4)2co
3 0.5mm，cacl
2 0.15mm，加入牛乳体积1/2(50ml)的胃消化缓冲液。称量乳蛋白质量1/80的胃蛋白酶(sigma公司，p6887，40mg)，使用少量(1～2ml)的胃消化缓冲液溶解胃蛋白酶。将胃蛋白酶溶液加入牛乳(晃匀)，并迅速将锥形瓶转移至预热好的37℃水浴锅，120rpm匀速摇晃2小时。结束后取出置于冰水冷却。
86.③
牛乳的体外模拟肠消化步骤。接着上一步得到的牛乳胃消化液，将ph调至7.0。配制肠消化缓冲液(ph＝7.0)kcl 6.8mm，kh2po
4 0.8mm，nahco
3 85mm，nacl 38.4mm，mgcl
2 0.33mm，cacl
2 0.6mm，加入与牛乳胃消化液同体积(约为150ml)的肠消化缓冲液。称量乳蛋白质量1/50的胰酶(sigma公司，8
×
usp，64mg)，使用少量(1～2ml)的肠消化缓冲液溶解胰酶。将胰酶溶液加入牛乳(晃匀)，并迅速将锥形瓶转移至预热好的37℃水浴锅，120rpm匀速摇晃2小时。结束后取出置于冰水冷却。
87.④
离心取上清液，获得牛乳可溶性消化产物。
88.⑤
可溶性消化产物的预处理步骤。在此使用“高温煮沸法”：取50ml牛乳消化液置于100℃沸水浴中加热4分钟。后取出冰水冷却。
89.⑥
加入饱和nacl溶液240μl，将溶液渗透压调至310mosm/l。使用0.22μm混合纤维素酯膜微滤除菌，得液态乳消化液。
90.⑦
将液态乳消化液与基础培养基dmem(caco-2培养用)或m3：basef(ncm460培养用)以3∶1比例(体积比)混合(在此称为“牛奶培养基”)，进而用于肠道细胞的培养。培养方法为：在12孔板分别培养caco-2和ncm460细胞，待细胞汇合度达到70％左右，将牛奶培养基换液加入培养孔中，继续培养24小时。结束后，在显微镜下观测细胞形态；使用cck-8试剂(碧云天公司，货号c0041)测定细胞活力(方法为：吸出细胞孔中的牛奶培养基，用pbs洗涤细胞表面2次。向每细胞孔中加入含有10％体积分数cck-8的基础培养基，继续孵育1小时。而后使用酶标仪在450nm波长下测定每孔的吸光度，以计算相对细胞活力)。此外，另重复上述操作步骤，处理结束后，使用ripa裂解液(碧云天公司，货号p0013b)裂解细胞，离心取上清，用于蛋白印迹(westernblotting)试验检测总erk1/2(美国abcam公司，货号ab184699)和p-erk1/2(美国abcam公司，货号ab278538)的蛋白表达量。
91.实施例3
92.与实施例2的步骤
①
～
④
相同，第
⑤
步采用超滤法预处理牛乳消化液(50ml)，获得下层滤过液(＜3kd)。加入饱和nacl溶液300μl，将溶液渗透压调至310mosm/l，微滤除菌。后续步骤与实施例2的
⑦
相同。
93.实施例4
94.与实施例2的步骤
①
～
④
相同，第
⑤
步使用bowman-birk抑制剂(sigma公司，t9777，2.5mg)加入牛乳消化液(50ml)。加入饱和nacl溶液240μl，将溶液渗透压调至310mosm/l，微滤除菌。后续步骤与实施例2的
⑦
相同。
95.实施例5
96.与实施例2的步骤
①
～
④
相同，第
⑤
步使用胎牛血清(gibco公司，15ml)加入牛乳消化液(50ml)。取50ml经预处理的牛乳消化液，加入饱和nacl溶液200μl，将溶液渗透压调至310mosm/l，微滤除菌。后续步骤与实施例2的
⑦
相同。
97.实施例2、3、4、5的显微镜观测结果展示于图4与图5，可知：无任何预处理的牛乳消化液会因其中的胰酶残留使肠道细胞(caco-2和ncm460)脱落和裂解，而其他4种预处理的方法均可以有效抑制或隔离胰酶，使消化产物能够用于肠道细胞培养。
98.将实施例2、3、4、5的cck-8细胞活力试验(图6)、以及蛋白印迹试验(图7)结果联合对比分析，可知：4种预处理方法(高温煮沸、超滤法、抑制剂法、血清中和)均能够显著提高肠道细胞(caco-2和ncm460)的活力，同时增加erk蛋白的磷酸化表达水平，但不同方法之间无显著统计差异。
99.上述试验结果可支持牛乳消化液在肠道细胞生长实验的应用分析，并不意味4种方法在其他生物指标的测定上(如：吸收转运试验、细胞抗氧化、细胞免疫调节等)可被视为等价或等同，实验者还需要根据自己的研究对象和研究目的来选择最适的预处理方法。
100.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。