一株新型高效脱氮莱茵海默氏菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物和环境工程技术领域，具体涉及一株新型高效脱氮莱茵海默氏菌及其应用。


背景技术：

2.我国水产养殖行业正在发生着深刻的变化。随着人们对水产品需求量及品质的要求越来越高，我国水产养殖正在向着高密度、规模化和集约化的方向快速发展。但是，这种高投入量和高生物负载量的养殖模式引起的养殖环境水体污染问题也日益严重。一方面，养殖过程中投加的过量饵料、水产动物产生的大量排泄物以及多种化学药品和抗生素的过量使用使得养殖水体中铵态氮、硝态氮和亚硝态氮的浓度严重超标，这严重破坏了养殖水体的自净能力，严重危害了养殖动物的健康生长，显著降低了水产养殖的产量、品质和效益。另一方面，含有大量氨氮污染物的养殖废水的随意排放或者不当处置会破坏污染土壤、自然水体及地下水，并威胁农作物的生长，甚至危害到人类将康。因此，针对养殖环境中氨氮污染物，建立高效、经济和绿色的脱氮方法具有重要的现实意义。
3.养殖水体中氨氮污染物的脱除主要包括物理方法、化学方法和生物方法。但是，物理方法需要高额的投资和运行经费，而且持续周期较短，对于氨氮污染物的脱除效果有限。化学方法对于氨氮污染物的去除率较好，但是通常会引入新的污染物，且容易产生次生物，从而减弱水体自净能力，引起养殖水体的退化。与物理和化学方法相比，生物方法则具有操作简单，作用周期短，适用范围广，可持续性好，绿色环保等优点。因此，基于微生物脱除养殖水体中氨氮污染物的生物方法得到了国内外广泛的关注。
4.微生物脱氮是一种高效、经济、环保的氨氮污染物脱除方法，其基本原理是微生物利用其同化和异化作用，将氨氮污染物转化为生物体或者含氮气体而彻底去除。目前微生物介导的脱氮过程主要包括厌氧氨氧化、硝化作用(氨氮和硝态氮的氧化)、反硝化作用(硝态氮的还原)以及硝化-反硝化耦合作用等。水产养殖是一个好氧体系，充足的氧气供应是养殖动物的健康快速生长的重要保障。因此，异养硝化-好氧反硝化微生物在养殖水体中氨氮污染物的脱除方面具有重要的应用价值。
5.异养硝化-好氧反硝化脱氮菌的物种多样性丰度，生态分布广泛，代谢途径多样，生长速度迅速，能够利用多种底物作为碳源和电子供体进行脱氮，因此受到了国内外广泛的关注。目前已报道的好氧脱氮菌主要包括芽胞杆菌(bacillus spp.)、假单胞菌(pseudomonaceae spp.)、不动杆菌(acinetobacter spp.)、产碱杆菌(alcaligenes spp.)和红球菌(rhodococcus spp.)等等，而且与这些菌相关的国家发明专利也较多。但是，目前已知具有脱氮功能的莱茵海默氏菌相关报道较少。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的是提供一株新型的具有脱氮功能的莱茵海默氏菌，为水体脱氮提供一种良好的微生物材料。
7.为实现上述目的，本发明提供了一株新型具有脱氮功能的菌株，其为莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为gdmcc no:61796，保藏日期为2021年7月12日。
8.本发明所述菌株由发明人于2019年10月从江门台山市养殖厂的养殖水体样品中分离获得，该菌株特征为：革兰氏染色呈阴性，单菌落呈圆形、乳白色、表面光滑、不透明、边缘规则。此外，所述菌株9y24生长的温度范围是10～40℃，最适生长温度是28℃；生长的ph范围是6～9，最适生长ph是8；生长的nacl浓度范围是0～2％(w/v)，最适nacl浓度是1％(w/v)。
9.本发明的第二个目的是提供上述的莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24在水体脱氮中的应用。
10.本发明所述的莱茵海默氏菌9y24，分别接种至以(nh4)2so4、kno3和nano2为唯一氮源的三种培养基中，28℃条件下180rpm振荡培养。然后，在培养至0、12、24、36、48、60和72h时分别吸取出适量的培养液测定其od
600
。同时，取2.0ml培养液，6000rpm离心10min后取上清液，测定其含有铵根离子、硝酸根离子和亚硝酸根离子的浓度。测试结果表明：莱茵海默氏菌9y24对水体中的nh
4 -n、no
3-‑
n和no
2-‑
n均具有较好的脱除效果。在(nh4)2so4为唯一氮源的培养基中，该菌株培养60h时对nh
4 -n的脱除率为77.5％，且在脱除铵态氮的过程中无其它无机氮的产生和积累；在以kno3为唯一氮源的培养基中，该菌株培养72h时对no
3-‑
n的脱除率为63.5％；在以nano2为唯一氮源的培养基中，该菌株培养60h时对no
2-‑
n的脱除率为82.4％；该菌株在脱除硝态氮和亚硝态氮的过程中无其它无机氮的产生和积累。
11.本发明的第三个目的是提供上述的莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24在制备水体脱氮微生物菌剂中的应用。
12.进一步的，上述的水体脱氮是脱除水体中铵态氮、硝态氮和/或亚硝态氮。
13.进一步的，上述的水体是指养殖废水，包括淡水养殖废水。
14.本发明的第四个目的是提供一种具有脱氮功能的活菌制剂，该活菌制剂含有上述的莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24作为主要活性成分。
15.本发明的第五个目的是提供上述的莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24或上述的活菌制剂在水质改良中的应用。
16.本发明的第六个目的是提供一种水质改良剂，该水质改良剂含有上述的莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24或上述的活菌制剂。
17.本发明具备的有益效果：
18.本发明所述莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24能够有效脱除水体中的铵态氮、硝态氮和亚硝态氮，其中对亚硝态氮的脱除效果高于80％，另外对铵态氮和硝态氮也具有明显的脱除效果。这些结果表明：莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24在水体脱氮中具有很好的应用潜力。
19.本发明的莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24于2021年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为gdmcc no:61796。
附图说明
20.图1为莱茵海默氏菌9y24在r2a培养基上培养72h时的菌落形态。
21.图2为莱茵海默氏菌9y24在以铵态氮、硝态氮和亚硝态氮为唯一氮源条件下的生长情况。
22.图3为莱茵海默氏菌9y24在以铵态氮、硝态氮和亚硝态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性。
具体实施方式
23.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
24.实施例1：莱茵海默氏菌9y24的分离、鉴定
25.采集江门台山市养殖厂(n 21
°
57'56.40'，e 112
°
50'0.76')中鲫鱼养殖池塘中水质较好的养殖水样共500ml，置于灭菌的样品瓶。随后，将样品置于4℃的采样箱中带回进行后续处理。将养殖水样带回实验室后，在超净工作台摇匀水样，取100μl样品加入装有900μl生理盐水的1.5ml离心管中，然后依次稀释至10-2
、10-3
、10-4
、10-5
和10-6
，吸取10-3
、10-4
、10-5
和10-6
稀释样品各200μl分别涂布于r2a培养基(青岛海博，货号hb0167)上，置于28℃生化培养箱中培养7天。通过肉眼观察，根据单菌落的大小、颜色、干湿程度、光滑性和是否产生晕圈等特征，从培养基上挑取不同的单菌落至新r2a培养基上，并通过多次划线纯化直至获得纯培养。将纯化获得的菌株进行编号，并与25％甘油(v/v)混匀后保藏于超低温冰箱，由此得到菌株9y24。
26.菌株9y24革兰氏染色呈阴性，该菌株在r2a培养基上培养3天时的菌落形态如图1所示，单菌落呈圆形，直径1.5～3mm，乳白色，表面光滑，不透明，边缘整齐。
27.实施例2：莱茵海默氏菌9y24的16s rrna基因序列分析和保藏
28.采用hipure细菌dna提取试剂盒(货号d3146-03，广州美基生物科技有限公司)提取菌株9y24的基因组dna并进行纯化。以纯化基因组dna为模板，使用细菌16s rrna基因扩增通用引物27f/1492r，即27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')扩增菌株9y24的16s rrna基因序列。扩增完成后，取适量pcr产物进行凝胶电泳检测，在确定存在目的条带的情况下，将剩余pcr产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，其序列如seq id no.1所示。将菌株9y24的16srrna基因序列提交至ezbiocloud数据库(www.ezbiocloud.net)进行序列同源比对。16srrna基因序列的比对表明：菌株9y24与模式菌株rheinheimera aquatica gr5
t
的16s rrna基因序列(登录号，gq168584)具有最高的相似度，为98.4％，低于细菌种划分的阈值98.65％。因此，本发明鉴定的菌株9y24是一株新菌株，代表莱茵海默氏菌属一个潜在新种，即rheinheimera sp.9y24，将其命名为莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24。目前，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为gdmcc no:61796，保藏日期为2021年7月12日。
29.实施例3：莱茵海默氏菌9y24的生长特性研究
30.将莱茵海默氏菌9y24接种至r2a液体培养基(青岛海博，货号hb0167-2)上，分别置
于4、10、15、20、28、37、40、43和45℃的生化培养箱，培养2周后观察生长情况。将莱茵海默氏菌9y24分别接种至ph值为3、4、5、6、7、8、9、10和11的r2a液体培养基中，置于28℃的生化培养箱静置培养2周。将莱茵海默氏菌9y24分别接种至人工配制的nacl质量分数分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、10.0和15.0％(w/v)的r2a液体培养基中，置于28℃的生化培养箱静置培养2周。对于生长ph和nacl测试，在培养完成后，取适量培养液测定其od
600
，确定莱茵海默氏菌9y24在不同ph值和nacl浓度条件下的生长情况。
31.试验结果显示，所述菌株9y24生长的温度范围是10～40℃，最适生长温度是28℃；生长的ph范围是6～9，最适生长ph是8；生长的nacl浓度范围是0～2％(w/v)，最适nacl浓度是1％(w/v)。
32.实施例4：莱茵海默氏菌9y24脱氮性能研究
33.将莱茵海默氏菌9y24分别接种至以铵态氮(nh
4 -n)、硝态氮(no
3-‑
n)和亚硝态氮(no
2-‑
n)为唯一氮源的培养基中，28℃，120rpm培养。分别在培养0、12、24、36、48、54、60和72h时取样，第一份培养液用于测定其od
600
值，第二份培养液6000rpm离心10min后取上清，用于nh
4 -n、no
3-‑
n和no
2-‑
n的测定。使用紫外分光光度法测定no
3-‑
n的浓度，使用n-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定no
2-‑
n的浓度，使用纳氏试剂分光光度法测定nh
4 -n的浓度。
34.nh
4 -n培养基(g/l)：乙酸钠0.5，丙酮酸钠0.5，(nh4)2so
4 0.094，na2hpo
4 1.0，kh2po41.0，mgso4·
7h2o 0.2，用去离子水定容至1l，调整ph为7.4，在1
×
105pa灭菌20min。随后，在灭菌的培养基中补加2ml经0.22μm过滤除菌的微量元素混合液。
35.no
3-‑
n培养基(g/l)：乙酸钠0.5，丙酮酸钠0.5，kno
3 0.144，na2hpo
4 1.0，kh2po41.0，mgso4·
7h2o 0.2，用去离子水定容至1l，调整ph为7.4，在1
×
105pa灭菌20min。随后，在灭菌的培养基中补加2ml经0.22μm过滤除菌的微量元素混合液。。
36.no
2-‑
n培养基(g/l)：乙酸钠0.5，丙酮酸钠0.5，nano
2 0.099，na2hpo
4 1.0，kh2po41.0，mgso4·
7h2o 0.2，用去离子水定容至1l，调整ph为7.4，在1
×
105pa灭菌20min。随后，在灭菌的培养基中补加2ml经0.22μm过滤除菌的微量元素混合液。
37.微量元素混合液(g/l)：edta-na 58.0，znso4·
7h2o 3.9，cacl
2 10.0，mncl2·
4h2o 1.0，feso4·
7h2o 10.0，(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 1.1，cuso4·
5h2o 1.6，cocl2·
6h2o 1.6，用去离子水定容至1l，ph为6.0，然后在超净工作台使用0.22μm滤器进行过滤除菌。
38.如附图2和3所示，莱茵海默氏菌9y24在以20mg/l nh
4 -n为唯一氮源条件下，在培养24h时其od
600
达到1.1，且其对nh
4 -n的脱除率达到71.2％。如附图2和3所示，莱茵海默氏菌9y24在以20mg/l no
3-‑
n为唯一氮源条件下，在培养48h时其od
600
达到1.0，且其对no
3-‑
n的脱除率达到60.8％。如附图2和3所示，莱茵海默氏菌9y24在以20mg/l no
2-‑
n为唯一氮源条件下，在培养48h时其od
600
达到1.2，且其对no
2-‑
n的脱除率达到72.9％。脱氮性能测试表明：莱茵海默氏菌9y24能够高效的脱除nh
4 -n、no
3-‑
n和no
2-‑
n，且其其脱除no
2-‑
n的性能优良。
39.以上结果表明，莱茵海默氏菌(rheinheimera sp.)9y24为一株新型的异养硝化-好氧反硝化功能菌株，能够高效脱除水体中的氨氮污染物，尤其是对水体中的亚硝态氮的脱除效果最强，在养殖水体及其它淡水水体中氨氮污染物的清除方面具有很大的应用潜力。
40.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对
本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。