一种苯并噻二唑-TB-氟硼络合物及其合成方法和应用与流程

一种苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼络合物及其合成方法和应用
技术领域
1.本发明属于属于有机合成、分析化学及生物成像领域，具体涉及一类具有优异光学性能的苯并噻二唑
‑
base
‑
氟硼络合物的合成及其在金属离子识别、光动力治疗和生物成像中的应用。


背景技术：

2.光动力治疗(photodynamic therapy,pdt)是一种用光敏药物和激光活化治疗肿瘤等疾病的新方法。由于其具有副作用低、微创、没有明显的耐药性、高肿瘤破坏选择性以及易与其他疗法合用等优点，已成为临床肿瘤精准治疗的重要新兴手段。光敏剂是pdt的核心，传统pdt的光敏剂存在的可见吸收、穿透性差等问题，因此越来越多的新型高效光敏剂被研发出来。但基于base(tb)骨架的光敏剂尚处于初级阶段，只有一篇相关报道。
3.合适的生物相容性是影响pdt光敏剂及荧光成像造影剂等性能的一个重要因素。氟硼荧光染料具有高荧光量子产率、较高的摩尔消光系数、较窄的荧光吸收、发射峰、较好的光稳定性和良好的生物相容性等优点，被广泛应用于生物医疗、ph探针、生物成像和金属离子检测等领域。氟硼荧光化合物的配位方式主要包括n,n
‑
、o,o
‑
以及n,o
‑
等原子与b原子配位(图1)。传统的氟硼荧光染料是一种高度平面化的结构，其具有强分子间π
‑
π堆积，导致其自吸收较大，易发生荧光淬灭现象，且其stokes位移较小，易受到激发光和散射光的影响，使其在生物成像等领域的应用受到了限制。因此，对氟硼化合物进行修饰，以获得大stokes位移的荧光化合物，有利于拓展其在生物和组织成像以及其他光学领域的应用。
4.因此，本发明通过在base(tb)骨架上引入苯并噻二唑、氟硼和三苯胺基基团，设计、合成了苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼络合物，并将其应用于金属离子的识别、光动力治疗和生物成像等领域。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼络合物及其合成方法和应用，通过在tb骨架上引入苯并噻二唑、氟硼、三苯胺基基团，设计、合成并噻二唑
‑
base
‑
氟硼络合物，并将其应用于金属离子的识别、光动力治疗和生物成像等领域。
6.一种苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼络合物，其结构式如式a所示：
7.8.一种苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼络合物的合成方法，包括以下步骤：
9.(1)化合物1与多聚甲醛反应得到中间体2，反应式如下：
[0010][0011]
(2)中间体2与硼酸三甲酯反应得到中间体3，反应式如下：
[0012][0013]
(3)中间体3与4,7
‑
二溴
‑
苯并噻二唑4通过偶联反应得到化合物5，反应式如下：
[0014][0015]
(4)化合物5水解得到化合物6，反应式如下：
[0016][0017]
(5)化合物6与三氟化硼反应得到中间体7，反应式如下：
[0018][0019]
(6)中间体7与4
‑
硼酸三苯胺8反应得到化合物9，反应式如下：
[0020][0021]
所述的苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼络合物作为光动力治疗光敏剂的应用。
[0022]
所述的苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼络合物作为荧光材料在生物成像中的应用。
[0023]
所述的苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼络合物作为fe
3
和cu
2
荧光探针在金属离子识别中的应用。
[0024]
有益效果：本发明所述的苯并噻二唑
‑
base
‑
氟硼络合物具有如下优势：
[0025]
(1)合成方法简单，后处理方便；
[0026]
(2)具有大的stokes位移，表现出优异的发光性能，具有优异的固态发光，有成为优异的oled材料的潜能；
[0027]
(3)具有广泛的ph适用范围，可应用于人生理环境中；
[0028]
(4)对黏度有效好的响应，有成为黏度响应的荧光探针的可能；
[0029]
(5)对fe
3
和cu
2
具有识别能力，有望成为优异的fe
3
和cu
2
荧光探针；
[0030]
(6)具有较好的pdt效果，且可对a549细胞进行染色成像，拓展了光敏剂的种类，为合成成像引导的pdt的光敏剂提供了新思路。
附图说明
[0031]
图1是含n,n
‑
，o,o
‑
和n,o
‑
的配体与b原子配位示意图；
[0032]
图2是化合物a在不同溶剂中的紫外吸收光谱；
[0033]
图3是化合物a在不同溶剂中的荧光发射光谱；
[0034]
图4是化合物5、6、7和a在dmf中的紫外吸收光谱；
[0035]
图5是化合物5、6、7和a在dmf中荧光发射光谱；
[0036]
图6是化合物5、6和a的固态荧光发射光谱；
[0037]
图7是化合物a在不同黏度下的荧光发射光谱(a)和折线图(b)；
[0038]
图8是化合物a在不同ph下的荧光发射光谱(a)和折线图(b)；
[0039]
图9是化合物a的荧光发射光谱(a)和不同生物硫醇存的荧光发射光谱(b)；
[0040]
图10是化合物a在不同浓度fe
3
存在下的荧光发射光谱(a)和折线图(b)；
[0041]
图11是化合物a在不同浓度fe
3
存在下的荧光发射光谱(a)和标准曲线(b)；
[0042]
图12是化合物a
‑
fe
3
体系的job’s曲线；
[0043]
图13是不同浓度a对人支气管上皮样细胞(hbe)的毒性；
[0044]
图14是a549细胞在a存在下在光照(l )或无光照(l
‑
)时的存活率；
[0045]
图15是无光照(l
‑
)和光照(l )下a对a549细胞的荧光显微镜图；
[0046]
图16是实施例的中间产物化合物5的1h nmr谱图；
[0047]
图17是实施例的中间产物化合物5的
13
c nmr谱图；
[0048]
图18是实施例的中间产物化合物6的1h nmr谱图；
[0049]
图19是实施例的中间产物化合物6的
13
c nmr谱图；
[0050]
图20是实施例的产物化合物a的1h nmr谱图；
[0051]
图21是实施例的产物化合物a的
13
c nmr谱图。
具体实施方式
[0052]
本发明通过在tb骨架上引入苯并噻二唑、氟硼、三苯胺基基团，设计、合成了苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼类络合物，并将其应用于金属离子的识别、光动力治疗和生物成像等领域。
[0053]
苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼类络合物的结构式如a所示：
[0054][0055]
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0056]
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例式示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
[0057]
实施例
[0058]
本实施例中，苯并噻二唑
‑
base
‑
氟硼络合物如表1所示。
[0059]
表1
[0060][0061]
本实施例中，苯并噻二唑
‑
tb
‑
氟硼类络合物的合成方法包括以下步骤：
[0062]
化合物1与多聚甲醛反应得到中间体2，中间体2与硼酸三甲酯反应得到中间体3，
中间体3与4,7
‑
二溴
‑
苯并噻二唑4通过偶联反应得到中间体5，中间体5水解得到中间体6,中间体6与三氟化硼反应得到中间体7，中间体7与4
‑
硼酸三苯胺8反应得到化合物a。具体步骤为：
[0063]
(1)将4
‑
溴
‑3‑
甲氧基苯胺1(50.0mmol)和多聚甲醛(100.0mmol)依次加入200ml圆底烧瓶中，置于低温槽中调温至
‑
15℃，搅拌下向烧瓶内缓慢滴加三氟乙酸(100ml，约30min滴加完毕)后，室温下反应7天。反应完全后(tlc追踪)，将混合物倒入冰水中，氨水调节ph＝9
‑
10，冷却至室温，抽滤，乙醇洗涤三次，得中间体2。
[0064][0065]
方程式1 tb
‑
och3‑
br(2)的合成
[0066]
(3)将中间体2(5.0mmol)加入100ml圆底烧瓶内，抽换气三次后，置于低温槽中调温至
‑
78℃，搅拌下向烧瓶内加入20.0ml无水四氢呋喃，滴加2.5ml正丁基锂，在氩气保护下反应1h后滴加0.6ml硼酸三甲酯，之后置于室温下反应4h。tlc追踪至反应完全后，二氯甲烷萃取(30.0ml
×
3)，旋干得粗产物。粗产物经柱层析提纯(v
pe
:v
ea
＝5:1)得中间体3(70％)。
[0067][0068]
方程式2中间体3的合成
[0069]
(4)取中间体3(2.0mmol)、4,7
‑
二溴
‑
苯并噻二唑4(4.8mmol)、四(三苯基磷)钯(20％mmol,0.06g)依次加入100ml圆底烧瓶中，氩气保护下加入35.0ml无水甲苯，然后加入碳酸钾(0.53g)，108℃反应12h。反应完全后(tlc追踪)，冷却至室温，二氯甲烷萃取(10.0ml
×
3)，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干得粗产物，粗产物经柱层析提纯(v
dcm
:v
ea
＝100:1)得化合物5(70％)。
[0070][0071]
方程式3化合物5的合成
[0072]
化合物5：7,7'
‑
(3,9
‑
二甲氧基
‑
6h,12h
‑
5,11
‑
二苯并[b,f][1,5]二氮芳辛
‑
2,8
‑
二基)双(4
‑
溴苯并[c][1,2,5]噻二唑)
[0073]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.82(d,j＝7.2hz,1h,ar
‑
h),7.40(d,j＝7.6hz,1h,ar
‑
h),7.02(s,1h,ar
‑
h),6.85
‑
6.61(m,5h,ar
‑
h),4.73
‑
4.68(m,2h,
‑
ch2‑
bridge),4.32
‑
4.18(m,4h,tb
‑
ch2*2),3.73(d,j＝8.8hz,6h,
‑
och3*2).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ159.1,156.3,153.9,153.4,149.7,149.0,132.0,131.2,130.2,129.7,127.8,122.2,120.0,119.8,
112.8,111.3,109.6,107.9,66.8,58.2,58.1,55.8,55.4.
[0074]
(5)取化合物5(2.0mmol)于50ml圆底烧瓶中，抽换气三次后，置于低温槽中调至
‑
15℃，加入15.0ml无水二氯甲烷，然后滴加三溴化硼，滴加结束后，将反应瓶移至室温，在氩气保护下继续反应12h。反应完全后(tlc追踪)，加水淬灭，二氯甲烷萃取(10.0ml
×
3)，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干后得化合物6(75％)。
[0075][0076]
方程式4化合物6的合成
[0077]
化合物6：2,8
‑
双(7
‑
溴苯并[c][1,2,5]噻二唑
‑4‑
基)
‑
6h,12h
‑
5,11
‑
二苯并[b,f][1,5]二氮芳辛
‑
3,9
‑
二醇
[0078]1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.06(d,j＝7.6hz,1h,ar
‑
h),7.58(d,j＝7.6hz,1h,ar
‑
h),7.22(s,1h,ar
‑
h),7.03(d,j＝8.4hz 1h,ar
‑
h),6.96(s,1h,ar
‑
h),6.79
‑
6.71(m,3h,ar
‑
h),4.88
‑
4.80(m,4h,tb
‑
ch
2*2
),4.32(dd,j1＝6.0hz,j2＝16.0hz,2h,
‑
ch2‑
bridge).
13
c nmr(100mhz,dmso
‑
d6)δ157.6,155.1,153.7,153.1,132.7,130.8,130.7,130.4,128.9,112.4,111.3,110.7,66.3,56.9.
[0079]
(6)化合物6与三氟化硼反应得到中间体7，反应式如下：
[0080][0081]
方程式5化合物6的合成
[0082]
称取化合物6(2.0mmol)于50ml圆底烧瓶中，置于低温槽中调至
‑
15℃，氩气保护下加入15ml无水二氯甲烷，随后加入10ml三乙胺(48mmol)，搅拌30min，然后缓慢滴加10ml三氟化硼乙醚溶液(48mmol)，滴加结束后，在室温下继续反应24h。反应完全后(tlc追踪)，加水淬灭，二氯甲烷萃取(10.0ml 3)，粗产物经柱层析提纯(v
dcm
:v
meoh
＝120:1)得中间体7(35％)后，直接用于下一步反应。
[0083]
(7)中间体7与4
‑
硼酸三苯胺8反应得到化合物a，反应式如下：
[0084][0085]
方程式6产物a的合成
[0086]
取化合物7(2.0mmol)、4
‑
硼酸三苯胺8(4.8mmol)、四(三苯基磷)钯(0.06g)和碳酸钾(0.53g)依次加入100.0ml圆底烧瓶中，抽换气三次后，加入35ml无水甲苯，在108℃下反应24h。反应完全后(tlc追踪)，加水淬灭，二氯甲烷萃取(20.0ml
×
3)，粗产物经柱层析提纯(v
dcm
:v
meoh
＝80:1)得化合物a(54％)。
[0087]
化合物a：
[0088]1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ9.42(s,1h,ar
‑
h),9.24(s,1h,ar
‑
h),7.94(d,j＝8.4hz,2h,ar
‑
h),7.82(d,j＝7.2hz,1h,ar
‑
h),7.71(d,j＝7.6hz,1h,ar
‑
h),7.38
–
7.34(m,4h,ar
‑
h),7.12
‑
7.06(m,8h,ar
‑
h),6.79(d,j＝8.4hz,1h,ar
‑
h),6.70(s,1h,ar
‑
h),6.49
–
6.42(m,2h,ar
‑
h),4.56(d,j＝16.4hz,2h,
‑
ch2‑
bridge),4.20(s,2h,tb
‑
ch2),4.06
‑
4.01(m,2h,tb
‑
ch2).
13
c nmr(100mhz,dmso
‑
d6)δ156.8,154.9,154.4,153.5,149.6,147.8,147.5,131.5,131.2,130.6,130.5,130.2,128.1,127.6,125.0,124.1,122.9,121.2,118.8,112.2,111.7,111.3,66.7,58.4,58.3.
[0089]
溶剂化效应
[0090]
测试了实施例所得化合物a的溶剂化效应，具体试验方案如下：
[0091]
将化合物a分别用二氯甲烷(dcm)，四氢呋喃(thf)，甲醇(meoh)，乙腈(mecn)，二甲亚砜(dmso)，甲苯(toluene)，n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)，正己烷(n
‑
hexane)八种溶剂将其配制成浓度为1
×
10
‑5mol/l的工作液，并测试其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，如附图2和3所示。
[0092]
由图2和3可知，化合物a在大极性溶剂中λ
em
发生红移，说明其具有ict效应。
[0093]
a的紫外吸收出现在300nm左右，归属于芳环上π
‑
π*跃迁导致的b带吸收；而其在410nm处的紫外吸收归属于杂原子上n
‑
π*跃迁导致的r带吸收。
[0094]
发光性质测试
[0095]
测试了化合物5、化合物6、化合物7和化合物a在dcm溶液中的紫外吸收和荧光发射光谱(图4和5)。
[0096]
测试了化合物5、化合物6和化合物a的固态荧光发射光谱(图6)。
[0097]
具体试验方案如下：
[0098]
称取10
‑5mol的化合物5、化合物6、化合物7和化合物a，用dcm溶液定容至浓度为1
×
10
‑5mol/l，测试其紫外吸收、荧光发射及固态荧光发射光谱。
[0099]
化合物5、化合物6、化合物7和化合物a的光谱数据如表2所示。
[0100]
由表2可知，与化合物6和化合物7相比，化合物a的吸光度大大增加，与化合物5相比，化合物a的吸光度也略有增加，同等条件下，化合物a的摩尔吸光系数是化合物7的4倍，这是由于化合物a的homo/lumo能隙更小，有利于电子流动，从而使摩尔吸光系数增大。化合物a具有更长的λ
em
(637nm)和更大的stokes位移(328nm)。大的stokes位移和红光发射有利于减小激发光和散射光对荧光发射的影响，可有效屏蔽生物背景干扰，有利于拓展其在生物成像等方面的应用。
[0101]
表2化合物5、6、7和a的光谱数据(dcm)
[0102][0103]
a
溶液中紫外吸收波长(狭缝为2.5/5nm)；
b
摩尔消光系数ε＝a/bc，单位为1
×
105l
·
mol
‑1·
cm
‑1；c溶液中荧光发射波长；
d
溶液中stokes位移；
e
相对荧光量子产率(参比：硫酸奎宁)；
f
荧光亮度，单位为l
·
mol
‑1·
cm
‑1；
g
固态激发波长(狭缝为2.5/2.5nm)；
h
固态荧光发射波长；
i
固态stokes位移。
”‑”
表示强度过低无法测试。
[0104]
黏度响应测试
[0105]
测试了化合物a对黏度的响应情况(dmso:丙三醇依次为1:9
‑
10:0)(λ
ex
＝310nm，狭缝：5/10nm)(图7)。由图7可知，当丙三醇的含量为10％和20％时，荧光强度略有升高，这可能是由于黏度的增大限制了化合物a的分子内旋转，增大了其分子刚性，从而使荧光强度轻微增大。而当丙三醇含量进一步增大时，荧光强度开始降低，这可能是由于质子溶剂中氢键给体的增加使化合物a形成了分子间氢键，导致荧光淬灭。
[0106]
ph响应测试
[0107]
测试了化合物a对ph的响应情况(λ
ex
＝310nm，狭缝：5/10nm)(图8)。由图8可以看出，当溶液ph为2
‑
10时，化合物a的荧光发射光谱无明显变化，表明其具有广泛的ph适用范围，且可适用于人生理环境中。
[0108]
对金属离子和生物硫醇的识别
[0109]
测试了化合物a对不同离子和生物硫醇的响应(λ
ex
＝310nm，狭缝：5/10nm，如图9、表3)
[0110]
表3化合物a与不同离子、生物硫醇的作用
[0111][0112]
结合图9和表3可以看出，加入fe
3
和cu
2
后，化合物a的荧光强度分别减少99％和78％；而当加入其他金属离子、阴离子或生物硫醇时，荧光强度变化可忽略，表明化合物a对fe
3
具有最好的识别效果；干扰离子对化合物a的影响较小，说明化合物a对fe
3
和cu
2
具有更高效的识别。
[0113]
化合物a与fe
3
作用后，其λ
em
发生明显红移，说明其与fe
3
可能发生了配位作用。因此我们进一步研究了化合物a对fe
3
的识别作用(图10)。如图10所示，在浓度为1
×
10
‑5‑1×
10
‑4m范围内，随着fe
3
浓度的增加，化合物a的荧光强度明显降低，直至淬灭。
[0114]
随后探究了化合物a
‑
fe
3
体系的标准曲线(附图10，r2＝0.99)和检测限(lod＝1.2
×
10
‑6mol
·
l
‑1)。
[0115]
为进一步探究化合物a识别fe
3
的原因，绘制了job’s曲线(附图11)。由图12可以看出，化合物a与fe
3
未形成稳定配合物。这可能是由于化合物a中的o、n杂原子先与b原子进行了络合，影响了fe
3
的配位。而化合物a能对fe
3
产生响应的原因可能是由于其中tb骨架的v型结构形成了半空腔，可捕获fe
3
。
[0116]
细胞毒性
[0117]
以人支气管上皮样(hbe)细胞为模型，采用mtt法检测化合物a对hbe细胞的细胞毒性。将hbe细胞接种在96微孔板中(1
×
10
‑5个/ml)，每个孔中加入100μl的培养基，在37℃的co2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的化合物a到接种好的细胞中孵育24h。然后用pbs缓冲溶液冲洗微孔板3次，在每个孔中加入10μl的mtt溶液继续培养4h。移除孔内的培养基，在每个孔中加入150μl的dmso用以溶解细胞内的蓝紫色甲臜(formazam)晶体，并将其置于摇床上，低速震荡5
‑
7min，使结晶物质充分溶解。最后采用酶联免疫检测仪测量各个孔在560nm和670nm处的吸光度值。细胞毒性通过下列公式计算：
[0118]
％viability＝[∑(a
i
/a0×
100)/n]
[0119]
式中a
i
分别为不同浓度化合物的吸光度值；a0为无添加化合物的对照孔的平均吸光度值；n(＝3)表示三次平行实验。
[0120]
采用mtt法测试了c对正常细胞hbe细胞的毒性(附图12)。如图13所示，化合物a对hbe的细胞毒性低，可应用于生物体内。
[0121]
如附图14所示，当不进行光照时，经化合物a处理的a549细胞均表现出极高的存活率，表明其具有可忽略的暗毒性；而进行光照后，a549细胞的存活率显著下降。即使9的浓度降低至6.25μmol
·
l
‑1，a549细胞存活率仍低于40％，表明化合物a具有极低的暗毒性和较高的光毒性，故而其具有优异的pdt效率。
[0122]
化合物a对hbe和a549细胞的半数抑制率如表4所示，结果表明，进行光照后其对a549细胞的ic
50
值小于hbe细胞，且具有极低的ic
50
值，表明其具有极好的pdt效率，且有应用于现实治疗的可能性。
[0123]
表4化合物a对两种细胞的半数抑制浓度(ic
50
)
[0124][0125]
细胞成像测试
[0126]
将a549细胞接种到96微孔板中培养24h。随后细胞用不同浓度(6.25、12.50μmol
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‑1)的化合物a再培养24h后，一半进行光照2h，一半不光照。将培养基换成含有钙黄绿素(ca，100μg/ml)的培养基进一步培养24h，以染色活细胞和死细胞。接着用pbs缓冲溶液冲洗微孔板3次，加入mtt溶液继续培养4h。移除培养基后加入dmso，并将其低速震荡5
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7min。最后，使用荧光显微镜分析细胞。
[0127]
通过活/死细胞染色直接观察体外光动力治疗效果(图15)。
[0128]
如附图15所示，黑暗组均未引起明显的细胞死亡，这体现了化合物a低的暗毒性；而光照组的细胞几乎全部死亡，这表明化合物a具有较好的光毒性，这与体外光动力治疗实验分析中的结果相符。
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相比于合成原料和中间体，化合物a对a549细胞的成像更加清晰，其在细胞中呈黄色，可避免细胞本身的背景颜色干扰。从染色结果可以看出，化合物a可进入细胞，并对细胞质进行染色，但无法进入细胞核内。
[0130]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。