一种团头鲂与黑尾近红鲌间远缘杂交子代的选择育种方法与流程

1.本发明属于鲤科、鲌亚科鱼类远缘杂交子代的选择育种技术领域，更具体涉及一种团头鲂与黑尾近红鲌间远缘杂交子代的选择育种方法。


背景技术：

2.杂交育种指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并在其杂种后代中通过选择而育成纯合品种的方法。杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各种不同的类型，为选择育种提供丰富的材料，理想的育种目标是将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同微效基因积累起来，产生在各该性状上超过亲本的类型，因此正确选择亲本并予以合理组配是杂交育种成败的关键。自20世纪50年代末开始，我国进行了大量的鱼类杂交试验，如芙蓉鲤(散鳞镜鲤
♀×
兴国红鲤
♂
)、颖鲤(散鳞镜鲤
♀×
鲤鲫移核鱼
♂
)等，这些杂交种具有生长比亲本快，营养成分比亲本高，抗病力比亲本强等优势性状。如何利用生物技术对现有鱼类进行遗传改良获得性状优良的水产新品种，是本领域长期面临和需要解决的问题。
3.鲌亚科鱼类是我国广泛分布的类群，多数是江河、湖泊、水库捕捞的主要对象，经济价值高，常见的有近红鲌属、鲂属等，包括黑尾近红鲌、团头鲂等。
4.黑尾近红鲌(ancherythroculter nigrocauda)又名高肩、黑尾鲌，属鲤科(cyprinidae)、鲌亚科(cultrinae)、近红鲌属(ancherythroculter)，是我国长江上游特有的杂食性偏肉食性经济鱼类；由于水利工程修建和酷捕滥渔等原因，自然资源很少，规格也很小，上世纪80年代被学者列入“三级急切保护对象”。研究发现黑尾近红鲌饲料蛋白质需求量低(33.0～36.7％)、这在鲌类中是绝无仅有的，同时还具有抗病、抗逆、抗应激等特点，适宜活体运输和活鱼上市；但该品种个体较小，长江中的性成熟个体仅为100～200g，人工驯养的成鱼个体一般为400～600g，不适合大众消费大规格“大白刁”的习惯。鉴于黑尾近红鲌的优良性状，我们认为这是一个不可多得的育种材料，并建立了活体种质资源库；利用黑尾近红鲌饲料蛋白需求量低和抗病抗应激的特征，以经四代选育的雄性黑尾近红鲌与产漂流性卵的雌性翘嘴鲌杂交，培育出养殖饲料成本比母本翘嘴鲌降低50.0～52.4％、生长速度比父本黑尾近红鲌提高23.5～29.6％的杂交鲌“先锋1号”新品种(gs-02-001-2012)，解决了鲌养殖成本高、不易捕捞和活鱼上市的行业难题。
5.团头鲂(megalobrama amblycephala)又名武昌鱼，属鲤科(cyprinidae)、鲌亚科(cultrinae)、鲂属(megalobrama)，是我国重要的草食性经济鱼类之一。团头鲂生长速度快，饲料适宜蛋白质含量32％，与黑尾近红鲌成鱼适宜蛋白质含量(33％)相近；但该品种对嗜水气单胞菌抗性差，养殖成活率受爆发性出血病的影响大，且应激性强，造成了养殖产量不稳、劳动强度增加、生产成本升高等问题。为克服团头鲂的不足，利用黑尾近红鲌抗嗜水气单胞菌和抗应激的特点，通过团头鲂与黑尾近红鲌远缘杂交获得优良新品系，经检索有"一种团头鲂与黑尾近红鲌远缘杂交方法"已公开，申请号201510950545.3，该专利申请主要存在的缺陷是：团头鲂的亲本挑选、亲本培育、人工催产等核心技术被“一种翘嘴红鲌与团
a2，第二针注射余量。雄鱼注射剂量是雌鱼的1/3～1/2，雌鱼总剂量注射完毕后立即注射雄鱼。注射催产药物后的亲本分养在催产池中，并保持充足溶氧。
15.1.4、杂交授精。待亲鱼发情时分别起网捕鱼，选团头鲂雌鱼、黑尾近红鲌雄鱼人工采集精卵干法授精或半干法授精；雌、雄亲鱼比例为1:1～2。
16.1.5、杂交受精卵孵化。将受精卵采用黄泥浆或滑石粉浆脱粘，或直接粘附人工鱼巢(如棕榈片、网片等)后，置入冲水式孵化槽或孵化缸、孵化环道中孵化，孵化密度为50～80万粒/m3水体，孵化水流以鱼卵不沉积为度；当“腰点”出现时，移出孵化设备，至池塘中进行鱼苗鱼种和亲鱼培育。
17.2、团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)的杂交子代选育；
18.2.1、杂交子代的亲本选择。在团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交子代中，选取健康、性成熟的体重1.0kg以上的3～4龄个体做亲本。
19.2.2、杂交子代的亲本培育。团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)的杂交子代亲鱼放养量为150～200尾/亩，投喂粗蛋白含量为33％以上的专用配合饲料。4月中旬开始，亲本培育池每周换水1次，同时不定期冲水(一般每周2-3次)，促进亲鱼的性腺发育。
20.2.3、杂交子代的逐代繁育。杂交子代的逐代亲鱼催产与“杂交催产”相同，杂交子代的逐代人工授精与“杂交授精”相同，杂交子代的逐代繁育孵化与“杂交受精卵孵化”相同。
21.2.4、杂交子代的逐代选育。在团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)的杂交子代中，以菱形体型和生长速度为选育目标，采用群体选育技术连续选育四代；从鱼苗培育到亲鱼，每代经历二年，3次选择。每次选育时间分别为6月龄、18月龄、24月龄，对应的选择率分别为20％、10％、5％，总选择率为0.1％。
22.2.5、杂交子代经连续四代选育获得的鲌鲂新品种性状检测。与原始亲本团头鲂和黑尾近红鲌相比，检测团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)的杂交子代经连续四代选育获得的鲌鲂新品种性状：
23.(1)基于ssr标记的遗传特性：利用多态性较高的11对黑尾近红鲌微卫星引物，分析团头鲂(
♀
)和黑尾近红鲌(
♂
)及其杂交后经连续四代选育的鲌鲂新品种等三个群体的遗传相似度和遗传距离，结果显示鲌鲂新品种与母本团头鲂的遗传相似度为0.7627、高于父本黑尾近红鲌的遗传相似度0.5838，与母本团头鲂的遗传距离为0.2709、小于父本黑尾近红鲌的遗传距离0.5381；显示鲌鲂新品种与母本团头鲂的亲缘关系更近，遗传上更偏向于母本。所述的引物是：
24.黑尾近红鲌微卫星荧光引物和位点特征
[0025][0026]
(2)体型：测量三个群体的可量性状和框架数据，运用聚类分析和主成分分析方法对鲌鲂新品种、团头鲂和黑尾近红鲌的形态进行分析，显示鲌鲂新品种和团头鲂、黑尾近红鲌的遗传距离分别为0.18、0.26，团头鲂和黑尾近红鲌的遗传距离为0.39；鲌鲂新品种形态上和团头鲂为一类，呈菱型。
[0027]
(3)窒息点：采用密闭式呼吸实验法探究了鲌鲂新品种、团头鲂及黑尾近红鲌幼鱼的窒息点，结果显示在水温23－25.5℃(24.7
±
0.5℃)时，体质量为7.82g鲌鲂新品种、6.02g团头鲂和8.02g黑尾近红鲌的窒息点分别为0.49
±
0.03mg/l、0.63
±
0.02mg/l、0.41
±
0.04mg/l；鲌鲂新品种窒息点显著(p＜0.05)低于母本团头鲂，比团头鲂窒息点降低了22.2％。
[0028]
(4)抗嗜水气单胞菌感染能力：在24－26℃(25
±
1℃)水温条件下，采用腹腔注射嗜水气单胞菌菌悬液的感染方法，测定鲌鲂新品种、团头鲂与黑尾近红鲌抗嗜水气单胞菌感染能力；结果显示，三个品种间抗嗜水气单胞菌感染能力存在显著差异(p＜0.05)，依据寇氏法计算该病原菌对鲌鲂新品种、团头鲂和黑尾近红鲌的半致死浓度分别为6.9
×
108cfu/ml、7.2
×
106cfu/ml和3.6
×
107cfu/ml，三种鱼对嗜水气单胞菌的敏感性由强到若依次是：团头鲂＞黑尾近红鲌＞鲌鲂新品种。
[0029]
(5)生长速度与成活率：在相同条件下，鲌鲂新品种与团头鲂、黑尾近红鲌标记后同池养殖，投喂适合团头鲂生长的鲂料，结果显示鲌鲂新品种生长速度平均比团头鲂快21.9％、比黑尾近红鲌快84.8％，养殖成活率平均比团头鲂提高37.5％。
[0030]
本方法选用特定的团头鲂与黑尾近红鲌进行远缘杂交，通过设定的杂交方法及参数控制，使得杂交受精率、孵化率和出苗率均达80％以上，后代性状优良，且体型较高的后代表现出生长速度快、抗病力强、鳞片更加紧致等优良性状，能有效获得性状优良的育种材料，为进一步选育新品种奠定了基础，对遗传育种具有重要意义以及重要的应用价值，这种结果是无法通过相近品种的杂交预测就能得到的，而是通过不断的试验及优化改进才能取得；对于改变其培育方法、使用的药物及参数，都会对后代产生较大的影响，从而改变了其培育时间、品种及部分构造，本技术方案相对于现有技术具有突出的和显著的技术进步。
[0031]
优选的方案：原始亲本挑选均经连续四代及以上选育的团头鲂雌鱼和黑尾近红鲌雄鱼杂交，获得杂交子代。
[0032]
优选的步骤：原始亲本团头鲂和黑尾近红鲌以生长速度为选育目标，采用群体选择技术，从鱼苗培育到亲鱼，每代经历二年，3次选择。每次选育时间分别为6月龄、18月龄和24月龄，对应的选择率分别为20％、10％、5％，总选择率为0.1％。
[0033]
对所获杂交子代进行逐代选育，培育出生长速度快、抗逆抗应激的优良鲌鲂新品种，解决了鲂易感染嗜水气单胞菌引起爆发性出血病的难题。
[0034]
通过上述技术措施：最关键的是步骤2团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交子代的逐代选育；本发明主要解决了团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)的杂交子代，以菱形体型和生长速度为选育目标，获得了性状优良的鲌鲂杂交后的选育新品种，解决了鲂易感染嗜水气单胞菌引起爆发性出血病和应激性强的技术难题；本发明技术方案相对于现有技术的进步是公开了团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)的杂交子代选育获得优良新品种的技术方案；本发明技术方案与现有技术比较增加了团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)的杂交子代选育技术措施。
[0035]
本发明与现有技术对比：相同点：(1)选择了团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交组合。(2)解决了杂交育种技术，获得了菱形体型、生长快的杂交优良品系。
[0036]
本发明与现有技术对比：不同点：(1)本发明在团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)的杂交子代中，以菱形体型和生长速度为选育目标，采用群体选育技术连续选育四代；从鱼苗培育到亲鱼，每代经历二年，3次选择。每次选育时间分别为6月龄、18月龄、24月龄，对应的选择率分别为20％、10％、5％，总选择率为0.1％。(2)本发明公开了团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交子代经连续四代选育，获得鲌鲂新品种的育种技术方案及其优良性状的检测方案。(3)获得的鲌鲂新品种解决了鲂易感染嗜水气单胞菌引起爆发性出血病的行业难题。
[0037]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0038]
获得了菱形体型、生长速度快、抗逆抗应激等稳定优良性状的鲌鲂新品种(品种号：gs-01-005-2018)。本发明利用团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交，对所获杂交子代进行连续四代选育，获得的优良鲌鲂新品种体型呈菱形，生长速度快，抗逆性强、成活率高，性情温顺，鳞片不易脱落。与团头鲂相比，生长速度平均提高21.9％，窒息点平均降低22.2％、对嗜水气单胞菌抗性显著增强、养殖成活率平均提高37.5％；与黑尾近红鲌相比，生长速度平均提高84.8％。解决了鲂易感染嗜水气单胞菌引起爆发性出血病、应激性强的难题，推动了我国水产养殖业的绿色健康发展。
具体实施方式
[0039]
实施例1：
[0040]
通过团头鲂雌鱼与黑尾近红鲌雄鱼杂交，对所获杂交子代进行连续四代群体选育，培育性状优良的鲌鲂新品种；
[0041]
一种团头鲂与黑尾近红鲌间远缘杂交子代的选择育种方法，其步骤是：
[0042]
1、团头鲂和黑尾近红鲌挑选：选择冬季和春季，挑选体型好、健康、成熟的个体作亲本。
[0043]
2、团头鲂和黑尾近红鲌亲本培育：分池培育。团头鲂亲鱼放养量为150～200尾/亩，投喂专用配合饲料和鲜嫩青草；黑尾近红鲌亲鱼放养量为200～300尾/亩，投喂粗蛋白含量为33％以上的专用配合饲料。4月中旬开始，亲本培育池每周换水1次，同时不定期冲水，促进团头鲂和黑尾近红鲌亲鱼的性腺发育。
[0044]
3、团头鲂雌鱼和黑尾近红鲌雄鱼人工催产：长江中游选择5月至6月，水温稳定控制在20～28℃(其中任一个温度均可)，分别对两种亲本注射催产药物鲤脑垂体(pg)或多巴胺拮抗物地欧酮(dom)、绒毛膜促性腺激素(hcg)、鱼用促黄体素释放激素类似物2号(lrh-a2)，单独使用或混合使用；注射时优选采用胸鳍基部无鳞处注射，进针角度与亲鱼身体的夹角为45
°
左右。所述的雌鱼推荐剂量为每千克亲鱼用pg 2～6mg或dom 2～8mg、hcg 500～1200iu、lrh-a
2 2～10μg，根据性腺发育状况和水温调整剂量或合理配伍，雌鱼采用一针注射法或二针注射法；所述的雌鱼二针注射法的针距为6～10h，第一针为总剂量的1/10或1～2μglrh-a2，第二针注射余量。所述的雄鱼注射剂量是雌鱼的1/3～1/2，雌鱼总剂量注射完毕后立即注射雄鱼。注射催产药物后的亲本分养在催产池中，水中溶氧保持在5mg/l以上。
[0045]
4、团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交授精：当亲鱼追逐或表现出急躁不安时起网捕鱼，挑选的团头鲂雌鱼轻压腹部有卵粒流出，挑选的黑尾近红鲌雄鱼轻压腹部有精液流出，人工采集上述亲鱼的卵子与精子，采用干法授精或半干法授精(是一种授精方式，后面有详细操作方法介绍)；雌、雄亲鱼比例为1:1～2。干法授精：擦干团头鲂雌鱼和黑尾近红鲌雄鱼体表水分，将团头鲂卵子挤入干燥的受精容器中，同时挤入黑尾近红鲌雄鱼精液，操作过程中严禁带入水分；用干羽毛轻轻搅拌使精卵混合均匀，加入少量0.7％生理盐水搅拌均匀，立即脱粘或直接粘附人工鱼巢。半干法授精：擦干团头鲂雌鱼和黑尾近红鲌雄鱼体表水分，将团头鲂雌鱼卵子挤入盛有少量0.7％生理盐水的受精容器中，同时挤入黑尾近红鲌雄鱼精液，并用干羽毛搅拌均匀，立即脱粘或直接粘附人工鱼巢。
[0046]
5、团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交受精卵人工孵化：将黄泥土或滑石粉用水溶解并采用60目网布过滤，保持一定的粘稠度，将杂交受精卵置入过滤的黄泥浆或滑石粉浆脱粘，或直接粘附人工鱼巢(如棕榈片、网片等)后，置入冲水式孵化槽或孵化缸、孵化环道中孵化，孵化密度为50～80万粒/m3水体，孵化水流以鱼卵不沉积为度；当“腰点”(鳔)出现时，移出孵化设备，至池塘中进行杂交鱼苗鱼种和亲鱼培育。所述的“腰点”是鱼类“鳔”器官的俗称。
[0047]
6、团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交子代的亲本培育：杂交子代亲鱼放养量为150～200尾/亩，投喂粗蛋白含量为33％以上的专用配合饲料。4月中旬开始，亲本培育池每周换水1次，同时不定期冲水，促进亲鱼的性腺发育。
[0048]
7、团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交子代的逐代繁育：杂交子代的逐代亲鱼催产与“团头鲂雌鱼和黑尾近红鲌雄鱼人工催产”相同，人工授精与“团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交授精”相同，人工孵化与“团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交受精卵人工孵化”相同。
[0049]
8、团头鲂(
♀
)与黑尾近红鲌(
♂
)杂交子代的逐代选育：所获杂交子代以菱形体型和生长速度为选育目标，从鱼苗培育到亲鱼，每代经历二年，3次选择；第一次选择时间为6月龄、选择率为20％，第二次选择时间为18月龄、选择率为10％，第三次选择时间为24月龄、选择率为5％。杂交子代经连续4代选育，获得体型呈菱形、生长快、抗逆、抗应激的优良鲌鲂新品种。
[0050]
9、发明人测定了一种团头鲂与黑尾近红鲌间远缘杂交子代的选择育种方法获得的鲌鲂新品种的相关性状参数，获得了显著的技术进步。具体数据详见下表一、表二、表三、表四和表五。
[0051]
表一 鲌鲂新品种、团头鲂和黑尾近红鲌等三个群体间的形态差异聚类分析结果
[0052]
群体团头鲂鲌鲂新品种黑尾近红鲌团头鲂0.000.180.39鲌鲂新品种0.180.000.26黑尾红鲌0.390.260.00
[0053]
从上述表一数据可知，基于形态聚类分析得出鲌鲂新品种与团头鲂的遗传距离(0.18)小于黑尾近红鲌的遗传距离(0.26)；表明鲌鲂新品种在形态学方面更接近于团头鲂。
[0054]
表二 鲌鲂新品种、团头鲂和黑尾近红鲌等三个群体间nei的遗传相似度(对角线上)和遗传距离(对角线下)
[0055]
群体团头鲂鲌鲂新品种黑尾近红鲌团头鲂 0.76270.3184鲌鲂新品种0.2709 0.5838黑尾近红鲌1.14460.5381 [0056]
从上述表二数据可知，基于ssr标记的鲌鲂新品种和团头鲂的遗传相似度(0.7627)高于黑尾近红鲌的遗传相似度(0.5838)，和团头鲂的遗传距离(0.2709)小于黑尾近红鲌的遗传距离(0.5381)；表明鲌鲂新品种与母本团头鲂的亲缘关系更近，遗传上更偏向于母本。
[0057]
表三 鲌鲂新品种、团头鲂及黑尾近红鲌的窒息点(水温24.7
±
0.5℃)
[0058]
品种鲌鲂新品种团头鲂黑尾近红鲌体重(g)7.82
±
0.696.02
±
0.578.02
±
0.78窒息点(mg/l)0.49
±
0.03b0.63
±
0.02a0.41
±
0.04c[0059]
注:a,b,c同行数值右上标含不同字母代表差异显著(p＜0.05)
[0060]
从上述表三数据可知，水温24.7
±
0.5℃时，团头鲂窒息点＞鲌鲂新品种窒息点＞黑尾近红鲌窒息点，且鲌鲂新品种的窒息点0.49
±
0.03mg/l，与黑尾近红鲌窒息点0.41
±
0.04mg/和团头鲂窒息点0.63
±
0.02mg/l均存在显著性差异(p＜0.05)；鲌鲂新品种的窒息点比团头鲂降低了22.2％。
[0061]
表四 嗜水气单胞菌对鲌鲂新品种、团头鲂与黑尾近红鲌的半致死浓度(水温25
±
1℃)
[0062]
品种鲌鲂新品种团头鲂黑尾近红鲌
lc
50
(cfu/ml)6.9
×
1087.2
×
1063.6
×
107[0063]
从上述表四数据可知，水温25
±
1℃时，鲌鲂新品种、团头鲂和黑尾近红鲌对嗜水气单胞菌的半致死浓度分别为6.9
×
108cfu/ml、7.2
×
106cfu/ml和3.6
×
107cfu/ml；三种鱼对嗜水气单胞菌的敏感性由强到若依次是：团头鲂＞黑尾近红鲌＞鲌鲂新品种。
[0064]
表五 鲌鲂新品种、团头鲂和黑尾近红鲌同池养殖数据
[0065][0066]
从上述表五数据可知，鲌鲂新品种生长速度平均比团头鲂快21.9％、比黑尾近红鲌快84.8％，养殖成活率平均比团头鲂提高37.5％。