一种孤独症大鼠模型的构建方法与流程

1.本发明属于动物模型构建领域，具体涉及一种孤独症大鼠模型的构建方法。


背景技术：

2.孤独症也称自闭症，是一类多发于青少年的发育性神经精神疾病，患者多会表现出社交障碍、重复性刻板动作和焦虑等行为及情绪的异常，目前尚无有效的药物治疗方法。近年来，世界各国自闭症的患病率逐年升高，自闭症的基础与临床研究以及自闭症动物模型的研究已成为前医学与神经科学领域的热点之一。目前在国际范围内，孤独症已不仅仅是一个医学问题，更是逐渐成为医学背景下的急需解决的社会问题。因此，提高对本病的认知和研究水平变得尤为重要。动物模型因其可控性、易得性及预知性等特点，提供了优于人体研究的优势，在人们对疾病病因及发病机制的探索中扮演着重要角色，孤独症动物模型成为人们探索神经系统与孤独症发病关系的关键。
3.建立合理有效的动物模型，探讨孤独症的成因，是了解孤独症的病因及发病机制，进行早期筛查和干预的基础。目前，孤独症的动物模型包括环境因素模型(母体免疫模型、丙戊酸模型等)、遗传学模型(fmr-1基因模型、mecp-2基因模型等)、脑损毁模型(海马损毁模型、杏仁核损毁模型等)。其中，应用最为广泛的为母体免疫模型，主要包括孕期腹腔注射脂多糖模拟细菌感染、poly-ic模拟病毒感染(poly-ic具有双链rna结构，是一种干扰素诱导物，在体内具有诱导吞噬细胞，诱发抗体形成的作用。对于孕期母体暴露poly-ic致免疫激活的孤独症模型研究已非常成熟，不仅在发育、行为方面得以证实孤独症，在病理、生物化学及结构等方面也十分深入)。孤独症动物造模采用的动物多为啮齿类动物及非人灵长类动物，以啮齿类动物为主。国内外啮齿类动物孤独症模型的建立多采用wistar大鼠，极少采用sprague-dawley大鼠。而两者相比，sprague-dawley大鼠具有繁殖能力强，生长发育快及对疾病抵抗力强等优势。
4.目前认为孤独症谱系障碍是环境与遗传因素共同作用所致。流行病学研究表明，胎儿暴露于某些具有神经毒性的药物，如丙戊酸(valproic acid，vpa)和丙酸等抗癫痫药物，可导致其神经系统发育障碍，严重影响认知功能发展，导致孤独症的产生，因此，神经毒理学方法是建立和研究孤独症动物模型的重要手段之一。孕期vpa暴露是一种经典而常用的神经毒理学孤独症模型，孕12.5d的小鼠腹腔注射vpa后，其子代均可出现社交性和探索性行为减少、重复刻板运动、焦虑紧张状态等孤独症谱系障碍样表现。
5.目前围绕孤独症病因及发病机制而创制的动物模型不断增多，这一方面显示出学术界对本病的不断重视，同时模型的多样化也造成了研究上的莫衷一是。纵观国际及国内对动物模型的评价标准，三种有效性广泛用于评估模型与人类疾病的接近程度。模型呈现的有效性越多，其对人类疾病的呈现效果就越好。这些有效性不仅在评估动物模型的可靠性上至关重要，其在评估药物治疗的疗效时也不可替代。第一种是结构有效性，即模型要符合一定的理论假说且病理生理改变应与假说或理论相一致。第二种是表面有效性，即模型能够在行为学等多方面模拟疾病的典型特征。在孤独症动物模型中，能够模拟刻板行为及
社交、言语障碍等典型临床症状即具有较好的表面有效性。第三种是预测有效性，即模型的药理学反映及非药理学反应与临床治疗表现相一致，并能够为远期的治疗及发病机制研究提供预测性。总结而论，孤独症是一种复杂的发育障碍性疾病，基因异常、脑功能异常等都是近来人们不断探索的方向。孤独症的发病与多种因素密切相关，目前，人们虽通过流行病学资料、临床观察等多种途径掌握了一些易感因素，但对疾病的认识还远远不够。充分发掘利用动物模型是研究孤独症发病原因及治疗方法的最佳选择。当前的模型尚没有符合三个基本有效性的理想的病理学及病因学模型。


技术实现要素：

6.本发明旨在开发一种能够重点针对孤独症的核心症状，能够很好的进行抗焦虑性孤独症的药效评价的动物模型。该模型在诱发孤独症经典症状，以及血压偏高、炎性因子释放紊乱等孤独症伴随症状上均表现出较高的成功率和稳定性。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.一种孤独症大鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.(1)、皮下注射：选择4周龄的雄性大鼠，适应性饲养1周；建模共持续30天。适应性饲养结束后，在建模的第1、10天分别对大鼠皮下注射干扰素α50μg/kg，在第2、15天分别对大鼠皮下注射乙酰胆碱10μg/kg，在第20天对大鼠皮下注射苯环己哌啶(pcp)8μg/kg。
10.(2)、饲喂高蛋白饲料：在建模的第1-28天对大鼠饲喂高蛋白饲料，所述高蛋白饲料由基础饲料添加质量为基础饲料质量10％的大豆蛋白粉、5％的胆酸钠、0.2％的谷氨酸。
11.(3)、昼夜颠倒刺激：在建模的30天期间，对大鼠的饲养环境进行昼夜颠倒，即白天将大鼠饲养箱用黑布包裹，营造黑暗环境，晚上打开大鼠饲养箱的照明灯。
12.(4)、柠檬酸灌胃：在建模的第29天对大鼠进行禁食，并在第30天灌胃柠檬酸30mg/kg；即可得到孤独症大鼠模型。
13.所述大鼠为雄性sd大鼠。
14.30天建模结束后，通过大鼠体重变化、旷场实验、三箱社交实验、社交偏好测试、水迷宫实验的检测，检测大鼠空间认知加工过程及记忆能力，结果表明，大鼠表现了典型的自闭行为，符合孤独症动物模型可靠性和有效性的判定治病，即疾病的发病原因、症状表现、病理生理，按照本发明的构建方法，能够成功获得孤独症大鼠模型。
15.本发明的技术方案，具有如下优点：
16.1、本发明的孤独症动物模型的构建方法中，通对动物皮下注射干扰素α、乙酰胆碱和苯环己哌啶 饲喂高蛋白饲料 昼夜颠倒刺激 柠檬酸灌胃得到孤独症动物模型，这种非单因素诱导的孤独症动物模型与病因学上认为孤独症是多因素诱导发生相符，能够更好地模拟人类孤独症的特征。本发明非单因素诱导的孤独症动物模型，基本上符合三种有效性，无论是从病理生理理论角度，还是模拟典型临床症状和治疗预测角度，都是较为理想的动物模型，将为孤独症的多因素诱导发病机制提供支持，并为开发孤独症治疗的新方案提供理论依据。
17.2、本发明构建的孤独症动物模型效果稳定，个体差异小；多因素之间相互协同，构建的疾病模型更为准确。该模型在诱发孤独症经典症状(模拟刻板行为及社交、言语障碍等典型临床症状)，以及血压偏高、炎性因子释放紊乱等孤独症伴随症状上均表现出较高的成
功率和稳定性。
18.3、本发明的孤独症动物模型，为非单因素诱导的孤独症动物模型，将为孤独症的多因素诱导发病机制提供支持，以及更好地模拟人类孤独症的缓慢进展的优势，为开发一种有效治疗孤独症的新药物制剂提供重要的理论依据。不但可用于探究多因素对孤独症的科学内涵，还能对新药的筛选提供能反应疾病本质的动物模型。
19.4、本发明采用了皮下注射干扰素α、乙酰胆碱、苯环己哌啶相结合的诱导方式，以上三种试剂在各自发挥作用的同时，能够相互协同加强，能够极佳的诱导孤独症的发生。发明人经过多次试验和验证，优化了以上三种试剂的注射时间和注射剂量，保证了更为准确的孤独症大鼠模型。
20.5、本发明同时还采用了饲喂高蛋白饲料 柠檬酸灌胃的诱导方法，能够更好的模拟中医临床孤独症病因、病症，同时与注射三种试剂和昼夜颠倒刺激相结合，能够极佳的诱发孤独症经典症状和伴随症状。发明人经过无数次的创造性劳动和科学实验，筛选出了基础饲料添加10％的大豆蛋白粉、5％的胆酸钠、0.2％的谷氨酸的高蛋白饲料配方，不仅非常适宜于大鼠饲喂，而且极利于孤独症病因病症的临床模拟。建模的最后一天灌胃柠檬酸30mg/kg，在本研究中起到了画龙点睛的作用，保证了效果稳定的孤独症大鼠模型。
具体实施方式
21.一种孤独症大鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
22.(1)、皮下注射：选择4周龄的雄性大鼠，适应性饲养1周；建模共持续30天。适应性饲养结束后，在建模的第1、10天分别对大鼠皮下注射干扰素α50μg/kg，在第2、15天分别对大鼠皮下注射乙酰胆碱10μg/kg，在第20天对大鼠皮下注射苯环己哌啶(pcp)8μg/kg。
23.(2)、饲喂高蛋白饲料：在建模的第1-28天对大鼠饲喂高蛋白饲料，所述高蛋白饲料由基础饲料添加质量为基础饲料质量10％的大豆蛋白粉、5％的胆酸钠、0.2％的谷氨酸。
24.(3)、昼夜颠倒刺激：在建模的30天期间，对大鼠的饲养环境进行昼夜颠倒，即白天将大鼠饲养箱用黑布包裹，营造黑暗环境，晚上打开大鼠饲养箱的照明灯。
25.(4)、柠檬酸灌胃：在建模的第29天对大鼠进行禁食，并在第30天灌胃柠檬酸30mg/kg；即可得到孤独症大鼠模型。
26.所述大鼠为雄性sd大鼠。
27.30天建模结束后，通过大鼠体重变化、旷场实验、三箱社交实验、社交偏好测试、水迷宫实验的检测，检测大鼠空间认知加工过程及记忆能力，结果表明，大鼠表现了典型的自闭行为，符合孤独症动物模型可靠性和有效性的判定治病，即疾病的发病原因、症状表现、病理生理，按照本发明的构建方法，能够成功获得孤独症大鼠模型。
28.对比实验：试验分为6组，第1组采用本发明的建模方法，第2组仅采用步骤(1)的注射法，第3组仅采用骤(2)的高蛋白饲料饲喂法，第4组仅采用骤(3)的昼夜颠倒刺激，第5组仅采用骤(4)的柠檬酸灌胃法，第6组为空白对照组。30天建模结束后，通过大鼠体重变化、旷场实验、三箱社交实验、社交偏好测试、水迷宫实验的检测，结果表明，第1组成功构建了典型的孤独症大鼠模型，第2-5组的大鼠仅在一定程度上表现了自闭孤独行为，但还不足够符合孤独症动物模型标准，第6组表现正常。