一种魔芋寡糖、其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及魔芋寡糖及其应用技术领域，更具体地说，涉及一种从魔芋多糖降解分离纯化得到的魔芋寡糖kgmos以及其制备方法和用途。


背景技术：

2.肠道对维持人体健康极其重要。越来越多研究表明，肠道菌群在健康和疾病中具有至关重要的作用，包括调节免疫和炎症反应以及促进营养物质的消化(maslowski,k.m.,&mackay,c.r.nat immunol 2011,12,5-9；cardarelli,h.r.,et al.,benef microbes 2016,7,271-285.)。首先，肠上皮细胞可作为抵抗入侵病原体的主要防御屏障(garrett,w.s.,et al.,cell 2010,140,859-870)。随着肥胖和糖尿病等代谢疾病的发生率逐步上升，近年来，膳食纤维(如kgm)对肠道健康状况的改善作用已引起越来越多研究的关注(johansson,m.e.,et al.,cell mol life sci 2011,68,3635-3641；kang,y.,et al,int j obes(lond)2019,43,1631-1643；zheng,j.,et al,j agric food chem 2018,66,5821-5831；zhai,x.,et al,j agric food chem 2018,66,12706-12718；chen,h.,et al,j agric food chem 2019,67,5278-5288；zhao,y.,et al,int j biol macromol 2020,159,1186-1196)。
3.魔芋聚糖(kgm)是由魔芋(amorphophallus konjac)球茎中提取得到的一种中性多糖，其重复单元是由-(1
→
4)-连接的d-葡萄糖和d-甘露糖组成。kgm的单糖的比例，分子量，糖残基的乙酰化修饰修饰与其产地，品种和生产方式有关(gomez,b.,et al.,j agr food chem 2017,65,2019-2031)。在过去的二十年中，kgm已经在食品、化学、化妆品和制药行业得到了广泛的应用。
4.研究表明，kgm对人体健康有益，主要在调节肠道菌群、减重和糖尿病管理，降低癌症风险等方面发挥作用。同时在药物输送和组织工程方面的应用也受到了关注。但是，天然kgm的高分子量(范围从200至2000kda)、高粘度和低溶解度的特点限制了其应用(tester,r.f.,al-ghazzewi,f.h.,j sci food agr 2016,96,3283-3291)。
5.kgm经酶或物理化学法降解后，可得到低分子量寡糖，从而显著降低其粘度并提高水溶性。据报道，kgm，特别是kgm寡糖对肠道健康具有的显著的促进作用，主要包括益生元作用、抗氧化活性和提高免疫功能(jiang,m.,et al,j zhejiang univ-sc b 2018,19,505-514)。kgm还具有治疗炎症性肠病和溃疡性结肠炎的治疗潜力(zhang,l.,et al.,food funct 2019,10,1928-1939；liu,r.,et al.,int immunopharmacol 2016,40,385-391)。
6.研究表明，kgm寡糖促进健康的功效与其分子结构和纯度有密切相关。据报道，超低分子量的kgm寡糖(dp 2～4)可通过增强益生菌而改善肠道环境(jiang,m.,et al,j zhejiang univ-sc b 2018,19,505-514.)。
7.然而，目前文献尚未对dp 18～24的kgm寡糖进行深入研究。同时，当前文献中很少有关于kgm寡糖的生产工艺和纯度的信息。此外，越来越多的证据表明，先前研究中使用的kgm分子量大多不均一，且纯度低于90％。这严重影响了kgm寡糖相关的功能研究(jiang,
m.,et al,j zhejiang univ-sc b 2018,19,505-514；ariestanti,c.a.,et al,food sci nutr 2019,7,788-796)。
8.因此，需要对dp 18～24的kgm寡糖及其应用进行深入研究。


技术实现要素：

9.本发明对天然kgm进行控制性降解，得到特定分子量范围的魔芋寡糖，从而克服其在应用时遇到的问题。
10.本发明首次通过酸降解魔芋多糖得到分子量为2200～4000da的魔芋寡糖kgmos(dp 18～24)，经hpgpc分析为均一寡糖，经单糖组成分析，
13
c nmr、1h nmr分析可知，该寡糖的重复单元组成与现有文献报道一致，由甘露糖和葡萄糖组成，摩尔比例为约1.5:1。
11.本发明首次研究了分子量为2200-4000da的魔芋寡糖kgmos(dp 18-24)在改善肠道菌群结构、维持肠道健康中的作用。
12.本发明首先得到结构均一的魔芋寡糖kgmos，并进一步评估了其在c57bl/6小鼠中对结肠功能的改善作用。同时，本发明揭示了魔芋寡糖的一个新的作用机制及通过促进结肠丁酸的产生从而增强组蛋白h3和h4的乙酰化，增加了muc2基因的表达，最终提高了结肠黏蛋白含量从而增强了结肠粘膜屏障保护功能。本发明有助于设计和研发基于kgm的治疗肠道疾病的保健品和药物。
13.本发明一方面提供了一种魔芋寡糖kgmos，重均分子量是2200～4000da，分子量分布为1.01～1.4，聚合度(dp)范围在18～24。
14.本发明另一方面提供制备所述魔芋寡糖kgmos的方法，该方法包括以下步骤：
15.a)将魔芋多糖kgm在酸存在下降解；
16.b)将步骤a)所得溶液离心，取上清液，蒸干；
17.c)将步骤b)所得产物在去离子水中溶解后，离心；
18.d)收集步骤c)离心后得到的上清液，用超纯水在3500da分子量截留的透析袋中透析，得到最终产物kgmos。
19.图6显示了根据本发明一个实施方式的制备本发明的魔芋寡糖kgmos的工艺流程图，但是本发明不限于此。例如，离心后的残渣也可以循环再次进行降解。
20.在本发明的一个实施方式中，所述步骤a)如下进行：将魔芋多糖kgm溶解于酸溶液中，在60～100℃的条件下降解。
21.所述魔芋多糖kgm可以按照本领域中已知的方法制备而没有特别限制。例如，可以如下制备：(1)将食品级魔芋粉在40％乙醇水溶液中分散以溶解杂质，然后进行固液分离得到第一沉淀；(2)第一沉淀用水重新分散获得水溶胶后进行固液分离得到第一上清液；(3)将第一上清液加乙醇至乙醇终浓度30％后进行固液分离得到第二沉淀；(4)第二沉淀分散于70％乙醇水溶液中后进行固液分离得到第三沉淀；(4)第三沉淀分散于100％乙醇中后进行固液分离得到第四沉淀，干燥获得魔芋多糖kgm。但是本发明不限于此。
22.在本发明的一个实施方式中，所述步骤b)如下进行：将步骤a)所得溶液在转速6000～10000rpm离心，取上清液蒸干。
23.在本发明的一个实施方式中，所述步骤c)如下进行，用去离子水溶解步骤b)蒸干所得的残渣，在6000-10000rpm转速离心。
24.在本发明的一个实施方式中，所述步骤d)如下进行：收集步骤c)离心后得到的上清液，装入3500da分子量截留的透析袋中，在超纯水中透析，冻干，得到最终产物魔芋寡糖kgmos。
25.在本发明的一个实施方式中，所述酸可以选自：三氟乙酸，盐酸，硫酸，硝酸，磷酸，氢溴酸，特别是三氟乙酸。
26.在本发明的一个实施方式中，所述步骤a)中，降解反应的温度可以为60～100℃，优选为70～98℃，更优选为80～95℃，例如85℃、90℃。降解反应的时间可以为1小时以上，1.5小时以上，2小时以上，例如2-4小时。特别地，可以在90℃条件下降解2-4小时。
27.在本发明的一个实施方式中，所述步骤b)和c)中，离心转数可以为6000～10000转，例如为7000～9800转。
28.在本发明的一个实施方式中，所述步骤b)和c)中，离心时间可以为10分钟以上，例如10～40分钟。
29.在本发明的一个实施方式中，所述步骤d)中，透析时间可以为1天以上，例如1～5天。
30.本发明评估了本发明的魔芋寡糖kgmos在c57bl/6小鼠中对结肠功能的改善作用。实验结果表明，本发明的魔芋寡糖kgmos具有改善肠道菌群、维持肠道健康的作用。实验结果还表明，魔芋寡糖能够通过促进结肠丁酸的产生从而增强组蛋白h3和h4的乙酰化，增加了muc2基因的表达，最终提高结肠黏蛋白含量从而增强了结肠粘膜屏障保护功能。因此，本发明有助于设计和研发基于kgm的治疗肠道疾病的保健品和药物。
31.因此，本发明又一方面涉及一种药物或食品组合物，其包含根据本发明的魔芋寡糖kgmos。所述药物还可以包含其他药物活性成分和/或可药用载体。所述食品组合物还可以包含其他可食用成分。所述药物或食品组合物是通过添加本发明的魔芋寡糖kgmos而制备的。
32.在本发明的又一方面，提供了本发明所述的魔芋寡糖kgmos的用途，所述用途选自：用于制备促进结肠内丁酸合成的药物或食品的用途，用于制备增强黏膜上皮细胞组蛋白h3和h4的乙酰化的药物或食品的用途，用于制备增加结肠黏蛋白含量的药物或食品的用途，用于制备提高粘膜屏障功能的药物或食品的用途，用于制备改善肠道菌群、维持肠道健康的药物或食品的用途。
33.在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值，特别是整数数值。举例而言，“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有次级范围，特别是由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。
34.若数量或其他数值或参数是以范围、优选范围或一系列上限与下限表示，则其应理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或优选值与该范围的下限或优选值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。
35.在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精
确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。
36.除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本技术文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化，并且在某些方面，小于或等于0.1％的变化。
37.以上实施方式仅为本发明的示例性实施方式，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
附图说明
38.图1中，a是本发明实施例1的魔芋寡糖kgmos的hplc图谱；b是本发明实施例1的魔芋寡糖kgmos的单糖组成分析hplc图谱；c是本发明实施例1的魔芋寡糖kgmos的1h nmr图；d是本发明实施例1的魔芋寡糖kgmos的
13
c nmr图。
39.图2显示本发明实施例1的魔芋寡糖kgmos对小鼠体重、摄食和饮水量以及结肠长度的影响。
40.图3显示本发明实施例1的魔芋寡糖kgmos对小鼠肠道菌群的影响。
41.图4显示本发明实施例1的魔芋寡糖kgmos对小鼠结肠粘液屏障的影响。
42.图5显示本发明实施例1的魔芋寡糖kgmos对小鼠粪便中短链脂肪酸以及组蛋白h3和h4乙酰化的影响。
43.图6是根据本发明一个实施方式的制备魔芋寡糖kgmos的工艺流程图。
具体实施方式
44.下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
45.本发明实施例中使用的仪器设备如下：
46.高效液相色谱仪(gpc-malls-ri)：美国waters 2695连接八角度激光检测器(malls，美国wyatt)和示差折光检测器(ri，美国waters)
47.核磁共振波谱仪：美国bruker avanceiii
48.气相色谱仪：日本岛津gc-2014
49.图片扫描仪：匈牙利pannoramic scanner
50.测序仪：美国illumina miseq platform
51.实时定量(rt-qpcr)仪：美国applied biosystems
52.食品级魔芋粉(纯化特级，90％，货号03-tk)购自武汉市清江魔芋制品有限公司。
53.实施例1：魔芋寡糖kgmos的制备
54.将食品级魔芋粉按照10％w/v的浓度分散于40％乙醇水溶液，加热至70℃，同时不断搅拌，以溶解杂质。4小时后，用3号砂芯漏斗过滤，滤渣沉淀重新用10倍体积的水重悬分散，并加热至70℃过夜(约16小时)，获得水溶胶，冷却至室温后，9000转/分钟离心30分钟，弃沉淀，取上清加乙醇至乙醇终浓度30％，搅拌后，室温静止4小时，再次9000转/分钟离心30分钟，获得沉淀，而后用70％乙醇水溶液和100％乙醇分别清洗离心一次，最终获得的沉淀样品通过真空干燥获得魔芋多糖kgm。
55.将kgm以1％w/w的浓度分散在0.2m三氟乙酸(tfa)水溶液中，并在搅拌下于90℃温育2小时。将该溶液在9000g下离心20分钟，并将上清液在60℃下减压干燥。将所得产物溶于蒸馏水中，并在9000g下离心20分钟。选用3500da分子量截留的透析袋，将上清液在milli-q水中透析3天，冷冻干燥后得到kgm的降解产物kgmos。
56.物化性质测定：
57.色谱条件：waters e2695，色谱柱日本东曹tsk-gel g2500pw
xl
(7μm，7.8mm x 30cm)，柱温35℃；检测器：八角度激光检测器(ls)，示差折光检测器(ri，35℃)。激光检测器光源波长选用623.8nm。多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146ml/g计算。
58.样品制备：称取5mg样品，溶解于1ml流动相中，流动相为0.05mol/l的nah2po4和0.15mol/l的nano3溶液(ph 7，0.02重量％叠氮钠)，配制成浓度5mg/ml的溶液。用12 000
×
g离心20min后取上清液，经0.22μm的水相微孔膜过滤后进行hpgpc-malls-ri分析测定。所得gpc色谱图如图1的a所示。
59.数据处理：使用astra(version 6.1.1，wyatt technology，santa barbara，ca)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算分子量。
60.经计算，本发明的魔芋寡糖kgmos为均一寡糖，分子量为2200～4000da，重均分子量mw为3200da，数均分子量mn为2900da，分子量分布(pdi＝mw/mn)约为1.1，聚合度dp为18～24。
61.单糖组成分析：
62.1)取1mg kgmos寡糖样品，溶于0.5ml水中，再加入0.5ml 4mol/l的tfa水溶液，110℃水解4h，冷却后，加甲醇减压蒸发除去tfa。
63.2)加入100ml 0.3mol/l naoh水溶液溶解水解物，再加100ml 0.5mol/l 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)甲醇溶液(0.4355g/5ml)，漩涡混匀。
64.4)在70℃水浴中反应100min，取出放置10min，冷却至室温。
65.5)加入100ml 0.3mol/l的hcl水溶液中和，加水至1ml，再加等体积的氯仿，漩涡振荡，静置。吸取上层水相，再重复萃取2次。
66.6)用0.22mm微孔滤膜过滤后装入液相瓶中进行hplc分析。
67.液相色谱条件：使用线性梯度洗脱程序(缓冲液a：15体积％乙腈和85体积％0.05m kh2po4水溶液；缓冲液b：40体积％乙腈和60体积％0.05m kh2po4水溶液，ph 6.7)，检测波长为254nm。通过比较kgmos与单糖标准品的保留时间和峰面积，确定kgmos的单糖组成和含量。
68.糖组成分析hplc图谱如图1的b所示。由图可知，kgmos的重复单元由甘露糖和葡萄
糖组成，摩尔比例为约1.5:1。
69.化学结构鉴定：
70.使用核磁共振进行分析。
71.室温下，取一定量的kgmos，用500μl重水溶解后，用500mhz的bruker核磁共振仪获得其1h nmr以及
13
c nmr谱图，分别如图1的c和d所示。
72.经单糖组成分析，
13
c nmr、1h nmr分析可知，该寡糖的重复单元组成与现有文献报道一致。
73.在糖化学领域中，即使重复单元一样，但由于分子量不一样，其空间结构会不同，这种空间结构的变化可能导致活性的显著改变。kgmos与已报道的分子量范围是100-6000da(聚合度1～37)和聚合度2～4的魔芋寡糖的分子量不同(gomez,b.,et al.,j agr food chem 2017,65,2019-2031；jiang,m.,et al,j zhejiang univ-sc b 2018,19,505-514)，可认为本发明中的魔芋寡糖kgmos为一新型的寡糖类化合物。研究表明，寡糖的分子量会影响其粘度、溶液构象等理化性质，并进而导致其生物学活性的差异。
74.实施例2：魔芋寡糖kgmos对c57bl/6小鼠结肠健康状态的影响
75.使用实施例1制备的魔芋寡糖kgmos进行如下实验。
76.2.1动物饲养
77.将c57bl/6小鼠(6至8周)随机分为三组(n＝15/组)，每天口服给药。分别给予生理盐水(对照组)，低剂量(10mg/kg/天，kgmos10组)和高剂量(100mg/kg/天，kgmos100组)，持续八周。每5天记录一次食物和水的摄入量，每周对小鼠称重。
78.在给药期结束后，将所有小鼠通过co2窒息处死。收集血液样品并通过离心(4000g，5分钟)分离以获得血清。将血清样品储存在-80℃用于进一步分析。小鼠处死后，快速截取结肠组织。测量结肠长度后，将组织在液氮中速冻，并储存在-80℃用于生化检查，或用carnoy固定剂固定后进行组织学分析。同时，收集粪便用于肠道菌群分析。
79.实验结果如图2所示，其中a显示给药kgmos对于摄食的影响，b显示给药kgmos对于饮水量的影响，c显示给药kgmos对于体重的影响，以及d显示给药kgmos对于肠道长度的影响。
80.由图2可知，与对照组相比，从给药后3周起，两个给药组小鼠的食物消耗均显著降低(图2的a)，但饮水量显著增加(图2的b)。在给药期间，所有治疗组的小鼠体重均逐渐增加，但与对照组相比，口服kgmos降低了小鼠的体重增加率且呈现剂量依赖(图2的c)。同时，同对照组相比，kgmos100组小鼠结肠的长度显著增加(图2的d)，表明kgmos具有促进肠道组织修复，维持肠道组织健康的功能。
81.2.2微生物组成分析
82.使用qiagen qiaamp dna stool mini kit(qiagen，德国)，从对照、kgmos低剂量和高剂量组处理的结肠粪便样本中提取细菌dna以分析kgmos对肠道菌群的影响。
83.使用通用引物338f(5'-actcctacgggaggcagcag-3')和806r(5'-ggactachvgggtwtctaat-3')扩增细菌16s rrna基因的v3-v4高变区。
84.扩增步骤如下：95℃条件下2分钟，然后在95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次，最后72℃延伸5分钟。扩增子在illumina miseq平台上进行纯化，定量和双端测序。所得原始fastq文件利用qiime(1.17版)进行解编和质量筛选。使用uqiime(7.1版，
http://drive5.com/uparse/)对操作分类单位(otu)进行了聚类(97％的相似性截止)。使用uchime鉴定并除去嵌合序列。使用ribosomal database project(rdp，http://rdp.cme.msu.edu/)结合silva(ssu123)16s rrna数据库按照70％序列同源性对otu进行分类学分类。
85.结果见图3，其中，a显示otu分类学分类的venn图，b显示pca分析结果，c显示门相对丰度分析结果，以及d显示属相对丰度分析结果。
86.venn图显示三组中共享了805个otu，而对照、低剂量和高剂量组中特有otu的数量分别为830、728和510(图3的a)。
87.pca分析结果表明，不同剂量的kgmos处理会导致整体菌群结构组成发生明显变化(图3的b)。
88.由图3的c可知，在门的水平上，优势门是拟杆菌、厚壁菌、变形杆菌(proteobacteria)和疣微菌(verrucomicrobia)。与对照组相比，kgmos显著降低了拟杆菌的丰度，且呈现剂量依赖性。然而，与对照组比较，低剂量和高剂量kgmos组均显著提高了厚壁菌的丰度，分别从18.6％增至28.0％和28.8％。此外，与对照组相比，kgmos剂量在10mg/kg时显著增加了变形杆菌和脱铁杆菌(deferribacteres)的丰度，而且该剂量组小鼠肠道中的疣微菌相对水平显著高于对照组和高剂量组(图3的c)。
89.由图3的d可知，在属水平上，与对照和kgmos10组相比，高剂量组显著增加了幽门螺杆菌、奥德杆菌和雷克氏菌的相对丰度。两个处理浓度均显著降低了不可培养拟杆菌属(uncultured_bacteroidales)，拟普雷沃菌属(alloprevotella)和副萨特氏菌属(parasutterella)细菌的相对水平，增加了脱硫弧菌属(desulfovibrio)、颤杆菌属(oscillibacter)和厌氧球菌属(anaerotruncus)细菌的丰度，但不影响别样杆菌属(alistipes)和理研菌科_rc9_gut_组(rikenellaceae_rc9_gut_group)细菌的丰度。另外，低剂量kgmos处理增加了阿卡曼氏菌属(akkermansia)细菌的相对比例。
90.文献报道显示，超低分子量的kgm寡糖(dp 2-6)可增加akkermansia,bacteroides,[prevotella]和bifidobacterium的相对丰度，但减少helicobacteraceae_unclassified和s24-7_unclassified的相对丰度(zheng,j.,et al.,j agric food chem 2018,66,5821-5831)。高分子量魔芋多糖可显著增加有益菌megasphaera elsdenii的相对丰度，但降低有害菌群alistipes，alloprevotella,bacteroides acidifaciens和parabacteroides goldsteinii的相对丰度(kang,y.,et al.,int j obes(lond)2019,43,1631-1643)。此外，有研究表明，喂食高分子量魔芋多糖可提高小鼠肠道bateroides和akkermansia的相对比例，但降低了firmicutes和mucispirillum的丰度(zhai,x.,et al.,j agric food chem 2018,66,12706-12718)。与文献报道相比，kgmos可同样增加肠道保护菌akkermansia的比例。与文献报道的超低分子量魔芋寡糖和魔芋多糖作用不同的是，kgmos处理可降低肠道微生物中拟杆菌的丰度。肠道拟杆菌参与了碳水化合物的代谢，进而增加可被宿主利用的膳食纤维中能量的释放。考虑到kgmos处理可显著降低小鼠体重，推测kgmos可通过降低肠道拟杆菌丰度减少宿主的能量获取，这表明kgmos具有作为抗肥胖药物的潜力。
[0091]
与文献报道的高分子量魔芋多糖功效不同的是，上述数据表明聚合度为dp18-24的kgmos显着增加了可产生丁酸的厚壁菌门firmicutes中细菌的丰度，例如
ruminococcaceae科。这将有助于肠道微生物将膳食纤维(包括kgmos自身)代谢产生丁酸。此外，kgmos可提高具有肠道保护作用(防止沙门氏菌感染)的细菌mucispirillum的相对丰度。
[0092]
上述数据表明，kgmos处理可降低spirochaetes门细菌如treponema_2属的丰度，treponema_2属是spirochaetaceae科中一类重要的病原体，可导致许多全球性流行的疾病。这表明kgmos可在降低宿主的病原体易感性方面发挥积极作用。
[0093]
综上，有别于超低分子量魔芋寡糖和高分子量魔芋多糖，聚合度为dp18-24的kgmos可进一步优化肠道菌群结构，增加有益菌群的丰度，并减少有害菌群的相对比例，从而显著提升肠道特别是结肠的健康状态。
[0094]
2.3组织病理学分析
[0095]
肠道粘液层具有屏蔽肠壁，防止有害成分和病原微生物的对机体损伤的功能。而粘液层主要是杯状细胞持续分泌的黏蛋白形成的。为评价kgmos对肠道功能的影响，结肠组织经固定后(每个组别n＝8)，利用乙醇脱水，包埋在石蜡中。组织切片(10μm)用阿尔辛蓝染色特异性识别黏蛋白颗粒，进而扫描拍照并记录杯状细胞数。选取相隔100μm的三个不同位置，对杯状细胞进行计数，并计算平均值。
[0096]
结果见图4的a-c，其中，a显示阿利新蓝染色结果，b显示粘蛋白颗粒面积定量分析结果，c显示杯状细胞数量定量分析结果。
[0097]
结肠粘液染色结果表明高剂量组的黏蛋白水平显著高于低剂量组和对照小鼠(图4的a和b)，表明高剂量kgmos可促进黏蛋白分泌，然而三个处理组的杯状细胞数相似(图4的c)。由于黏蛋白是结肠黏液的主要成分，其可隔离肠道内容物(包括食物、细菌、真菌、病毒等)和宿主肠道上皮细胞。对维持肠黏膜稳态起着重要的作用。我们的数据表明，kgmos处理可显著提高结肠黏蛋白含量，从而提高结肠的屏障作用，改善肠道健康状态。
[0098]
2.4实时定量聚合酶链式反应(real-time qpcr)检测kgmos对调控小鼠肠道粘液分泌的关键蛋白的转录水平的影响
[0099]
对照组及kgmos处理组的小鼠结肠组织块根据trizol试剂(美国invitrogen)说明书提取总rna后，用primescript rt master mix(日本takara)反转录为cdna，而后利用tb green
tm premix ex taq
tm
(日本takara)根据说明书在abi 7500(美国applied biosystems)上运行real-time qpcr检测。简要步骤如下：
[0100]
利用ncbi的primer-blast设计引物，如下表。
[0101]
[0102][0103]
反应混合物(体积为20μl)包含10μl的2
×
tb green premix ex taq，正向和反向引物各200nm，以及0.2μl rox参照染料ii。
[0104]
将pcr反应组分依次加入后，使用以下方案一式三份进行反应：95℃持续30s，然后是95℃持续3s和60℃持续30s，循环40次。
[0105]
在每次反应后进行解离曲线分析以确定靶标特异性，并利用7500system sds software对数据进行分析，采用相对阀值(threshold cycle，ct)法进行定量：δc
t
＝c
t target
–ct reference
，δδc
t
＝δc
t test sample
–
δc
t calibrator sample。测试样品(test sample)中相对于基准样品(calibrator sample)中目标(target)基因的mrna水平即为2-δδct
，其中β-肌动蛋白(β-actin)为内参(reference)，对照组则为calibrator sample。通过以上方法计算靶基因的相对表达水平，所有的数据都是目标基因mrna的相对表达量。
[0106]
结果见图4的d-e，其中，d显示粘蛋白生成相关基因定量结果，e显示肠道屏障功能相关基因定量结果。
[0107]
结果表明，高剂量kgmos处理显著提高了结肠粘蛋白基因muc2的转录，而其他粘蛋白编码基因muc3和muc5ac未发生显著改变。同时，两个给药组中，参与黏膜保护和修复的杯状细胞蛋白tff1和tff3的转录未发生显著改变(图4的d)。此外，kgmos的给药对结肠中紧密连接蛋白zo1、zo2、occludin和intection的转录没有影响(图4的e)。
[0108]
2.5对小鼠粪便中短链脂肪酸(scfa)的定量分析
[0109]
将粪便制备成悬液后，利用乙酸乙酯从结肠粪便样品中提取短链脂肪酸，然后使用连有玻璃毛细管柱和火焰电离检测器的气相色谱仪(日本岛津gc-2014)测定。
[0110]
结果见图5的a，其显示结肠粪便中短链脂肪酸含量的定量分析结果。结果显示kgmos处理增加了结肠中的丁酸水平且呈现了剂量依赖，而结肠组织中乙酸和丙酸水平均无明显变化。不同剂量的kgmos，对总短链脂肪酸水平无显著影响。kgm曾在体外试验中表明具有提高scfa的效果(connolly,m.,et al.,j funct foods 2010,2,219-224)，而本发明的kgmos则在动物体内可提高小鼠结肠中scfa丁酸含量。
[0111]
2.6kgmos对调控小鼠结肠中组蛋白乙酰化水平的影响
[0112]
包括丁酸在内的短链脂肪酸具有抑制组蛋白脱乙酰化酶的活性进而抑制组蛋白的脱乙酰化从而增强包括muc2在内的基因表达(hatayama,h.,et al.biochem bioph res co2007,356,599-603)。
[0113]
对收集的结肠样本，利用蛋白免疫印迹法测定kgmos处理后小鼠结肠中组蛋白乙酰化程度的变化。简单的说，结肠组织块用ripa裂解液(中国碧云天)冰上裂解并用bca试剂盒(美国invitrogen)测定蛋白浓度后和加入上样缓冲液煮沸变性后，经十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺电泳(sds-page)后，半干转(美国bio-rad)至硝酸纤维素膜(美国pall)，经脱脂奶
粉封闭，抗小鼠乙酰化组蛋白一抗(美国cst)孵育，洗涤，辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育洗涤，最后经底物ecl孵育显影。结果见图5的b-d，其中，b显示结肠组织中乙酰化组蛋白h3和h4以及组蛋白h3和h4蛋白免疫印迹结果，以及c和d显示结肠组织中乙酰化组蛋白h3和h4以及组蛋白h3和h4蛋白定量分析结果。
[0114]
结果表明，与对照组相比，kgmos的给药显著提高了乙酰化组蛋白h3和h4的水平(图5的b、c和d)。
[0115]
上述对kgmos的生物功能的研究从对肠道菌群的影响，对结肠粘蛋白基因的表达和对肠道短链脂肪酸含量的分析三方面研究了寡糖kgmos对肠道功能的影响。结果显示，kgmos寡糖提高了肠道菌群的比例，提高了益生菌的含量；此外kgmos通过提高结肠muc2粘蛋白基因的转录，促进粘蛋白的表达，粘蛋白分泌的增加可有效屏蔽肠壁，防止有害成分和病原微生物的进入；丁酸作为一种短链脂肪酸主要来自于肠道菌群，通过肠道进入体内后，可作用于其相应的受体，进而调节食欲、能量摄入和利用，从而产生对肥胖、高血糖等代谢异常的调节作用。这些结果显示kgmos能够通过调节肠道功能产生多方面的有益健康的活性。
[0116]
上述研究结果显示kgmos100处理后小鼠结肠长度显著增加。考虑到kgmos处理可剂量依赖性地增加结肠中丁酸的产量，而丁酸也是结肠上皮细胞的能量源之一，有报道称其可促进细胞生长。因此，可以认为摄取kgmos可以促进结肠组织的生长，从而有利于结肠的健康或肠道创伤组织的修复。