一种转基因非人动物的构建方法及其应用与流程

1.本技术涉及转基因非人动物的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种转基因非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。


背景技术：

2.胆固醇是哺乳动物细胞膜的重要结构成分，在细胞信号转导、胞内转运、类固醇激素和胆汁酸的合成中起着重要作用。动脉粥样硬化性心血管疾病是一种在发达国家中主要的致死疾病，而临床和动物研究表明，高水平的血浆胆固醇是动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素。因此，如何调节胆固醇代谢引起了越来越多研究者的关注。
3.膳食胆固醇的过量摄入是导致高胆固醇血症的常见原因，对胆固醇吸收机制的认识可望为高胆固醇血症的防治提供新的思路。目前认为，胞外游离胆固醇的吸收主要是由尼曼-匹克c1型样蛋白1(niemann-pick c1-like 1,npc1l1)介导的囊泡内吞(vesicular endocytosis)途径实现的。npc1l1蛋白是一种n-糖基化蛋白质，由1333个氨基酸和13个跨膜片段组成。它有一个可以选择性地结合胆固醇和氧固醇的典型的n端信号肽，以及一个带有对胆固醇内化必不可少的内吞信号序列的不太保守的c端细胞质尾部。这种蛋白质的表达模式是物种和组织特异性的。
4.npc1l1高表达于小肠吸收型上皮细胞的刷状缘和人及灵长类动物的肝细胞胆管面。npc1l1基因敲除小鼠对胆固醇的吸收率下降约70％，能够抵抗饮食诱导的高胆固醇血症；而其他脂类(如甘油三酯、磷脂)和植物性甾醇的吸收则不受影响。解析npc1l1囊泡形成、内吞、运输和循环等相关过程的细胞分子机制，对揭示胆固醇的吸收机制具有重要意义。
5.寻找npc1l1的共作用分子，是解析胆固醇吸收机制的有效策略。因包括大鼠在内的啮齿类动物肝脏组织几乎不表达npc1l1蛋白，迄今关于npc1l1介导胆固醇吸收机制的研究多以离体大鼠肝癌细胞为模型，导入人npc1l1基因进行的。
6.由于包括小鼠和大鼠在内的啮齿类动物的肝脏组织很少表达npc1l1蛋白，因此npc1l1在胆固醇吸收中的机制的体外研究主要通过在大鼠肝癌细胞系中过表达人npc1l1蛋白进行。虽然外源npc1l1基因在一定程度上可以模拟该蛋白的功能，但与表达内源npc1l1蛋白的细胞模型相比，由于表达水平不可控，在阐明信号通路方面存在明显局限性。
7.非专利文献《flotillins play an essential role in niemann-pick c1-like 1-mediated cholesterol uptake》利用npc1l1-egfp在大鼠肝癌细胞过表达的细胞模型，经免疫沉淀和质谱分析，发现共作用分子flotillin在介导形成富含胆固醇的npc1l1微区(microdomain)膜结构和胆固醇吸收中发挥重要作用。然而，目前尚无可体内示踪npc1l1的动物模型，用以进一步在体内探索npc1l1在胆固醇吸收中的作用机制。
8.在npc1l1蛋白的在体内功能研究方面，目前常用的小鼠模型为npc1l1基因全身敲除模型，或者在全身敲除的基础上利用villin-cre使肠道过表达人源npc1l1，或者利用载脂蛋白e启动子在肝脏过表达人源npc1l1，以探讨肠道或肝脏npc1l1蛋白在胆固醇代谢中
的作用。虽然敲入的外源npc1l1在标靶组织的定位与内源性蛋白的定位基本一致，但是也会发生脱靶现象。现有文献报道的关于npc1l1定位的研究，不管是在体内的小鼠组织还是离体的细胞模型，均利用荧光标记二抗杂交显影，这在放大荧光信号的同时也会产生杂信号。专利文献cn101580871a公开了使用报告基因并连接标签蛋白进行npc1l1蛋白的定位，但其将标签蛋白插入编码npc1l1蛋白的氨基酸之间，可能会影响npc1l1蛋白的表达及功能，并且该专利文献采用的也是体外示踪的方法。


技术实现要素：

9.本技术利用crispr/cas9基因组编辑技术，构建了肠道特异性表达npc1l1-flag-egfp融合蛋白的小鼠模型，在内源性npc1l1蛋白的c端分别标记上增强型绿色荧光蛋白egfp和flag蛋白标签。
10.本发明的第一方面，涉及一种转基因非人动物的构建方法，所述的构建方法包括在转基因非人动物的npc1l1基因的3’非编码区插入报告基因和/或编码标签蛋白的基因。
11.优选的，所述的报告基因包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶基因(cat)、人生长激素基因(hgh)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)、增强绿色荧光蛋白基因(egfp)、β-半乳糖苷酶基因(β-gal)、tdtomato红色荧光蛋白基因(tdtomato：番茄串联二聚体)、mcherry红色荧光蛋白基因(mcherry)或萤火虫荧光素酶基因。进一步优选的，所述的报告基因为egfp，所述的egfp蛋白的氨基酸序列如seq id no：31所示。
12.优选的，所述的标签蛋白包括但不限于myc标签蛋白、flag标签蛋白、his6标签蛋白、t7标签蛋白、v5标签蛋白、ha标签蛋白或gst标签蛋白。进一步优选的，所述的标签蛋白为flag标签蛋白，所述的flag标签蛋白的氨基酸序列如seq id no：21所示。
13.优选的，所述的非人动物表达npc1l1蛋白-标签蛋白-报告基因编码蛋白的融合蛋白。其中，npc1l1蛋白与标签蛋白之间、标签蛋白与报告基因编码蛋白之间可以直接连接或通过接头连接。所述的接头可以为现有技术中常规的柔性接头、刚性接头、可裂解接头或无意义氨基酸等等。优选为连接肽。优选的，所述的连接肽序列如seq id no：30所示。
14.进一步优选的，所述的非人动物表达npc1l1蛋白-连接肽-标签蛋白-连接肽-报告基因编码蛋白的融合蛋白。
15.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物表达npc1l1-flag-egfp(npc1l1-fg)蛋白或者npc1l1-连接肽-flag-连接肽-egfp蛋白。
16.优选的，所述的融合蛋白为肠道特异性表达蛋白。进一步优选的，所述的肠道为小肠，例如十二指肠、空肠或回肠。
17.优选的，插入位点为3’非编码区前(优选为紧邻3’非编码区之前)、3’非编码区后(优选为紧邻3’非编码区之后)或者3’非编码区核苷酸序列中任意相邻两个碱基之间。
18.进一步优选的，所述的插入位点位于npc1l1蛋白阅读框末端和3'utr之间。在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入位点位于npc1l1蛋白阅读框末端与终止密码子之间。
19.优选的，所述的构建方法包括使用sgrna和/或打靶载体构建转基因非人动物。
20.优选的，所述的sgrna3
′
末端包含pam序列，进一步优选的，所述的pam序列可以为agg、tgg或ggg。
21.进一步优选的，所述的sgrna靶位点序列如seq id no：13-20任一项所示，优选的，所述的sgrna序列如seq id no：5-12任一项所示。
22.更进一步优选的，所述的sgrna序列如seq id no：5所示，所述的sgrna靶位点序列如seq id no：13所示。
23.进一步优选的，所述的打靶载体包含5’臂、3’臂和供体dna序列，所述的供体dna序列包括编码标签蛋白的核苷酸序列和报告基因。其中，所述的编码标签蛋白的核苷酸序列与报告基因直接连接或通过编码接头的核苷酸序列连接。优选的，所述的接头可以为现有技术常见的柔性接头、刚性接头、可裂解接头或无意义氨基酸等等。
24.在本发明的一个具体实施方式中，所述的接头为连接肽。
25.在本发明的一个具体实施方式中，所述的供体dna序列为编码标签蛋白的核苷酸序列、报告基因以及编码连接肽的核苷酸序列(linker)。更优选的，所述的供体dna序列包括编码标签蛋白、编码连接肽和报告基因的cdna序列。
26.优选的，所述的供体dna序列从5
’‑3’
包含flag-egfp。
27.优选的，所述的供体dna序列从5
’‑3’
包含linker-flag-linker-egfp。
28.在本发明的一个具体实施方式中，进一步优选的，所述的供体dna序列如seq id no：29所示。
29.更进一步优选的，所述的5’臂如seq id no：3所示。
30.更进一步优选的，所述的3’臂如seq id no：28所示。
31.本发明所述的非人动物选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
32.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
33.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将打靶载体、靶向npc1l1基因的sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得转基因非人动物。
34.本发明的第二方面，涉及一种采用上述构建方法获得的转基因非人动物或其后代。
35.本发明的第三方面，涉及一种靶向npc1l1基因的sgrna，所述的sgrna靶位点序列如seq id no：13-20任一项所示。
36.优选的，所述的sgrna序列如seq id no：5-12任一项所示。
37.在本发明的一个具体实施方式中，所述的sgrna序列如seq id no：5所示，所述的sgrna靶位点序列如seq id no：13所示。
38.本发明的第四方面，涉及一种包含上述sgrna的载体。优选的，所述的载体包括t7启动子及sgrnascaffold的片段dna。
39.优选的，所述的载体为病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。
40.本发明的第五方面，涉及一种打靶载体，所述的打靶载体包含5’臂、3’臂和供体dna序列。所述的供体dna序列包括编码标签蛋白的核苷酸序列和报告基因。其中，所述的编码标签蛋白的核苷酸序列与报告基因直接连接或通过编码接头的核苷酸序列连接。优选
的，所述的接头可以为现有技术常见的柔性接头、刚性接头、可裂解接头或无意义氨基酸等等。
41.在本发明的一个具体实施方式中，所述的接头为连接肽。优选的，所述的连接肽序列如seq id no：30所示。
42.在本发明的一个具体实施方式中，所述的供体dna序列为编码标签蛋白的核苷酸序列、报告基因以及编码连接肽的核苷酸序列(linker)。
43.更优选的，所述的供体dna序列包括编码标签蛋白、编码连接肽和报告基因的cdna序列。
44.优选的，所述的供体dna序列从5
’‑3’
包含flag-egfp。
45.优选的，所述的供体dna序列从5
’‑3’
包含linker-flag-linker-egfp。
46.在本发明的一个具体实施方式中，进一步优选的，所述的供体dna序列如seq id no：29所示。
47.优选的，所述的报告基因包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶基因(cat)、人生长激素基因(hgh)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)、增强绿色荧光蛋白基因(egfp)、β-半乳糖苷酶基因(β-gal)、tdtomato红色荧光蛋白基因(tdtomato：番茄串联二聚体)、mcherry红色荧光蛋白基因(mcherry)和萤火虫荧光素酶基因。进一步优选的，所述的报告基因为egfp，所述的egfp蛋白的氨基酸序列如seq id no：31所示。
48.优选的，所述的标签蛋白包括但不限于myc标签蛋白、flag标签蛋白、his6标签蛋白、t7标签蛋白、v5标签蛋白、ha标签蛋白、gst标签蛋白、荧光素酶或β-gal酶。进一步优选的，所述的标签蛋白为flag标签蛋白，所述的flag标签蛋白的氨基酸序列如seq id no：21所示。
49.更进一步优选的，所述的5’臂如seq id no：3所示。
50.更进一步优选的，所述的3’臂如seq id no：28所示。
51.优选的，所述的打靶载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因可以为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(hsv-tk)、sacb、rpsl(stra)、tetar、phes、thya、cacy、gata-i或ccdb等。
52.在本发明的一个具体实施方式中，所述的打靶载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因可以为新霉素磷酸转移酶编码序列neo、潮霉素b磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶(hprt)、胸腺嘧啶激酶(tk)及嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)。
53.本发明的第六方面，涉及一种编码上述的sgrna的dna分子。
54.本发明的第七方面，涉及一种包含上述打靶载体，上述靶向npc1l1基因的sgrna或者上述的包含上述sgrna的载体的细胞。
55.本发明的第八方面，涉及一种包含上述打靶载体，上述靶向npc1l1基因的sgrna，上述的包含上述sgrna的载体，或者上述的细胞在npc1l1基因修饰中的应用。
56.本发明的第九方面，涉及一种动物疾病模型，所述的疾病模型来源于上述的非人动物或其后代、上述的构建方法获得的非人动物或其后代。优选的，所述的疾病包括胆固醇相关疾病。
57.本发明的第十方面，涉及上述的sgrna、上述的包含上述sgrna的载体、上述的dna分子、上述的打靶载体或上述的非人动物或其后代在制备动物的疾病模型中的应用，优选的，所述的疾病包括胆固醇相关疾病。
58.本发明的第十一方面，涉及上述的sgrna、上述的包含上述sgrna的载体、上述的dna分子、上述的打靶载体、上述的非人动物或其后代、上述构建方法获得的非人动物或其后代或上述的疾病模型在npc1l1蛋白体内示踪以及在制备治疗或预防胆固醇相关疾病的药物中的应用。
59.本发明的第十二方面，涉及一种细胞、组织或器官，其来源于上述的非人动物或其后代，或者疾病模型。
60.本发明的第十三方面，涉及一种融合蛋白，所述的融合蛋白从n端至c端依次包含非人动物npc1l1蛋白、flag标签蛋白和egfp蛋白。
61.优选的，非人动物npc1l1蛋白与flag标签蛋白之间、flag标签蛋白与egfp蛋白之间可以直接连接或通过接头连接。所述的接头可以为现有技术中常规的柔性接头、刚性接头、可裂解接头或无意义氨基酸等等。优选为连接肽。优选的，所述的连接肽序列如seq id no：30所示。
62.进一步优选的，所述的融合蛋白为npc1l1-flag-egfp蛋白或npc1l1-连接肽-flag-连接肽-egfp。
63.本发明的第十四方面，提供了一种编码上述融合蛋白的核酸。
64.本发明的第十五方面，涉及一种表达上述融合蛋白的细胞或者包含上述编码融合蛋白核酸的细胞。
65.本发明所述的胆固醇相关疾病包括但不限于高脂血症、动脉粥状硬化、冠心病、高血压、脑卒中、肥胖病、骨质疏松、老年痴呆、胆石症、低胆固醇血症或肿瘤。
66.本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
67.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度。
68.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述非人动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。
69.在一个特定实施方式中，所述非人动物是非人哺乳动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、
km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠。
70.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning alaboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.-in-chief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
71.本发明的技术效果在于应用crispr/cas9基因重组系统进行flag及egfp基因的敲入，构建npc1l1-flag-egfp非人动物模型，非人动物模型肠道特异性表达npc1l1-flag-egfp蛋白，可利用egfp标签蛋白镜下可视化追踪npc1l1蛋白的在非人动物体内运动轨迹，利用flag标签抗体富集捕获npc1l1蛋白及其潜在的共作用蛋白。本技术的技术方案不会改变内源性npc1l1蛋白的表达分布，因此可以有效避免npc1l1在标靶组织外表达而造成的实验假象。同时该模型可以方便地利用荧光显微镜直接观察内源性npc1l1蛋白的定位、内吞囊泡的形成及其在细胞内的转运，也可避免抗体杂交所致的杂信号的干扰。目前尚无可体内示踪npc1l1的动物模型，用以进一步在体探索npc1l1在胆固醇吸收中的作用机制。
72.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
73.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
74.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
75.图1：图1a为uca
tm-crispr/cas9荧光素酶法检测sgrna活性，图1b为凝胶电泳检测
sgrna的体外转录产物，其中，con为阴性对照，pc为阳性对照，m为marker；
76.图2：图2a为npc1l1基因3’端非翻译区插入flag-egfp基因的打靶载体构建示意图；5’probe和egfp probe所示为southern印迹检测所用探针结合位置；p1f/p1r、p2f/p2r和p3f/p3r所示为小鼠基因型鉴定用引物位置；e18：外显子18；e19：外显子19；la：左侧同源臂；ra：右侧同源臂；bsphi、bamhi为限制性内切酶；图2b：正确重组的打靶载体酶切鉴定结果；apai、hindiii、draiii、eco47iii、kpni为限制性内切酶；
77.图3：图3a：southern blot检测f1代小鼠的基因同源重组情况；各泳道上方所示为小鼠编号；5’probe:5’探针；egfp probe：egfp探针；图3b：pcr法鉴定小鼠基因型；knock-in allele：敲入等位基因；wild-type allele：野生型等位基因； / 为野生型小鼠；t/t为npc1l1-flag-egfp纯合小鼠；
78.图4：npc1l1-flag-egfp蛋白沿十二指肠-回肠轴的定位，hcd为高胆固醇饮食，比例尺：50μm；
79.图5：图5a为npc1l1-flag-egfp蛋白的组织分布，图5b为npc1l1-flag-egfp蛋白在小肠中的分布；
80.图6：npc1l1-flag-egfp敲入小鼠(t/t)在体重(a)、摄食量(b)、血糖(c)、血浆tc和tg(d&e)、肠道外观(f)、肠道tc和tg(g&h)、肝脏外观和重量(i&j)、肝脏tc和tg(k&l)方面显示出与野生型小鼠( / )相似的表型，其中，tc为总胆固醇，tg为甘油三酯，hcd为高胆固醇饮食，*p《0.05，**p《0.01；
81.图7：npc1l1-flag-egfp敲入小鼠(t/t)中胆固醇诱导的肠道内吞囊泡的可视化结果，其中，灌胃给药200μl墨汁5-30分钟结果(a)，200μl含有不同浓度胆固醇的玉米油15分钟结果(b)，200μl含有不同浓度胆固醇的玉米油20毫克/毫升胆固醇0-60分钟结果(c)；(d)和(e)：空肠刷状缘膜下方含有囊泡的npc1l1-flag-egfp的平均数量，拍摄多张图像(n＝8-10)并从每只小鼠(n＝2-3)计数，比例尺：10μm；
82.图8：伊折麦布(ezetimibe)抑制含有胆固醇的内吞囊泡的转运，其中，a：荧光可视化结果；b：含有囊泡的npc1l1-flag-egfp的平均数量。从每只小鼠(n＝4)拍摄和计数多张图像(n＝10)，比例尺：10μm；
83.图9：pcs-3g质粒图谱。
84.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
85.实施例1npc1l1-flag-egfp小鼠的构建
86.为了获得npc1l1-flag-egfp转基因小鼠，通过crispr/cas9系统在npc1l1基因上插入flag-egfp编码基因，获得表达npc1l1-flag-egfp蛋白的转基因小鼠。
87.首先引入crispr/cas系统进行基因编辑，该系统中靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率，根据crispr/cas9系统中sgrna切割原理，针对npc1l1基因终止密码子后的非翻译区，在crispr设计网站(http://www.sanger.ac.uk/htgt/wge/)上选择打靶分数高且脱靶率低的sgrna序列，3’端引入一个与靶向dna序列错配的碱基。sgrna序列和对应的靶向序列见表1。于sgrna序列两侧加上与pcs-3g骨架质粒互补
的同源臂序列，左侧同源臂序列为5
’‑
ctatttctagctctaaaac-3’(seq id no：1)，右侧同源臂序列为5
’‑
ggtgtttcgtcctttcca-3’(seq id no：2)。合成单链寡聚核苷酸片段，经退火后，通过gibson无缝连接的方式连入经xhoi和bamhi双酶切线性化的pcs-3g质粒，最终获得pcs-3g质粒图谱如图9所示，连接产物转化后选择经测序验证正确的克隆，采用uca
tm-crispr/cas9荧光素酶活性检测法检测cas9/sgrna的活性，其活性结果如图1a所示，sgrna1、sgrna3、sgrna5、sgrna8均有较强的剪切向导活性。综合考虑靶点位置和活性结果，选择sgrna1进行体外转录制备向导rna。在sgrna1对应的dna序列两侧分别加上与骨架质粒匹配的同源臂序列，其中5’端序列为5
’‑
ctatttctagctctaaaac-3’(seq id no：1)，3’端序列为5
’‑
tatagtgagtcgtatta-3’(seq id no：4)。合成的两条互补单链寡核苷酸片段经退火后，通过gibson无缝克隆方式组装至经xhoi和bamhi双酶切的质粒载体pt7-2g，质粒经测序正确后，使用t7 rna聚合酶和megashortscript
tm
t7转录试剂盒，体外转录sgrna和cas9 mrna，产物经megaclear
tm
转录纯化试剂盒纯化回收后，进行rna电泳检测。凝胶电泳显示sgrna1在65℃温育5min呈现出单一条带，提示成功制备可用于显微注射的rna(图1b)。
88.表1靶向npc1l1基因3’utr的sgrna序列及其靶向dna序列
[0089][0090][0091]
下一步，选择sgrna1的sgrna/cas9靶位点序列信息设计并构建打靶载体，在小鼠
npc1l1基因的终止密码子前面(小鼠npc1l1蛋白阅读框末端和3'utr之间)敲入flag-egfp编码序列的打靶策略见图2a，其中flag蛋白标签由dykddddk(seq id no：21)8个氨基酸组成，构建打靶载体所用的引物见表2。以基因组dna为模板，用引物la-f/rpcr扩增5’端同源臂(la)(seq id no：3)，产物大小为1388bp；以基因组dna为模板，用引物ra-f1/r的扩增产物为模板，再用引物ra-f2/r扩增得到3’端同源臂(ra)(seq id no：28)，产物大小为1294bp；引物fg-f/r扩增插入的flag-egfp基因序列(fg)即供体dna序列(seq id no：29)。扩增产物经aio
tm
法克隆进载体ptv-4g，经酶切和dna测序进行鉴定，打靶载体酶切鉴定结果如图2b所示，正确的克隆经apai酶切可得到6076bp和800bp片段；经hindiii和sphi双酶切可得到3842bp、2025bp和1009bp片段；经eco47iii和kpni双酶切可得到4611bp和2265bp片段。正确的克隆用于后续显微注射。
[0092]
将体外转录制备的sgrna、cas9 mrna和打靶载体质粒配制成混合物，通过显微注射法注射到c57bl/6n小鼠受精卵胞质中，然后移植到假孕受体母鼠内，母鼠生产获得的子鼠称为f0代小鼠。
[0093]
受精卵移植的假孕母鼠单笼饲养20d后，观察乳鼠出生情况。剪取长至1周后f0代小鼠尾尖组织1cm，溶于500μl基因组dna裂解液(0.2％sds、0.2mol/lnacl、5mmol/l edta、0.1mol/ltris-hcl[ph 8.0]、0.5mg/ml蛋白酶k)，提取基因组dna进行pcr鉴定其基因型。基因型鉴定引物设计位置参考图2a中p1f/p1r、p2f/p2r和p3f/p3r所示，反应体系为基因组dna1μl(50ng)，2x pcr mix12.5μl，10μmol/l上下游引物各1μl，ddh2o 9.5μl，总体积为25μl。采用touchdown pcr，反应条件为94℃，2min；98℃，10s，67～57℃，30s，68℃，2min，每个循环降低0.7℃，共15个循环；98℃，10s，57℃，30s，68℃，2min，共25个循环；再于68℃，10min。反应结束后取10μl pcr产物跑2％琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判断小鼠基因型并经测序确认。以p1f/p1r引物扩增得到2154bp产物且以p2f/p2r为引物扩增得到1971bp产物，为f0阳性小鼠。p1f序列为5
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acttctctgtagatggaacccag-3’(seq id no：22)，p1r序列为5
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gtagttgtactccagcttgtgcccc-3’(seq id no：23)；p2f序列为5
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cacgacttcttcaagtccgccatgc-3’(seq id no：24)，p2r序列为5
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cagccataagacccatgccag-3’(seq id no：25)；p3f序列为5
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cagggccagatgttaaccaagctct-3’(seq id no：26)，p3r序列为5
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gtaccactgccacacgttcccaag-3’(seq id no：27)。通过446个受精卵的显微注射和体内移植，出生子鼠44只，出生率9.86％；经pcr基因型鉴定，其中4只f0小鼠发生同源重组，阳性率9.1％。鉴定阳性的f0代小鼠和野生型c57bl/6n小鼠交配，获得f1代小鼠。
[0094]
f1代小鼠基因型鉴定方法同f0代小鼠，对pcr鉴定同源重组阳性的f1代小鼠，进一步进行基因组的southern印迹检测，探针结合位点见图2a中5’probe和egfp probe所示，限制性内切酶酶切位点见图2a中bsphi、bamhi所示。基因组dna经bsphi酶切后，以5’探针杂交显影，出现9.5kb条带者为野生型，4.7kb条带者为重组小鼠。基因组dna经bamhi酶切后，以egfp探针杂交，仅见6.7kb条带者为正确重组且无随机插入的阳性f1代小鼠。southern印迹结果显示编号1～4为阳性f1代小鼠，编号5～7为有随机插入的重组小鼠，编号8为野生型小鼠(图3a)。进一步鉴定f1代小鼠基因型的引物设计位点见图2a中p3f/p3r，以引物p3f/p3r扩增，野生型基因和flag-egfp敲入的等位基因型可分别得到550bp和1338bp的产物。如图3b所示，只有550bp产物的是野生型小鼠( / )；只有1338bp扩增产物的是表达npc1l1-flag-egfp融合蛋白(简称npc1l1-fg)的纯合小鼠(t/t)。
[0095]
实施例2npc1l1-flag-egfp小鼠模型的应用
[0096]
使小鼠吸入3.5％异氟醚麻醉后，迅速取出小肠组织，分成6等份(s1：十二指肠，s2-4：空肠，s5-6：回肠)。每段中间切取0.5cm，浸入4％中性多聚甲醛中，4℃固定过夜。用pbs洗涤后，将组织依次在15％和30％蔗糖溶液中脱水过夜，然后包埋在o.c.t.中并在液氮中冷冻。8μm厚的切片在55℃下孵育20min，然后用pbs中的10μg/ml dapi染色5min后进行封片。使用配备有数码相机(olympus bx53/dp80)的荧光显微镜捕获荧光图像。
[0097]
荧光显微镜下观察npc1l1-flag-egfp蛋白的分布。与 / 小鼠相比，t/t小鼠十二指肠、空肠和回肠的绒毛上皮细胞呈现明显的绿色荧光，清晰勾勒出绒毛刷状缘膜，隐窝内无明显绿色荧光(图4)。绿色荧光的分布与报道的npc1l1蛋白的分布一致，表明egfp基因敲入可以准确追踪内源性npc1l1蛋白的表达和分布。
[0098]
为了观察flag和egfp敲入是否影响npc1l1蛋白的表达，采集 / 和t/t小鼠的肝、肾、胃、胆囊和小肠等组织，通过western blot检测npc1l1-flag-egfp蛋白的表达。使用抗flag抗体，发现两只小鼠的肝、肾、胃和胆囊中npc1l1-flag-egfp蛋白水平均未检测到，而t/t小鼠小肠中约250kd的蛋白含量明显(图5a)，并且在s3-5中更丰富(图5b)。这表明npc1l1-flag-egfp融合蛋白在t/t小鼠小肠的所有节段均有表达，且蛋白丰度在空肠和回肠中最高，这与先前报道的npc1l1分布特征一致。
[0099]
用1.25％的高胆固醇饮食(d12108c，research diets，new brunswick，nj)喂养小鼠3周。收集血浆并用丙酮从肝脏和空肠中提取脂质，用于比色测定总胆固醇和甘油三酯的浓度。在高胆固醇饮食下，野生型和纯合子小鼠的体重、食物摄入量、血糖水平没有差异(图6a-c)。t/t小鼠小肠和肝脏的形态也与 / 小鼠相似(图6f，i-j)。
[0100]
在高胆固醇饮食(hcd)3周的条件下，血浆总胆固醇水平与普通饮食相比显着增加，但两种基因型之间没有差异(图6c)。虽然 / 和t/t小鼠的血浆甘油三酯水平相似，但与食物控制相比没有显着变化(图6e)。此外，在两种小鼠品系之间没有观察到肠道和肝脏总胆固醇和甘油三酯水平的差异(图6g-h，k-l)。这些结果强烈表明flag-egfp蛋白的c端对不影响内源性npc1l1蛋白的活性。
[0101]
为了确定egfp标签是否可用于追踪npc1l1内化，需要进一步研究了胆固醇诱导的npc1l1阳性囊泡运输。为此，首先确定合适的肠段和样本收集时间，以进行囊泡可视化。如图7a所示，通过灌胃给予200μl墨水后，墨水最先分别在5分钟时达到s4，在15分钟时达到s5，在30分钟时达到s6。因此，在禁食过夜后，t/t小鼠通过口服管饲法给予200μl含有4-40mg/ml胆固醇的玉米油15分钟或40mg/ml胆固醇0-60分钟。在指定的时间，收集空肠(s4)组织以制备冷冻切片。dapi染色后，直接在荧光显微镜下观察npc1l1阳性囊泡。如图7c所示，早在40毫克/毫升胆固醇喂养后5分钟就可以看到刷状缘膜下方的npc1l1阳性囊泡。囊泡的数量在15分钟时增加到峰值，并在60分钟时大大减少(图7e)。正如预期的那样，囊泡的形成随着胆固醇剂量的增加而增加，并在20mg/ml的浓度下达到最丰富的信号(图7d)。然而，在40mg/ml的浓度下可以看到更大的囊泡(图5b)。
[0102]
我们通过使用npc1l1特异性抑制剂伊折麦布(ezetimibe)进一步确定了囊泡是否是npc1l1特异性的。发现通过胃管饲法对10mg/kg ezetimibe预处理5天，在胆固醇管饲30分钟后显着降低了胆固醇诱导的刷状缘膜下囊泡的形成(图8)。
[0103]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中
的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0104]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0105]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。