一种miRNA模拟物及其应用的制作方法

一种mirna模拟物及其应用
技术领域
1.本发明属于再生医学技术领域，特别涉及一种mirna模拟物及其应用。


背景技术：

2.角膜上皮位于眼球的最前方，直接暴露于外界环境中，眼外伤、细菌或病毒感染都可引起角膜上皮缺损，上皮缺损导致视力下降甚至引起角膜云翳形成。因此，角膜上皮是我们需要着重保护的组织。正常情况下角膜上皮缺损经过潜伏期、迟滞期、迁移期、增殖期和再上皮化期可在7-14天愈合，但是复发性角膜糜烂可发生在外伤或者某些营养不良，易导致基底膜的破坏，会出现难以愈合和反复性上皮缺损现象，甚至会引起角膜瘢痕形成，影响正常视力。这主要是周围上皮细胞分泌炎症因子和活化因子致使基质细胞纤维化产生。目前对于角膜上皮缺损治疗的方法有口服四环素、使用局部类固醇或自体血清滴眼液以及羊膜修补或移植。虽然这些药物治疗表现出了一定的效果，但是具有耐受性和副作用，治疗成功率低等问题。着重要说的是羊膜，它在临床上表现出了优异的治疗效果，但是治疗机理未知，易携带病毒等问题为临床治疗带来了潜在的风险。有大量的文献曾研究过角膜上皮损伤愈合，通过许多不同种类的实验动物以及不同的损伤方法获得了巨大的进展，提高了患者的生活质量，但仍然会发生许多由于角膜瘢痕的形成而导致失明和生活质量下降的病例。所以我们还是需要更加有效的药物或者其他治疗方法来挽救悲剧的发生。
3.mirna是一组内源性非蛋白编码rna，长度约为20-22个核苷酸，其主要功能是参与基因转录后的调控。mirna可与其信使rna(massage rna，mrna)的3’端非翻译区(universal training reactor，utr)结合，引起靶mrna在蛋白水平上的表达抑制(不完全互补匹配)或靶mrna的降解(完全互补匹配)，通过负向调节mrna转录后抑制调节多种信号通路并影响基因表达。目前尚未见有mirna24-3p模拟物在制备促进角膜上皮创伤愈合药物中的应用。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种mirna模拟物。
5.本发明的第二个目的在于提供上述mirna模拟物的应用。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.一种mirna模拟物，为mirna 24-3p模拟物，其核苷酸序列为tggctcagttcagcaggaacag(seq id no:1)。
8.合成所述mirna模拟物的正向引物的核苷酸序列为：uggcucaguucagcaggaacag(seq id no:2)，合成所述mirna模拟物的反向引物的核苷酸序列为：cuguuccugcugaacugagcca(seq id no:3)。
9.所述的mirna模拟物在制备促进创伤愈合药物中的应用。
10.所述的创伤优选为角膜上皮创伤。
11.mirna模拟物通过上调cdc42、frs2、ctgf、egfr和mmp9基因的表达，促进角膜上皮细胞迁移，进而达到促进创伤愈合的效果。
12.一种促进创伤愈合的药物，包含上述作为活性成分的mirna模拟物，所述mirna模拟物的核苷酸序列如seq id no:1所示。合成所述mirna模拟物的正向引物的核苷酸序列为：uggcucaguucagcaggaacag(seq id no:2)，合成所述mirna模拟物的反向引物的核苷酸序列为：cuguuccugcugaacugagcca(seq id no:3)。
13.利用mirna模拟物制备促进创伤愈合的药物的方法，包括如下步骤：将mirna24-3p模拟物与外泌体和缓冲液混合，得到混合液，经转染，离心，即得促进创伤愈合的药物。
14.所述的利用mirna模拟物制备促进创伤愈合的药物的方法中，mirna模拟物在混合液中的浓度优选为0.5～0.7μmol/l；更优选为0.625μmol/l。
15.所述的利用mirna模拟物制备促进创伤愈合的药物的方法中，外泌体在混合液中的浓度优选为0.05～0.07g/l；更优选为0.0625g/l。
16.所述的外泌体优选为脂肪间充质干细胞来源的外泌体。
17.所述的缓冲液优选为pbs缓冲液；更优选为ph为7.4的缓冲液。
18.所述的转染优选通过电穿孔方法实现转染的目的。
19.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
20.(1)本发明提供了一种mirna模拟物，其能够上调细胞迁移相关基因(cdc42、frs2、ctgf、egfr和mmp9)的表达，促进角膜上皮细胞迁移，进而加速上皮创伤愈合，是一种较好的适用于角膜上皮缺损修复的药物，为临床药物转化提供了新的方向。
21.(2)本发明的mirna 24-3p模拟物在体外对角膜上皮细胞迁移具有明显的促使作用，在体内同样可以加速角膜再上皮化，在角膜上皮创伤愈合中具有极高的商品化潜能和转化应用前景。
附图说明
22.图1为脂肪间充质干细胞的流失图。
23.图2为实施例1得到的脂肪间充质干细胞来源的外泌体的透射电镜图。
24.图3为转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞的迁移结果图。
25.图4为转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞的趋化性结果图。
26.图5为转染mirna24-3p模拟物调节兔角膜上皮细胞迁移相关基因表达结果图。
27.图6为不同时间内工程化外泌体和脂肪间充质干细胞来源的外泌体对角膜上皮的愈合效果图。
具体实施方式
28.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
29.实施例1：
30.(1)选用新西兰大白兔(购于广东省医学实验动物中心)腹股沟皮下脂肪组织来源的脂肪间充质干细胞进行分离培养与传代
31.a)新西兰大白兔使用安乐法处死，无菌状态下取兔腹股沟皮下脂肪组织，用4℃预冷的含有双抗(青霉素-链霉素，10000u/ml)pbs缓冲液(ph7.4，购于gibco公司，下同；)反复冲洗3次；
32.b)使用眼科剪和眼科镊清除筋膜和血管，预冷的pbs缓冲液冲洗3次，取其中的脂肪球轻柔地转入至无菌平皿中，再向其中加入2倍体积溶解在pbs缓冲液中的1％ⅱ型胶原酶(购于美国sigma公司)溶液，并放置在37℃培养箱中，每隔10min取出平皿轻轻摇晃，总消化时间为120min；
33.c)将平皿中的消化内容物转移至50ml离心管内，紧接着等体积加入含10％fbs的dmem/f12培养基(购于美国gibco公司)，转速为1000r/min离心5min，弃上层脂肪，使用100目的细胞过滤筛收集下层悬液，并再次使用转速为1500r/min离心10min，收集下层沉淀物；
34.d)将所述的下层沉淀物加入新鲜的含10％fbs的dmem/f12培养基重悬，接种于25cm2的培养瓶中，置于37℃及5％co2恒温培养箱中培养，即得脂肪间充质干细胞；
35.e)通过细胞流式仪对上面获得的脂肪间充质干细胞进行鉴定，判断脂肪间充质干细胞的质量，如图1。
36.(2)脂肪间充质干细胞来源外泌体的提取制备
37.a)待步骤(1)得到的脂肪间充质干细胞长满细胞培养瓶50％面积时，换含10％无外泌体fbs的dmem/f12培养基培养，每隔2天收集脂肪间充质干细胞上清液；
38.b)将所述240ml上清液于4℃，300
×
g，10min离心去除细胞；4℃，3000
×
g，10min离心去除死细胞；4℃，10000
×
g，30min离心去除细胞碎片；4℃，100000
×
g，70min超速离心得到外泌体沉淀；加入6ml pbs缓冲液再次4℃，100000
×
g，70min超速离心，弃上清，加入100μl pbs缓冲液重悬后即可得到纯化后的脂肪间充质干细胞来源的外泌体(透射电镜结果如图2所示)，最终脂肪间充质干细胞来源的外泌体的浓度在300～500μg/ml均可；本实施例脂肪间充质干细胞来源的外泌体的浓度为400μg/ml。
39.实施例2：
40.将提取的脂肪间充质干细胞来源的外泌体、兔角膜上皮细胞和兔脂肪间充质干细胞进行二代测序(测序由广州华银康医疗集团股份有限公司完成)。然后通过所选mirna表达且脂肪间充质干细胞高表达的原则对数据进行分析并筛选，最终筛选1种mirna并合成双链mirna模拟物(即：mirna24-3p模拟物)进行功能性实验；其中，
41.mirna 24-3p模拟物的核苷酸序列为：tggctcagttcagcaggaacag(seq id no:1)；
42.mirna 24-3p模拟物：
43.正向引物：uggcucaguucagcaggaacag(seq id no:2)；
44.反向引物：cuguuccugcugaacugagcca(seq id no:3)。
45.实施例3：
46.按照lipofectamine
tm rnaimax转染试剂(购于invitrogen公司)说明书对兔角膜上皮细胞进行转染，即：
①
接种0.25-1
×
106个兔角膜上皮细胞(购买于北纳生物)至6孔板中，孵育4小时；
②
取9μl的lipofectamine
tm rnaimax转染试剂加入到150μl的培养基(购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司)中混合均匀，得到混合溶液1；
③
同时取30pmol实施例2的mirna 24-3p模拟物加入150μl的培养基中混合均匀，得到混合溶液2；
④
将步骤
②
得到的混合溶液1和步骤
③
得到的混合溶液2按体积比1:1的比例充分混合，在室温下静置孵育5分钟，得到混合溶液3；
⑤
取250μl步骤
④
的混合溶液3加入至步骤
①
的6孔板中，然后添加1ml的完全培养基在培养箱中5％co237℃环境下孵育1-3天，得到
转染mirna24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞(mirna 24-3p组)。以mirna模拟物阴性对照(即mirna nc，由广州艾基生物技术有限公司提供)替代mirna24-3p模拟物进行上述试验得到阴性对照组兔角膜上皮细胞；
47.mirna模拟物阴性对照的正向引物为：
48.ucacaaccuccuagaaagaguaga；
49.mirna模拟物阴性对照的反向引物为：
50.ucuacucuuucuaggagguuguga。
51.以pbs缓冲液为溶剂，将1
×
106个阴性对照组兔角膜上皮细胞和转染mirna24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞分别制成阴性对照组兔角膜上皮细胞悬液和转染mirna24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞悬液，将阴性对照组兔角膜上皮细胞悬液和转染mirna24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞悬液按3
×
105个细胞/孔分别接种于2插件中(来源德国的ibidi公司)，每孔加入完全培养基70μl，在二氧化碳培养箱中孵育24小时，轻轻去掉2插件，然后使用pbs缓冲液轻轻冲洗，目的是洗掉多余的细胞和死细胞。在去掉2插件后，换为无血清培养基。在0天、1天、3天、5天时间点分别观察兔角膜上皮细胞迁移情况并拍照。
52.结果如图3所示，从图3可以看出，相比阴性对照组兔角膜上皮细胞，转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞迁移更明显；说明mirna24-3p模拟物可以显著的促使兔角膜上皮细胞迁移，加速角膜上皮创伤闭合。在第五天时，使用mirna 24-3p模拟物处理的角膜上皮细胞创伤闭合度可以达到50％左右。
53.实施例4：
54.将实施例3的阴性对照组兔角膜上皮细胞和转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞用0.25％的胰酶消化，并用完全培养基终止消化，离心后用无血清的培养基进行重悬并计数，得到转染mirna模拟物阴性对照(即mirna nc)的兔角膜上皮细胞悬液和转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞悬液。在transwell小室中分别加入含有2
×
104个转染mirna模拟物阴性对照(即mirna nc)的兔角膜上皮细胞悬液和转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞悬液；并分别加入200μl的无血清培养基；在24孔板中加入完全培养基500μl。将小室轻轻放入24孔板中，避免产生气泡。在二氧化碳培养箱中培养12小时，用pbs缓冲液清洗小室内外，确保无血清残留。将小室放入盛有0.1％结晶紫的24孔板中，在室温下染色30分钟。拿出小室，小心的使用棉签擦掉小室内的兔角膜上皮细胞，然后使用pbs缓冲液冲洗多次。将小室放在盖玻片上在显微镜下进行观察并拍照，然后使用imagej进行计数并分析，最终得到细胞趋化图。
55.结果如图4所示，从图4可以看出转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞穿过小室的数量明显比转染mirna模拟物阴性对照(即mirna nc)的兔角膜上皮细胞多，这说明转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞的趋化性更好。
56.实施例5：
57.将实施例3转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞置于完全培养基在5％co2的细胞培养箱中37℃孵育1天。吸弃上清液，将收集的转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞通过rna提取试剂盒(hipure total rna micro kit，购于北京美基美生物科技有限公司)提取总rna，使用nanodrop测定提取rna的浓度及纯度。待rna浓度和纯度达标后，使用逆转录试剂盒(primescripttm rt reagent kit，购于宝日医生物技术(北京)有限公司)将
所提取的mrna逆转录为cdna。逆转录仪程序设定如下：体系1：42℃2min
→
4℃保温；体系2：37℃15min
→
85℃5s
→
4℃保温。按pcr试剂盒(all-in-onetm qpcr mix，购于广州复能基因有限公司)配制好反应体系，将pcr板放入pcr仪开始反应，时长约1.5h。pcr扩增反应中所使用的内参基因为β-actin基因。同时以正常兔角膜上皮细胞为空白对照(ctr)组，以实施例3得到的阴性对照组兔角膜上皮细胞替代上述转染mirna 24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞进行试验(即mirna-nc组)。pcr扩增反应中所用到的引物如表1所示。
58.表1：
[0059][0060][0061]
反应结束后，使用与仪器配套的lightcycler 96sw 1.1软件处理数据。通过2
‑△△
ct方法计算。
[0062]
通过对所得数据进行处理得到图5，即为转染mirna24-3p模拟物的兔角膜上皮细胞迁移相关基因(cdc42、frs2、ctgf、egfr和mmp9)表达图。
[0063]
从图5可以看出，相比空白对照组(正常兔角膜上皮细胞)或mirna
–
nc组，mirna 24-3p模拟物可上调兔角膜上皮细胞相关基因(cdc42、frs2、ctgf、egfr和mmp9基因)的表达，从而加速角膜上皮快速愈合。
[0064]
实施例6：
[0065]
为了让合成的mirna24-3p模拟物顺利进入目的细胞，本实施例使用电穿孔的方式将mirna24-3p模拟物转入实施例1制备的脂肪间充质干细胞来源的外泌体中，然后作用于动物实验。具体为：将50μl脂肪间充质干细胞来源的外泌体(400μg/ml)加入无菌2ml离心管中，然后将0.2nmol使用edpc水(购于美国invitrogen公司)稀释的mirna24-3p模拟物(100μm)加入上部离心管中混合均匀；向上部离心管中添加pbs缓冲液，使总体积为320μl。静置10分钟后，使用neontm转染装置(invitrogen，mpk5000，美国)进行电穿孔。电转条件为：0.5kv，10ms，5次脉冲。电穿孔后的混合物用超速离心机(beckman，optima xpn-100，美国)离心除掉游离的mirna24-3p模拟物，即获得的工程化外泌体(exos-miran 24-3p)。用pbs缓冲液再重悬，使工程化外泌体的浓度为20μg/ml。
[0066]
将新西兰大白兔(单只体重：2.2-2.7公斤)随机分为3组，分别为pbs缓冲液组(3
只)、脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exos)组(3只)和工程化外泌体(exos-miran 24-3p)组(3只)。兔角膜上皮创伤模型具体步骤如下：
[0067]
注射0.4ml速眠新ⅱ注射液(吉林省敦化市圣达动物药品有限公司)，经颈部皮下注射诱导麻醉；然后使用1ml注射器抽取2％现用现配的戊巴比妥溶液，经耳缘静脉缓慢注射1ml；注意观察兔子呼吸反应，5分钟后肌肉注射1ml 2％戊巴比妥溶液，注射后轻按摩局部肌肉组织，促进药物的吸收，此麻醉药剂量只适用2.2-2.7公斤的新西兰大白兔；
[0068]
全身麻醉后，置于手术台上，局部使用盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，聚维酮碘消毒眼周毛发及眼睑，生理盐水冲洗结膜囊，消毒铺无菌巾，选取合适开睑器开睑；
[0069]
使用直径10mm的角膜环钻在术眼角膜上做出标记，然后在手术显微镜下使用刮刀刮去角膜上皮细胞层。在结膜下分别注射pbs缓冲液(200μl)，脂肪间充质干细胞来源的外泌体悬液(200μl，20μg/ml)和工程化外泌体悬液(200μl，20μg/ml)；其中，脂肪间充质干细胞来源的外泌体悬液和工程化外泌体悬液的溶剂均为pbs缓冲液。
[0070]
在7天内使用荧光素钠染色对角膜上皮闭合进行跟踪并拍照。
[0071]
结果如图6所示，结果表明在第2天时，脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exos)组和工程化外泌体(exos-miran 24-3p)组对角膜上皮愈合都具有较好的作用，但工程化外泌体效果更佳，这主要是因为miran 24-3p模拟物可以促使角膜上皮细胞迁移，从而加速角膜上皮的愈合。在第3天时，工程化外泌体(exos-miran 24-3p)组已经完全再上皮化，而脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exos)组仍然具有很小范围的未再上皮化。相比pbs缓冲液组，在7天内，脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exos)组和工程化外泌体(exos-miran24-3p)组始终具有一个优良的效果。
[0072]
本发明实施例1制备得到的脂肪间充质干细胞来源的外泌体浓度较为可控，mirna24-3p模拟物可通过转染试剂进入兔角膜上皮细胞，然后调控兔角膜上皮细胞相关基因(cdc42、frs2、ctgf、egfr和mmp9)的表达，从而加速角膜上皮细胞快速迁移。在体内动物实验中，mirna24-3p模拟物通过脂肪间充质干细胞来源的外泌体的包载进入目的细胞(兔角膜上皮细胞)，作用于兔角膜上皮细胞，促使角膜上皮细胞的迁移，从而达到促使角膜上皮愈合的目的。结合实施例6的pbs缓冲液组和脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exos)组的实验结果，说明筛选的mirna 24-3p模拟物不仅在体外对角膜上皮细胞迁移具有明显的促使作用，而且在体内同样可以加速角膜再上皮化。本发明首次筛选了一种可加速角膜上皮细胞迁移的mirna模拟物(miran 24-3p模拟物)，在角膜上皮创伤愈合中具有极高的商品化潜能和转化应用前景。
[0073]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。