一种冬瓜果面蜡粉基因的CAPS分子标记及其应用的制作方法

一种冬瓜果面蜡粉基因的caps分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种冬瓜果面蜡粉基因的caps分子标记及其应用。


背景技术：

2.冬瓜(benincasa hispida cogn.)为葫芦科冬瓜属一年生草本植物，原产于我国南方和印度，全国各地均有栽培。冬瓜脆爽多汁，营养成分丰富，耐贮藏运输，耐热性强，是适于现代化农产品加工的良好原料，同时还具有利尿、清热、化痰、解渴等功效，在医药领域中也有着广泛的用途。
3.根据老熟冬瓜果面蜡粉的有无，可将冬瓜分为粉皮冬瓜和青皮冬瓜两种表型。不同地区对冬瓜类型的喜好不同，其中华南地区以青皮冬瓜为主，四川、江西、湖南等省份则以粉皮冬瓜为主。此外，冬瓜果面蜡粉在果实耐储性和抗病性等方面也发挥着重要的作用。可见，冬瓜果面蜡粉是冬瓜育种过程中的重要性状之一。
4.然而，由于果面蜡粉是冬瓜果实成熟期才显现的外观性状，因此在传统育种过程中，需要等到果实成熟期才能进行针对性选育，这种育种方法不仅耗时耗力，且效率低下。因而，有必要开发与冬瓜蜡粉性状紧密连锁的分子标记，以便于直接在育苗期进行大规模筛选，从而缩小育种群体，提高育种效率。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种冬瓜果面蜡粉基因的caps分子标记，可用于冬瓜果面蜡粉表型的鉴定。
6.本发明的第二个目的是提供用于扩增上述caps分子标记的引物，该引物能产生有蜡粉材料特异性标记和无蜡粉材料特异性标记(共显性标记)，重复性好，特异性强。
7.本发明的第三个目的是提供上述的caps分子标记，或者上述的caps分子标记引物在冬瓜果面蜡粉表型选育中的应用。
8.本发明的第四个目的是提供一种冬瓜果面蜡粉有无的鉴定方法。该方法具有准确、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便等优势。
9.本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
10.一种冬瓜果面蜡粉基因的caps分子标记，所述caps分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，seq id no.1所示序列自5’端起第1370位碱基为snp位点，所述snp位点为g或a。
11.本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
12.用于扩增上述caps分子标记的引物，所述引物包括上游引物和下游引物。
13.优选地，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
14.本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：
15.上述的caps分子标记，或者上述的caps分子标记引物在冬瓜果面蜡粉表型选育中的应用。
16.本发明的上述第四个目的是通过以下技术方案来实现的：
17.一种冬瓜果面蜡粉有无的鉴定方法，包括以下步骤：
18.s1、以冬瓜基因组dna为模板，采用权利要求2或3的caps分子标记引物进行pcr扩增，对pcr扩增产物酶切后进行电泳分析：
19.s2、当仅产生140bp、305bp的果面无蜡粉亲本特异性标记wax
140 305
时，该冬瓜为果面无蜡粉冬瓜；当仅产生445bp的果面有蜡粉亲本特异性标记wax
445
时，该冬瓜为果面有蜡粉冬瓜；当同时产生445bp的果面有蜡粉亲本特异性标记wax
445
和140bp、305bp的果面无蜡粉籽亲本特异性标记wax
140 305
时，该冬瓜为果面有蜡粉冬瓜。
20.本发明通过对电泳结果进行分析，该用于扩增所述caps分子标记的引物对能产生445bp的果面有蜡粉亲本p131特异性标记wax
445
和140bp、305bp的无蜡粉亲本w3特异性标记wax
140 305
。由于该标记为共显性标记，同时具有双亲本特异性条带的单株为杂合体。
21.因此，当caps分子标记引物对仅产生445bp的果面有蜡粉亲本特异性标记wax
445
时，该冬瓜为果面有蜡粉冬瓜；当该分子标记引物对能同时产生445bp的果面有蜡粉亲本特异性标记wax
445
和140bp、305bp的果面无蜡粉亲本特异性标记wax
140 305
时，该冬瓜为果面有蜡粉冬瓜；当该分子标记引物对仅产生140bp、305bp的单边籽亲本特异性标记wax
140 305
时，该冬瓜为果面无蜡粉冬瓜。
22.优选地，pcr扩增时，pcr反应体系包括1μl基因组dna、2μl含mg
2
的10
×
pcrbuffer、1.5μl dntps、1μl上游引物、1μl下游引物、1u taq酶，添加ddh2o至20μl。
23.进一步地，pcr反应体系包括1μl浓度为200ng
·
μl-1
的基因组dna、2μl含mg
2
的10
×
pcrbuffer、1.5μl浓度为2.5mm的dntps、1μl浓度为10mm的上游引物waxs4-caps1-f(seq id no.2)、1μl浓度为10mm的下游引物waxs4-caps1-r(seq id no.3)、1u taq酶、添加ddh2o至20μl。
24.优选地，pcr扩增时，扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。
25.优选地，所述酶切为采用限制性内切酶ava ii进行酶切。
26.优选地，酶切体系包括10μl pcr扩增产物，1μl10
×
buffer，1uava ii限制性内切酶，添加ddh2o至20μl；酶切条件为37℃酶切3小时。
27.优选地，所述冬瓜基因组dna为冬瓜叶片的基因组dna。
28.优选地，所述电泳为采用琼脂糖凝胶进行电泳，所述琼脂糖凝胶为质量百分含量为3％的琼脂糖凝胶。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
30.本发明公开了一种冬瓜果面蜡粉基因的caps分子标记，该分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，seq id no.1所示序列自5’端起第1370位碱基是snp位点，其碱基为g或a。同时，本发明还公开了用于扩增上述caps分子标记的引物，该caps分子标记引物能同时产生果面有蜡粉材料的特异性标记和果面无蜡粉材料的特异性标记，且重复性好，特异性强。此外，将本发明开发的冬瓜果面蜡粉基因caps分子标记用于鉴定冬瓜的果面蜡粉表型，尤其是用于苗期快速鉴定冬瓜的果面蜡粉表型，具有准确、快速、成本低、鉴定周期短，
操作简便等优点，能够辅助冬瓜新品种选育，具有广阔的应用前景。
附图说明
31.图1为冬瓜果面蜡粉基因caps标记的pcr扩增产物酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱(m：100bp ladder；p131：果面有蜡粉亲本，w3：果面无蜡粉亲本，f1：p131与w3的杂交一代)；
32.图2为冬瓜果面蜡粉基因casp分子标记在第88个p131与w3构建的f2家系单株中的扩增结果(m为dna marker，泳道1为p131，泳道2为w3，泳道3为f1，泳道4-99为88个f2单株)；
33.图3为冬瓜果面蜡粉基因casp分子标记在不同生态型冬瓜资源种质中的扩增结果(m为dna marker，泳道1-30为不同生态型的冬瓜单株)。
具体实施方式
34.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
35.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
36.实施例1冬瓜果面蜡粉基因casp分子标记的开发及扩增
37.本实施例提供的冬瓜果面蜡粉基因的casp分子标记以及用于扩增caps分子标记的引物对的开发及验证过程如下：
38.(1)材料(广东省农业科学院蔬菜研究所提供)：亲本的来源：p131：果面有蜡粉亲本，w3：果面无蜡粉亲本。
39.(2)试验方法：以果面有蜡粉的冬瓜p131与果面无蜡粉的冬瓜w3为亲本构建6世代分离群体，研究冬瓜籽型的遗传规律，结果显示冬瓜果面有蜡粉与无蜡粉为一对核基因控制的质量性状，有蜡粉对无蜡粉为显性。随后，利用f2群体通过极端性状混池重测序(bsa-seq)结合基于遗传图谱的基因定位方法，将冬瓜果面蜡粉基因定位在冬瓜第9号染色体46,164,000-46,668,969的物理区间范围内。
40.综合比较定位区间，获得一个候选基因waxs4基因，将其命名为bhwaxs4。通过比较果面有蜡粉材料与果面无蜡粉材料基因组中的bhyabby4序列，发现在两者间存在1个snp(单核苷酸的多态性)的改变。bhwaxs4基因的核苷酸序列(seq id no.1)如下：
41.ttatgatgaaggtctttcgttctctccacatcaaatagttaaacagattcaataataatgttaggataaggtcgaaggttcaaagttcgacatacaaaaaataaggtcgacaaaattcaatctacttaaaaaaaaaacaacaatatttttacaaataatttgaaaacaacaatatttttctaaataattcctaaaagaacaatatccttttaattttctcttttaaaactgtataaaaaaaatccataaaatggacttttttcttaacagtttgtgtgggatgtcgaaatttcaacctgatttacttatccatagaaatcaacattatttcataaaagaacattataatataatattttaatggtttcaaagatgttcatctccttcatcttccccgccctctcacattaaatattcagacaccaaaatctcaactaaaatggcggttcaccattcaacactcgcaccaaactccgccgcacccaccgccgccggaatccaaatggacggcggcgaattccacagactcgccaaggtatggacaatcgccattgcattgatttcttactcatactatattgcttccaaaattcataaaggactcccaaggctcatcgctctcttccccgttatcttcatcttcctcctccttcctctcaatctccattccttccatctctgcggtccgactgccttcttgctcgcttggctcggcaatttcaaactcctcctctttgccttcgatctcggtcctctgttctc
atcgccgctccctagccttctccacttcgctaccatgctctgccttccgatcaagatcaacaatcagaaatccgagatccggagaactggaaatcagatcgttctttctttcaaggttttgctcctggcgattgtcattcggctctacgattatcgaaatcggatggatccggcgatcgcttccgttctgtattgcctccatttatacttcggcatcgaaatcgtcctcgctctgtgttctcttccggcaaaggccatcttcggagctccgatcgaaccgcagttcgacgaaccctatctctccacttcgcttcaggacttctgggggcatcgatggaatctcatggttccgagtattctacgcccggccgtgtacaatcccacccgtttcataacctcccgtgtttttgggcctaggtgggcccagtttctcgcaatggtagctacgtttgctgtctccggctttatgcacgagcttatcttttattacttcacacgtgccgctcccatgtgggaggtcacgtggttctttgtcctacatggcttctgcacggccgcggaggtggccgccaaagctgcggtggctagccggaaggtacggtggaaggtccaccggatggtgtctgggcctatgactttggtgtttctaatggcgacggcacggtggctgatgttccctcagttaattcgaaatggtgttgttgaccggacgattggtgagtattatactatggcccatttcgtgaagggaaaacttatttagttagttgaaccttgaaagtaaggagtgaacttgtgatgaaaaattagagtgtcgtgagatgtatagtctaaggagttaaaatggatgttttttagtcgtgaccaaacatcctcttcatgattaaaaaaaatgtttgatgttttttttttgtttttttttttaatgtgatccatgtaatttagaccttagttactttttctcaataaactatagtttgatcttctactcacgataattgaattcagattaagaagaaaacacgatttaaatgga
42.该snp位于bhwaxs4基因的1370bp处，果面有蜡粉亲本为腺嘌呤核苷酸(a)(如序列表seq id no.1所示，不同的是第1370bp位置处为a)，而果面无蜡粉亲本为鸟嘌呤核苷酸(g)(如序列表seq id no.1所示)。
43.在snp位点两侧设计一对特异性引物，包括上游引物waxs4-caps1-f和下游引物waxs4-caps1-r。
44.上游引物和下游引物的具体核苷酸序列分别如下：
45.waxs4-caps1-f：5
’‑
ccacttcgcttcaggacttc’(如seq id no.2所示)；
46.waxs4-caps1-r：5
’‑
ttcacgaaatgggccatagt’(如seq id no.3所示)。
47.(3)试验验证：根据冬瓜果面蜡粉基因定位及候选基因筛选等前期研究结果，使用该对特异caps标记对果面有蜡粉亲本p131和果面无蜡粉亲本w3进行扩增、酶切，该caps标记能产生445bp的果面有蜡粉亲本p131特异性标记wax
445
和140bp、305bp的果面无蜡粉亲本w3特异性标记wax
140 305
，结果显示该标记带型清晰、重复性好。
48.上述验证的具体过程为：以冬瓜基因组dna为模板，使用上述caps分子标记引物进行pcr扩增，并对所得扩增产物进行ava ii酶切，随后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。对图1中的结果进行分析得知，该标记能产生445bp的果面有蜡粉亲本p131特异性标记wax
445
和140bp、305bp的果面无蜡粉亲本w3特异性标记wax
140 305
。
49.实施例2冬瓜果面蜡粉的鉴定方法
50.本实施例提供的冬瓜果面蜡粉的鉴定方法，包括以下步骤：
51.(1)冬瓜dna的提取
52.实验材料为p131、w3及二者杂交后代f1的新鲜叶片，提取基因组dna步骤如下：
53.①
取少量新鲜叶片放入2ml离心管中，随后加入5mm钢珠和700ul 2％ctab提取液，并置于组织破碎仪研磨样品，混匀后于65℃水浴30min；
54.②
静置至室温后，加入700μl的氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔混匀，静置2min后12000rmp离心15min，取500ul上清转移至新的1.5ml离心管中；
55.③
加入500ul预冷的异丙醇，轻柔混匀后于-20℃放置30min；
56.④
12000rmp离心10min，弃上清；
57.⑤
向离心管中加入700ul预冷的75％乙醇洗涤dna沉淀2次，放在超净工作台上吹干；
58.⑥
加入50μl ddh2o溶解dna沉淀，提取得到冬瓜基因组dna，备用。
59.(2)以冬瓜基因组dna为模板，采用实施例1中设计的caps分子标记引物进行pcr扩增。pcr反应体系包括：1μl浓度为200ng
·
μl-1
的基因组dna、2μl含mg
2
的10
×
pcrbuffer、1.5μl浓度为2.5mm的dntps、1μl浓度为10mm的上游引物waxs4-caps1-f、1μl浓度为10mm的下游引物waxs4-caps1-r、1u taq酶、添加ddh2o至20μl。扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。
60.(3)对pcr扩增产物进行酶切，取10μlpcr产物，1μl 10
×
buffer，1uavaii限制性内切酶，添ddh2o至20μl；37℃酶切3小时。
61.(4)酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测
62.将酶切产物加入4μl 6
×
loading buffer，甩下后涡旋混匀；取10μl混合液用加入3％(质量百分比)gelstain的琼脂糖凝胶进行电泳，120v稳压电泳30min后在凝胶成像仪上进行拍照分析。
63.(5)扩增结果
64.该caps分子标记引物对在果面有蜡粉的亲本p131中产生了455bp的条带，在果面无蜡粉的亲本w3中产生了140bp和305bp的条带，且f1能同时产生445bp的果面有蜡粉亲本条带和140bp、305bp的果面无蜡粉亲本条带(见图1)。
65.实施例3有无蜡粉冬瓜单株的鉴定方法
66.采用实施例2的方法对p131与w3的f2家系群体的88个单株(编号3-91)进行验证。对各单株分别编号，提取单株dna进行检测；只产生140bp和305bp条带的为果面无蜡粉的单株，只产生455bp条带的是果面有蜡粉的单株，同时产生445bp、140bp和305bp的为果面有蜡粉的单株。
67.通过标记检测结果发现，445bp带型的单株有27个(果面有蜡粉纯合)，140bp、305bp带型的单株有15个(果面无蜡粉纯合)，杂合带型有46个(果面有蜡粉杂合)(见图2)。
68.田间性状鉴定结果与标记检测结果高度一致，准确率达到97.44％。
69.实施例4冬瓜种质资源有无蜡粉品种的筛选
70.采用实施例2的方法对30份不同生态型的冬瓜种质资源(广东省农业科学院蔬菜研究所提供)进行验证(表1)。每份资源混合取样，提取dna进行检测；检测结果发现，445bp带型的株系有10个(果面有蜡粉纯合)，140bp、305bp带型的株系有18个(果面无蜡粉纯合)，杂合带型有2个(果面有蜡粉杂合)(见图3)。
71.田间性状鉴定结果与标记检测结果高度一致，准确率达到90％。
72.表1 30种不同生态型的冬瓜资源信息
[0073][0074][0075]
综合上述实施例可见，本发明开发的casp分子标记可对冬瓜果面有蜡粉材料与果面无蜡粉材料进行有效区分，于苗期便可准确、快速检测出冬瓜材料的果面蜡粉表型。
[0076]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。