G3bp1条件性基因敲除小鼠模型的制作方法

g3bp1条件性基因敲除小鼠模型
技术领域
1.本发明涉及基因工程，具体为g3bp1条件性基因敲除小鼠模型。


背景技术：

2.基因敲除是一种重要的遗传工程技术。它通过同源重组的方法在染色体上用外源的已突变基因替换内源的正常同源基因，从而使内源基因失活。研究者通过观察特异内源基因失活后动物的表型，来推断特异基因的功能。
3.g3bp1属于含rrm结构域的rna结合蛋白，具有复杂多样的分子功能。它可通过调节mrna的稳定性和翻译调控基因表达，也可通过蛋白间的相互作用调控应激颗粒生成和信号转导。g3bp1参与病毒感染、免疫应答、肿瘤生长和神经再生等多种生物学过程。近年来，g3bp1在心血管系统细胞自稳和疾病中的角色颇受关注。在动脉粥样硬化中，g3bp1调节非经典wnt通路和应激颗粒的形成影响血管平滑肌细胞对炎症诱导信号的反应。在炎症性血管疾病的内皮细胞中，g3bp1是否存在功能目前并不清楚。g3bp1全身性基因敲除小鼠的部分胚胎呈现颅内出血，提示g3bp1与血管内皮通透性的维持有关，可能参与血管内皮细胞自稳和功能失调。由于g3bp1全身基因敲除小鼠胚胎致死，构建g3bp1血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠模型尤为必要。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种g3bp1条件性基因敲除小鼠模型，能够克服现有技术中g3bp1全身基因敲除小鼠胚胎致死的难题，辅助g3bp1在炎症性血管疾病中的功能和机制研究。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种g3bp1条件性基因敲除小鼠模型，该模型由以下步骤构建：
6.构建同源重组dna载体；
7.通过体外转录获得cas9 mrna和针对g3bp1基因2号内含子和3号内含子的grna；
8.将同源重组dna载体、cas9 mrna和grna注射到小鼠的受精卵中；
9.培育获得条件性基因敲除小鼠。
10.具体的，所述同源重组dna载体包含3.0kb 5’同源臂、0.8kb的flox区域和3.0kb 3’同源臂。
11.具体的，所述同源重组dna载体通过in-fusion cloning的方法构建。
12.具体的，guide rna序列如下：
13.2号内含子
14.guide rna#1agtcccgacttccaagtttc agg
15.guide rna#2gtcccgacttccaagtttca ggg
16.3号内含子
17.guide rna#1aggcgctaagctgtgatcac tgg
18.guide rna#2taatatagtccagctgtcag tgg
19.具体的，培育获得条件性基因敲除小鼠的步骤如下：
20.将受精卵植入假孕母体并获得阳性f0代小鼠；
21.阳性f0代小鼠与cdh5-cre工具鼠交配获得阳性f1代杂合子小鼠；
22.阳性f1代杂合子小鼠自交获得阳性f2代纯合子小鼠；
23.阳性f2代纯合子小鼠为条件性基因敲除小鼠。
24.本发明的有益效果：
25.1.g3bp1血管内皮细胞特异的基因敲除小鼠为研究心血管疾病的发病机理和治疗提供动物模型。
26.2.g3bp1条件性基因敲除小鼠为研究应激颗粒、相分离和rna降解调控提供在体动物模型。
27.3.不会出现基因敲除导致小鼠致死无法构建模型的现象。
附图说明
28.图1为本发明的g3bp1条件性敲除的原理示意图；
29.图2为本发明的g3bp1 flox同源重组质粒图谱；
30.图3为本发明的f0代小鼠鉴定策略示意图；
31.图4为本发明的同源重组阳性f0代小鼠pcr鉴定电泳图，数字：f0代小鼠编号；wt：野生型对照；m为1kb dna marker；
32.图5为本发明的f1代小鼠5’同源臂和3’同源臂pcr鉴定电泳图。
具体实施方式
33.下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
34.参照图1-5所示，
35.根据g3bp1基因结构，选择g3bp1-201转录本的exon 3为flox区域。exon3翻译起始于该基因编码区的6.8％，敲除该区域会引起读码框移码突变，使翻译提前终止，从而导致蛋白突变。敲除exon 3后理论上可能翻译出一段突变蛋白，预测序列如下：
36.mvmekpspllvgrefvrqyytllnqapdmlhrkstgk*。
37.针对g3bp1基因2号内含子和3号内含子设计crispr/cas9基因编辑系统的guide rna序列以及同源重组dna载体(donor vector)。同源重组载体包含3.0kb 5’同源臂、0.8kb的flox区域和3.0kb 3’同源臂。
38.参照图1所示，通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和grna；通过in-fusion cloning的方法构建同源重组载体。继而使用显微注射将cas9 mrna、grna和同源重组载体dna注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠。f0代小鼠中g3bp1基因2号内含子和3号内含子被同源重组载体替代。
39.通过pcr扩增及测序鉴定阳性的f0代小鼠。将g3bp1 flox阳性的f0代小鼠与cdh5-cre小鼠(cdh5启动子驱动cre切割酶在血管内皮细胞特异地表达)交配获得阳性f1代杂合子小鼠，阳性的f1代小鼠自交获得阳性f2代纯合子小鼠。阳性f2代纯合子小鼠中g3bp1基因在血管内皮细胞的基因组中被敲除。
4684 minrepeat steps 2-4 for 35cycles5685 min-612-hold
[0059]3’
同源臂重组阳性f0代小鼠pcr鉴定方法
[0060]
引物信息：
[0061]
primersequence 5'
‑‑
》3'primer typeiiicccacagggtaggtagctcaforwardivccagcctcctcatttcccacreverse
[0062]
反应体系：
[0063]
reaction componentvolume(μl)ddh2o13.2gxl pcr buffer22.5mm dntp2primer iii(10pmol/μl)0.5primer iv(10pmol/μl)0.5gxl dna polymerase*0.8genomic dna1total20
[0064]
反应条件：
[0065]
step#temp(℃)timenote1943min-29815sec-36115sec-4684minrepeat steps 2-4for 35cycles5685min-612-hold
[0066]
同源重组阳性f0代小鼠pcr鉴定结果
[0067]
双臂同源重组阳性的f0代小鼠为5、6、8、10、12号，长片段pcr鉴定电泳结果如图4所示：
[0068]
f1代小鼠5’和3’同源臂pcr鉴定
[0069]
pcr鉴定策略及方法同f0代小鼠鉴定部分，f1代小鼠5’和3’同源臂pcr鉴定电泳结果如图5所示。pcr鉴定阳性小鼠为：1、2、3、4、7、11、13、16、17、25、28、31、32、33、35、36、39、49、50、51、53、54、55、56、58、59、60、61、63、65、67、68、69、70、71、72号；经测序确认均为阳性。
[0070]
f2代小鼠获得及基因型鉴定
[0071]
f0代阳性小鼠与野生型cdh5-cre小鼠交配，繁育获得f1代小鼠，f1繁育获得f2代小鼠，通过pcr方法及测序对其进行基因型鉴定。
[0072]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施
例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。