用于快速识别微生物的设备和方法与流程

1.本发明涉及医学诊断领域，并且更特别地涉及一种微流体装置，该微流体装置设计成管理所有临床步骤，以检测单个样品本体内的微生物和病原体的范围。


背景技术：

2.对并入芯片实验室微流体装置的高度紧凑的分析生化系统的需求开始获得动力。准确性、全面分析、快速分析时间、成本效益、低样品量、性能以及用户友好性方面的改进为每个产品中所需的标准。
3.不同的生物医学研究实验室和生物医学公司付出巨大努力，以开发用于患者血液或尿液中的微生物和病原体(主要是细菌和真菌或病毒)的快速识别的系统。全球医疗保健系统仍然为一种标准的诊断芯片努力，以作出早期且有效的治疗决策，尤其是在新病原体的发生率方面。全球每年发生有数百万次血液感染，大多数感染发生在第三世界国家中，在该第三世界国家中，无法定期获得医疗服务。另外，发达国家中极端的医院成本要求缩短患者住院时间，以降低医院改善患者健康的成本。
4.存在基于病原体的表型或分子特性的众所周知的诊断方法。大体上，患者血液样品送至临床诊断实验室，并且处理样品，以用于细菌培养。对于使细菌在特殊条件下生长而言，需要几天(如果不是更长的话)。专家在视觉上诊断样品。细菌的形态特征向病理学家提供感染类型的指示。然而，该方法需要相当大量的时间、耗材、装备、无菌环境以及训练有素的人员。
5.荧光原位杂交(fish)为另一种常用的诊断方法，其基于互补探针对病原体遗传物质的荧光发射。样品装载在载玻片上、渗透、固定，并且然后与专门设计的探针杂交。样品然后被洗涤几次，以移除未附着的病原体和试剂。在荧光显微镜之下使与探针杂交的病原体可视化，以分析病原体的存在。现在，样品通过大体上处于蓝色光谱的激光激发，并且如果存在任何病原体，则样品将在绿色光谱下发出荧光。没有绿色荧光指示，细菌与探针之间没有杂交。测试需要利用其它探针再次重复，以评估可疑细菌的存在(在其清楚时)，该过程为缓慢的并且需要专业人员进行实验步骤。
6.还存在免疫诊断方法，其中抗原-抗体反应作为主要检测手段。这样的装置的两种主导形式为酶联免疫吸附测定(elisa)和侧向流动测试(lfd)，也被称为量油尺。对期望的抗原特异的抗体可与作为探针应用的放射性标记、荧光标记或成色酶缀合。这些方法的众所周知的应用包括妊娠测试、区分血型，以及微生物和药物在活体中的检测。该方法被认为是一种有效的方法，但是与大多数其它技术一样，其也具有一些缺点，诸如市场上的抗体的可用性、特异性抗体生产过程冗长(数周至数月)、对训练有素的人员的需要、频繁的移液和洗涤步骤，以及更重要的是抗体的特异性。
7.对于少量试样而言，基于核酸的方法大体上为特异性且高度敏感性的，并且可用于不同类型的微生物(包括无活力或灭活的微生物)。对于难以培养的有机体而言，这些技术为特别有用的。聚合链式反应(pcr)为分子诊断类别中的使用最广泛的分子生物学技术
中的一种。pcr为非常高效、可靠且快速的。然而，由于操作员的参与和步骤的数量，这些测定的高灵敏度带来交叉污染的高风险。该测定的另一个缺点与引物至序列的非特异性退火有关，该序列为相似但不完全相同的。另外，由于这些技术依赖于酶活性，因此在存在抑制酶活性的任何试剂污染的情况下，可出现假阴性。需要有经验的人员准备和操作测定为该测定的一些其它缺陷。尽管如此，其仍然为在医院中针对紧急情况患者的最准确且广泛使用的方法中的一种。大体上，在一小时内，可评定特定病原体的存在。
8.噬菌体为普遍存在的病毒，其感染细菌并采用它们的遗传机制来复制自身。细菌已开发一种适应性免疫系统，称为规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)。crispr由相同的重复dna序列(28到37个碱基对)组成，其中与先前入侵病毒的基因组序列完全匹配的在重复之间的不同间隔dna区域(21到72个碱基对)使得细菌能够记住病毒。如果相同的病毒(或密切相关的病毒)再次攻击细菌，则细菌可从crispr阵列转录rna序列，以靶向病毒的遗传物质。细菌然后使用具有螺旋和核酸酶活性的cas蛋白质来展开dna并将dna切开，这使病毒失活。对于不同的细菌而言，crispr碱基的排列为独特的，并且可用作它们的指纹。cas12a(用于ssdna和dsdna)和cas13(用于ssrna)为cas蛋白质家族成员中的两个。当可编程grna与病原体的特定rna或dna靶标结合时，这两种酶变成激活的并切割所有附近的rna分子。通过将该复合物与标记的rna报告基因(其在两个端部上具有荧光团和猝灭剂)组合，被激活的cas蛋白质切割报告rna，从而产生可测量的荧光信号，其指示病原体的存在。然而，该方法需要对提取的病原体的预扩增。
9.通过等温重组酶聚合酶扩增(rpa)程序完成的遗传物质可使用基本温度控制装备完成。制作适当装置来使用该革命性技术为本发明的主题。
10.因此，本发明的目标在于提供一种用于快速识别微生物的设备和方法，其涉及规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)。
11.本发明的另一个目标在于提供一种用于快速识别微生物的设备和方法，其以批处理形式操作并且具有随机访问能力。
12.本发明的另一个目标在于提供一种用于快速识别微生物的设备和方法，其为价格合理且可靠的。
13.本发明的另一个目标在于提供一种用于快速识别微生物的设备和方法，其设置和运行起来简单，从而使得普通技术人员能够在经过少量训练的情况下在现场操作机器。
14.本发明的另一个目标在于提供一种用于快速识别微生物的设备和方法，其配备有样品处理、测试和报告。
15.本发明的另一个目标在于提供一种用于快速识别微生物的设备和方法，其具有快速、短的周转时间。
16.前文概述了本发明的更相关的目标中的一些。这些目标应当被解释为仅仅是对本发明的更突出的特征和应用中的一些的说明。通过应用以不同的方式使用公开的本发明或者修改本发明，可获得许多其它有益的结果。因此，通过参考本发明的概要和描述本发明的优选实施例的详细描述，可具有充分理解本发明下的其它目标。


技术实现要素：

17.本发明由所附权利要求书限定，其中具体实施例在附图中示出。为了概括本发明
的目的，本发明涉及一种用于快速识别采样装置、微流体采样装置内的微生物的设备和方法。微流体采样装置具有多个反应室，它们各自具有用于与微生物反应的不同反应剂。与微生物的反应指示反应室中微生物的存在。
18.设备包括抓取器，其用于保持采样装置。激光器定位成照射微流体采样装置。运动台连接到抓取器，以用于在平面中移动采样装置，以用于相对于来自激光器的光束定位微流体采样装置的部分。检测器检测从多个反应室中的每个发射的光，以用于检测反应室中微生物的存在。
19.在本发明的更具体的实施例中，微流体采样装置包括主贮存器，其用于接收样品并且使样品的包含微生物的部分隔离。收集贮存器从样品贮存器接收样品的包含微生物的部分。多个反应室各自具有不同的反应剂。包含微生物的部分通过毛细管微通道转移至多个反应室中的每个，以用于与微生物反应，以指示反应室中微生物的存在。
20.在本发明的另一个更具体的实施例中，微流体采样装置为可旋转盘，其具有中心孔。抓取器与中心孔接合，以用于保持可旋转盘。运动台包括用于沿径向移动可旋转盘的滑动器和用于旋转可旋转盘的马达。激光器可在运动台移动时照射微流体采样装置的选择部分。激光器可用于照射微流体采样装置，以加热微流体采样装置中的样品，以实现样品的裂解。另外，激光器可用于照射多个反应室中的每个内的微流体采样，以指示反应室中微生物的存在。优选地，光谱仪检测器检测从多个反应室中的每个发射的光，以用于检测反应室中微生物的存在。
21.在微流体采样装置的另一个更具体的示例中，装置包括样品本体，其具有用于接收样品并使样品的包含微生物的部分隔离的主贮存器。收集贮存器从样品贮存器接收样品的包含微生物的部分。多个反应室各自具有不同的反应剂。毛细管微通道将包含微生物的部分转移至多个反应室中的每个，以用于与微生物反应，以指示反应室中微生物的存在。优选地，样品本体为透明的，并且由玻璃制作。玻璃使得激光器能够对样品进行加热处理。
22.主贮存器阀插置在主贮存器与收集器贮存器之间，以用于控制到收集器贮存器中的流，并且收集器贮存器阀插置在收集器贮存器与毛细管微通道之间，以用于控制到多个反应室中的流。主贮存器阀和收集器贮存器阀可为磁操作阀或光学操作阀。
23.在另一个具体的实施例中，第一种设计可针对单个样品检测多种有机体，而第二种设计针对多个样品检测单种有机体。
24.本发明还并入到用于快速识别样品中的微生物的方法中，该方法包括将样品引入到样品贮存器中的步骤。包含微生物的样品的部分与样品隔离。样品的包含微生物的部分收集到收集贮存器中。不同的反应剂引入到多个反应室中的每个中。包含微生物的部分转移到多个反应室中的每个中。顺序地照亮多个反应室中的每个，以用于检测反应室中微生物的存在。
25.在更具体的示例中，包含微生物的样品通过由激光器加热样品来与样品隔离。本发明的设备和方法适合于与如下文中描述的crispr技术一起使用。
26.本发明提供不同的平台，以服务于对不同体液(诸如血液、尿液、唾液、精液等)的诊断应用。在此，针对感染液体，解释用于识别血液中病原体的示例的设计平台。在一个示例中，全血注射到盘中，并且然后，包含细菌的血浆与开始旋转的盘分离。在高速旋转下，重元素(诸如红细胞和白细胞)通过旋转盘中的快速沉降过程与血浆和细菌分离。因此，盘类
似于微型离心机起作用。然后，血浆和细菌通过孔跟随至下一个区段，同时由聚焦的激光束照射。在焦点处，细菌壁被裂解，并且dna被释放。该方法对打开真菌壁而言也为非常高效的。然后，样品被引导至36个反应室。每个室具有三种关键成分：(1)蛋白质cas 12和/或cas 13；(2)在两个端部上具有荧光团和猝灭剂的随机标记的rna分子；(3)与所讨论的病原体的遗传物质互补的一种单独类型的grna分子。可对grna分子进行编程，以仅靶向其全基因组已经测序并在数据库中为可用的病原体。
27.不同的酶用于产生crispr rna(简称为crrna)。然后，样品被引导至36个反应室。针对顶级传染病的不同crrna补体(被称为引导rna(简称为grna))放置在36个反应室中，还存在蛋白质cas 12和/或cas 13。室中的第三元素为随机rna。随机rna对于所有室而言为公共的，并且具有两个荧光指示分子，它们从每侧附接到通用设计的rna。所有三种成分(grna、cas 12/13蛋白质以及随机rna报告rna)都被冷冻干燥，并且可在盘内部存储达长时间段(数年)。盘为真空密封的，并包装在黑色的暗盖中，以避免与光的任何相互作用。如果存在未知细菌，在反应室中针对其存在互补grna分子的病原体在该特定反应室中的grna列表中，则杂交发生在病原体的遗传物质crrna和grna之间，并且因此cas 12/13蛋白质被激活。该特定的蛋白质开始切断/切割任何附近的rna，其包括报告rna。荧光标记的报告基因在由crispr-cas系统的rnase活性切割时发射可测量的荧光。当反应室利用泵激光器激发时，这造成辐射荧光的主要改变。在传统的诊断方法中，每个细菌或者细菌的dna或rna的片段可生成仅一个信号。为了放大信号，我们需要通过培养细菌来放大细菌，或者通过pcr增加细菌的dna或rna的片段，以提高信号水平。crispr cas 12/13使用有趣的构思，代替通过放大源来放大信号，其使用源的存在作为打开的开关，并且信号生成由cas 12/13和报告rna完成。这两种元素分子在反应室中始终彼此相邻，但是当crrna基因组靶标与grna杂交时反应开始。
28.本发明基于一种新的基于玻璃的微流体装置和方法的发展，其中所有的生物传感器和蛋白质和酶都位于一个特定的贮存器中。本发明的优点中的一些在于：血浆液体将通过相对真空功率和自转过程来填充贮存器，这为避免使用内部或外部泵来移动液体的简单但高效的技术。
29.原位离心，以分离不同种类的液体，诸如血浆液体和细菌从红血和白血样品中的提取。
30.原位细胞裂解，以破坏细胞壁并释放dna和rna。
31.另一个主要优点在于使用最少量的样品来同时进行许多测试。
32.基于crispr的诊断为简单且非常准确的；读出为快速的，并且其有助于非常快速得到准确的结果；装置为便携式且轻的，并且消耗非常少量的能量。
33.由于每次运行中的多重分析，成本低；盘具有cd大小的结构，并且可从-50℃到 50℃存储，而没有对用以存储的冷藏库或特定位置的需要，并且因此其可在室温下存储，而不需要任何冷藏；盘为可回收的，并且对环境具有较小的危害；成本有效；用户友好；
可在护理点和边境(例如，机场)处使用。
34.前文已相当宽泛地概述本发明的更相关和更重要的特征，以便可更好地理解以下详细描述，使得可更充分地认识到对本领域的当前贡献。将在下文中描述本发明的附加特征，其形成本发明的主题。本领域技术人员应当认识到的是，公开的概念和具体实施例可容易地用作修改或设计用于实现本发明的相同目的的其它结构的基础。本领域技术人员还应当认识的是，这样的等同构造不脱离本发明的精神和范围。
附图说明
35.为了更充分理解本发明的本质和目标，应当参考结合附图进行的以下详细描述，在该附图中：图1a为本发明的用于快速识别微生物的设备的侧视图；图1b为图1a的装置的等距视图：进一步图示旋转盘；图2a图示旋转盘的基层；图2b图示旋转盘的主层，其中将发生反应；图2c图示旋转盘的覆盖层；图2d图示配备有树脂注射盖和阀的旋转盘的覆盖层；图3a图示用于图1a和图1b的设备的旋转盘的第二实施例的基层；图3b图示图3a的旋转盘的第二实施例的主层；图3c图示配备有树脂注射盖和阀的旋转盘的第二实施例的覆盖层；图4a为处于闭合位置的磁机械阀的等距视图；图4b为处于开启位置的磁机械阀的等距视图；图4c为处于闭合位置的液晶弹性体的各向同性相的等距视图；图4d为处于开启位置的液晶弹性体的各向同性相的等距视图；图5a图示旋转盘的第三实施例的主层；图5b呈现图5a的完整组件旋转盘；图6a图示用于线性盒的主层设计；图6b图示用于图6a的线性盒的完整组件；以及图7为cas 12/13蛋白质与grna反应的示意图。
36.相似的参考字符遍及附图中的若干图指代相似的部分。
具体实施方式
37.图1a和图1b图示用于快速识别微生物(诸如细菌、真菌和病毒)的设备。设备适合于与crispr cas 12/13诊断方法一起使用。设备接收微流体采样装置1.0，以用于快速识别微流体采样装置1.0内的微生物。如将在下文中更详细地描述的，微流体采样装置1.0接收样品以用于分析。微流体采样装置1.0为可互换且一次性的，以用于快速识别微生物。微流体采样装置1.0能够针对众所周知的细菌感染来诊断样品(诸如血液样品)。然而，微流体采样装置1.0也可设计成用于病毒或真菌检测。
38.在该示例中，微流体采样装置1.0示出为旋转盘1.0，旋转盘1.0具有近似光盘(cd)大小。设备包括抓取器1.1，其用于保持旋转盘1.0。抓取器1.1包括马达1.11，马达1.11安装
在运动台1.2上，以用于使旋转盘1.0旋转。
39.光学镜1.3将来自激光源1.4的激光束1.5反射至旋转盘1.0。光学镜1.3可在轨道1.2上移动。旋转盘1.0的旋转和光学镜1.3在轨道1.2上的运动允许激光束1.5基本上接近旋转盘1.0的任何部分。光谱仪检测器1.7测量穿过旋转盘1.0的选择部分和/或从旋转盘1.0的选择部分发射的光。
40.图2a-2d为并入到旋转盘2.0中的微流体采样装置1.0的放大视图。旋转盘2.0包括由透明材料(诸如玻璃或任何其它材料)形成的基层2.1，基层2.1具有500-700μm的优选厚度，作为可旋转盘2.0的结构基部。基层2.1使旋转盘2.0的其余较薄层稳定。孔2.2限定在旋转盘1.0中，以用于使得抓取器1.1能够保持和旋转旋转盘1.0。
41.图2b为旋转盘2.0的主层2.3，主层2.3具有形成旋转盘的孔2.2的部分的同心中心孔。主层2.3由透明材料(诸如玻璃或任何其它材料)形成。主贮存器2.4限定在主层2.3中，以用于接收待测试的样品。主贮存器阀2.5将主贮存器2.4连接到毛细管通道2.6。毛细管通道2.6与收集器贮存器2.7连通，从而使得主贮存器阀2.5能够控制到收集器贮存器中的流。收集器贮存器阀2.8控制从收集器贮存器2.7通过毛细管微通道2.9至多个反应室2.11的流体流。
42.多个阻力通道2.10插置在毛细管微通道2.9与多个反应室2.11之间，以抑制从多个反应室2.11到毛细管微通道2.9中的回流。
43.覆盖层2.13覆在主层2.3上面。基层2.1和主层2.3以及覆盖层2.13绕着旋转盘2.0的圆周以及中心孔2.2的圆周以真空紧密布置固定。
44.覆盖层2.13包括入口2.14，其用于将样品液体引入到旋转盘2.0中。另外，覆盖层2.13包括用于接收主贮存器阀2.5的孔口2.15，以及用于接收收集器贮存器阀2.8的孔口216。提供密封塞2.17，以用于在将样品引入到旋转盘2.0中之后密封入口2.14。主贮存器阀2.5以及收集器贮存器阀2.8的解释将在下文中更详细地描述。
45.在存在许多患者和医生正在寻找少数常见疾病而不是36种类型的病原体中的全部的一些情况下，则旋转盘2.0可针对12种不同的病原体进行编程，并且每次运行可接受三个不同的样品。可旋转盘1.0可被标记和印上条形码(未示出)，因此每个反应室具有独特的标识。装置为灵活的，并且可基于客户需求填充有生物材料。
46.操作方法在该示例中，旋转盘2.0包含36个反应室2.11，从而使得36个不同的测试能够从单个旋转盘2.0同时运行。在30分钟内，将针对36种不同类型的光基因检查样品。然而，本领域技术人员应当理解的是，旋转盘2.0可在设计上修改，以容纳或多或少的测试室。在需要运行许多样品测试的一些情况下，每个盘可针对12种诊断类型同时运行三个不同的样品。
47.在下面阐述设备的操作方法的示例。样品(诸如血液样品)引入到三个样品注射位置2.14中的一个中，并且安装密封插入塞2.17，以封闭三个样品注射位置2.14。
48.旋转盘2.0然后放置到设备中。当旋转盘2.0开始旋转时，由于离心力，血浆和细菌与重物种(诸如红细胞和重血细胞)分离。红细胞向外移动，而血浆朝向旋转盘2.0的中心移动。细菌也更多地朝向旋转盘2.0的中心移动。此时，激光源1.4开始朝向旋转盘2.0的中心照射，并且将血液样品的样品温度提高至接近150℃。旋转盘2.0的最后制作使得血液样品能够被加热至上述温度。在该局部热下，裂解开始发生。细胞壁开始破坏，并且dna和rna被
释放。离心力和/或热将样品的含有期望微生物的部分与样品的其余部分隔离。
49.在开启主贮存器阀2.5时，提取的dna/rna和血浆液体将移出至毛细管通道2.6，以进入收集器贮存器2.7。在收集器贮存器2.7中，不同类型的酶以冷冻干燥的形式存储。酶的选择基于将在反应室2.11中诊断的光基因的类型。酶的功能在于挑选合适的dna并在期望的配对位置处进行切断。如果期望的光基因存在于样品中，则现在具有准备好用于检测的dna或rna片段。为了具有冗余并提高信噪比水平，优选的是，挑选至少三个不同的dna或rna片段用于检测。
50.通过激活该收集器贮存器阀2.8，漂浮在血浆液体中的dna/rna片段将转移到毛细管微通道2.9中。毛细管微通道2.9在十二个反应室2.11之中分配样品。阻力通道2.10设计在路径中，以避免冷冻干燥粉末从反应室2.11朝向毛细管通道2.9的泄漏。当dna/rna片段到达反应室2.11中时，dna/rna片段与存储在反应室2.11内的冷冻干燥粉末反应。将参考图7更详细地解释dna/rna片段与冷冻干燥粉末之间的反应。
51.激光束1.5传播通过旋转盘1.0内的反应室1.6。激光束1.5从激光源1.4照射至光学镜1.3，以聚焦在旋转盘2.0上，以激发反应室1.6内的荧光分子。光谱仪检测器1.7测量反应室2.11内的激发荧光分子。如果发生任何反应，则该特定反应室2.11在由蓝色二极管激光器激发时将发射绿色荧光信号。
52.玻璃的优点优选地，可旋转盘2.0由玻璃制作，因为玻璃相对于基于热塑性塑料的盒具有许多优点。玻璃具有许多独特的性质，其对于生命科学、生物医学中的许多不同应用而言为有益的。这些独特的性质包括：优异的光学透明度，具有低荧光背景；大的机械强度、热稳定且耐刮擦；化学惰性，液体和气体不可渗透，从而使其具有生物相容性。
53.这些独特的性质使玻璃对于许多应用而言为高度合乎期望的，然而，当今可用的传统制作方法(诸如机械切断/切割/钻孔、激光烧蚀、水射流切断，以及光刻湿法/干法蚀刻)不能够产生研究人员、工程师和设计师希望为其产品实现的复杂的高纵横比微结构。
54.在过去的3到5年中，在“选择性激光辅助蚀刻”领域中已经存在许多发展，以满足对具有高精度特征的玻璃装置的需求。然而，这些新发展为非常昂贵的，它们耗时且难以扩展以满足较高容量的市场。因为这些问题，行业不得不采取使用pmma和/或热塑性塑料来满足其需求。pdms和热塑性塑料虽然在表面上这些好像是更具成本效益的解决方案，但是它们仍然具有许多缺陷，这些缺陷使它们不太合乎期望。两者都需要用于正在生产的不同装置中的每个的模具，这些模具具有有限的使用寿命并且需要更换，因为利用模具难以进行产品设计改变，因为必须设计模具并且重新设计模具可为昂贵的。pdms和热塑性塑料两者都可具有关于荧光的问题，并且它们也与许多有机溶剂不相容。对于细胞裂解而言，高温操作为期望的，这为大多数塑料的熔点。
55.本发明提供快速、成本有效且可扩展的玻璃微制作过程，其可满足不断扩大的生命科学的需求。针对批量生产，基于激光的本解决方案为快速、经济、高度受控且可扩展的。本过程设计成与当今生命科学中使用的目前几乎所有常见玻璃材料一起使用。本过程不依赖昂贵的模具来制作装置，并且能够利用几个按键对装置特征进行改变，而且我们的过程
不需要对昂贵的纳米制作装置(诸如光刻方法中使用的装置)的需求。
56.图3a-3c图示本发明的第二实施例。在该实施例中，旋转盘3.0重新设计成同时接受许多样品，并针对单种微生物或病原体进行检测。旋转盘3.0设计成应对世界上正在经历类似于埃博拉病毒或寨卡病毒的疾病大流行的地区，或者正面临类似于炭疽病的生物线的军队。代替针对36种类型的病原体诊断每个样品，旋转盘3.0针对一种特定的感染在单次运行中检查尽可能多的人。在当前设计的25个反应室中，同等间隔的屏障独立地放置在旋转盘3.0中。本发明的另一个明显用途是在农业中。假设园丁想要针对特定的疾病来检查所有果树。于是从每棵树收集的样品被印上条形码并装载在单个盘中。
57.旋转盘3.0包括由透明材料(诸如玻璃或任何其它材料)形成的基层3.1，基层3.1具有500-700μm的优选厚度，作为可旋转盘3.0的结构基部。旋转盘3.0限定孔3.2，从而使得抓取器1.1能够保持和旋转旋转盘3.0。
58.图3b图示旋转盘3.0的主层3.3，主层3.3由透明材料(诸如玻璃或任何其它材料)形成。主贮存器3.4限定在主层3.3中，以用于接收待测试的样品。主贮存器阀3.5将主贮存器3.4连接到毛细管通道3.6。毛细管通道3.6与收集器贮存器3.7连通，从而使得主贮存器阀3.5能够控制到收集器贮存器3.7中的流。收集器贮存器阀3.8控制从收集器贮存器3.7中的每个至相应的反应室3.11的流体流。主贮存器阀3.5以及收集器贮存器阀3.8的解释将在下文中更详细地描述。
59.图3c图示旋转盘3.0的覆盖层3.13，覆盖层3.13由透明材料(诸如玻璃或任何其它材料)形成。基层3.1和主层3.3以及覆盖层3.13绕着旋转盘3.0的圆周以及中心孔3.2的圆周以真空紧密布置固定。
60.覆盖层3.13包括入口3.14，其用于将样品液体引入到旋转盘3.0中。另外，覆盖层3.13包括用于接收主贮存器阀2.5的孔口3.15，以及用于接收收集器贮存器阀2.8的孔口2.16。提供密封插入塞3.17，以用于在将样品引入到旋转盘3.0中之后密封入口3.14。
61.操作方法样品(诸如血液样品)注射到主贮存器3.5的入口3.14中，并且插入塞3.17被插入，以密封入口3.14。由于离心力，旋转盘3.0的旋转将血浆液体和病原体与红细胞和白细胞分离。血浆液体和病原体朝向旋转盘3.0的中心外部移动。通过将激光束1.5朝向旋转盘3.0的中心施加，裂解过程开始，并且病原体的壁破裂，以释放dna和rna。
62.当贮存器阀3.5被激活时，包含dna和rna的液体将穿过毛细管通道3.6。弯曲的毛细管通道3.6将样品从主贮存器3.5转移至收集器贮存器3.7。特定的卷曲干燥酶放置在收集器贮存器3.7内部。酶在与液体混合时被激活。酶切断dna并挑选dna或rna的特定片段。dna或rna的挑选的特定片段被称为crrna。
63.当收集器贮存器阀3.8被激活时，crrna移动至反应室3.9。在反应室内部，放置具有grna和随机rna的cas 12/13蛋白质。如果被存储以免于光和湿度，则所有这些生物材料被冷冻干燥以持续数年。如果crrna与grna杂交，则cas 12/13蛋白质被激活，从而造成包括随机rna的任何rna的切断。
64.将适当的微型阀集成到微流体装置中为有挑战性的主题，因为阀需要在没有泄漏和错误的情况下起作用。该阀还需要稳健、简单、低成本并且易于集成到微流体装置中。微型阀可分类成五个不同的组：
机械主动微型阀使用表面微机械加工技术，可机械移动的隔膜与磁、电、压电或热促动方法耦合。大多数机械主动微型阀传统上将柔性隔膜与磁、静电、压电或热耦合。为了使微型阀小型化，静电促动为最佳候选中的一个。但是，由于极高的电压要求，难以获得高的力和大的差异。关于压电促动，可能的是，实现非常高的力，但是对于非常小的偏差而言，需要高电压。热促动可经由大冲击提供大量的力，但是为相对缓慢的，并且由于热消散，不可适合于许多流体。因此，基于磁性的微型阀可为来自该类别的优异选择，并且将在本工作中单独地论述。
65.非机械主动微型阀示例包括基于流变材料中的电化学、相变的促动原理。相变促动机制诸如液晶弹性体、水凝胶、溶胶-凝胶、石蜡。另外，电流变材料或铁磁流体可用于非机械主动微型阀。与传统的机械主动微型阀相比，这些相变微型阀为相对新且便宜的。这些非机械主动微型阀就它们简单的装置结构和一次性而言特别受关注，从而使它们非常适合生命科学中的应用。
66.基于智能材料的微型阀大体上为定向向列侧链液晶弹性体，其具有将在此处论述的粘弹性质和非常弱的分子间相互作用。
67.外部主动微型阀大体上，这种类型的微型阀通过使用外部系统作为内置模块化或气动器件来工作。大体上，外部主动微型阀使用外部系统作为集成模块化或气动器件来操作。外部系统的使用为设计微型阀的最实用的方法中的一个。该促动在高入口压力下没有泄漏通量的情况下为有利的，但是由于对附加的外部系统的需要，小型化可为困难的。
68.机械被动微型阀大多数被动微型阀或止回阀并入往复位移微型泵的入口和出口中，作为机械移动部件。最常见的被动微型阀为瓣片、隔膜、球形球或移动结构。用于pcr芯片应用的另一种类型的机械被动微型阀基于凝胶光聚合方法。在该方法中，局部凝胶塞将通过微通道中的原位光聚合产生。该局部凝胶塞用作被动微型阀，其有效地防止由于在热循环期间的热引起的压力差而产生的大量液体流。该方法为非常缓慢的，并且不适合于快速dna分析。
69.非机械被动微型阀：非机械被动微型阀在往复位移微型泵的入口和出口中使用喷嘴、扩散器或特斯拉元件。在pcr微流体装置中，被动非机械基于表面性质；疏水性的或亲水性的，并且用于控制微通道中的流体流。某些芯片可配备有连接到主通道的访问端口，以用于确定流体塞的定位。通过利用疏水性的聚四氟乙烯物质涂覆这些端口，结构可用作被动止动阀，而没有任何外部传感器。这种类型的微型阀为不可靠的，因为涂覆的疏水性膜可受到pcr混合物中经常包括的表面活性剂的影响。
70.尽管许多类型的阀可并入本发明内，但是两种类型的微型阀示出为并入本发明内。第一优选阀为非机械主动阀，诸如智能液晶弹性体。第二优选阀为机械主动微型阀，诸如基于磁性的微型阀。两个微型阀都可嵌入微流体装置中。
71.图4a和图4b为处于闭合位置和开启位置的磁机械阀4.0的等距视图。对于基于磁性的微型阀40而言，外部磁场4.1将用于激活。具有零泄漏和优异特性的基于磁性的微型阀
40将嵌入到微流体装置中。基于磁性的微型阀40包括永久棒状磁体4.2，其由弹性体聚合物4.3覆盖或附接。这种类型的阀已示出优异的特性：没有可检测的向上泄漏流、零死体积、保持其在微流体装置之上的表面可安装能力。磁棒4.2总是由弹簧4.4向下推动。弹簧附接到覆盖层。整个阀部件被组装并连接到彼此，并且其插入如先前示出的阀位置孔中。壳体箱4.5胶合到覆盖层。弹簧类型为压缩的，并且其总是将磁体和弹性体向下推动，以封闭装置中的微通道。
72.通过使用这种类型的微型阀，功率消耗降低并且具有快速响应时间。在磁性微型阀的情况下，外部磁场4.1将从箱4.5的顶部施加，以促动和控制微型阀的操作。当施加外部磁场4.1时，其将磁棒4.2朝向自身移动，从而引起通道的开启和液体的流动。
73.图4c和图4d为处于闭合位置4.11和开启位置4.12的液晶弹性体阀4.10的各向同性相的等距视图。对于利用智能液晶弹性体制备的另一种类型的微型阀而言，将使用用于细胞裂解和荧光激发的相同激光源。使用这种液晶弹性体的主要原因是因为可逆且可控的延伸为它们的基本性质。在本发明中，我们提出液晶弹性体微型阀的集成，其中交联度和聚合物链的长度将被优化，以在施加外部应力(诸如机械应力、温度改变或曝光)时达到最大的可逆性。该弹性性质将被优化，以增加聚合物的可逆性而没有任何滞后，以提高微流体装置中集成的微型阀的性能。
74.弹性体微型阀的延伸方向将设计成平行于分子的导向器的方向，并平行于通道的壁和流体的流，因此在施加外部功率源的情况下，可控制液体的流。这样的微型阀的期望特性为零泄漏、没有死体积、能够与表面脱离、快速响应时间、长存放时间、低功率消耗以及无污染。以上给出的所有参数都在微流体装置中的液体流中起着重要作用。
75.图5a和图5b图示本发明的第三实施例的主层5.1和覆盖层5.13。基层(未示出)类似于图3a。旋转盘5.0的主层5.1修改成具有用于每种病原体的专用收集器贮存器5.11。盘5.0的主层5.1限定中心孔5.2和主贮存器5.3。孔口5.15接收贮存器阀5.5，以将液体从主贮存器5.3转移至u形微通道5.6。u形微通道5.6设计成避免放置在收集器贮存器5.7中的生物材料移动到微通道5.6中。收集器贮存器阀5.8位于孔口5.16中。在收集器贮存器5.7中产生crrna的提取的普通材料之后，收集器贮存器阀5.8被激活，并且样品移动至反应室5.11。样品在反应室5.11中与grna杂交。
76.图5的旋转盘5.0与图2的旋转盘2.0之间的主要差异在于，收集器贮存器5.7对于12个反应室5.11而言不是公共的。每个反应室5.11具有其自己的收集器贮存器5.7。另外，反应室5.11和收集器贮存器5.7可被合成一体，以在整个旋转盘5.1中将阀的数量减少到三个。在该构造之下，收集器贮存器5.7和反应室5.11变成一个室，并且收集器贮存器阀5.8被移除。
77.图6a和图6b图示将微流体采样装置并入到线性盒6.0中的本发明的第四实施例。在图1-3和图5中示出的先前实施例中，用以在旋转盘内泵送液体的主要力为离心力。用以在线性盒6.0内泵送液体的主要力为真空和重力。
78.由于不存在离心力，该装置接受已经在外部离心的样品，或者仅接受没有离心的样品。这意味着在血液的情况下，所有细胞都将存在于识别过程中。它们可在信号中产生一些噪音，但是它们的影响为较小的。甚至在盘基部装置中，如果盘不以高速旋转，则样品也可移动至反应室而无需离心。不利的一面是：病原体浓度在反应室中将为低的，但是系统仍
然工作并产生结果。
79.图6a和图6b图示用以保持离心或未离心样品的主贮存器6.1。在该贮存器中，样品利用聚焦的激光束处理，以进行细胞裂解。机械主动微型阀位置6.15接收主贮存器阀6.5，以将液体转移通过主要毛细管微通道6.6，以将样品分配到收集器贮存器6.7中。微虹吸通道6.10阻止生物材料从收集器贮存器6.7至主要毛细管通道6.6的移动。指定的酶位于收集器贮存器6.7中，以使dna和rna去切割(de-cleave)。在过程完成之后，位于孔口6.16中的收集器贮存器阀6.8将被激活，以将crrna传递至反应室6.11。蛋白质ca12/13、报告rna、grna在冷冻干燥时位于反应室内部。一旦液体进入到该区域，它们就开始被激活，并且如果crrna靶核酸和grna杂交，则cas12/13开始切割任何报告的rna分子。
80.类似于图5的盘设计，在该设计中，每种病原体具有其自己的专用收集器贮存器6.7。可能的是，将所有的收集器贮存器6.7连接到彼此，并且仅使用单个阀来进行至反应室6.11的分配。
81.图7呈现crisper-cas 13诊断的原理。构思在于检测rna 7.1。生物材料7.2、7.3和7.4装载在装置盘的反应室中。这些材料为冷冻干燥的，并且可封装在隔膜内部。该隔膜可通过使用生物相容性聚电解质材料制作，该生物相容性聚电解质材料可与生物材料形成复合物，并且长时间完好无损，并且在反应室中存在液体的情况下释放。这可长时间保持生物材料完好无损。
82.grna 7.2设计成类似于钥匙，并且是检测靶遗传物质7.1并因此激活cas 13蛋白质7.3的钥匙。本领域清楚的是，cas 12和cas 13为两种不同的蛋白质，第一种由单链和双链dna片段激活，并且第二种由rna分子激活。cas 12通过解旋酶活性将dna展开，并且将其与可编程的grna杂交，而cas 13然而直接地将靶rna分子与grna杂交，对展开过程没有任何需要。取决于靶遗传物质类型，两种蛋白质可一起或单独在反应室中使用。
83.7.4呈现荧光标记的报告rna分子。它们大体上为短寡核苷酸(20-30个碱基对)的任何rna碱基组合，如作为7.4中的条示出的。两个端部连接到猝灭荧光分子7.5和7.6。7.5设计成吸收蓝光并发出绿光荧光，而分子7.6设计成吸收绿光并发射红光。如果在反应室中不存在杂交(意味着报告rna 7.4不被切断)，则当以蓝光照射反应室时，7.5分子吸收蓝光，但是由于分子7.6非常靠近(小于10 nm)发射绿光的荧光源，故分子7.6吸收绿光并发射红光。观察到的是蓝光激发和红光发射，没有绿光的迹象。现在，如果杂交发生在靶遗传物质7.1与grna 7.2之间，则cas 13 7.3被激活，并且报告rna 7.4由cas蛋白质7.3切断。这意味着7.5和7.6的两个荧光分子之间的距离限制不再存在，并且当以蓝光照亮反应室时，将观察到绿光。当然，其可仍然为发射红光的一些未破损报告rna。通过针对红光应用过滤器，可观察到清楚的绿色光谱。这意味着该特定室中的病原体存在。可实时或在终点检测荧光发射。
84.如果核酸提取发生在将生物样品注射到盘中之前，或者如果细胞裂解通过酶促或渗透机制而不是使用激光进行，则将不存在对激光裂解过程的任何需要。因此，没有极热生成，于是人们可考虑利用塑料模制制成的所有部件。这可降低生产成本，因为所有研究都利用玻璃部件完成，并且最终设计可使用塑料模制技术进行。
85.本公开包括包含在所附权利要求书中的内容以及前述描述的内容。尽管本发明以其具有一定程度的特定性的优选形式描述，但是理解的是，优选形式的本公开仅通过示例
的方式作出，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可采取部件的组合和布置以及构造细节方面的许多改变。