一种重组抗EGFR单抗前体的制剂的制作方法

一种重组抗egfr单抗前体的制剂
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组抗egfr单抗前体的制剂。


背景技术：

2.表皮生长因子受体（即egfr）也称作c-erbbl/herl，其家族成员都是生长因子受体酪氨酸激酶，它们在细胞表面与特异的生长因子或天然配体相互作用，如与egf或tgfa相互作用，由此活化受体酪氨酸激酶。egfr在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中具有重要的作用，同时在相当一部分的人类肿瘤中都有表达。egfr抑制剂能阻断egfr的活性，抑制其磷酸化和信号传导，从而起到多重途径的抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。在一些研究中，egfr抑制剂与多种化疗药物和放疗药物联合作用于一些肿瘤细胞株时，表现出累加和协同作用。
3.包括帕尼单抗在内的抗-egfr的抗体容易引起皮肤毒性，主要特征有红疹、痤疮、瘙痒及皮肤干燥，为了解决同时提高疗效和降低毒副作用的难题，研究人员设计并制备了一种重组抗egfr全人源单克隆抗体前体pan-p（专利申请号cn201410724477.4），为igg1型抗体，具有adcc 效应，并且其抗原结合部位含有一段具有肿瘤特异性蛋白酶酶切位点的封闭肽，该抗体为酶介导的特异性结合型抗体，对肿瘤有特异性结合，可以减少一般性抗-egfr抗体引起的皮肤毒性，如：红疹、痤疮、瘙痒及皮肤干燥等。
4.由于重组抗egfr全人源单抗前体pan-p具有独特的氨基酸序列（一级结构）和高级结构，为了提高抗体稳定性、延长抗体保质期，需要有针对性的开发一种制剂配方和/或制剂方法。


技术实现要素：

5.为了提高重组抗egfr全人源单克隆抗体前体pan-p（专利申请号cn201410724477.4）在储存中的稳定性、延长保质期，本发明提供了一种制剂配方，技术方案如下：所述的pan-p蛋白具有seq id no: 1的重链序列和seq id no:2的轻链序列，重链和轻链两条肽链之间通过二硫键链接。
6.所述的制剂配方包括以下剂量或浓度的pan-p蛋白和辅料：pan-p，20 mg/ml～50 mg/ml；一水合柠檬酸，0.40
±
0.04 mg/ml；二水合柠檬酸钠，2.38
±
0.24 mg/ml；聚山梨酯20（peg20），1.0
±
0.1 mg/ml；甘露醇，50
±
5 mg/ml；配好后溶液的ph值为6.0
±
0.3。
7.更具体而言，所述的制剂配方包括以下剂量或浓度的pan-p蛋白和辅料：pan-p，50 mg/ml；
一水合柠檬酸，0.40 mg/ml；二水合柠檬酸钠，2.38 mg/ml；peg20，1.0 mg/ml；甘露醇，50 mg/ml；配好后溶液的ph值为6.0。
8.所使用的溶剂是水，应达到注射用水的质量标准。
9.所述的辅料柠檬酸、柠檬酸钠、聚山梨酯20、甘露醇等的生产过程和质量管理应符合行政机构对药用辅料的要求，达到中国药典规定的质量标准。
10.所述的制剂配方适用于静脉注射的给药方式。
11.本发明的有益效果是，能够显著提高pan-p蛋白在20～50 mg/ml浓度下的储存的稳定性，减少储存过程中聚集体和电荷异质体的产生。
附图说明
12.图1 储存后的pan-p重组蛋白的egfr结合能力的检测结果；图2 储存后的pan-p重组蛋白经酶切激活后的egfr结合能力的检测结果。
具体实施方式
13.实施例1、重组抗egfr全人源单抗前体pan-p的制剂配方将重组抗egfr全人源单抗前体pan-p（专利申请号cn201410724477.4）按表1所示配方溶解于溶液中，形成注射液制剂，用于静脉注射。
14.表1 pan-p的制剂配方该制剂配方的实现方法：将含有pan-p的细胞培养液通过一系列层析、过滤等步骤进行纯化、除病毒后，将获得的含有目的蛋白的溶液浓缩，然后透析、稀释，配制入按照上述配方配置的缓冲液中。
15.实施例2、不同缓冲液和ph对目的蛋白稳定性的影响将pan-p蛋白分别以20 mg/ml的浓度溶解于不同ph的20 mm磷酸盐缓冲液（pbs）、柠檬酸盐缓冲液（cbs）、醋酸缓冲液（abs）、组氨酸缓冲液（hbs）中，在45℃放置28天，然后分别用反相层析（rp-hplc）、分子排阻层析（se-hplc）、阳离子交换层析（cex-hplc）分析溶液中的蛋白分布情况，并以未经45℃温育的初始样品作为对照，分析结果列示在表2。
16.表2 不同缓冲液对pan-p重组蛋白稳定性的影响
结果表明，从聚集体和电荷异质体形成情况来看，使用ph6.0的20 mm柠檬酸盐缓冲液（cbs）最有利于pan-p重组蛋白的稳定。
17.为了进一步优化缓冲液的浓度，分别采用20 mm、10 mm、5 mm的ph6.0柠檬酸盐缓冲液重复上述分析步骤，分析结果见表3。
18.表3 不同柠檬酸盐缓冲液对pan-p重组蛋白稳定性的影响结果表明，20 mm和10 mm浓度有相似的结果，而5 mm浓度的结果显著降低，因此选择10 mm的ph6.0柠檬酸盐缓冲液作为pan-p重组蛋白制剂的缓冲液。
19.实施例3、不同表面活性剂对目的蛋白稳定性的影响将pan-p蛋白分别以50 mg/ml的浓度溶解于添加不同浓度聚山梨酯20（peg20）、聚山梨酯80（peg80）的10 mm的ph6.0柠檬酸盐缓冲液中，在45℃放置28天，然后分别用反相层析（rp-hplc）、分子排阻层析（se-hplc）、阳离子交换层析（cex-hplc）分析溶液中的蛋白分布情况，并分别以未经45℃温育的初始样品和未添加聚山梨酯的样品作为对照，分析结果列示在表4。
20.表4 不同表面活性剂对pan-p重组蛋白稳定性的影响
上表中peg20、peg80的浓度单位为mg/ml。
21.结果表明添加非离子型表面活性剂peg20有助于增强pan-p在50 mg/ml浓度下的稳定性，其中1.0 mg/ml聚山梨酯20（peg20）的添加量取得了最好的结果。
22.实施例4、不同糖类对目的蛋白稳定性的影响将pan-p蛋白分别以50 mg/ml的浓度溶解于添加不同浓度糖类和1.0 mg/ml聚山梨酯20的10 mm、ph6.0柠檬酸盐缓冲液中，在45℃放置28天，然后分别用反相层析（rp-hplc）、分子排阻层析（se-hplc）、阳离子交换层析（cex-hplc）分析溶液中的蛋白分布情况，并分别以未经45℃温育的初始样品和未添加糖类的样品作为对照，分析结果列示在表5。
23.表5 不同糖类对pan-p重组蛋白稳定性的影响结果表明添加甘露醇对pan-p的稳定性改善最强，5%浓度甘露醇的效果优于1%甘露醇，因此选择5%（相当于50 mg/ml）甘露醇作为制剂组分。
24.实施例5、pan-p重组蛋白制剂在不同储存温度稳定性的检测将pan-p蛋白按照实施例1所述的配方和方法制成制剂，然后在-80℃、-20℃、4℃、25℃的条件下分别储存6个月，取出后分别用反相层析（rp-hplc）、分子排阻层析（se-hplc）、阳离子交换层析（cex-hplc）分析溶液中的蛋白分布情况，分析结果列示在表6。
25.表6 pan-p重组蛋白制剂在不同储存温度稳定性的检测结果表明该制剂在-80℃、-20℃、4℃的条件下储存6个月分子的分布基本无变化，se-hplc分析蛋白纯度仍在95%以上，聚集体、酸性峰、碱性峰比例无明显变化。但在25℃条件下储存6个月分子的分布略有值得关注的变化。
26.实施例6、酶联免疫法检测储存后的pan-p重组蛋白的结合能力按照专利申请cn201410724477.4“实施例1 pan的构建”所述的方法构建对照抗体pan，与pan-p相比，pan具有完全相同的可变区和恒定区，但是不带有封闭肽（在pan-p中轻链n端融合表达的封闭肽封阻了）。pan具有egfr结合活性，而pan-p须经upa（尿激酶型纤溶酶原激活物）蛋白酶切除封闭肽后才能释放出egfr结合活性。
27.采用elisa的方法检测实施例5中在-80℃、-20℃、4℃、25℃的条件下储存6个月的pan-p制剂在upa蛋白酶切割前和切割后的egfr亲和性，并以pan作为对照。
28.elisa检测方法如下：在 96 孔酶标板上包被溶于 pbs（ph=6.84）中的 egfr-fc 重组蛋白（500 ng/ml，张江生物技术公司），使用含有10%脱脂奶粉的pbs进行封闭。在室温下，使用经梯度稀释的待检抗体孵育1小时。接下来，在37℃条件下使用了辣根过氧化物酶（hrp）偶联的抗人f(ab’)2 抗体（1:5000, 西格玛）孵育 30 分钟，最后使用了tmb（四甲基联苯胺）进行了显色，450nm波长下读数。以od450对抗体浓度的对数作图，结果见图1（使用未经酶切的pan-p）、图2（使用经upa酶切的pan-p），并计算各个样品的ec50（半数效应浓度），计算结果见表7。
29.表7 elisa法检测不同温度下保存的pan-p样品的ec50值通过分析表明，在-80℃、-20℃、4℃条件下储存6个月的pan-p样品很好的保持了封闭肽的效果，并且经酶切后能释放出egfr亲和力，说明在使用实施例1所列配方后pan-p蛋白在-20℃至4℃的低温储存过程中很好的保持了结构的完整性和立体构象的正确性。