一种用于3D喷墨法高通量核酸原位合成的功能化表面处理方法与流程

一种用于3d喷墨法高通量核酸原位合成的功能化表面处理方法
技术领域
1.本发明涉及一种用于3d喷墨法高通量核酸原位合成的功能化表面处理方法，属于合成生物学领域。


背景技术：

2.高通量寡核苷酸合成作为合成生物学的有力工具。传统的寡核苷酸合成方法是基于亚磷酰胺化学的柱式合成，每个寡核苷酸是在单独一个合成管或在合成板中的一个柱子中合成的，每种核酸的产量较高，一般为nmol量级，但合成中消耗的试剂量多成本也高，合成通量有限。新一代dna合成技术主要是通过大规模平行合成技术实现了寡核苷酸的高通量合成。高通量寡核苷酸合成主要包括光化学芯片原位合成法、电化学原位合成法、微流控合成法和3d喷墨打印原位合成法等。光化学芯片原位合成受限于光敏脱保护单体的高成本和合成长度短的问题已经局限在基因芯片等极少量应用场景。电化学原位合成法由于合成错误率高的问题逐渐被淘汰。基于微流控的合成方法需要引入微泵微阀等使得其结构相对复杂操作麻烦效率降低，也未成为主流方式。基于玻片或硅片微阵列的3d喷墨打印法原位合成方法，合成的通量高，合成成本低，合成长度更长，逐渐成为目前主流的高通量寡核苷酸合成方式。
3.原位喷墨打印法的核心难点之一是解决在作为dna合成的载体的玻片或硅片基底表面如何不通过物理间隔实现每个液滴化学反应的独立分区，也就是通过表面的基团的疏水性和亲水性差异实现将液滴稳定在特定位置，或者说通过高低不同的表面自由能实现活性化学反应和惰性物理分区。目前的玻片处理法通常采用不同比例的硅烷化试剂，一般包括亲水硅烷和疏水硅烷的不同比例的混合。亲水硅烷提供的亲水基团用与后续亚磷酰胺单体反应以进行合成，疏水硅烷提供的疏水基团帮助液滴利用表面张力稳定在特定位置。玻片表面通常是均一的，均匀分布着大量的疏水基团和少量的亲水基团。这是因为其表面需要具备较强的疏水性以利于反应试剂即“墨滴”降落至玻片后维持良好的形态，从而保证不同种类的单体既能相互靠近，提高通量，又能互不干扰，提高序列准确性。然而，在玻片的处理过程中，疏水性的提升通常采用带有疏水基团的试剂对玻片上的亲水基团-羟基进行封闭化处理，但是羟基是dna合成的反应位点，这势必伴随着反应位点的减少，即每种序列dna分子产量的降低。概括地讲，传统的玻片处理方式存在亲水-疏水、产量-通量的对立统一关系。基于硅片表面的功能化表面处理利用复杂的光刻技术将100-300nm的电磁辐射通过特定图案化的掩膜来制造出特定的反应区域，使得非照射区域内包含低自由能的疏水分子，也就是合成惰性基团，照射区域内包含高自由能的亲水分子。但是该方法需要将光刻设备和打印设备整合，特别是在打印过程中需要复杂的校准才能报证打印落点精度的落到光刻后的活性区域。复杂精密的固定和对准装置使得设备成本很高。对准也就是合成活性基团，复杂的光刻掩膜和装置使得硅片处理成本显著增加。同时不透明的硅材料打印无法用于基因芯片等诊断产品开发。除了光学处理另外还有基于mems加热元件的局部处理用于高通量
dna合成的研究。上述用于3d喷墨法高通量核酸原位合成的功能化表面处理方法各有优劣，因此，需要继续开发新的能够满足相关应用需求的高效率低成本的用于3d喷墨法高通量核酸原位合成的功能化表面处理方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种用于3d喷墨法高通量核酸原位合成的功能化表面处理方法，经本发明处理后的表面可以利用多通道压电喷墨头组件同时进行液滴原位蚀刻以及后续将功能基团添加到表面进行无需校准的高效寡核酸合成，解决了目前需要利用复杂光刻技术和对准装置的功能化表面处理方法的高成本问题以及传统玻片的功能化表面处理方式的产量和通量无法同时提高的矛盾。
5.本发明所提供的用于3d喷墨法高通量核酸原位合成的功能化表面处理方法，包括如下步骤：
6.1)将基底的表面进行富羟基化处理；
7.2)在所述基底的表面修饰疏水性分子；所述疏水性分子不与亚磷酰胺单体反应；
8.3)采用多通道压电喷墨头组件将蚀刻墨水喷射到所述基底表面的预设区域进行微蚀刻；
9.所述蚀刻墨水采用氟盐类化合物配制；
10.所述氟盐类化合物与所述疏水性分子反应；
11.4)在所述基底的表面修饰亲水性分子，至此实现所述基底表面的功能化。
12.上述的方法中，所述基底为高纯石英玻璃片或设有二氧化硅涂层的硅片(如采用设有二氧化硅层的硅晶圆)，比如4英寸、5英寸、6英寸、8英寸、12英寸等规格。
13.上述的方法中，步骤1)中，采用食人鱼溶液进行所述富羟基化处理，可将所述基底在所述食人鱼溶液中室温下孵育10分钟～120分钟，过程中有大量气泡产生；
14.所述食人鱼溶液配制过程中会伴随剧烈的放热现象，应将过氧化氢小心沿烧杯内壁缓缓倒入浓硫酸并一直搅拌加快散热。
15.上述的方法中，步骤2)中，所述疏水性分子可为氟辛基三氯硅烷(perfluorooctyltrichlorosilane，fots)、(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷((tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane)或(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三甲氧基硅烷(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trimethoxysilane)。这些试剂均具备强疏水性同时能够高效封闭羟基。
16.上述的方法中，步骤3)中，所述氟盐类化合物指的是可以生成氟离子的含氟化合物，可为氟化铵、四丁基氟化铵、苯基三甲基氟化铵、三乙胺三氢氟酸盐(triethylamine trihydrofluoride)和氟化氢吡啶(pyridine hydrofluoride)中至少一种。
17.上述的方法中，步骤3)中，所述蚀刻墨水的溶剂具有如下特点：
18.1)对所述氟盐类化合物具有一定的溶解性；
19.2)形成的所述蚀刻墨水通过所述多通道压电喷墨头组件的喷头形成较好形态的墨滴；
20.所述蚀刻墨水的溶剂优选为聚丙烯碳酸酯、聚乙二醇、乙腈、2-甲基戊二腈和3-甲氧基丙腈中一种或多种的组合。
21.所述蚀刻墨水可以与所述基底的表面上修饰的第一层所述疏水性分子反应，也就是第一层疏水性分子在特定位置断裂产生活性基团，在特定图案化的打印区域经过所述蚀刻墨水湿法蚀刻后暴露出大量羟基，既可以增加反应位点也可以增加亲水性；而非打印区域依然保留强疏水的全氟硅烷分子(即疏水性分子)，形成的极大的亲疏水差异更有利于打印液滴形态的维持。
22.上述的方法中，步骤4)中，所述亲水性分子可为3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷、n-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷或3-碘-丙基三甲氧基硅烷；
23.所述亲水分子只与特定区域的羟基反应，不与第一层的所述疏水性分子反应。
24.修饰所述亲水性分子之后，可继续修饰长链spacer，其在打印后图案区域和所述亲水性分子结合，且只能与特定图案化区域的所述亲水性分子反应，不与第一层的所述疏水性分子反应，用以减少后续寡核苷酸合成时的空间位阻。然后修饰general linker分子在打印后图案区域和第三层的spacer分子结合，第四层的general linker分子只能在特定图案化区域的第三层的spacer分子反应，不与第一层的所述疏水性分子反应，用以后续合成寡核苷酸的亚磷酰胺单体连接，并可以方便从基底上裂解下来。
25.本发明采用的多通道压电喷墨头组件包括6组通道，每组通道包含180-256个独立喷嘴，其中第一通道用于活化剂tetrazole的喷墨打印，第二、第三、第四和第五通道用于四种亚磷酰胺单体的喷墨打印，包括2'-f-ac-dc亚磷酰胺单体，dmf-dg亚磷酰胺单体，def-da亚磷酰胺单体和tbb-dt亚磷酰胺单体，也可以为其他各类包含保护基团的亚磷酰胺单体。第六通道用于氟盐化合物蚀刻墨水的打印。这样直接用相同的多通道压电喷墨头组件进行后续高分辨率的亚磷酰胺单体和核酸合成。
26.通过本发明方法可在基底表面形成特定区域图案化的功能表面，然后可以直接用相同的多通道压电喷墨头组件进行后续高分辨率的亚磷酰胺单体和核酸合成。与目前同类方法比较无需昂贵的光刻设备与反复的位置校准设计，降低了合成成本；另外还可以提高功能化位点上的可用活性位点密度，提高单条寡核苷酸的产量。
附图说明
27.图1为使用以氟盐蚀刻墨水打印法图案化的过程中的化学反应式示意图。
28.图2a为多通道压电喷墨头组件的整体示意图。
29.图2b为多通道压电喷墨头组件的侧面透视示意图。
30.图2c为多通道压电喷墨头组件的底面透视示意图。
31.图3为氟盐蚀刻墨水打印法对两种不同涂层材料(疏水性分子层和亲水性分子层)对表面进行功能化的示意性工艺流程。
32.图4为氟盐蚀刻墨水打印法处理的功能化表面图案化的反应活性区(白色)和反应钝性区(灰色)示意图，其中寡核酸层从活性功能化的表面延伸。
33.图5a为第一至第六通道压电喷墨的打印到基底表面示意图。
34.图5b为第一至第六通道压电喷墨的打印到基底表面侧方透视示意图。
35.图6为氟盐蚀刻墨水打印法处理形成包含活化和钝化功能化的不同区域的图案化
表面的工作流程。
36.图7a为在氟盐蚀刻墨水打印法差异功能化处理之后的基底表面直接使用大量水蒸气处理自发形成的液体分布照片。
37.图7b为在氟盐蚀刻墨水打印法差异功能化处理之后的基底表面使用寡核苷酸合成用的亚磷酰胺单体墨水打印后液体分布照片。
38.图8为基于本发明氟盐蚀刻墨水打印法处理后的功能表面化基底上进行150个碱基的寡核苷酸合成后的寡核苷酸微阵列合成效果图。
具体实施方式
39.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
40.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.1.功能化表面的预处理
42.1.1高纯石英玻璃作为基底，主要成分是二氧化硅，以下简称玻片。
43.1.2玻片经去离子水超声清洗30min后于80℃烘干。
44.1.3将玻片浸入新鲜配制的食人鱼溶液中(h2so4/30％h2o2，体积比3：1)，室温下孵育1h，此时有大量气泡产生。注意，食人鱼溶液配制过程中会伴随剧烈的放热现象，应将过氧化氢小心沿烧杯内壁缓缓倒入浓硫酸并一直搅拌加快散热，该溶液腐蚀性非常强，应小心操作。
45.1.4上述玻片转移至新的染色缸中，以大量去离子水冲洗多次至废水近中性，然后以乙腈浸泡20s，取出后氮气快速吹干。
46.2.第一层疏水性分子的处理
47.2.1干燥的玻片浸入新鲜配制的0.02m的fots的二氯甲烷溶液，干燥气氛中室温孵育30min。
48.2.2然后取出玻片，依次用二氯甲烷和乙腈清洗，烘干备用。
49.3.氟盐化合物蚀刻墨水的制备
50.3.1配制方法为2m tbaf的聚丙烯碳酸酯溶液，以三氟乙酸逐滴加入，调整ph至近中性(ph＝6～7)，得到氟盐化合物蚀刻墨水。
51.4.打印刻蚀以及后处理过程
52.4.1以大量的无水乙醇洗去墨水以终止刻蚀反应的进行，吹干后，全玻片涂布gops(即第二层亲水性分子)或者general linker的dmf溶液，干燥气氛中室温反应过夜，以大量的乙腈溶液清洗，吹干备用。经过本步骤处理的玻片可以有效防止刻蚀区域的复疏水化，从而起到固定亲水基团的作用，同时general linker的加入可以使最终合成的寡核苷酸方便地从玻片上切割下来。
53.上述处理过程中发生的化学反应式如图1所示，从右列至左列依次是：第一步反应是在二氧化硅表面加上第一层疏水性分子，第二步反应是氟盐化合物选择性去除特定区域的疏水性分子，第三步反应是在特定区域选择性加上亲水分子层，第四步反应是在亲水分子层上加上spacer分子层，第五步反应是加上general linker分子用于寡核苷酸合成和后续切割。
54.本实施例采用6组通道的多通道压电喷墨头组件，每组通道包含180-256个独立喷
嘴，其中第一通道用于活化剂tetrazole的喷墨打印，第二、第三、第四和第五通道用于四种亚磷酰胺单体的喷墨打印，包括2'-f-ac-dc亚磷酰胺单体，dmf-dg亚磷酰胺单体，def-da亚磷酰胺单体和tbb-dt亚磷酰胺单体，第六通道用于氟盐蚀刻墨水的打印。多通道压电喷墨头组件的整体示意图如图2a所示，其侧面透视示意图如图2b所示，底面透视示意图如图2c所示。6组通道打印到基底表面示意图如图5a所示，侧方透视示意图如图5b所示。
55.图3为氟盐蚀刻墨水打印法对两种不同涂层材料对表面进行功能化的示意性工艺流程(与图1的不同之处在于从表面的特定区域角度看)，第一步代表疏水性分子层的处理(a-b)，第二步代表氟盐化学物选择性蚀刻处理(b-c)第三步代表加入亲水性分子层(c-d)，第四部代表在亲水层上加入合成寡核苷酸用的连接层(d-e)。
56.图4为经本实施例氟盐蚀刻墨水打印法处理的功能化表面图案化的反应活性区(白色圆圈内区域代表反应活性区)和反应钝性区(灰色)的示意图，其中寡核酸层从活性功能化的表面延伸。
57.图6为经本实施例氟盐蚀刻墨水打印法形成包含活化和钝化功能化的不同区域的图案化表面的流程示意图，第一步代表疏水性分子层的处理(a-b)，第二步代表氟盐化学物选择性蚀刻处理(b-c)，第三步代表加入亲水性分子层和合成寡核苷酸用的连接层寡核酸在该表面的活性功能化区域上合成(c-d，图示的黑色十字填涂区域)。
58.图7a为在本实施例氟盐蚀刻墨水打印法差异功能化处理的基底表面，直接使用大量水蒸气处理自发形成的液滴分布照片，可以看出，图案化区域显示高度亲水性，而其他区域疏水性，可以用于后续寡核苷酸合成。
59.图7b为在本实施例氟盐蚀刻墨水打印法差异功能化处理的基底表面，使用寡核苷酸合成用的亚磷酰胺单体墨水打印后的液滴分布照片，可以看出，用于合成的图案化区域显示良好的液滴形态。
60.图8为基于本实施例氟盐蚀刻墨水打印法处理后的功能表面化基底上进行150个碱基的寡核苷酸合成，最后一个碱基使用cy3荧光标记的单体进行指示，显示的寡核苷酸微阵列合成效果图，由该图可以看出，经过150轮合成后寡核苷酸合成特征点依然会保持良好的形态，合成的最后一个碱基用荧光标记提示多重反复冲洗后本发明功能化表面处理依然正常该方法可以成功用于高通量长链寡核苷酸的合成。