一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。


背景技术：

2.被子植物雌雄配子的发育，都是由大孢子母细胞经过减数分裂，最终形成精细胞与卵细胞，通过受精作用结合，发育成为新的个体植株。植物的双受精过程，是花粉传播到柱头时，花粉管经过珠孔进入珠心，最后进入胚囊，一个精细胞与中央细胞结合，发育成为胚乳，另一个精细胞与卵细胞结合最终发育成为胚。大孢子母细胞是由紧接表皮下的珠心组织的细胞分化产生的，此细胞比周围的细胞大，细胞质丰富，可产生核大的孢原细胞，有的能直接成为胚囊母细胞，有的可成为覆盖细胞和胚囊母细胞。拟南芥的雌配子体是由一个孢原细胞（二倍体体细胞）经过减数分裂、有丝分裂和细胞分化发育而成。拟南芥雌配子体发育分为两个阶段：一是大孢子发生阶段，胚珠原基顶端的1个亚表皮细胞分化形成大孢子母细胞，大孢子母细胞经过一次减数分裂形成4个单倍体大孢子，随着发育进行，处在珠孔端的3个大孢子退化，仅剩合点端的一个大孢子即功能大孢子幸存并参与雌配子体发生；二是雌配子体发生，功能大孢子的形成开始，其经过三次连续核有丝分裂形成合胞体，再经过细胞化，最终形成“七胞八核”的雌配子体（胚囊）的过程。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供可以用于在大孢子母细胞外围细胞可诱导的表达目标基因的系统：ipwrky28-venus，其特征是该系统所驱动的蛋白只在有诱导剂存在的情况下在大孢子母细胞外围细胞中特异性表达。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案构建该系统：一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统，以pwrky28与报告基因venus连接构建载体，构建细胞特异性诱导表达系统，导入拟南芥植株中，在诱导剂存在的条件下，观察报告基因在胚珠的不同时期的荧光表达情况，得到一个大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。所述报告基因venus序列如seq id no:1所示；所述pwrky28序列如seq id no:2所示。
5.所述载体的构建方法具体包括以下步骤：1）根据at4g18170 基因全基因组序列设计扩增pwrky28的引物，利用引物从拟南芥中扩增wrky28基因的启动子；引物序列：forward primer：ctaggcgatcgccacatcaccaaaagttatcctctc；reversed primer：gatccgtcgacggggtgaagaacaatgaagagagagg；2）采用sfaa1合sgrdi双酶切pwrky28片段，并回收带有粘性末端的启动子片段pwrky28；
3）采用sfaa1合sgrdi双酶切pigl载体骨架，并回收载体骨架pigl；4）t4-dna连接酶连接pigl载体骨架和pwrky28，转化大肠杆菌db3.1挑选单克隆，得到ipwrky28-gl载体；5） ipwrky28-gl载体与penter-venus载体lr交换反应，转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆，提取质粒，得到pwrky28：：vge-5
×
gal4 dna：：venus。
6.所述诱导的方法具体包括以下步骤：（1）将权利要求1所述载体导入农杆菌并转化拟南芥，提取t1代植株dna，进行pcr鉴定，取阳性苗植株诱导；（2）诱导前，对目标植株停止浇水三天，让栽培基质适当干燥。
7.（3）诱导时，配置浓度为200 ug/l methoxyfenozide作为诱导剂，将对目标植株地上部分放在诱导液中浸泡60s，然后用诱导液浇灌栽培基质致其吸水饱和，2小时后用诱导液对植株的花序进行喷雾诱导；（4）诱导后，培养24小时取胚珠观察荧光情况；（5）诱导表达并观察vennus信号。
8.本发明的优点在于：（1）实现mmc外围细胞诱导性显示的marker。
9.（2）实现诱导性的mmc外围细胞特异性的蛋白表达，通过置换vennus为目标蛋白cds实现。
10.（3）诱导性的系统中，目标基因已经转入基因组中，但是处于静默状态，只有当诱导剂存在的情况下才启动表达，在植物生物学科学研究中有重要价值；此系统能够克服组成型表达和细胞特异性表达导致致死无法得到后代的情况，也可以通过诱导表达致死基因，通过诱导剂的喷施导致雌性败育，具有农业生产中的潜在应用价值。
附图说明
11.图1是本发明观察到的mmc外围细胞表达情况。
12.图2为诱导表达系统示意图。
具体实施方式
13.本发明的目的是为了开发研究一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。具体实施如下：以pwrky28与报告基因venus连接构建载体，构建细胞特异性诱导表达系统，导入拟南芥植株中，在诱导剂存在的条件下，观察报告基因在胚珠的不同时期的荧光表达情况，得到一个大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统（图2），报告基因venus序列如seq id no:1所示。
14.诱导方法如下：
⑴ꢀ
将权利要求1所述载体导入农杆菌并转化拟南芥，提取t1代植株dna，进行pcr鉴定，取阳性苗植株诱导；
⑵ꢀ
诱导前，对目标植株停止浇水三天，让栽培基质适当干燥。
15.⑶ꢀ
诱导时，配置浓度为200 ug/l methoxyfenozide作为诱导剂，将对目标植株地
上部分放在诱导液中浸泡60s，然后用诱导液浇灌栽培基质致其吸水饱和，2小时后用诱导液对植株的花序进行喷雾诱导；
⑷ꢀ
诱导后，培养24小时取胚珠观察荧光情况。
16.对这些转基因植株进行观察发现，vennus能在mmc外围细胞中诱导性表达（图1）。
17.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。


技术特征：
1.一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统，其特征在于，以pwrky28与报告基因venus连接构建载体，构建细胞特异性诱导表达系统，导入拟南芥植株中，在诱导剂存在的条件下，观察报告基因在胚珠的不同时期的荧光表达情况，得到一个大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统；所述报告基因venus序列如seq id no:1所示；所述pwrky28序列如seq id no:2所示。2.根据权利要求1所述的大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统，其特征在于，所述载体的构建方法具体包括以下步骤：1）根据at4g18170 基因全基因组序列设计扩增pwrky28的引物，利用引物从拟南芥中扩增wrky28基因的启动子；2）采用sfaa1合sgrdi双酶切pwrky28片段，并回收带有粘性末端的启动子片段pwrky28；3）采用sfaa1合sgrdi双酶切pigl载体，并回收pigl载体骨架；4）t4-dna连接酶连接pigl载体骨架和pwrky28，转化大肠杆菌db3.1挑选单克隆，得到ipwrky28-gl载体；5） ipwrky28-gl载体与penter-venus载体lr交换反应，转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆，提取质粒，得到pwrky28：：vge-5
×
gal4 dna：：venus。3.根据权利要求1所述的大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统，其特征在于，所述诱导的方法具体包括以下步骤：（1）将权利要求1所述载体导入农杆菌并转化拟南芥，提取t1代植株dna，进行pcr鉴定，取阳性苗植株诱导；（2）诱导前，对目标植株停止浇水三天，让栽培基质适当干燥；（3）诱导时，配置浓度为200 ug/l methoxyfenozide作为诱导剂，将目标植株地上部分放在诱导液中浸泡60s，然后用诱导液浇灌栽培基质致其吸水饱和，2小时候后用诱导液对植株的花序进行喷雾；（4）诱导后，培养24小时取胚珠观察荧光情况；（5）诱导表达并观察vennus信号。

技术总结
本发明的目的是为了开发一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。以pWRKY28驱动人工转录因子VGE表达，构建细胞特异性诱导表达系统，并将报告基因Vennus构建到表达系统中，导入拟南芥植株中，观察它们在胚珠的不同时期，特别是MMC时期的表达情况，得到一个大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。


技术研发人员：程焱 秦源 杨攀 熊俊杰 林志斌
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2021.09.14
技术公布日：2022/2/24