检测牙鲆抗病力的引物、重组蛋白及其应用的制作方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及检测牙鲆抗病力的引物及其在牙鲆抗病品种选育中的应用。


背景技术：

2.rho-gtp酶属于小g蛋白家族，在哺乳动物中已发现大约20种，分为8个亚家族，按作用形式可分为典型成员与非典型成员
[1,2]
：典型成员如cdc42、rac1和rhoa，在与gdp结合的非活性状态和与gtp结合的活性状态之间循环
[3]
；非典型成员如rnd，主要以活性gtp结合状态存在
[4]
。rho-gtp酶参与了许多重要的细胞过程，如细胞骨架构建、囊泡运输、细胞黏附、转录、细胞增殖、分化、吞噬、凋亡和nadph氧化酶的激活，并在病原体感染过程中起到一定作用。
[0003]
rnd亚家族是rho-gtp酶家族中的非典型成员，包括rnd1(rho6)、rnd2(rho7/rhon)、rnd3(rho8/rhoe)，不能水解gtp，以活性gtp结合状态存在，其表达水平易受gtp酶表达修饰的调控，因此受多种生长因子及激素诱导
[5]
。其中，rnd1 mrna在胎儿脑、肺、肝、肾内表达，在成人脑组织和肝中高表达，在大鼠大脑、肝脏和睾丸中表达，但在肌肉中不表达
[4]
。rnd蛋白与效应蛋白相互作用，激活调节各种细胞过程的信号通路
[6]
。rnd1有许多生物学功能，可通过降低肌球蛋白的收缩性对细胞形态产生影响，调节肌动蛋白细胞骨架，参与神经连接的形成，影响轴突延伸，参与细胞黏附调控、膜运输，参与肿瘤发生与迁移，并与神经细胞凋亡有关。
[0004]
rnd 1在哺乳动物中的功能已经被大量证实，但在鱼类几乎没有研究，仅有对斑马鱼基因组序列数据库进行的分析。牙鲆(paralichthys olivaceus)是一种重要的海水养殖鱼类，属鲽形目(pleuronectiformes)、鲆科(bothidae)、牙鲆亚科(paralichthyinae)、牙鲆属(paralichthys)，生长速度快、个体大、肉质鲜美且繁殖力强，深受消费者和养殖户欢迎，经济价值很高，广泛养殖于中国、日本和韩国等亚洲国家。但近年来随着牙鲆养殖产业的不断壮大，各类疾病也开始频繁爆发，从牙鲆苗种到养成阶段几乎均有病害的发生，死亡率可达80％，给养殖户造成了巨大的经济损失。其中由迟缓爱德华氏菌(edwardsiella tarda)感染牙鲆后引起的腹水病是牙鲆感染的主要细菌病，夏季7
–
8月水温20℃以上为发病高峰期，水温越高，发病期越长，一旦发病，易与多种细菌混合感染，引起较高的死亡率。
[0005]
鱼类细菌性疾病主要以使用抗生素预防为主，而引起的细菌抗逆性以及食品安全问题限制了抗生素的使用，所以通过改良鱼类种质资源，提高其天然抗病力成为重要的技术手段。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的技术问题在于提供了检测牙鲆抗病力的引物。通过对牙鲆感染实验中抗病家系和易感家系进行gwas、gblup综合分析，筛选得到了rnd1基因，推测其可能与免疫抗病功能相关。因此，本项目对牙鲆rnd1基因进行克隆、鉴定，分析其在牙鲆不同健康
组织中的相对表达量，以及进行哈维氏弧菌和迟缓爱德华氏菌感染后肝和肾组织中不同时间点的表达分析，并做后续蛋白抑菌活性实验等验证其免疫抗病功能。
[0007]
本发明是通过如下技术方案来实现的：
[0008]
一种用于检测牙鲆抗病力的引物，所述的引物序列为snp-rnd1-fcagaggaacagcggaatagt，snp-rnd1-rgctccccaaaaggtaagata。
[0009]
本发明还提供所述引物在牙鲆抗病品种选育中的应用，所述引物是基于牙鲆rnd1基因序列gene id:1009635213，利用所述引物进行pcr扩增，扩增的目标片段大小为439bp，所述引物扩增产物定位在牙鲆rnd1基因的4157bp处的碱基序列为[c/t]，选择出具有特异性扩增目的片段的个体作为亲本，进行牙鲆抗病新品种的选育。
[0010]
进一步，所述的pcr反应体系：cdna 1μl，tb green premix ex taq 10μl，rox reference dyeⅱ0.4μl，正反引物各0.8μl，ddh2o 7μl；反应程序95℃30sec，40个循环：95℃5sec，60℃34sec。
[0011]
本发明还提供一种具有抗病性状的重组蛋白，所述蛋白是基于牙鲆rnd1基因序列seq ip no.3(gene id:1009635213)重组获得，重组蛋白的序列如seq ip no.4所示。
[0012]
本发明还提供所述重组蛋白在制备防治牙鲆细菌病生物药品中的应用。
[0013]
本发明与现有技术相比的有益效果：
[0014]
利用本发明所述引物，筛选出具有目标片段的的牙鲆个体，有利于加快牙鲆抗病力新品种的培育；本发明发现基于牙鲆rnd1基因获得重组蛋白对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌均具有抑制作用，因此，所述重组蛋白在制备牙鲆细菌病生物防治药品中具有应用前景。
附图说明
[0015]
图1为rnd1基因序列；
[0016]
图2为构建rnd1氨基酸系统发育树；
[0017]
图3为rnd1基因在牙鲆各组织中表达量比较；
[0018]
图4注射迟缓爱德华氏菌后不同时间牙鲆的肾脏、肝脏rnd1相对表达量；
[0019]
图5为rnd1基因在抗病和易感家系中的表达差异；a：2014年家系，b：2015年家系。
[0020]
图6为牙鲆rnd1蛋白的抑菌实验：金黄葡萄球菌(a)、大肠杆菌(b)、迟缓爱德华氏菌(c)、哈维氏弧菌(d)，r为rnd1蛋白，p为pbs阴性对照，k为卡那霉素阳性对照，a为氨苄青霉素阳性对照；
[0021]
图7为rnd1基因中抗病snp位点的定位。
具体实施方式
[0022]
为使本发明的特征及优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细说明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0023]
实施例1牙鲆抗病基因的筛选
[0024]
dna、rna提取及cdna第一链合成
[0025]
dna提取用天根海洋动物组织基因组提取试剂盒进行，实验方法参照说明书。
[0026]
使用trizol法提取rna，1％琼脂糖凝胶电泳观察各组织rna条带，检测其完整度，使用dna/proteins analyzer p100测定rna浓度及相关比值，选择质量较好、条带完整的rna用于后续cdna的合成。
[0027]
使用takara prime script rt r reagent kit with gdna eraser反转录试剂盒合成cdna第一链，首先去除基因组dna，pcr体系：gdna clean reagent 1μl，5
×
gdna clean buffer 2μl，总rna 1mg，rnase free water补足10μl体系；反应条件42℃2min。再进行反转录反应，pcr反应体系：上一步反应液10μl，evo m-mlvrtase enzyme mix 1μl，rt primer mix 1μl(表1中的引物)，5
×
rtase reaction buffer mixⅰ4μl，rnase free water 4μl；反应条件37℃15min，85℃5sec。合成的cdna用actin内参基因引物(表1)做pcr反应验证质量，pcr反应体系：cdna 1μl，takara ex taq 10μl，正反引物各1μl，ddh2o7μl；反应条件34个循环：94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，经1％琼脂糖凝胶电泳，观察条带，选择质量好的cdna用于后续基因克隆及荧光定量实验。
[0028]
表1引物序列
[0029][0030]
4生物学分析
[0031]
使用dnastar7.0和dnaman软件进行序列合成，得到牙鲆rnd1基因cdna序列，ncbi orf finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)确定其开放阅读框并预测氨基酸序列，牙鲆rnd1 cdna开放阅读框为699bp，编码232个氨基酸。预测蛋白分子量为26kd(图1所示)。根据相似物种rnd1的结构分析，在牙鲆rnd1蛋白属于p-loop_ntpases超家族(accession number：cl38936)，分别在20-27位、45-47位、67-70位、125-128位、168-170位分别是g1 box，g2box，g3 box，g4 box和g5 box位点；在22-28，70-73，125-126，168-170处存在gtp/mg2 结合位点；在48-50位，69-70和86-87位存在switch i region和switch ii region。
[0032]
从ncbi上检索不同生物rnd1蛋白序列(表2)，利用blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行同源性比对，运用mega7软件，采用邻位相接法(nj法)构建氨基酸系统发育树(图2)，并设置bootstrap重复1000次，计算各分支的置信度。
[0033]
表2
[0034][0035]
实施例2荧光定量pcr
[0036]
在海阳实验基地随机选取6尾健康牙鲆，麻醉后取其10种组织：肝、脾、肾、肠、鳃、肌肉、皮肤、心脏、脑以及血液。分别放入冻存管中，立即投入液氮中速冻，随后转移到-80℃冰箱，用于rna的提取。
[0037]
根据本实验室前期建立的方法[wanglei proteome profiling reveals immune responses in japanese flounder(paralichthys olivaceus)infected with edwardsiella tarda by itraq analysis]，对牙鲆进行迟缓爱德华氏菌感染，分别取感染后5个时间点(0h、6h、12h、24h和48h)的牙鲆各6条。以pbs为对照，在相同时间点各取6条。麻醉后解剖取肝脏、脾脏、肾脏等组织，分别放入冻存管中立即投入液氮中速冻，随后转移到-80℃冰箱，用于rna的提取。
[0038]
根据牙鲆rnd1基因的orf序列，合成荧光定量pcr引物(表1中的引物ex-rnd1-f，ex-rnd1-r)，以牙鲆actin基因为内参基因，使用takara tbpremix ex taq
tm
，利用abi 7500fast荧光定量pcr仪进行荧光定量实验，测定牙鲆rnd1基因在脾、肝、肾、头肾、肠、心、鳃、皮肤、肌肉、血液中的相对表达量，pcr反应体系：cdna 1μl，tb green premix ex taq 10μl，rox reference dyeⅱ0.4μl，正反引物各0.8μl，ddh2o 7μl；反应程序95℃30sec，40个循环：95℃5sec，60℃34sec。每个组织设置5个生物重复，采用2-δδct
方法计算
rnd1的相对表达量，利用origin绘制各组织相对表达量图，用spss进行显著性检验。分析组织表达特异性，发现rnd1在牙鲆心脏、肝脏、肾脏、头肾、脾脏中表达量较高，在肠、皮肤、血液、鳃、肌肉中表达量较低(图3)。
[0039]
(显著性)
[0040]
以牙鲆actin基因为内参基因，使用相同方法测定牙鲆rnd1基因在pbs注射、迟缓爱德华氏菌感染处理后0h、6h、12h、24h、48h肝脏、肾脏中的相对表达量，反应体系同上。每组设置3个生物重复，采用2-δδct
方法计算rnd1的相对表达量，利用origin绘制不同时间点两个相对表达量对比图，用spss进行显著性检验。分析肾脏、肝脏rnd1相对表达量，对照组与0h感染组表达量无明显差异，0h到6h表达量降低，6h后表达量逐渐升高，在肾中感染后48h时rnd1表达量极显著高于6h、12h时(如图4所示)。可见，在排除注射对鱼体影响的情况下，细菌侵袭造成了组织中pornd1表达量降低；随感染时间增加，pornd1表达量上升，以抵抗细菌侵袭。
[0041]
实施例3抗病家系及易感家系筛选及样品采集
[0042]
2014年9月-10月在海阳基地实验隔离区进行的牙鲆感染实验，筛选牙鲆抗病家系f1421和易感家系f1441，两个家系的感染存活率分别为47.06％和11.11％。2015年筛选牙鲆抗病家系f1501和易感家系f1544，两个家系的感染存活率分别为80.72％和8.54％。每年在感染实验后，采集抗病家系和易感家系未经感染的鱼苗各5条，麻醉后取肝脏组织，在液氮中速冻后放入-80℃冰箱中保存，用于提取rna。同时采集鱼苗的鳍条，放入酒精中保存用于提取dna。
[0043]
应用实施例1所述的dna提取方法提取各样品的dna。
[0044]
应用实施例2所述的荧光定量pcr方法检测牙鲆rnd1基因在抗病和易感家系中的表达模式。结果证明牙鲆rnd1基因在2014年和2015年抗病家系中的表达量均显著高于易感家系。见图5。
[0045]
实施例4牙鲆rnd1基因原核表达及纯化
[0046]
对牙鲆rnd1基因编码的蛋白进行结构分析，设计引物(表1中的引物ex-rnd1-f，ex-rnd1-r)，以牙鲆肝脏cdna(实施例1所述方法获得)为模板扩增rnd1编码区全长序列696bp，将pcr产物纯化后连入pet-t1载体，送入公司测序，将测序正确的阳性质粒(pet-t1-rnd1)进行扩增和纯化，双酶切后连入同样酶切的pet-his载体。将pet-his-rnd1转化大肠杆菌rosetta2(de3)，挑取单克隆进行测序。将阳性单克隆进行扩大培养，在菌液浓度od
600
＝0.6时加入终浓度1mm的iptg，在18℃振荡培养18小时，诱导蛋白表达。使用sds-page电泳方法检测蛋白表达。确定培养温度和培养时间后，使用200ml菌液进行蛋白大量表达和纯化，采用镍柱法纯化重组蛋白，测定蛋白浓度为1mg/ml。
[0047]
实施例5牙鲆rnd1重组蛋白的体外抑菌实验
[0048]
使用金黄葡萄球菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌进行抑菌试验。取1ml菌液加入到200ml lb液体培养基中，37℃180rpm恒温振荡培养6h。将菌液用pbs缓冲液洗涤，使用分光光度计测定菌液od600值。将菌液稀释1000倍，取100μl均匀涂布到tsb固体培养基上，用无菌镊子将灭菌干燥后的牛津杯置于平板表面，轻轻按压固定。吸取100μl0.5 mg/ml的rnd1蛋白加入牛津杯中，阴性对照组为100μlpbs；迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌组阳性对照组为100μl氨苄青霉素，金黄葡萄球菌、大肠杆菌组阳性对照组为50μl卡那霉素。
放入恒温培养箱37℃培养12h，观察细菌生长状况，并使用游标卡尺测量抑菌圈大小。如图6所示。利用牛津杯法进行重组蛋白体外抑菌实验，发现rnd1重组蛋白对培养的金黄葡萄球菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌均有一定的抑菌活性。
[0049]
实施例6牙鲆rnd1基因snp位点与抗病力的关联分析
[0050]
通过gwas分析，在牙鲆14号染色体的的4,575,720bp处定位到1个snp位点，该位点的信息为[c/t]。利用牙鲆基因组进行snp位点的精细定位，该位点定位在牙鲆rnd1基因的4157bp处。经过基因结构分析和序列比对，牙鲆rnd1基因包含5个外显子，分别为123bp、87bp、108bp、136bp和245bp；4个内含子分别为647bp、3700bp、201bp和126bp，snp位点位于内含子2上。在snp位点上、下游设计引物，以实施例3所述的牙鲆2014年抗病和易感家系dna为模板，进行snp位点区域的扩增。扩增结果见图7。