聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料、其制备方法及其用途与流程

聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料、其制备方法及其用途
技术领域
1.本发明涉及细胞材料制备领域，具体涉及聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料的制备方法及其用作非胰酶消化细胞培养材料的用途。


背景技术：

2.在组织工程和生物医学工程中，大量生产种子细胞的方法是在体外多次培养和收获干细胞。近来发现，不依赖贴壁的细胞，例如：脂肪干细胞（adsc）、间充质干细胞（msc）和胚胎干细胞（esc），也能够在细胞培养基底上粘附生长，由于细胞贴壁十分紧密，从而导致分离困难。目前最常用的细胞分离方法包括酶消化和机械解离，但反复使用酶消化和机械解离会引起传代细胞干性逐渐丧失，其中酶消化通过去除细胞粘附所需的表面蛋白和离子使细胞脱落，这便是造成细胞干性丧失的主要原因。因此需要寻找新的细胞收获方法，来弥补当前技术的不足。
3.热敏性聚（n-异丙基丙烯酰胺）（pinpam）是一种常见的热响应性高分子材料，经其修饰过的基底在温度高于聚合物浊点时，表面相对疏水，温度低于聚合物浊点时，表面相对亲水。利用细胞在疏水表面（温度高于浊点）上粘附生长，从亲水表面（温度低于浊点）上自动分离的性质，仅通过降低培养温度就可以从培养基底上分离出完整的细胞。另外通过加入其他共聚单体，可以精确调节聚合物的浊点温度，这使它成为细胞非胰酶收获技术的理想选择，但其在实际使用过程中，现有的热敏性聚（n-异丙基丙烯酰胺）在聚丙烯等培养载体表面的嫁接效率不高，操作复杂、成本较高，以及聚（n-异丙基丙烯酰胺）本身相变迟滞的问题。


技术实现要素：

4.为了克服上述问题，本发明目的在于提供一种聚（n-异丙基丙烯酰胺）嫁接的聚丙烯载体材料、制备方法及其用作非胰酶消化细胞培养材料的用途，该复合物能够在收获细胞时最大限度的保留细胞外基质，以解决细胞收获中使用酶消化和机械解离所造成的细胞损伤问题。
5.本发明技术方案如下：聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料，是通过原位自由基聚合的方法，在经过等离子体处理的聚丙烯表面均匀地接枝一层聚（n-异丙基丙烯酰胺）嫁接层，厚度在1-10μm之间可调。当环境温度在32℃以上时，呈现疏水性，当环境温度在32℃以下时呈现亲水性，从而通过改变环境温度实现聚丙烯载体材料表面的亲疏水性的调控，进而应用于细胞的收获。
6.聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料的制备方法，是在n2气氛下，以n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸、多巴胺甲基丙烯酸酯（dma）为共聚单体，以去离子水或dmf为溶剂，以过硫酸铵(aps)或偶氮二异丁腈(aibn)为引发剂，通过自由基聚合原位接枝到聚丙烯
表面，得到聚（n-异丙基丙烯酰胺）；然后进一步通过edc/nhs的方法负载可促细胞生长的rgd三肽。
7.引发剂与单体的总的摩尔比为1：100~1：300，在60~70℃下反应进行8-16小时。
8.较佳地，引发剂与单体的总的摩尔比为1：300~1：200。
9.聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料的制备方法，具体包含以下步骤：步骤一：将聚丙烯材料置于二氯甲烷超声清洗或搅拌清洗以除去各种添加剂，然后在烘箱中干燥；步骤二：将上述聚丙烯材料通过氧等离子体处理，备用；步骤三：取n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸和dma加入去离子水或n,n-二甲基甲酰胺中，通入氮气搅拌；步骤四：加入偶氮二异丁腈(aibn)或过硫酸铵(aps)和步骤二中处理过的聚丙烯材料，大于65℃反应8-24小时；步骤五：取出步骤四反应后的聚丙烯材料，在蒸馏水中清洗、干燥，获得了表面具有热敏性的聚丙烯材料，可用于细胞的培养和分离。
10.步骤六：将步骤五反应获得的聚丙烯材料继续放在去离子水里，加入edc/nhs，并加入rgd室温下反应6小时，取出并用去离子水清洗，就获得了表面嫁接有rgd的聚丙烯材料。修饰rgd有助于细胞在表面的生长。
11.聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料用于非胰酶消化细胞培养，通过降低培养温度，即可促使细胞从基底上脱落，脱落效率可以达到95%以上，避免使用胰酶消化或机械解离，最大限度地保留细胞活力以及细胞外基质，并减少细胞损伤，在大规模细胞培养以及组织工程中具有重要的应用价值。
12.有益效果：本发明采用的原料价格低廉，合成简单，可以进行规模化生产。本发明中所使用的材料与其他的细胞收获技术相比能够节省成本，简化生产工序，降低生物污染的风险。
附图说明
13.图1、实施例1所得聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体的sem照片，可见在聚丙烯的表面形成一层聚（n-异丙基丙烯酰胺）嫁接层，外观显示粗糙的表面。
14.图2、实施例1所得聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体的反射fitr光谱图，在1720cm-1
是典型的酰胺键的吸收，证实了聚（n-异丙基丙烯酰胺）嫁接层的存在。
15.图3、实施例3所得负载有rgd的载体材料用于l929细胞培养的形态图（72h），结果说明在37℃条件下，l929细胞可以很好地黏附在本发明的表面为疏水性的聚丙烯载体材料上，且生长状态良好。
16.图4、降温后细胞脱落后的载体（上图）以及l929细胞培养的形态图（72h）(降低温度吹打后)（下图），结果说明，当温度降低到32℃以下时，这里为室温，（25℃）载体表面变为亲水性，l929细胞可以从载体表面脱落，效率达95%以上。
具体实施方式
17.以下将结合实施例说明本发明的技术方案：
实施例11.将 0.5 g 聚丙烯颗粒（或微球）, 用二氯甲烷清洗三次，每次 20 ml，清洗时间 3 小时，并在 40℃ 条件下干燥 24 小时。
18.2. 将上述聚丙烯材料通过氧等离子体处理 2 分钟。
19.3. 取4.8 mmol n-异丙基丙烯酰胺加入40 ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，通入氮气鼓泡并搅拌20分钟。
20.4. 取1.2mmol的dma溶于步骤3所述溶液中，并分别加入0.033g偶氮二异丁腈(aibn)，步骤2中的聚丙烯材料，65℃环境中反应8小时。
21.5. 取出步骤4中的聚丙烯材料，在蒸馏水中清洗10分钟，40℃鼓风干燥箱中干燥12小时。经上述程序处理后，即获得表面具有热敏性的聚丙烯颗粒 (图1)。聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体的反射fitr光谱图，在1720cm-1
是典型的酰胺键的吸收，证实了聚（n-异丙基丙烯酰胺）嫁接层的存在 (图2)。
22.6．将步骤5制备的聚丙烯载体裁剪成与96孔板空径大小相同的圆片, 在紫外光照下下正反灭菌12h后， 放入96孔板，加入细胞密度4
×
10
4 含有完dmem的l-929细胞，在37℃培养24h，48h，72h.。然后在光镜下直接观察。
23.实施例2与实施例1不同之处在于，共聚单体中增加了丙烯酸单体，一方面可以调节聚（n-异丙基丙烯酰胺）的lcst温度以及收缩程度，另一方面引入活性官能团羧基。
24.1.将 0.5 g 聚丙烯颗粒（或微球）, 用二氯甲烷清洗三次，每次 20 ml，清洗时间 3 小时，并在 40℃ 条件下干燥 24 小时。
25.2.将上述聚丙烯材料通过氧等离子体处理 2 分钟。
26.3，是取4.8 mmol n-异丙基丙烯酰胺和0.1 mmol丙烯酸加入40 ml 去离子水中，通入氮气鼓泡并搅拌20分钟。
27.4.取1.2mmol的dma溶于步骤3所述溶液中，并分别加入0.033g过硫酸铵(aps)以及步骤2中的聚丙烯材料，65℃环境中反应8小时。
28.5.将步骤4反应后的聚丙烯材料取出，并在蒸馏水中清洗10分钟，40℃环境中干燥12小时。经上述处理程序后，即获得表面具有热敏性的聚丙烯颗粒。
29.6.将步骤5制备的聚丙烯载体裁剪成与96孔板空径大小相同的圆片, 在紫外光照下下正反灭菌12h后， 放入96孔板，加入细胞密度4
×
10
4 含有完dmem的l-929细胞，在37℃培养24h，48h，72h.。然后在光镜下直接观察。该实施例的目的在于考察共聚单体丙烯酸对于嫁接层亲水性和收缩率的影响。
30.实施例31.将 0.5 g 聚丙烯网（或微球）, 用二氯甲烷清洗三次，每次 20 ml，清洗时间 3 小时，并在 40℃ 条件下干燥 24 小时。
31.2.将上述聚丙烯材料通过氧等离子体处理 2 分钟。
32.3.称取4.8 mmol n-异丙基丙烯酰胺和0.1 mmol丙烯酸加入40 ml 去离子水中，通入氮气鼓泡并搅拌20分钟。
33.4.取1.2 mmol的dma溶于步骤3所述溶液中，并分别加入0.033g过硫酸铵(aps)，步骤2中的聚丙烯材料，65℃环境中反应8小时。
34.5.取出步骤4中的聚丙烯材料，在蒸馏水中清洗10分钟，然后放入100ml的去离子水中，加入edc/nhs(1:1)和 c(rgd)fk，室温下反应8小时。
35.6．将步骤5反应后的聚丙烯材料取出，并在蒸馏水中清洗10分钟，40℃环境中干燥12小时。经上述处理程序后，即获得表面具有热敏性的聚丙烯颗粒。
36.7．将步骤6制备的聚丙烯载体裁剪成与96孔板空径大小相同的圆片, 在紫外光照下下正反灭菌12h后， 放入96孔板，加入细胞密度4
×
10
4 含有完dmem的l-929细胞，在37℃培养24h，48h，72h.。然后在光镜下直接观察。结果显示聚丙烯载体表面负载有rgd后，能显著促进l-929细胞的生长（图3）。
37.实施例4本实施例的目的在于证明本发明的聚丙烯载体材料不仅能够很好地支持细胞生长，同时也能通过降低温度使得载体上的细胞脱落，从而可以实现不需要应用胰酶就可实现细胞收获的目的。
38.将实例2所制备的材料裁剪成合适大小（可以放在96孔板孔内）后，在紫外光照下正反灭菌12h，放入96孔板，加入细胞密度4
×
104含有完培dmem的l-929细胞，分别37℃培养24h、48h、72h后，放到4℃冰箱冷藏30min，轻轻吹打材料后将材料取出，每孔内加入10μl cck-837℃培养4h后， 测od值（结果见表1）。移除培养基用pbs清洗，分别加入80μl dmem，10μl fda 和10μl pi，静置10 min后在倒置显微镜下观察。细胞脱附率达到95%。（图4）实施例5本实例的实施在于不仅证明本发明的表面热敏性的聚丙烯载体不仅能够很好地支持细胞生长，而且证明负载有rgd的本发明的表面热敏性的聚丙烯载体还能促进细胞的生长。总的来说，本实例也证明通过降低温度使得载体上的细胞脱落，从而可以实现不需要应用胰酶及可实现细胞收获的目的。
39.将实例3所制备的材料裁剪成合适大小（可以放在96孔板孔内）后，在紫外下正反灭菌12h放入96孔板，加入细胞密度4
×
104含有完培dmem的l-929细胞，分别37℃培养24h、48h、72h后放到4℃冰箱冷藏30min，轻轻吹打材料后将材料取出，每孔内加入10μl cck-837℃培养4h后，测od值（结果见表1）。移除培养基用pbs清洗，分别加入80μl dmem，10μl fda 和10μl pi ，静置10 min后在倒置显微镜下观察。细胞脱附率达到95%。
40.表1结果显示对于本发明所制备的聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料，无论表
面是否负载有rgd, 都可以通过降低环境温度而不应用胰酶实现细胞的收获。细胞脱附率达到大约95%。rgd的负载能够显著促进细胞在聚（n-异丙基丙烯酰胺）接枝的聚丙烯载体材料表面的生长，细胞活性增加大约10%。以空白培养板(tcp) 为空白对照（细胞活性设定为100），则下表显示的是不同载体在不同培养阶段的细胞活性。