一种位于猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的SNP分子标记及应用的制作方法

一种位于猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的snp分子标记及应用。


背景技术：

2.现代养猪生产中，母猪繁殖性状作为重要经济性状是影响猪场经济效益的关键因素。我国养猪业得益于母猪繁殖性能的不断改良，已成为世界上生猪存栏数最多的养猪大国。通过引进国外优良杜洛克品种并进行培育选种，母猪的繁殖性能得到了明显的提升，取得了较大遗传进展。但同时，需要清醒地认识到由于受到遗传因素、育种技术、生产管理等多方面的约束，我国母猪繁殖性能与发达国家(如丹麦)仍有较大差距，提升母猪繁殖性能方面仍有较大的选育空间。母猪健仔数和健仔率是反映母猪特别是初产母猪繁殖性能的重要参考指标。健仔数和健仔率性状均为低遗传力性状，通过传统育种方法实际应用进展缓慢，因而利用分子标记进行辅助育种的方式更为效率和可观。
3.对家猪重要经济性状的遗传改良，随着科技的不断发展，已经从通过表型选择的传统选育方式发展到利用分子标记进行全基因组关联分析(genome-wide association study,gwas)的检测方法。通过检测猪全基因组中的单核苷酸多肽位点，利用全基因组关联分析方法，找到与表型性状如健仔数和健仔率显著关联的遗传变异标记，以挖掘出与性状相关的候选基因，揭示影响表型变化的分子遗传机制。最终，通过挖掘出的分子标记对候选母猪群体进行选育，以达到提高选育效率，加速母猪健仔数和健仔率的遗传进展，最终为养殖场带来不菲的经济增益。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种位于猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的snp分子标记及应用。
5.为实现上述目的，所采取的技术方案：一种位于猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的snp分子标记，所述snp分子标记的位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列9号染色体上第33597148位c》t突变。
6.优选地，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no：1所示，在该序列的第141位存在一个碱基突变c》t，导致猪健仔数和健仔率的差异。
7.优选地，所述猪包括杜洛克猪及其合成系。
8.本发明提供了一种用于检测上述所述的snp分子标记的引物对，包含引物p001-f和引物p002-r，其核苷酸序列如下所示：
9.p001-f：5
’‑
tccatattctcacagacaccaggt-3’，
10.p002-r：5
’‑
tgttgggcagtcttaggaatgact-3’。
11.本发明提供了一种用于检测上述所述的snp分子标记的试剂盒，包含上述所述的
引物对。
12.本发明提供了一种鉴定位于猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的snp分子标记基因型的方法，包含如下步骤：
13.(1)提取待测猪的基因组dna；
14.(2)采用上述所述的引物对或上述所述的试剂盒中的引物对对步骤(1)获得的基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
15.(3)对步骤(2)获得的pcr扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
16.(4)基于所述测序结果，确定待测猪的位于猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的snp分子标记的基因型。
17.本发明提供了一种筛选高健仔数和健仔率的猪品种的方法，包含如下步骤：
18.检测上述所述的snp分子标记，淘汰所述snp分子标记的5’端第141位单核苷酸是t的个体，保留所述snp分子标记的5’端第141位单核苷酸是c的个体为种猪。
19.本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，所述方法包括：
20.确定种猪核心群中的种猪的上述所述的snp分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本9号染色体上第33597148位点为cc、tc基因型的种猪个体，淘汰在第33597148位点为tt基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因c的频率，从而提高后代猪的健仔数和健仔率。
21.优选地，所述猪或种猪包括杜洛克及其合成系。
22.本发明提供了上述所述的snp分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在鉴定猪健仔数和健仔率性状、筛选高猪健仔数和健仔率的猪品种、猪遗传育种或提高猪健仔数和健仔率中的应用。
23.有益效果：
24.(1)本发明研究并确定同时影响猪健仔数和健仔率相关的分子标记位于猪的9号染色体上的核苷酸序列上，验证其对健仔数和健仔率性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于提高种猪健仔数和健仔率的遗传改良中，从而提高母猪群体的繁殖能力，提高企业经济利润，增加核心竞争力。通过优选该snp的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高核心群母猪的健仔数和健仔率，加快母猪相关繁殖性状的改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。
25.(2)本发明提供一种鉴定上述猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的snp分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对种猪高健仔数和健仔率进行提高性选育改良，加快育种进展。
附图说明
26.图1是纯种杜洛克猪在9号染色体上关于健仔数(a)和健仔率(b)性状的全基因组关联分析(gwas)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体位置；纵坐标表示-logp值。
具体实施方式
27.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
28.实施例1
29.(1)实验动物
30.本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种杜洛克猪536头，为种猪分公司核心群。
31.本实验共选取该资源群体中杜洛克猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
32.(2)样本采集
33.收集上述仔猪断尾或耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。
34.(3)猪全基因组50k snp判型
35.对上述资源群体536头杜洛克猪中的每个个体采集耳组织或断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组dna，经nanodrop2000/2000c核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的dna的浓度和od比值(od260/280、od260/230)。经nanodrop2000/2000c核酸蛋白检测仪检测合格的dna样品，按照检测的浓度将dna稀释至50ng/μl左右。再将6μl已提取好的待测dna样品与2μlloading buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150v电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察dna的完整性。
36.dna样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在illumina beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50k snp芯片(illumina，美国)基因型判定。利用r语言genabel包中checkmarker对所有样本50k芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6
的snp，最终得到39506个snp的有效基因型数据。
37.(4)全基因组关联(gwas)分析
38.为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合r语言genabel软件包进行gwas分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用bonferrini法确定snp与健仔数和健仔率性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效snp位点数量，即基因组显著水平阈值为1.27e-06，即0.05/39506(有效snp数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效snp位点数量，即染色体显著水平阈值为2.53e-05，即1/39506(有效snp数量)。
39.gwas分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克猪9号染色体上存在显著影响健仔数和健仔率的位点，显著关联的snp为seq no.1中第141位核苷酸g.141c》t(两种性状的p值分别为3.80e-06、3.69e-06)。
40.(5)不同基因型与健仔数和健仔率表型的关联性分析
41.根据表1可知，分子标记的snp位点g.141c》t(seq no.1中第141位核苷酸，即对应于国际猪基因组11.1版本参考序列9号染色体上第33597148位c》t突变)与健仔数性状极显著相关(p《0.001)，说明此分子标记显著影响猪的健仔数，可以通过对猪的此snp位点的选择，从而提高该群体的健仔数，进而加快育种进程。另外，据表1可得基因型为cc型的个体比ct型和tt型的健仔数和健仔率更高，并且两个性状间协同变化。对于健仔数性状，cc型个体表型平均值比ct型和tt型个体表型平均值分别大0.95和1.71；对于健仔率性状，cc型个体表型平均值比ct型和tt型个体表型平均值高5.96％和13.28％。另外，根据两种表型进行的
方差分析(健仔数)和非参数检验(健仔率)结果说明，三种基因型在健仔数和健仔率两种表型中的分布均具有极显著差异(p《0.01)。因此，在育种中逐步保留cc基因型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因c的频率，可以显著提高母猪的健仔数和健仔率，为养殖企业带来更多的经济效益。
42.表1分子标记的9号染色体第33597148位突变位点与健仔性状的统计分析
[0043][0044]
注：***表示差异极显著
[0045]
实施例2目的dna序列扩增及测序
[0046]
(1)引物设计
[0047]
通过ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的9号染色体上seq id no:1的dna序列，并利用引物设计软件oligo 7设计引物。设计的引物的dna序列如下所示：
[0048]
p001-f：5
’‑
tccatattctcacagacaccaggt-3’，
[0049]
p002-r：5
’‑
tgttgggcagtcttaggaatgact-3’；
[0050]
(2)pcr扩增
[0051]
10μl的反应体系中加入dna模板1μl，双蒸水3.4μl，2
×
tag pcr stanmix with loading dye 5μl，引物p001-f和p002-r各0.3μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、57.6℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
[0052]
(3)dna序列测定
[0053]
dna序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，得出对应snp位点的突变。测序结果如下所示：
[0054][0055][0056]
注：序列表中标注的m为突变位点，用标有加粗字体显示(括号中为突变碱基，即等位基因突变)，在该序列的首尾下划线 斜体显示为设计引物序列位置。
[0057]
实施例3分子标记的snp位点g.141c》t效应分析
[0058]
根据表1可知，snp位点g.141c》t优势等位基因型cc型与劣势等位基因tt型相比，能够增加1.71头健仔和提高13.28％的健仔率。因此，通过分子标记辅助选择或基因组选择，逐步对群体内cc型的猪进行选种保留，则能显著增大优势等位基因c等位基因频率，从
而有利于母猪的健仔数和健仔率的提高，加快猪的育种改良进程最终有效提高种猪育种的经济效益。
[0059]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。