基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒与流程

基于crispr/cas12a-lamp快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒
技术领域
1.本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种基于crispr/cas12a-lamp快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒。


背景技术：

2.由规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(crispr-associated protein,cas蛋白)组成的crispr/cas系统被认为是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种适应性免疫系统，以消灭外来的遗传物质。 crispr序列是一个特殊的dna重复序列，包含有高度保守的长度约为21-48bp的重复序列(repeats)和26-72bp的间隔序列(spacer)。重复序列被不同的间隔序列隔开，crispr通过间隔序列对靶基因进行识别。cas位于crispr位点附近，是双链dna核酸酶家族的总称。随着对crispr/cas系统的作用机制和cas蛋白功能的逐步揭示，crispr/cas系统逐渐发展成为一种由引导rna指引cas核酸酶对靶基因进行特定核酸编辑的技术。crispr/cas系统的工作原理是crrna(crispr-derived rna)通过碱基配对与tracrrna(trans-activating rna) 结合形成tracrrna/crrna复合物，此复合物引导核酸酶如cas9蛋白至与crrna配对的靶序列位点处剪切双链dna，从而实现对基因组dna序列进行编辑；而通过人工设计这两种 rna，可以改造形成具有引导作用的sgrna(single guide rna)，足以引导cas9对dna的定点切割。故crispr/cas系统不仅可以应用于基因编辑，而且已经成为核酸检测的一种工具，显示了下一代分子诊断方法的巨大潜力。目前已鉴定出很多种cas蛋白能在sgrna引导下对靶位点进行切割。cas12a属于该家族中的一种，能在sgrna引导下对靶基因进行特定切割，同时被激活的cas12a可发挥非特异性剪切酶活性，对所遇到的单链dna(ssdna) 进行非特异性剪切。利用cas12a可被靶向激活的特性，经过特异性地设计，可以用于靶基因的特异性检测。
3.相比较于传统病原体的鉴定方法，核酸检测技术是早期诊断的利器。尽管qpcr作为核酸检测金标准已经广泛应用于一线检测中，但是基于变温扩增的检测技术需昂贵的设备，且需要标准化的实验室和专业技术人员进行操作，反应时间长，难以满足即时检测要求，对于病原体含量极低的情况无法实现早期监测。如何更加快速、简便、准确、低成本的检测，是病原体核酸检测未来的发展方向。现有的一些核酸快速检测方法有lamp(环介导等温扩增) 以及rpa-exo探针法(重组酶聚合酶扩增-探针法)等。这类方法在一些特殊恒温核酸扩增酶介导下，摆脱了对变温设备的依赖，靶标核酸可以在固定温度进行核酸扩增与检测。基于 lamp或raa的核酸恒温扩增检测，虽然摆脱了热循环设备的限制，但是其高速扩增和高灵敏度带来了假阳性的可能。基于crispr/cas系统的恒温检测则在恒温扩增方法的基础上引入了高度精确的crispr系统，极大提高了检测方法的精确度与灵敏度。
4.当前，基于crispr的恒温速检测技术主要分为两大类，即2020年诺贝尔化学奖得主 jennifer doudna开发的依赖于cas12a的称为detectr的核酸恒温检测技术，以及张锋
开发的依赖于cas13a的称为sherlock的核酸恒温检测技术。其原理都是通过恒温扩增方法如lamp、rpa等对目的片段进行扩增富集，扩增后的目的片段会被cas蛋白通过一段 sgrna的引导靶向识别，激活cas蛋白成为一个dna切割机(cas12a)或者rna切割机 (cas13a)，将附近所有的单链dna(cas12a)或者单链rna(cas13a)进行切割。基于该原理，将单链dna制备成荧光淬灭探针，通过监测荧光信号的释放实现对目的序列的特异性检测。然而，使用单一的crispr/cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题为：针对现有病原体早期监测防控技术的缺陷和不足，基于 crispr/cas12a-lamp快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法。本发明的另一目的是提供一种基于crispr/cas12a-lamp快速可视化检测福氏志贺氏菌的试剂盒。
6.本发明的技术方案为：基于crispr/cas12a-lamp快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法，包括如下步骤：
7.(1)提取待检测样本的总dna；
8.(2)以步骤(1)提取的总dna为模板，f3和b3为外引物对，fip和bip为内引物对，进行lamp扩增，f3的核苷酸序列为ctgcatggacgcctttgg(seq id no.1所示)，b3的核苷酸序列为cttaccgccaatctcttcgg(seq id no.2所示)，fip的核苷酸序列为cgctgaagtactgctctccgctttttctgatgggcagagccac(seq id no.3所示)，bip的核苷酸序列为 ctggtgacaataacccggaccattttaggaggatcctgctcaagc(seq id no.4所示)；
9.(3)将步骤(3)的扩增产物在crispr/cas12a检测体系中酶切并进行荧光检测； crispr/cas12a检测体系的sgrna的序列为 gaauuucuacuguuguagauuuuaugcggagagcaguacuucag(seq id no.5)或gaauuucuacuguuguagauuuucuggugacaauaacccggacc(seq id no.6)。
10.进一步地，步骤(2)中，lamp扩增的反应体系为：1μl isothermal amplificationbuffer ii，6mm mg
2
，320u/ml bst 3.0dna polymerase，1.2mm dntps，0.2μm f3和 b3，1.6μm fip和bip，模板dna 1.0μl，加无核酸酶水补足10μl，反应条件：60℃扩增20分钟。
11.进一步地，步骤(3)中，crispr/cas12a检测体系为：200nm的lba cas12a，0.83 μm sgrna，4u/μl rna酶抑制剂，2μl的nebuffer 2.1，1.17μm荧光-淬灭标记的 ssdna探针以及depc水。
12.基于crispr/cas12a-lamp快速可视化检测福氏志贺氏菌的试剂盒，该试剂盒包括 lamp扩增试剂和crispr/cas12a检测试剂，所述lamp扩增试剂中含有外引物对f3和 b3，内引物对fip和bip，f3的核苷酸序列如seq id no.1所示，b3的核苷酸序列如seqid no.2所示，fip的核苷酸序列如seq id no.3所示，bip的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述crispr/cas12a检测试剂中含有sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.5或 seq id no.6所示。
13.进一步地，所述lamp扩增试剂含有1μl isothermal amplification buffer ii，6mmmg
2
，320u/ml bst 3.0dna polymerase，1.2mm dntps，0.2μm f3和b3，1.6μm fip 和bip，无核酸酶水。
14.进一步地，所述crispr/cas12a检测试剂含有200nm的lba cas12a，0.83μm sgrna， 4u/μl rna酶抑制剂，2μl的nebuffer 2.1，1.17μm荧光-淬灭标记的ssdna探针以及 depc水。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
16.本发明通过对lamp的扩增方法与crispr/cas12的检测方法结合成为 crispr/cas12a-lamp的分子检测试剂盒和检测方法。该分子检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有可视化的优势，更有利于对福氏志贺氏菌的分子检测技术在基层中的推广和应用。
附图说明
17.图1 pcr鉴定体系的灵敏度检测；
18.图2 qpcr鉴定体系的灵敏度检测；
19.图3 lamp鉴定体系的灵敏度检测；
20.图4 crispr/cas12a检测体系的sgrna筛选；
21.图5 crispr/cas12a-lamp鉴定体系的灵敏度检测；
22.图6 crispr/cas12a-lamp鉴定体系的特异性检测；
23.图7 20株临床福氏志贺氏菌通过crispr/cas12a-lamp鉴定的情况。
具体实施方式
24.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
25.实施例1：特异性靶基因筛选及引物设计
26.1.1本地blast分析
27.从ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载福氏志贺氏菌全基因组序列，对本地的核酸数据库进行本地blast检索，获取得到菌种各序列片段与数据库的比对结果。
28.1.2blast重确认
29.使用在线blast功能，使用2种策略确认其菌种特异性和菌种鉴定可用性。一种策略为blast时排除目的菌种，结果显示无任何相似序列者为目的菌种特异基因；第二种策略为blast时选择在目的菌种内进行检索，结果返回大量相似序列者是目的菌种的不同菌株共有序列。结合两种策略，最终找出符合两种策略标准的目的基因。
30.1.3引物设计
31.本试验以福氏志贺氏菌的假说蛋白基因(hypothetical protein)，genbank登陆号为 ae014073(4170556..4171068)设计特异引物。特异引物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具primerexplorerv5software(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计完成，包括一对外引物(f3:ctgcatggacgcctttgg；b3:cttaccgccaatctcttcgg)和一对内引物(fip:cgctgaagtactgctctccgctttttctgatgggcagagccac； bip:ctggtgacaataacccggaccattttaggaggatcctgctcaagc)，该引物用于 lamp技术检测，其中外引物还用作pcr反应的上、下游引物，用于福氏志贺氏菌的pcr 鉴定。
cb2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
57.⑦
将吸附柱cb2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液eb，室温放置2分钟。12,000rpm离心2分钟收集dna溶液。
58.(3)连接、转化及筛选
59.1)大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备
60.①
挑取单个dh5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50ml lb培养基中，37℃振荡2小时。当od600 值达到0.35时，收获细菌培养物。
61.②
将细菌转移到一个50ml预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10分钟，使培养物冷却。
62.③
于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出培养液，并将管倒置l分钟以使残留的培养基流尽。
63.④
每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/l cacl2-mgcl2溶(80mmol/l mgcl2， 20mmol/l cacl2)重悬细胞沉淀。
64.⑤
于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出上清液，并将管倒置l分钟以使残留的液体流尽。
65.⑥
每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1mol/l cacl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。
66.2)连接到simple载体
67.①
在微量离心管中加入1μlsimple载体和4μl目的基因的pcr产物进行混合。
68.②
37℃反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。
69.3)转化dh5α
70.①
全量(5μl)加入至50μl dh5α感受态细胞中，冰浴30分钟。
71.②
42℃加热30秒后，再冰浴2分钟。
72.③
加入37℃温浴过的lb培养基250μl，培养60分钟(37℃，200rpm)。
73.④
取100μl涂布于含有氨苄青霉素的lb培养基上，37℃培养过夜以形成单菌落。
74.4)阳性克隆的筛选
75.挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃缓慢振荡培养4小时，以m13f (tgtaaaacgacggccagt)和m13r(caggaaacagctatgacc)测序引物进行菌落pcr扩增。对扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后紫外观察，将经pcr验证正确的阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序。
76.5)阳性质粒提取
77.挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃缓慢振荡培养4小时，进行 pcr扩增。扩增引物及扩增条件同前述最优反应条件。将经pcr确证的阳性克隆，接种于 lb液体培养基，37℃，160rpm培养过夜。取每个菌株过夜培养液5ml，用天根生化科技 (北京)有限公司小量质粒提取试剂盒进行质粒抽提，具体操作步骤如下：
78.①
取5ml过夜培养的福氏志贺氏菌菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机， 12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清。
79.②
向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
80.③
向离心管中加入150μl溶液p2，温和地上下翻转8次使菌体充分裂解。
81.④
向离心管中加入350μl溶液p5，立即快速地上下颠倒混匀20次，充分混匀， 12,000rpm离心2分钟。
82.⑤
将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)， 12,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
83.⑥
向吸附柱cp3中加入300μl漂洗液pwt，12,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
84.⑦
将吸附柱cp3放入收集管中，12,000rpm离心1分钟。
85.⑧
将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液tb，12,000rpm离心30秒。
86.6)阳性质粒浓度测定
87.打开thermo scientific biomate 3s紫外分光光度计，预热15分钟；选定mode方式为 dsdna，将比色杯用超纯水反复洗几次后加入60μl te缓冲液调零；将te缓冲液完全吸出，然后加入待测样品(2μl样品加入58μl te缓冲液)，选定稀释倍数为30倍进行测定，读取质粒dna浓度。
88.7)质粒数目换算及梯度稀释
89.阳性质粒测完浓度后，分别根据其所测浓度换算成质粒拷贝数目。质粒拷贝数目换算公式为：
[0090][0091]
(注：x为质粒浓度ng/μl；y为目的产物碱基对数；na为阿伏伽德罗常数；3829为载体碱基对数；660为碱基平均分子量)。取已知浓度的质粒进行10倍梯度稀释。
[0092]
3.建立pcr扩增体系
[0093]
(1)pcr条件优化
[0094]
pcr具体反应体系为：2
×
pcr mix 12.5μl，10μm的上游引物和下游引物各1.0μ l，模板dna 1.0μl，加去核酸酶水补足25μl。
[0095]
(2)在pcr仪中按以下程序扩增：
[0096]
预变性94℃5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，30个循环；终延伸72℃7 分钟。
[0097]
(3)灵敏度检测
[0098]
利用构建好的质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行pcr扩增，其反应体系和反应程序如前所述。
[0099]
如图1，pcr鉴定体系的灵敏度检测结果显示，本发明中的pcr的鉴定体系的灵敏度为4*102拷贝数/μl质粒。
[0100]
4.建立qpcr扩增体系
[0101]
(1)qpcr扩增条件
[0102]
qpcr具体反应体系为：2
×
qpcr premix 10μl，0.2μm的上游引物和下游引物各1.0 μl，模板dna 1.0μl，加无核酸酶水补足20μl。
[0103]
(2)在pcr仪中按以下程序扩增：
[0104]
预变性95℃30秒；95℃5秒，58℃15秒，72℃10秒，40个循环；按照默认程序进行熔解曲线分析。
[0105]
(3)灵敏度检测
[0106]
利用构建好的质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行qpcr扩增，其反应体系和反应程序如前所述。
[0107]
如图2，qpcr鉴定体系的灵敏度检测结果显示，本发明中的pcr的鉴定体系的灵敏度为4*100拷贝数/μl质粒。
[0108]
5.建立lamp鉴定体系
[0109]
(1)lamp反应建立和优化
[0110]
经过优化的反应体系为1μl isothermal amplification buffer ii，6mm mg2 ，320u/ml bst 3.0dna polymerase，1.2mm dntps，0.2μm f3和b3，1.6μm fip和bip，模板 dna 1.0μl，加去核酸酶水补足10μl。
[0111]
反应条件：60℃扩增20分钟。
[0112]
(2)灵敏度检测
[0113]
利用构建好的质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行lamp扩增，其反应体系和反应程序如前所述。
[0114]
如图3，lamp鉴定体系的灵敏度检测结果显示，本发明中的lamp的鉴定体系的灵敏度为4*100拷贝数/μl质粒。
[0115]
6.建立crispr/cas12a-lamp鉴定体系
[0116]
(1)crispr/cas12a检测体系的优化
[0117]
设计4条针对假说蛋白基因的sgrna序列，具体序列如下：
[0118]
sgrna1 gaauuucuacuguuguagauuuuaugcggagagcaguacuucag
[0119]
sgrna2 gaauuucuacuguuguagauuuucuggugacaauaacccggacc
[0120]
sgrna3 gaauuucuacuguuguagauuuucccugacaacgcuugagcagg
[0121]
sgrna4 gaauuucuacuguuguagauuuucagcaucauauaacgcuuacc
[0122]
以4*100拷贝数/μl的质粒作为lamp扩增的模板，于管底发生lamp扩增反应。为避免热量传播，管底lamp扩增反应覆盖20μl石蜡油。共10μl lamp反应产物作为酶切底物，采用20μl的crispr/cas12a反应体系对sgrna切割活性进行筛选。为避免 lamp扩增后开盖操作造成气溶胶传播，crispr/cas12a反应体系预置在pcr管盖部，包含200nm的cas12a，0.83μm sgrna，4u/μl rna酶抑制剂，2μl的 nebuffer 2.1，1.17μm fam-bhq1标记的ssdna探针(fam-tttttt-bhq1)以及depc 水。当20min的lmap反应完成后，颠倒混匀pcr反应管，并在37℃条件下进行20min 的酶切。荧光信号由cfx96 touch real-time pcr检测系统采集，可视化结果由激发波长为 485nm的透射光源实现。
[0123]
如图4，crispr/cas12a检测体系的sgrna筛选结果显示，本发明中，sgrna1和 sgrna 2有荧光产生，且在激发波长为485nm的透射光源下sgrna2可产生更加明亮的荧光，将sgrna2用作后续试验的检测。
[0124]
(2)crispr/cas12a-lamp检测方法灵敏度分析
[0125]
利用构建好的质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行crispr/cas12a-lamp检测，
其反应体系和反应程序如前所述。
[0126]
如图5，crispr/cas12a-lamp鉴定体系的灵敏度检测结果显示，本发明中的crispr/cas12a-lamp的鉴定体系的灵敏度为4*100拷贝数/μl质粒。
[0127]
(3)crispr/cas12a-lamp检测方法特异性分析
[0128]
根据lamp反应体系的最佳反应条件和crispr/cas12a最佳切割反应条件下对福氏志贺氏菌，粪肠球菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行检测，用以验证该方法对福氏志贺氏菌的特异性检测。
[0129]
如图6所示，本发明中，经crispr/cas12a-lamp鉴定体系检测，有且仅有福氏志贺氏菌检测产生荧光呈阳性，粪肠球菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌检测均呈阴性无荧光。
[0130]
(4)crispr/cas12a-lamp检测方法对临床菌株分离株的检测
[0131]
对20份经临床鉴定的福氏志贺氏菌临床分离株，通过快提dna试剂盒提取菌株的基因组dna，然后使用本发明的crispr/cas12a-lamp对该临床分离株进行检测，以验证 crispr/cas12a-lamp检测临床分离株的能力。
[0132]
如图7所示，本发明中，crispr/cas12a-lamp鉴定体系在20份经临床鉴定的福氏志贺氏菌临床分离株中得到了验证。表明了crispr/cas12a-lamp检测方法可以运用到临床分离株的检测，而且crispr/cas12a-lamp检测更加方便快捷，较高灵敏度和特异性，并且能够直观，肉眼可见的观察检测结果。