神经节苷脂GM3衍生物及其制备方法和应用与流程

神经节苷脂gm3衍生物及其制备方法和应用
技术领域：
1.本发明涉及的是一种医药化工技术领，具体地，本发明涉及神经节苷脂gm3衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
：2.鞘糖脂广泛存在于脊椎动物各组织细胞膜上，是一类双亲性糖脂化合物，由神经酰胺(包括鞘氨醇和脂肪酸两个模块)和寡糖链(包括多个单糖模块)以糖苷键相连形成。鞘糖脂由寡糖链、鞘氨醇、脂肪酸等模块构成，任何一个模块的变化均可产生不同的鞘糖脂结构，预计自然界存在的鞘糖脂种类在10万种以上。3.此类分子广泛参与细胞与外界的生化信号传导，在细胞生长、增殖、分化、粘附、衰老、凋亡等各个阶段均发挥重要作用，某些鞘糖脂类化合物还表现出对癌症、神经退行性疾病、自免疫疾病等重大疾病的治疗效果。4.神经节苷脂gm3具有重要的生物学功能，如维持细胞膜结构的稳定；作为细胞表面标记和抗原，参与细胞-细胞间相互作用和识别；作为分化标志，参与细胞生长调节和信息传递；作为某些生物活性因子的受体，影响细胞质膜蛋白的功能及参与细胞粘附等。神经节苷脂gm3是最早发现也是结构最为简单的一种神经节苷脂，yamakawa等于1952年首次从马红细胞中分离,化学结构为neunacα(2-3)galβ(1-4)glcβ(1-3)cer，其可由乳糖基神经酰胺(laccer)，在gm3合成酶的作用下连接一分子唾液酸形成。gm3的糖链可进一步增长即形成神经节苷脂类化合物，如gm1、gm2、cd1等。5.其中，神经节苷脂gm1已广泛地用于神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的治疗，是目前神经科用药金额第二大品种。6.但由于此类化合物在生物体内的含量极低、存在结构微观不均一性、难以分离纯化，严重制约了对其进行功能研究和新型药物的开发。因此人工合成神经节苷脂及其衍生物有助于实现鞘糖脂类药物的高产和创新，具有重要的科学意义。7.由于鞘糖脂结构的复杂性，对其构效关系研究用的样品主要来源于从稀有的天然物中提取分离，然而由于从天然物中提取的鞘糖脂数量有限，而且含量过少，且或多或少都混有蛋白或脂类，所进行的功能实验难于完全排除杂质的干扰，因此，人工合成鞘糖脂及其衍生物很有必要，其可为进一步研究鞘糖脂结构与功能的关系提供强有力的证据。8.目前，在临床上应用的神经节苷脂主要是从牛脑中分离提纯的，由于分离纯化困难，不适于大量生产，限制了其开发利用。神经节苷脂衍生物多采用化学全合成法或酶催化法获得。在化学合成过程中需要对糖进行多步的保护与脱保护操作，还需考虑糖苷键形成的区域和立体化学选择性，这些因素大大增加了合成的难度，并且由于化学全合成步骤过长，所要求的反应试剂比较昂贵，反应条件苛刻。9.因此，开发新的神经节苷脂衍生物及其合成方法显得非常有意义。 )等。26.在另一优选例中，-cooz部分为-cooh、-coonh4、-cook或-coona。27.在另一优选例中，所述的式i化合物，其光学异构体、顺反异构体、前药或药学上可接受的盐，其具有式ii所示的结构[0028][0029]式中，[0030]l选自：键、-o-、-c(＝o)o-、-(ch2)n-、-s-、n-rb；[0031]ar选自取代或未取代的下组基团：c3-c10环烷基、3-10元杂环基、c6-c14芳基、5-14元杂芳基；其中，所述的取代是指被1-5个ra取代；[0032]rb、ra、n、z、r2的定义如上所述。[0033]在另一优选例中，所述的式i化合物，其光学异构体、顺反异构体、前药或药学上可接受的盐，其具有式iii所示的结构[0034][0035]式中，[0036]m为0、1、2、3、4或5；[0037]l选自：键、-o-、-(ch2)n-、n-rb；[0038]各r3独立地选自：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、酯基、氧代基(＝o)、甲酰基、酰胺基、磺酰胺基、甲酰胺基、砜基、亚砜基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c3-c10环烷基、c3-c10环烷氧基、3-8元杂环基、c6-c14芳基和5-14元杂芳基；[0039]或者当两个r3连接于两个相邻的c原子时，r3与其连接的c原子共同构成一个取代或未取代的c3-c10环烷基、3-10元杂环基、苯基或5-6元杂芳基；其中，所述取代是指被选自下组的一个或多个基团取代：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、酯基、氧代基(＝o)、甲酰基、酰胺基、砜基、亚砜基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基；[0040]rb、n、z、r2的定义如上所述。[0041]在另一优选例中，部分为其中，r4和r5各自独立地选自：h、c1-c6烷基、卤素(如、cl、br、i)、硝基、氰基。[0042]在另一优选例中，部分为其中，r4选自：h、c1-c6烷基、卤素(如、cl、br、i)、硝基、氰基。[0043]在另一优选例中，式ii-iii中，l为键或-(ch2)-。[0044]在另一优选例中，r2选自取代或未取代的下组基团：c10-c20烷基、c2-c20烯基；其中，所述的取代是指被1-5个ra取代；[0045]ra选自：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、酯基、氧代基(＝o)、甲酰基、酰胺基、磺酰胺基、甲酰胺基、砜基、亚砜基、c1-c5烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c3-c10环烷基、c3-c10环烷氧基、3-10元杂环基、c6-c14芳基和5-14元杂芳基。[0046]在另一优选例中，r2选自取代或未取代的下组基团：c15-c18烷基、c2-c18烯基；其中，所述的取代是指被1-5个ra取代；[0047]ra选自：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、酯基、氧代基(＝o)、甲酰基、酰胺基、磺酰胺基、甲酰胺基、砜基、亚砜基、c1-c5烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c3-c10环烷基、c3-c10环烷氧基、3-10元杂环基、c6-c14芳基和5-14元杂芳基。[0048]在另一优选例中，各r3独立地选自：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、酯基、氧代基(＝o)、甲酰基、酰胺基、磺酰胺基、甲酰胺基、砜基、亚砜基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基。[0049]在另一优选例中，所述r1、r2和z为实施例中各具体化合物相对应的具体基团。[0050]在另一优选例中，所述的式i化合物，其光学异构体、顺反异构体、前药或药学上可接受的盐，所述化合物为实施例中表1中所列举的化合物。[0051]本发明第二方面，提供一种药物组合物，其包含：[0052](1)第一方面所述的化合物，其光学异构体、顺反异构体、前药或药学上可接受的盐，或者它们的组合；和[0053](2)药学上可接受的载体和/或赋形剂。[0054]本发明第三方面，提供一种第一方面所述的化合物，其光学异构体、顺反异构体、前药或药学上可接受的盐，或第二方面所述药物组合物的用途，用于制备治疗糖尿病、心脑血管疾病、神经疾病或肿瘤疾病的药物。[0055]在另一优选例中，心脑血管疾病为粥样动脉硬化。[0056]在另一优选例中，神经疾病选自：神经退行性疾病(阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)、帕金森病(parkinson’sdiseasepd)、亨廷顿舞蹈症(huntington’sdisease,hd)、gsls相关溶酶体贮积症(lysosomalstoragediseases,lsd)。[0057]在另一优选例中，所述的肿瘤疾病选自下组：肺肿瘤、乳腺肿瘤、消化器官肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、肉瘤、源自神经外胚层组织的肿瘤和淋巴组织增生病症。[0058]在另一优选例中，用于制备治疗病原微生物感染及相关疾病的药物。[0059]本发明第四方面，提供一种中间体化合物iv，其具有下式所示的结构，[0060][0061]式中，[0062]z和r1的定义如上所述。[0063]本发明第五方面，提供一种第四方面所述的式iv化合物的制备方法，包括如下步骤：[0064](ii)在缓冲溶液中，酶存在下，化合物a4化合物a1胞苷三磷酸(ctp)和丙酮酸反应，得到式iv化合物[0065]z和r1的定义如上所述。[0066]在另一优选例中，步骤(ii)中，所述的酶为neu5ac醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶和唾液酸转移酶的组合。[0067]在另一优选例中，步骤(ii)中，缓冲溶液选自：hepes溶液、tris-hcl缓冲液。[0068]在另一优选例中，步骤(ii)中，缓冲溶液还包含mg2 。[0069]在另一优选例中，所述的式iv化合物的制备方法，还包括步骤：[0070][0071](i)在缓冲溶液中，酶存在下，氟化乳糖和鞘氨醇反应，得到化合物a4[0072]在另一优选例中，步骤(i)中，酶为egcase糖苷合成酶。[0073]在另一优选例中，步骤(i)中，缓冲溶液为naac溶液，ph为4.8-6.8，优选地为5.8。[0074]本发明第六方面，提供一种第一方面所述的式i化合物的制备方法，包括如下步骤：[0075](iii)在缓冲溶液中，酶存在下，所述的化合物iv和r2cooh反应，得到式i化合物其中，r1、r2和z的定义如上所述。[0076]在另一优选例中，步骤(iii)中，所述的酶为scdase。[0077]在另一优选例中，步骤(iii)中，缓冲溶液为hepes溶液、ph为8-9，优选地8.5。[0078]在另一优选例中，所述的式i化合物的制备方法，还包括如下步骤：[0079](iii')在缓冲溶液中，酶存在下，化合物a4化合物a1胞苷三磷酸(ctp)、丙酮酸和r2cooh反应，得到式iv化合物[0080]式中，z、r1和r2的定义如上所述。[0081]在另一优选例中，步骤(iii')中，酶为neu5ac醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶、唾液酸转移酶和scdase的组合。[0082]在另一优选例中，步骤(iii')中，缓冲溶液还包含mg2 。[0083]在另一优选例中，所述的式i化合物的制备方法，还还包括步骤：[0084][0085](i)在缓冲溶液中，酶存在下，氟化乳糖和鞘氨醇反应，得到化合物a4[0086]本发明第七方面，提供一种第一方面所述的式i化合物的用途，用于制备鞘糖脂衍生物。[0087]在另一优选例中，所述的鞘糖脂衍生物为gm2衍生物、gm1衍生物、gd3衍生物、gd2衍生物、gd1衍生物、gt3衍生物。[0088]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明[0089]图1示出了本发明化合物诱导原代神经细胞的神经发生。[0090]图2示出了本发明化合物的划痕实验结果。[0091]图3示出了本发明化合物的侵袭实验结果；其中，a：a431细胞的侵袭能力，a空白；bgm3；cn-12；b：a431细胞的侵袭率。[0092]图4示出了本发明化合物对小鼠实体瘤的影响；其中，a：裸鼠接种实体瘤后活体成像图；b和c：实验结果分析图。具体实施方式[0093]本发明人通过广泛而深入的研究，开发了一种新的神经节苷脂衍生物及其合成方法，本发明方法可高效、高纯度、高产量地合成神经节苷脂gm3衍生物。本发明gm3衍生物对神经细胞具有显著的促进生长作用，安全性高。在此基础上完成了本发明。[0094]术语[0095]在本发明中，除非特别指出，所用术语具有本领域技术人员公知的一般含义。[0096]当通过从左向右书写的常规化学式描述取代基时，该取代基也同样包括从右向左书写结构式时所得到的在化学上等同的取代基。举例而言，-ch2o-等同于-och2-。[0097]如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。[0098]如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。[0099]如本文所用，术语“烷基”包括直链或支链的烷基。例如，c1-c6烷基表示具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基，c1-c30烷基表示具有1-30个碳原子的直链或支链的烷基，优选地为c1-c20烷基，更优选地为c1-c17烷基，烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。[0100]如本文所用，术语“烯基”包括直链或支链的烯基。例如c2-c6烯基指具有2-6个碳原子的直链或支链的烯基，c2-c30烯基，指具有2-30个碳原子的直链或支链的烯基，优选地为c2-c20烯基，更优选地为c2-c17烯基，烯基包括但不限于：乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或类似基团。[0101]如本文所用，术语“炔基”包括直链或支链的炔基。例如，c2-c6炔基是指具有2-6个碳原子的直链或支链的炔基，炔基的例子包括但不限于：乙炔基、丙炔基、丁炔基、或类似基团。[0102]如本文所用，术语“环烷基”是指包含特定数目的c原子的环状烷基，如“c3-c10环烷基”指具有3-10个(优选3、4、5、6、7或8个)碳原子的环烷基。其可以是单环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、或类似基团。也可以是双环形式，例如桥环或螺环形式。本发明中，环烷基意在包含取代环烷基。[0103]如本文所用，术语“c1-c6烷氧基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链的烷氧基；其具有式c1-c6烷基-o-或-c1-c5烷基-o-c1-c5烷基(如，-ch2-o-ch2ch3、-ch2-o-(ch2)2ch3、-ch2ch2-o-ch2ch3)结构，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。[0104]如本文所用，“杂环基”是指具有选自n、s和o的杂原子的饱和或部分饱和的环状基团，“3-10元杂环基”是指具有3-10个原子的且其中1-3个原子为选自下组n、s和o的杂原子的饱和或部分饱和的环状基团。其可以是单环，也可以是双环形式，例如桥环或螺环形式。3-10元杂环基优选3-8元杂环基，更优选地为6-8元杂环基。具体的实例可以为氧杂环丁烷、氮杂环丁烷、四氢-2h-吡喃基、哌啶基、哌嗪基、四氢呋喃基、吗啉基和吡咯烷基等。[0105]如本文所用，“芳基”是指环上不含杂原子的芳香族环基，“c6-c14芳基”是指在环上不含杂原子的具有6至14个碳原子的芳香族环基，所述芳基可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环。如苯基(即六元芳环)、萘基等，其中，六元芳基还意在包含六元芳基并5-6元环烷基和六元芳基并5-6元杂环烷基。c6-c14芳基优选c6-c10芳基。芳基可以是任选取代的或未取代的。[0106]如本文所用，“杂芳基”指具有1-3个原子为选自下组n、s和o的杂原子的环状芳香基，“5-14元杂芳基”指具有5-14个原子的且其中1-3个原子为选自下组n、s和o的杂原子的环状芳香基团。其可以是单环，也可以是稠环形式。具体的实例可以为吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、(1,2,3)-三唑基以及(1,2,4)-三唑基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异恶唑基、噻唑基、恶唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。杂芳基可以是任选取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、氘代烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烯基、炔基、烷硫基、烷基氨基、卤素、氨基、硝基、羟基、巯基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷硫基、氧代基、酰胺基、磺酰胺基、甲酰基、甲酰胺基、羧基和羧酸酯基等。[0107]如本文所用，“卤素”或“卤原子”指f、cl、br、和i。更佳地，卤素或卤原子选自f、cl和br。[0108]在本发明中，术语“酰胺基”是指带有结构-conrr'的基团，其中，r和r'可以独立的代表氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基，如上文所定义。r和r'在二烷基胺片段中可以相同或不同。[0109]在本发明中，术语“磺酰胺基”是指带有结构-so2nrr'的基团，其中r和r'可以独立的代表氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基，如上文所定义。r和r'在二烷基胺片段中可以相同或不同。[0110]在本发明中，术语“甲酰基”是指包含-cho的基团。[0111]在本发明中，术语“甲酰胺基”是指包含的基团，甲酰胺基还意在包含取代的甲酰胺基，具有式其中，r各自独立地代表氢、烷基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基，如上文所定义。各r可以相同或不同。[0112]在本发明中，“氨基”是指具有-n-rr'结构，r和r'各自独立地代表氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，如上文所定义，r和r'可以相同或不同。[0113]在本发明中，“亚砜基”是指具有-s(o)-r，r独立地代表氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，如上文所定义。[0114]在本发明中，“砜基”是指具有-s(o)2-r，r独立地代表氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，如上文所定义。[0115]在本发明中，“酯基”是指具有-c(o)-o-r或r-c(o)-o-结构，其中，r独立地代表氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，如上文所定义。[0116]在本发明中，术语“取代”指特定的基团上的一个或多个氢原子被特定的取代基所取代。特定的取代基为在前文中相应描述的取代基，或各实施例中所出现的取代基。除非特别说明，某个取代的基团可以在该基团的任何可取代的位点上具有一个选自特定组的取代基，所述的取代基在各个位置上可以是相同或不同的。本领域技术人员应理解，本发明所预期的取代基的组合是那些稳定的或化学上可实现的组合。[0117]本发明所述的基团除非特别说明是“取代的或未取代的”，否则本发明的基团均可被选自下组的取代基所取代：氘、卤素、氰基、硝基、羟基、氨基、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6烷氧基、3-10元杂环烷基、c3-c10环烷基、5-14元杂芳基、c6-c14芳基。[0118]在本发明中，术语“多个”独立指2、3、4、5个。[0119]除非特别说明，本发明所描述的结构式意在包括所有的同分异构形式(如对映异构，非对映异构和几何异构体(或构象异构体))：例如含有不对称中心的r、s构型，双键的(z)、(e)异构体等。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体、非对映异构体或几何异构体(或构象异构体)的混合物都属于本发明的范围。[0120]如本文所用，术语“互变异构体”表示具有不同能量的结构同分异构体可以超过低能垒，从而互相转化。比如，质子互变异构体(即质子移变)包括通过质子迁移进行互变，如1h-吲唑与2h-吲唑。化合价互变异构体包括通过一些成键电子重组而进行互变。[0121]鞘糖脂[0122]鞘糖脂由三部分组成：糖链(单糖或寡聚糖)、鞘氨醇及脂肪酸。它存在于细胞表面膜，非极性的脂链嵌于膜中，而糖链面向细胞间液。它可以作为细菌及病毒等的受体，血型抗原，又被认为和细胞间的粘着、细胞的生长、分化等相关。鞘糖脂的结构如下所示[0123][0124]其中，gal表示：半乳糖[0125]glc表示：葡萄糖[0126]galnac表示：n-乙酰半乳糖胺[0127]neu5ac表示：n-乙酰神经氨酸[0128]cer表示：神经酰胺[0129]神经节苷脂gm3是一类复杂的鞘糖脂。[0130]中间体[0131]中间体是指半成品，是生产所需要的产品过程中形成的产物。通常，发明人可以从中间体作为起始原料进行产品的生产。因此，筛选合适的中间体可以优化工艺路线，进而达到提高收率，节约时间、成本的目的。[0132]本发明所述的中间体是指如式iv所述的中间体化合物。[0133][0134]式中，[0135]r1、z的定义如上所述。[0136]中间体化合物iv的制备方法[0137]优选地，本发明化合物iv的制备方法包括步骤：[0138](ii)在缓冲溶液(如，含mg2 的hepes溶液)中，酶(如neu5ac醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶和唾液酸转移酶)存在下，化合物a4[0139]化合物a1胞苷三磷酸(ctp)和丙酮酸反应，得到式iv化合物[0140]z和r1的定义如上所述。[0141]优选地，式iv化合物的制备方法还包括步骤[0142][0143](i)在缓冲溶液(如，naac溶液)中，酶(如，egcase糖苷合成酶)存在下，氟化乳糖和鞘氨醇反应，得到化合物a4[0144]活性成分[0145]如本文所用，“活性成分”“本发明化合物”“神经节苷脂gm3衍生物”指式i所示的化合物，并且还包括及式i化合物的立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药。[0146]本发明化合物具有如下式i所示结构[0147][0148]式中，[0149]r1、r2、z的定义如上所述。[0150]优选地，本发明化合物具有式ii所示的结构[0151][0152]式中，[0153]z、ar和l、r2的定义如上所述。[0154]优选地，本发明化合物具有式iii所示的结构[0155][0156]式中，[0157]z、m、l、r3、r2的定义如上所述。[0158]优选地，式iii中，各r3独立地选自：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、酯基、氧代基(＝o)、甲酰基、酰胺基、磺酰胺基、甲酰胺基、砜基、亚砜基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基。[0159]优选地，式iii中，部分为其中，r4和r5各自独立地选自：h、c1-c6烷基、卤素(如、cl、br、i)、硝基、氰基。[0160]优选地，式iii中，，部分为其中，r4选自：h、c1-c6烷基、卤素(如、cl、br、i)、硝基、氰基。优选地，式i-iii中，-cooz部分为-cooh、-coonh4、-cook或-coona。[0161]优选地，式ii-iii中，l为键或-(ch2)-。[0162]优选地，式i-iii中，r2选自取代或未取代的下组基团：c10-c20烷基、c2-c20烯基；优选地，r2选自取代或未取代的下组基团：c15-c18烷基、c2-c18烯基；其中，所述的取代是指被1-5个ra取代；[0163]ra选自：卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、酯基、氧代基(＝o)、甲酰基、酰胺基、磺酰胺基、甲酰胺基、砜基、亚砜基、c1-c5烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c3-c10环烷基、c3-c10环烷氧基、3-10元杂环基、c6-c14芳基和5-14元杂芳基。[0164]本发明中的化合物可能形成的盐也是属于本发明的范围。除非另有说明，本发明中的化合物被理解为包括其盐类。在此使用的术语“盐”，指用无机或有机酸和碱形成酸式或碱式的盐。此外，当本发明中的化合物含一个碱性片段时，它包括但不限于吡啶或咪唑，含一个酸性片段时，包括但不限于羧酸，可能形成的两性离子(“内盐”)包含在术语“盐”的范围内。药学上可接受的(即无毒，生理可接受的)盐是首选，虽然其他盐类也有用，例如可以用在制备过程中的分离或纯化步骤。本发明的化合物可能形成盐，例如，化合物i与一定量如等当量的酸或碱反应，在介质中盐析出来，或在水溶液中冷冻干燥得来。[0165]本发明中的化合物含有的碱性片段，包括但不限于胺或吡啶或咪唑环，可能会和有机或无机酸形成盐。可以成盐的典型的酸包括醋酸盐(如用醋酸或三卤代醋酸，如三氟乙酸)、己二酸盐、藻朊酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二甘醇酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、羟基乙磺酸盐(如，2-羟基乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐(如，2-萘磺酸盐)、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐(如3-苯丙酸盐)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐，水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(如与硫酸形成的)、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐如对甲苯磺酸盐、十二烷酸盐等等[0166]本发明的某些化合物可能含有的酸性片段，包括但不限于羧酸，可能会和各种有机或无机碱形成盐。典型的碱形成的盐包括铵盐、碱金属盐如钠、锂、钾盐，碱土金属盐如钙、镁盐，和有机碱形成的盐(如有机胺)，如苄基、二环已基胺、海巴胺(与n,n-二(去氢枞基)乙二胺形成的盐)、n-甲基-d-葡糖胺、n-甲基-d-葡糖酰胺、叔丁基胺，以及和氨基酸如精氨酸、赖氨酸等等形成的盐。碱性含氮基团可以与卤化物季铵盐，如小分子烷基卤化物(如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物及碘化物)，二烷基硫酸盐(如，硫酸二甲酯、二乙酯，二丁酯和二戊酯)，长链卤化物(如癸基、十二烷基、十四烷基和十四烷基的氯化物、溴化物及碘化物)，芳烷基卤化物(如苄基和苯基溴化物)等等。[0167]本发明中化合物的前药及溶剂合物也在涵盖的范围之内。此处术语“前药”是指一种化合物，在治疗相关疾病时，经过代谢或化学过程的化学转化而产生本发明中的化合物、盐、或溶剂合物。本发明的化合物包括溶剂合物，如水合物。[0168]本发明中的化合物、盐或溶剂合物，可能存在的互变异构形式(例如酰胺和亚胺醚)。所有这些互变异构体都是本发明的一部分。[0169]所有化合物的立体异构体(例如，那些由于对各种取代可能存在的不对称碳原子)，包括其对映体形式和非对映形式，都属于本发明的设想范围。本发明中的化合物独立的立体异构体可能不与其他异构体同时存在(例如，作为一个纯的或者实质上是纯的光学异构体具有特殊的活性)，或者也可能是混合物，如消旋体，或与所有其他立体异构体或其中的一部分形成的混合物。本发明的手性中心有s或r两种构型，由理论与应用化学国际联合会(iupac)1974年建议定义。外消旋形式可通过物理方法解决，例如分步结晶，或通过衍生为非对映异构体分离结晶，或通过手性柱色谱法分离。单个的光学异构体可通过合适的方法由外消旋体得到，包括但不限于传统的方法，例如与光学活性酸成盐后再结晶。[0170]本发明中的化合物，依次通过制备、分离纯化获得的该化合物其重量含量等于或大于90％，例如，等于或大于95％，等于或大于99％(“非常纯”的化合物)，在正文描述列出。此处这种“非常纯”本发明的化合物也作为本发明的一部分。[0171]本发明的化合物所有的构型异构体都在涵盖的范围之内，无论是混合物、纯的或非常纯的形式。在本发明化合物的定义包含顺式(z)和返式(e)两种烯烃异构体，以及碳环和杂环的顺式和反式异构体。[0172]在整个说明书中，基团和取代基可以被选择以提供稳定的片段和化合物。[0173]特定官能团和化学术语定义都详细介绍如下。对本发明来说，化学元素与periodictableoftheelements,casversion,handbookofchemistryandphysics,75thed.中定义的一致。特定官能团的定义也在其中描述。此外，有机化学的基本原则以及特定官能团和反应性在“organicchemistry”,thomassorrell,universitysciencebooks,sausalito:1999,也有说明，其全部内容纳入参考文献之列。[0174]本发明的某些化合物可能存在于特定的几何或立体异构体形式。本发明涵盖所有的化合物，包括其顺式和反式异构体、r和s对映异构体、非对映体、(d)型异构体、(l)型异构体、外消旋混合物和其它混合物。另外不对称碳原子可表示取代基，如烷基。所有异构体以及它们的混合物，都包涵在本发明中。[0175]按照本发明，同分异构体的混合物含有异构体的比率可以是多样的。例如，在只有两个异构体的混合物可以有以下组合：50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，95:5，96:4，97:3，98:2，99:1，或100:0，异构体的所有比率都在本发明范围之内。本专业内一般技术人员容易理解的类似的比率，及为更复杂的异构体的混合物的比率也在本发明范围之内。[0176]本发明还包括同位素标记的化合物，等同于原始化合物在此公开。不过实际上对一个或更多的原子被与其原子量或质量序数不同的原子取代通常会出现。可以列为本发明的化合物同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯同位素，分别如2h、3h、13c、11c、14c、15n、18o、17o、31p、32p、35s、18f和36cl。本发明中的化合物，或对映体、非对映体、异构体，或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中含有上述化合物的同位素或其他同位素原子都在本发明的范围之内。本发明中某些同位素标记化合物，例如3h和14c的放射性同位素也在其中，在药物和底物的组织分布实验中是有用的。氚，即3h和碳-14，即14c，它们的制备和检测比较容易。是同位素中的首选。此外，较重同位素取代如氘，即2h，由于其很好的代谢稳定性在某些疗法中有优势，例如在体内增加半衰期或减少用量，因此，在某些情况下可以优先考虑。同位素标记的化合物可以用一般的方法，通过用易得的同位素标记试剂替换为非同位素的试剂，用批露在示例中的方案可以制备。[0177]如果要设计一个本发明的化合物特定的对映体的合成，它可以不对称合成制备，或用手性辅剂衍生化，将所产生的非对映混合物分离，再除去手性辅剂而得到纯的对映体。另外，如果分子中含有一个碱性官能团，如氨基酸，或酸性官能团，如羧基，可以用合适的光学活性的酸或碱的与之形成非对映异构体盐，再通过分离结晶或色谱等常规手段分离，然后就得到了纯的对映体。[0178]本技术所涉及的化合物及其药学可接受的盐的代谢产物，以及可以在体内转变为本技术所涉及的化合物及其药学可接受的盐的结构的前药，也包含在本技术的权利要求中。[0179]制备方法[0180]本发明的化合物可以按照常规路线或方法制备得到，也可以按照本文中描述的方法或路线获得。[0181]下面更具体地描述本发明化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。[0182]优选地，本发明式i化合物的制备方法，包括如下步骤：[0183](iii)在缓冲溶液(如，含mg2 的hepes溶液)中，酶(如，scdase)存在下，化合物iv和r2cooh反应，得到式i化合物。[0184]优选地，所述的式i化合物的制备方法包括如下步骤：[0185](iii')在缓冲溶液(如，含mg2 的hepes溶液)中，酶(如，neu5ac醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶、唾液酸转移酶和scdase)存在下，化合物a4化合物a1胞苷三磷酸(ctp)、丙酮酸和r2cooh反应，得到式iv化合物[0186]优选地，所述的式i化合物的制备方法，还包括步骤：[0187][0188](i)在缓冲溶液(如naac溶液)中，酶(如，egcase糖苷合成酶)存在下，氟化乳糖和鞘氨醇反应，得到化合物a4[0189]上述各式中，z、r1和r2的定义如上所述。[0190]优选地，本发明式i化合物的制备的反应历程如下所示，[0191][0192]式中，z、r1和r2的定义如上所述。[0193]药物组合物和施用方法[0194]由于本发明化合物具有优异的神经损伤修复、神经保护、肿瘤抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于预防和/或治疗(稳定、减轻或治愈)神经及肿瘤相关疾病。[0195]本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。[0196]“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。[0197]本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。[0198]用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。[0199]固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。[0200]用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。[0201]除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。[0202]除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。[0203]用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。[0204]本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。[0205]联合给药时，所述药物组合物还包括与一种或多种(2种，3种，4种，或更多种)其他药学上可接受的化合物。该其他药学上可接受的化合物中的一种或多种(2种，3种，4种，或更多种)可与本发明的化合物同时、分开或顺序地用于预防和/或治疗神经损伤及肿瘤相关疾病。[0206]使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。[0207]本发明的主要优点在于：[0208]1.本发明化合物对神经细胞具有显著的促进生长作用。[0209]2.发明化合物在较高剂量下对神经细胞无明显抑制、杀伤作用，具有较高的安全性。[0210]3.本发明方法，反应条件可控、效率高，且得到的产物具有较高的纯度和产率，有利于放大生产和纯化。[0211]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。[0212]实施例[0213]实施例1神经节苷脂gm3(α-neu5ac-(2-3)-β-gal-(1-4)-β-glc-(1-1)-cer)的合成[0214][0215]步骤1：化合物乳糖-鞘氨醇的合成[0216][0217]反应在含0.1％tritonx-100的50mm，ph5.8naac缓冲液中进行。总反应体系为100ml，其中，底物鞘氨醇(sphingosine)终浓度0.5mm的，氟化乳糖终浓度为1mm，纯egcase糖苷合成酶酶液终浓度为25μg/ml。将反应体系置于37℃恒温水浴中反应48-72h。反应结束后于沸水浴中煮沸5min使egcase糖苷合成酶灭活，12000r/min离心30min除去已失活的酶。离心后上层清液经处理后得乳糖-鞘氨醇(lactose-sphingosine)。[0218]步骤2：一锅法合成α-neu5ac-(2-3)-β-gal-(1-4)-β-glc-(1-1)-cer[0219]反应在含20mmmg2 的500mm，ph8.5的hepes缓冲液中进行，总反应体系为10ml；其中，底物lactose-sphingosine终浓度为10mm，mannac终浓度为20mm，硬脂酸终浓度为20mm，ctp终浓度为10mm，丙酮酸终浓度为60mm。将所有反应物完全溶解后，加入纯neu5ac醛缩酶、cmp-sialicacid合成酶、唾液酸转移酶及scdase，并将反应体系置于37℃恒温水浴中，反应48-72h。反应结束后，于沸水浴中煮沸5min使酶灭活，12000r/min离心30min，除去已失活的酶。离心后，上层清液经处理后得到白色固体α-neu5ac-(2-3)-β-gal-(1-4)-β-glc-(1-1)-cer(8.32mg，产率＝35.7％)。1h-nmr(400hz,cd3od)δ7.857(d,1h,j＝8.8hz),δ5.685(m,2h),δ5.467(d,1h,j＝7.6h-e),δ5.428(d,1h,j＝7.6h-d),δ5.345(br-s,1h),δ4.431(d,1h,j＝8hz,h-1),δ4.303(d,1h,j＝8hz,h-1'),δ4.186(d,1h),δ4.100-4.025(m,2h),δ4.000-3.500(m,18h),δ3.483(d,1h,j＝9.6hz),δ3.423(m,1h),δ2.848(d,1h,j＝12hz),δ2.174(t,2h,j＝8hz),δ2.007(s,3h,nhac),δ1.73(t,1h,j＝11.6hz),δ1.580(s,4h,ch2),δ1.42-1.08(s,50h,ch2),δ0.903(s,6h,ch3-sphingosine,ch3-tricosanoicacid).[0220]实施例2神经节苷脂gm3(α-neu5prop-(2-3)-β-gal-(1-4)-β-glc-(1-1)-cer)的合成[0221][0222]参照实施例1，将mannac替换为mannpro，收率40％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ5.99–5.78(m,1h),5.53–5.37(m,1h),4.08–3.33(m,19h),2.30–2.16(m,3h),2.20–2.03(m,2h),2.00(s,2h),1.56(q,j＝7.3hz,3h),1.40(q,j＝7.6hz,2h),1.28(d,j＝9.1hz,51h),0.88(t,j＝6.6hz,6h).[0223]实施例3化合物n-2的合成[0224][0225]参照实施例1，将mannac替换为收率32％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.81(s,1hh-4cou)7.82(dd,j＝8.0,1.6hz,1hh-5cou),7.74(ddd,j＝8.8,7.4,1.6hz,1h),7.42(m,2hh-6cou,h-8cou)5.85(m,1h)5.46(m,1h)4.32(dt,j＝13.9,7.0hz,2h),4.06–4.01(m,1h),4.01–3.96(m,1h),3.94(dd,j＝8.5,2.7hz,1h),3.92–3.89(m,1h),3.84(d,j＝4.5hz,1h),3.82(s,1h),3.79(t,j＝2.5hz,2h),3.76(d,j＝3.2hz,1h),3.73–3.65(m,2h),3.65–3.56(m,2h),3.55–3.53(m,1h),3.53–3.48(m,2h),3.46(dd,j＝9.7,3.3hz,1h),3.38(dt,j＝8.5,4.1hz,1h),2.32–2.15(m,4h),2.08(q,j＝7.0hz,2h),1.57(t,j＝7.3hz,2hch2),1.39(d,j＝15.4hz,2hch2),1.28(d,j＝9.4hz,46hch2),0.97–0.80(m,6h2ch3-cer).[0226]实施例4化合物n-3的合成[0227][0228]参照实施例1，将mannac替换为收率36％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.00(d,j＝7.6hz,2h),7.45(t,j＝7.6hz,2h),5.04(s,1h),4.31(dt,j＝11.5,7.2hz,4h),4.07–3.85(m,7h),3.79(td,j＝14.3,12.2,6.2hz,6h),3.72–3.42(m,12h),2.23(dt,j＝20.0,6.0hz,5h),2.08(q,j＝7.0hz,3h),2.00(s,3h),1.57(p,j＝7.0hz,4h),1.44–1.36(m,4h),1.28(d,j＝8.3hz,32h),0.88(t,j＝6.6hz,6h).[0229]实施例5化合物n-4的合成[0230][0231]参照实施例1，将mannac替换为收率30％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ9.19(s,1h),9.15(d,j＝7.7hz,1h),8.76(d,j＝7.7hz,1h),8.72–8.66(m,2h),5.78–5.68(m,1h),5.64(t,j＝5.9hz,1h),5.35(d,j＝9.7hz,2h),5.29–5.08(m,6h),5.08–4.77(m,8h),4.66(p,j＝1.6hz,7h),3.74(s,4h),3.62(td,j＝7.4,1.5hz,3h),3.47(ddt,j＝29.6,22.3,10.3hz,4h),3.35(s,3h),3.21(t,j＝11.9hz,2h),2.94(t,j＝7.3hz,3h),2.77(s,2h),2.66(d,j＝5.6hz,20h),2.64(s,20h),2.25(td,j＝6.8,1.8hz,6h).[0232]实施例6化合物n-5的合成[0233][0234]参照实施例1，将mannac替换为收率28％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.15(d,2h),7.81(d,j＝7.7hz,2h),5.90(m,1h),5.66(t,j＝5.9hz,1h),5.35(d,j＝9.7hz,2h),5.29–5.08(m,6h),5.08–4.77(m,8h),4.66(p,j＝1.6hz,7h),3.74(s,4h),3.62(td,j＝7.4,1.5hz,2h),3.47(ddt,j＝29.6,22.3,10.3hz,4h),3.35(s,3h),3.21(t,j＝11.9hz,2h),2.88(t,j＝7.3hz,3h),2.77(s,2h),2.66(d,j＝5.6hz,20h),2.64(s,20h),1.98(td,j＝6.8,1.8hz,6h).[0235]实施例7化合物n-8的合成[0236][0237]参照实施例1，将mannac替换为收率32％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.95(t,j＝1.7hz,1h),7.92(dd,j＝7.7,1.4hz,2h),7.57(dd,j＝8.2,1.9hz,1h),7.44(td,j＝7.9,1.3hz,2h),3.98(d,j＝10.2hz,2h),3.90–3.71(m,5h),3.71–3.36(m,9h),2.25(td,j＝7.4,1.3hz,3h),2.20–1.99(m,5h),1.98(s,2h),1.57(t,j＝7.1hz,3h),1.41(d,j＝9.0hz,2h),1.31(d,j＝7.7hz,12h),1.27(s,31h),0.92–0.83(m,6h).[0238]实施例8化合物n-9的合成[0239][0240]参照实施例1，将mannac替换为收率22％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.12(d,j＝7.7hz,2h),7.84(d,j＝7.7,2h),4.21(d,j＝10.2hz,2h),4.01–3.89(m,5h),3.71–3.44(m,9h),2.25(td,j＝7.4,1.3hz,3h),2.20–1.99(m,5h),1.98(s,2h),1.57(t,j＝7.1hz,3h),1.58(d,j＝9.0hz,2h),1.36(d,j＝7.7hz,12h),1.31(s,31h),0.88(s,6h).[0241]实施例9化合物n-6的合成[0242][0243]参照实施例1，将mannac替换为收率38％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.82(d,j＝7.7hz,1h),7.67(dt,j＝9.6,2.0hz,1h),7.47(td,j＝8.0,5.6hz,2h),7.31(td,j＝8.5,2.6hz,1h),5.04(s,1h),4.00(td,j＝10.6,4.1hz,3h),3.91–3.36(m,15h),2.25(t,j＝7.4hz,3h),2.21–1.94(m,8h),1.57(t,j＝7.1hz,3h),1.39(dd,j＝16.1,9.3hz,4h),1.27(s,32h),0.88(t,j＝6.6hz,6h).[0244]实施例10化合物的n-7合成[0245][0246]参照实施例1，将mannac替换为收率31％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.32(d,j＝7.7hz,2h),7.87(d,j＝7.7hz,2h),5.32(m,2h),5.01(m,2h),4.00(td,j＝10.6,4.1hz,2h),3.91–3.36(m,14h),2.21–1.94(m,8h),1.67(t,j＝7.1hz,2h),1.60(dd,j＝16.1,9.3hz,4h),1.53(s,28h),0.88(t,j＝6.6hz,6h).[0247]此外，参照实施例1的方法，将mannac分别替换为相应的取代的氨基甘露糖，合成了化合物n-10、n-11、n-12、n-13、n-14、n-15、n-16、n-17、2c-3、2c-9、2c-12，本发明合成的化合物汇总如下表1所示[0248]表1[0249][0250][0251]实施例11生物活性测试[0252]mtt试验[0253]mtt试验是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。[0254]mtt试验过程：[0255]1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔(边缘孔用无菌pbs填充)。[0256]2.置于5％co2培养箱中，37℃孵育24h左右，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物(3个复孔)。[0257]3.继续于5％co2培养箱中，37℃孵育24小时后，每孔加入10ulmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h。[0258]4.终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值。[0259]5.通过公式计算得到药物ic50。[0260]实验结果[0261]该生物活性测定实验中所有阳性、阴性和药物测定实验条件均一致。[0262]mtt实验结果表明，本专利涉及的化合物大部分在较高剂量下对神经细胞无明显抑制、杀伤作用(ic50》200mm)。[0263]实施例12细胞增殖实验[0264]实验过程：[0265]收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔(96孔平底板)加入100ul，铺板使待测细胞密度至100-1000每孔(边缘孔用无菌pbs填充)。置于5％co2的培养箱中，37℃孵育24h左右，加入浓度梯度的药物(3个复孔)。对给药后0h、12h、24h、48h、72h、96h每孔中细胞进行计数。通过公式计算药物对细胞增殖活性(或促进率)的影响，结果见表2。[0266]表2gm3衍生物促神经细胞生长活性实验[0267][0268]预实验中，neuro2a细胞给予衍生物n-3，给药浓度梯度从250μm至0.5μm，实时监控细胞数量(使用xcelligencertcadp实时无标记细胞分析仪检测细胞增殖)。结果显示50μmn-3显示出较好活性，且给药量较小。因此后续细胞实验衍生物给药浓度均为50μm。[0269]细胞增殖实验结果显示本发明化合物在neuro2a细胞表现出促进增殖的作用。其中衍生物n-14和2c-12组促neuro2a细胞增殖可达到27.8％和29.73％。对在neuro2a细胞上表现出促进增殖的作用的衍生物n-14和2c-12结构进行分析，推测苯环3号位上引入吸电子基(如硝基、卤素等)可明显增加促增殖活性。并且从表中数据可以看出：先导化合物神经节苷脂gm3(α-neu5ac-(2-3)-β-gal-(1-4)-β-glc-(1-1)-cer)中n-乙酰神经氨酸5’上的乙酰基，替换为烷基(如甲基)、硝基、cl、br、i等基团取代的苯酰基，所得衍生物的促进生长作用显著提升。[0270]实施例13原代神经细胞神经突生长实验[0271]实验过程：[0272]取出生24hr内乳鼠断头，在预冷的pbs缓冲液中，以大脑解剖定位分离海马组织；加入2ml的0.05％胰蛋白酶消化海马组织，在培养箱内37℃、5％co2的环境中消化20min之后，用等体积的dmem/f12(含10％fbs)终止消化；静置2min，等待未被彻底消化的组织及血网膜等沉降，取上层细胞500×g离心2min，除去上清液，用dmem/f12(含10％fbs)重悬细胞，以3×106每孔的密度滴片；0.5hr后加1mlneurobasal培养基，其中添加b27、glutamax和抗生素。之后每隔两天，更换一半体积培养基。[0273]原代神经元培养6d后，用化合物处理48h。细胞用pbs洗涤，在室温下用4％pfa(sigma)固定，0.1％triton在4℃下渗透细胞，然后在5％的驴血清中在室温下封闭细胞，与一抗(map2,abcam)在4℃下孵育12小时。在黑暗中向细胞中加入二抗1小时。细胞核核用dapi(sigma)染色15分钟。最后，将带有细胞的覆盖物放在载玻片上进行成像(蔡司lsm880)。[0274]实验结果如图1所示，其中，图a为原代神经元接种于6孔板，培养6天后用本发明化合物(n-14、2c-12)(50mm,ngf25ng/ml)处理原代神经元48h。map2(绿色)表示神经元。dapi表示原子核。比例尺:10μm。图b为定量显示各组原代神经细胞的长度。实验重复至少3次；*p《0.05。[0275]结果表明，本发明的gm3类似物(如n-14和2c-12)可以诱导神经突起生长，其可作为生长促进剂或在治疗神经损伤和疾病方面具有很大的潜力。[0276]实施例14划痕实验[0277]实验过程：[0278]细胞划痕实验(woundhealing)是一种操作简单、经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理：[0279]1.用胰酶消化对数期的细胞。[0280]2.细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜(数量少时可培养一段时间至铺满板底)。[0281]3.细胞铺满板底后，用1ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。(人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷。)[0282]4.吸去细胞培养液，用pbs冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。[0283]5.加入无血清培养基，拍照记录。[0284]6.将培养板放入培养箱培养，每隔24小时取出拍照。[0285]7.根据收集图片数据分析实验结果。[0286]取a431细胞接种于6孔板中，培养24h后划痕并给予药物2c-12(50mm)。无血清培养24h后，与培养0h和24h时拍照，收集图片数据分析，实验结果如图2所示。[0287]结果表明，本发明的gm3类似物可以抑制肿瘤细胞a431的迁移能力。[0288]实施例15transwell细胞侵袭实验[0289]实验过程：[0290]1、基质胶铺板[0291]1.基质胶准备：[0292]将冻存于－20℃冰箱的bdmatrigel胶4℃过夜，变成液态；(每个ep管130ul)；同时-20℃预冷试管和枪头。[0293]2.取1250ul无血清的预冷细胞培养基dmem，加入250ulmatrigel胶，混匀，每孔加100ul；(无血清培养基和基质胶按1：5稀释，4℃操作，最好在冰浴上)[0294]3.在37℃培养箱中(至少4-5h)。[0295]2、水化基底膜[0296]把剩下的培养基吸出，用无血清培养基dmem洗matrigel洗1次。[0297]3、细胞悬液制备[0298]胰酶消化细胞，离心，无血清培养基dmem洗3次，细胞计数，配成细胞悬液；细胞数：5-8*104。[0299]4、上室加200ul细胞悬液[0300]5、下室600ul含有20％fbs条件培养基[0301]6、上下室均加gm3衍生物(50mm)[0302]7、37℃培养箱中，孵育48小时[0303]8、染色和计数[0304]1.棉签擦去上室上面的非侵袭细胞。[0305]2.移去transwells，倒置，风干。[0306]3.24孔板中加入500μl含0.1％结晶紫0.1g/100ml，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃30min后取出，pbs清洗。[0307]4.直径上取4个视野，照相，计数。[0308]5.24孔板中加入500μl33％醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测od值，间接反应细胞数。[0309]实验结果如图3所示，结果表明，本发明gm3类似物可以抑制肿瘤细胞a431的侵袭能力。[0310]实施例16动物实验[0311]c57bl/6雄性鼠和balb/cnude裸鼠均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。小鼠黑色素瘤细胞-荧光素酶标记(b16-luc)细胞购买于美轩生物科技有限公司；荧光素钾盐购买于优宁维生物科技有限公司。[0312]实验过程：[0313]1、取对数生长期的肿瘤细胞，消化，重悬，使肿瘤细胞悬液的细胞浓度为5x10^6cells/ml。[0314]2、取0.2ml稀释好的细胞悬液，接种于小鼠皮下，待肿瘤直径长至约0.6cm时，将荷瘤小鼠分组进行实验，分为3组每组5只。[0315]3、小鼠每天腹腔注射本发明化合物(化合物n-12)100μg/只，连续注射7天。[0316]4、最后一天，安乐死老鼠，取肿瘤组织称重。[0317]实验结果如图4所示，结果表明，与空白组相比，本发明gm3类似物可以抑制裸鼠实体瘤的生长。[0318]在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12