一种tkt基因启动子突变体及其在生产L-赖氨酸中的应用的制作方法

一种tkt基因启动子突变体及其在生产l-赖氨酸中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物学和基因工程技术领域，特别是涉及一种tkt基因启动子突变体及其在生产l-赖氨酸中的应用。


背景技术：

2.l-赖氨酸是人类和动物所必需的、自身不能合成的氨基酸之一，由于l-赖氨酸具有多种生理功能，如平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因而被广泛应用于饲料工业、医药工业及食品工业中，其中90％以上的赖氨酸产品用作饲料添加剂。
3.目前为止，工业上生产l-赖氨酸的方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产l-赖氨酸应用最广泛的方法。国内外用于工业化生产l-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)、黄色短杆菌(b.flavum)、乳酸发酵短杆菌(b.lactofermentus)和大肠杆菌(e.coli)的改造型菌株。在谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的途径中，合成1mol赖氨酸需要消耗4molnadph，因此提高nadph的量是提高l-赖氨酸积累量的重要手段之一。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，g6pdh)由基因zwf编码，它是磷酸戊糖途径的主要调节酶，催化6-磷酸葡萄糖脱氢，形成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时其还原当量产物以nadph形式储存，以供生物合成及维持细胞内的还原状态，对维持细胞内nadph和氧化还原反应的平衡起着重要作用。ohnishi等都指出，通过定点突变，使zwf基因中的243位碱基由a突变成t可以有效解除atp、磷酸烯醇式丙酮酸和果糖-1，6-二磷酸的抑制作用，增大nadph的量，从而有效增加l-赖氨酸的量。
4.因此，通过基因突变来改变相应产物的表达量，从而影响到相关的代谢，达到提高目的产物的目标，是切实可行的方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种tkt基因启动子突变体，通过在tkt基因的启动子区域引入点突变，改变tkt基因的启动子区域的构象结构，从而影响tkt基因的表达。
6.本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种tkt基因启动子突变体的构建方法。
7.本发明所要解决的第三个技术问题是：提供一种包含tkt基因启动子突变体的重组载体及重组菌株。
8.本发明所要解决的第四个技术问题是：提供一种包含tkt基因启动子突变体的重组菌株在生产l-赖氨酸中的应用。
9.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
10.一种tkt基因启动子突变体，所述包含点突变的tkt基因启动子的核苷酸序列如
seq id no.2所示，其启动子区域部分核苷酸序列由seq id no.1中的ccaattaacc替换为tgagtgaaat。
11.如上所述的tkt基因启动子突变体的制备方法，包括以下步骤：
12.a.引物设计：根据ncbi公布的谷氨酸棒状杆菌atcc13032的基因组序列(seq id no.1)，设计如下引物：
13.p1:cgcggatccgcgacaaggaggagttcaataacc(bamh i)
14.p2:gatctacgacttaatttcactcattcaaatttggcaaagg
15.p3:cctttgccaaatttgaatgagtgaaattaagtcgtagatc
16.p4:acgcgtcgacggaagccttacgagttgc(sal i)；
17.b.pcr扩增：以谷氨酸棒状杆菌atcc13032基因组(seq id no.1)为模板，分别以引物p1和p2、p3和p4进行pcr扩增，得到大小分别为859bp(seq id no.3)、1262bp(seq id no.4)的dna片段；
18.其中pcr扩增条件为：
19.预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，1min30s；40循环；后延伸：72℃，10min；
20.c.纯化：将步骤b得到的产物分别通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化；
21.d.pcr扩增：以步骤c纯化后的两片段为模板，以引物p1和p4进行重叠pcr扩增获得2079bp的dna片段(seq id no.2)。
22.其中pcr扩增条件为：
23.预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃，10min。
24.一种包含tkt基因启动子突变体的重组载体及重组菌株，将通过重叠pcr获得的dna片段利用bamh i酶和sal i酶进行双酶切，然后与同样双酶切的穿梭质粒连接得到重组载体；然后将重组载体转化到赖氨酸生产菌中得到重组菌株。
25.优选的，所述的重组载体是将经过琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的重叠pcr获得的dna片段进行酶切、纯化后，再用连接酶连接到穿梭质粒pk18mobsacb上，得到重组载体(名称pk18-m-tkt)。
26.优选的，所述的重组载体电转化到谷氨酸棒杆菌中得到重组菌株。
27.进一步的，所述的谷氨酸棒杆菌为菌株m7(保藏编号：cgmcc no.8184，保藏时间：2013年09月13日，保藏中心：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，得到的重组菌株为m7-01。
28.进一步的，所述的重组菌株通过以下方法进行筛选：
29.将获得的重组质粒pk18-m-tkt电转化入谷氨酸棒杆菌菌株m7中，对培养产生的单菌落通过引物p1和m13f进行鉴定，将扩增出2114bp的dna片段(seq id no.5)的菌株定义为阳性菌株；将阳性菌株在含10％蔗糖的lb培养基上进行培养，将培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的lbg培养基(在lb培养基中添加5g/l的葡萄糖)上进行培养。筛选在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步进行pcr鉴定，挑取菌株利用如下引物进行pcr扩增：
30.p5:gcaccttgcgttgaaggcccag
31.p6:ctgcgagggagcgggtgtgagcg
32.将pcr扩增出的1728bp的dna片段(seq id no.6)，送北京invitrogen公司进行测序，通过序列比对，含有“tgagtgaaat”碱基序列的菌株即为重组菌株m7-01。
33.一种包含tkt基因启动子突变体的重组菌株在生产l-赖氨酸中的应用，将包含tkt基因启动子突变体的重组菌株进行发酵生产，得到l-赖氨酸。
34.由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
35.本发明通过对tkt基因的启动子区域引入突变，获得重组菌株，与现有菌株的相比，改造位点没有冲突，改造后的突变体可以增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，用于谷氨酸棒状杆菌中赖氨酸的发酵生产，可以进一步提高赖氨酸的产量，降低生产成本。
具体实施方式
36.下面结合实施例，进一步阐述本发明。
37.本发明涉及的培养基如下：
38.(1)lb固体培养基：tryptone(胰蛋白胨)10g/l，yeast extract(酵母膏)5g/l，nacl 10g/l，琼脂20g/l，ph 7.0。
39.(2)lb液体培养基：tryptone 10g/l，yeast extract 5g/l，nacl 10g/l，ph 7.0。
40.(3)lbg液体培养基：tryptone 10g/l，yeast extract 5g/l，nacl 10g/l，葡萄糖5g/l，ph 7.0。
41.(4)lbg固体培养基：tryptone 10g/l，yeast extract 5g/l，nacl 10g/l，葡萄糖5g/l，琼脂20g/l，ph 7.0。
42.实施例一包含点突变的tkt基因启动子区的dna片段的获得
43.a.引物设计：根据ncbi公布的谷氨酸棒状杆菌atcc13032的基因组序列，设计引物用于在菌株m7中tkt基因的启动子区域引入突变，设计引物如下(由北京invitrogen公司合成)：
44.p1:cgcggatccgcgacaaggaggagttcaataacc(bamh i)
45.p2:gatctacgacttaatttcactcattcaaatttggcaaagg
46.p3:cctttgccaaatttgaatgagtgaaattaagtcgtagatc
47.p4:acgcgtcgacggaagccttacgagttgc(sal i)；
48.其中p2引物末端划线部分序列与p3引物起始端划线部分序列为反向配对序列，p3引物中间划线部分序列为人工合成的“tgagtgaaat”序列，用于代替包含tkt基因的启动子区域的原序列(seq id no.1)中的“ccaattaacc”；
49.b.pcr扩增：以谷氨酸棒状杆菌atcc13032基因组为模板，分别以引物p1和p2、p3和p4进行pcr扩增，得到大小分别为859bp(seq id no.3)、1262bp(seq id no.4)的dna片段；
50.pcr体系：premixhs 25μl，模板dna2μl，引物(20pm)各1μl，灭菌蒸馏时21μl，总体积50μl。
51.其中pcr扩增条件为：
52.预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，1min30s；40循环；后延伸：72℃，10min；
53.c.纯化：将步骤b得到的产物分别通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化；
54.d.pcr扩增：以步骤c纯化后的两个片段为模板，以引物p1和p4进行重叠pcr扩增获得2079bp的dna片段(seq id no.2)。
55.pcr体系：premixhs 25μl，模板dna各2μl，引物(20pm)各1μl，灭菌蒸馏时19μl，总体积50μl。
56.其中重叠pcr扩增条件为：
57.预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃，10min。
58.e.纯化：将步骤d得到的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，该dna片段两端分别包含bamh i和sal i酶切位点。该dna片段导致tkt基因启动子区的“ccaattaacc”突变为“tgagtgaaat”。
59.实施例二包含点突变的tkt基因启动子区的重组载体pk18-m-tkt的构建
60.将实施例一中步骤e纯化得到的dna片段与穿梭质粒pk18mobsacb进行双酶切(bamh i/sal i)。
61.双酶切反应体系：质粒dna/目标片段20ul，bamh i4 ul，sal i 4ul，10*tbuffer 6ul，灭菌蒸馏水6ul。反应温度37℃，反应时间3小时或过夜。
62.将酶切后的产物分别通过琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化。将纯化后的产物，利用takara公司出品的dna ligation kit ver.2.0试剂盒进行连接，原则上载体dna和插入目标dna片段的摩尔数之比为0.03pmol：0.1～0.3pmol。连接温度为16℃，反应时间为4小时。
63.按照热激转化的方法，将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(购自takara公司)。将转化后的大肠杆菌在37℃条件下培养1小时后，涂布到含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素的lb固体平板上。培养箱中37℃过夜培养约16小时后，接种到含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素的lb液体培养基中，培养16小时后，使用omega公司的质粒提取试剂盒提取重组质粒pk18-m-tkt，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。将重组载体送北京invitrogen公司进行测序鉴定，将含有正确点突变的重组载体保存备用。
64.实施例三包含点突变的tkt基因启动子区的重组菌体的构建
65.将含有正确点突变的重组载体pk18-m-tkt通过电击转化到菌株m7中(经过测序确认该菌体染色体上保留有野生型的tkt基因启动子)，将转化后的菌液涂布到含卡那霉素最终浓度为50ug/ml的lbg固体培养基上，30℃培养24-30小时。对培养得到的单菌落分别通过引物p1和m13f进行鉴定，将扩增出2114bp的dna片段(seq id no.5)的菌株定义为阳性菌株。
66.其中pcr扩增条件为：
67.预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：62℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃，10min。
68.将阳性菌株在含10％蔗糖的lb固体培养基上进行培养，将培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的lbg固体培养基上进行培养。筛选在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步进行pcr鉴定，单菌落利用如下引物进行pcr扩增：
69.p5:gcaccttgcgttgaaggcccag
70.p6:ctgcgagggagcgggtgtgagcg
71.其中pcr扩增条件为：
72.预变性：95℃，5min；变性：98℃，10s；复性：60℃，15s；延伸：72℃，2min；40循环；后延伸：72℃，10min。
73.将pcr扩增出的1728bp的dna片段(seq id no.6)，送北京invitrogen公司进行测序，通过序列比对，含有“tgagtgaaat”碱基序列的菌株即为同源重组成功的菌株，被命名为m7-01。
74.实验例四l-赖氨酸的发酵生产
75.将构建的菌株m7-01和原始菌株m7进行小罐发酵试验。每个菌株重复3次，其中种子培养基配方如表1所示：
76.表1：种子培养基配方
77.名称配方蔗糖20g/l硫酸镁0.4g/l磷酸二氢钾1.0g/l硫酸铵20g/l硫酸亚铁12mg/l硫酸锰12mg/l生物素50mg/l玉米浆5ml/lvb110mg/l烟酰胺50mg/l消泡剂0.1％
78.种子培养条件：37℃，ph6.9，初始转速200rpm，风量0.5vvm，罐压0.5mpa，溶氧校正100％，控溶氧20-25％，接种量5％。培养24h左右，od生长至0.4左右(600nm，稀释26倍)时转接发酵罐。
79.发酵培养的培养基配方如表2所示：
80.表2：发酵培养基配方
81.名称配方葡萄糖30g/l硫酸镁1.5g/l磷酸二氢钾1.2g/l硫酸铵32g/l硫酸亚铁24mg/l硫酸锰24mg/l生物素30mg/l玉米浆24ml/lvb110mg/l烟酰胺30mg/l消泡剂0.1％
82.发酵培养条件：37℃，ph6.9，初始转速200rpm，风量0.5vvm，罐压0.5mpa，溶氧校正100％，控溶氧15-20％，接种量5％，残糖控1g/l，流加75％浓糖、50％硫酸铵，用液氨调节ph，培养周期48h。
83.经过三次发酵，发酵结果见表3。
84.表3：赖氨酸发酵实验结果
[0085][0086]
结果分析：
[0087]
如表3所示，对谷氨酸棒杆菌中的tkt启动子区域的碱基序列进行位点突变，得到的突变体与未突变菌株相比，能显著提高l-赖氨酸的产酸能力。
[0088]
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。