本发明涉及植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株NCIMB 43029；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌株NCIMB 43030；具有抗细菌和再上皮化作用的组合物，所述组合物包含植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌以及任选地包含嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和/或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，所述组合物用作医药产品，尤其用于损伤或伤口的再上皮化过程中；以及包含所述组合物的绷带或试剂盒。
背景技术
皮肤再生的成功是一项重大挑战，因为损伤或伤口愈合是高度动态且复杂的过程，其涉及许多阶段，从止血和凝结阶段开始，形成临时伤口基质，之后是发炎、再上皮化和组织重塑复原的阶段。
当损伤或伤口变成慢性时，愈合损伤或伤口的难度增加。
与伤口愈合过程最常相关的代表问题之一是伤口可能会被感染。开放性伤口，特别是慢性伤口，存在被病原体定殖的高风险。特别是，伤口床为细菌增殖提供理想环境，由于存在允许条件，如血液循环减少和氧气供应不足，细菌可定殖伤口床以形成多细胞聚集体，其通过具有特定结构的生物膜粘附于表面。生物膜由胞外多醣基质构成，允许形成包埋于所述基质中的微生物聚集体。所述结构存在于60％的慢性和6％的急性损伤或伤口中。
生物膜为微生物定殖因子，其不仅允许微生物对大量的生物和非生物表面的强粘附，而且通过包封微生物聚集体，允许后者免受抗微生物剂(如抗生素和杀菌剂)的影响，此外还促进感染扩散。在这些情况下，细菌感染难以根除，常常需要去除受感染的组织或施用高剂量的抗微生物剂(如抗生素和消毒剂)。
即使施用抗生素以供口服和局部使用是有效的治疗策略，其也是对治疗感染的损伤/伤口造成严重问题的耐药性现象出现的主要原因之一，因此妨碍所述损伤/伤口愈合。关于局部消毒剂的使用，应注意，其通常在许多情况下呈现高侵袭性，所述高侵袭性与其中施加这些物质的上皮区域的损伤相关联。
为了能够对伤口愈合采取行动，有必要理解该过程的生物化学方面。
众所周知，一氧化氮(NO)在损伤或伤口的愈合过程中起关键作用，并且尤其在其再上皮化和瘢痕形成方面起关键作用。一氧化氮由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)产生。特别是，一氧化氮为一种生物介质，其影响伤口愈合过程的所有阶段且作用于参与所述过程中的所有细胞类型。
尽管已对使用益生菌治疗皮肤变化进行了研究，但所获得的结果似乎并不明确和/或完全令人满意。
特别是，识别在具有损伤或伤口的组织中发挥相关抗细菌作用和有效再上皮化作用(尤其由iNOS介导)两者的益生菌或含有益生菌的组合物是仍有待实现的目标。
因此需要特别适用于治疗损伤或伤口且具有显著抗细菌作用和有效再上皮化作用的益生菌，以及适用于治疗损伤或伤口且同时不含副作用，且对需要再上皮化的施加区域温和，以及易于安置(set up)和便宜的组合物。
技术实现要素：
本发明人已出人意料地发现，包含SEQ ID NO:4的16S rRNA编码基因的高变区V1-V3、SEQ ID NO:5的groEL基因和SEQ ID NO:6的pheS基因的植物乳杆菌NCIMB43029菌株；包含SEQ ID NO 1的16S rRNA编码基因的高变区V1-V3、SEQ ID NO:2的groEL基因和SEQ ID NO:3的pheS基因的嗜酸乳杆菌NCIMB 43030菌株；以及嗜热链球菌显著增加iNOS的表达和活化，并且因此提高一氧化氮(NO)的水平，对损伤和伤口的再上皮化具有高度积极作用，同时也发挥重要的抗细菌活性。
此外，本发明的发明人已发现一种含有显示抗细菌和再上皮化作用的益生菌的组合物，其允许克服现有技术中的组合物的所有缺点，且其尤其显示不仅具有有效抗细菌和再上皮化作用，而且不含副作用，对施加区域温和，易于安置和便宜。
所述组合物在治疗难以愈合的损伤或伤口方面特别有效，尤其对于治疗存在病原菌的生物膜(可能对抗生素具有抗性)的伤口特别有效。
本发明的第一目标为植物乳杆菌菌株，于2018年4月20日保藏于NCIMB有限公司储存中心，登录号为43029，所述植物乳杆菌菌株包含SEQ ID NO:4的16S rRNA编码基因的高变区V1-V3、SEQ ID NO:5的groEL基因和SEQ ID NO:6的pheS基因(下文中称为植物乳杆菌NCIMB 43029)。
本发明的第二主题为嗜酸乳杆菌菌株，于2018年4月20日保藏于NCIMB有限公司储存中心，登录号为43030，所述嗜酸乳杆菌菌株包含SEQ ID NO:1的16S rRNA编码基因的高变区V1-V3、SEQ ID NO:2的groEL基因和SEQ ID NO:3的pheS基因(下文中称为嗜酸乳杆菌NCIMB 43030)。
如先前所指出，所述益生菌活化或诱导iNOS的表达。因此，本发明的另一目标为植物乳杆菌菌株NCIMB 43029和/或嗜酸乳杆菌菌株NCIMB 43030如先前所定义用作药物。
本发明的目标还为植物乳杆菌菌株NCIMB 43029和/或嗜酸乳杆菌菌株NCIMB 43030如先前所定义用于活化或诱导iNOS表达。
本发明的目标进一步为植物乳杆菌菌株NCIMB 43029和/或嗜酸乳杆菌菌株NCIMB43030如先前所定义用于损伤或伤口的再上皮化和/或用作抗细菌剂。
还已出人意料地发现，包括植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的组合物发挥合并的强大抗细菌和再上皮化作用，并且可用于治疗损伤或伤口。
因此，本发明的另一个目标是一种具有抗细菌和再上皮化作用的组合物，其包含植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
在本发明的一个方面中，所述组合物包含如先前所定义的植物乳杆菌菌株NCIMB43029和/或如先前所定义的嗜酸乳杆菌菌株NCIMB 43030。
在本发明的另一个方面中，所述组合物进一步包含嗜热链球菌物种的至少一种菌株，其能够高度显著地增加iNOS的表达和活化，并且因此提高一氧化氮(NO)的水平；和/或解淀粉芽孢杆菌物种的至少一种菌株，其能够发挥抗真菌活性。
在优选实施方式中，嗜热链球菌包含SEQ ID NO:7的16S rRNA编码基因的高变区V1-V2、SEQ ID NO:8的recA基因和SEQ ID NO:9的secA基因。
在另一优选实施方式中，解淀粉芽孢杆菌菌株为通过编码16S rRNA的SEQ ID NO:10来表征的已知菌株。
本发明的另一个目标为一种根据本发明的组合物，其用作药物，尤其用于损伤或伤口的再上皮化过程中。
本发明的优选方面为一种根据本发明的组合物，其用于通过活化或诱导iNOS表达进行的损伤或伤口的再上皮化过程中。
本发明的另一个目标为一种绷带，其包含根据本发明的组合物。
本发明的另一个目标为一种包含根据本发明的组合物的绷带，所述绷带用作药物，尤其用于损伤或伤口的再上皮化中。
本发明的另一个目标为一种包含无菌可压缩容器或单剂量或多剂量泵的试剂盒，其含有根据本发明的组合物和相对应的包装说明书。
附图说明
图1：细菌提取物在不同时间点对人角质细胞细胞系HaCaT的刮擦单层的再上皮化的作用。
(A)在20和28小时时，细菌提取物在50μg/ml浓度下对刮擦单层的伤口封闭率(相对于相应T0的％)的作用。数据表示为重复两次进行的三个独立实验的平均±SEM。双因素方差分析(ANOVA)后接邓尼特事后检验(Dunnett'spost-hoc test)用于数据组的比较分析。相对于对照(未经处理)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
(B)图像表示在伤口产生后20和28小时时未经处理(对照)或用细菌提取物(50μg/ml)处理的HaCaT细胞单层的再上皮化(放大倍数10倍)。
图2：益生菌提取物对刮擦的角质细胞单层中iNOS水平的影响。
对用50μg/ml益生菌提取物处理28小时的刮擦单层进行iNOS的免疫印迹分析。由条带的密度分析产生的值相对于关于β-肌动蛋白的那些值进行标准化，且与未经处理的对照进行比较。
(A)密度测定结果表示为iNOS/β-肌动蛋白(相对于对照的倍数)。
数据来源于重复两次进行的三个独立实验，而值表示为平均±SEM。单因素方差分析(ANOVA)后接邓尼特事后检验用于评估数据组之间统计学上显著差异的存在。相对于对照(未经处理)，*P<0.05，***P<0.01，****P<0.0001。
(B)示出表示iNOS的免疫印迹的图像。
图3：在存在或不存在氨基胍、AG、iNOS抑制剂的情况下在HaCaT细胞的刮擦单层的培养基中的亚硝酸盐水平。
在用细菌提取物处理之前，将HaCaT细胞的刮擦单层在存在或不存在20μM浓度的AG情况下培育15分钟。培养基中的亚硝酸盐水平在28小时之后通过格里斯试剂(Griess reagent)加以分析。所示数据表示为重复两次进行的三个独立实验的平均±SEM。双因素方差分析后接邦弗朗尼事后检验(Bonferroni'spost-hoc test)用于评估数据组之间统计学上显著差异的存在：相对于对照(未经处理)，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。相对于不存在AG情况下的各相应培养物，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。
图4：iNOS抑制剂AG对由嗜热链球菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌诱导的HaCaT细胞的刮擦单层的再上皮化的作用。
(A)对经20μM浓度的AG预处理15分钟且用50μg/ml浓度的益生菌提取物处理20小时的刮擦单层的封闭相对速率的作用。数据表示为重复两次进行的三个独立实验的平均±SEM。双因素方差分析(ANOVA)后接邦弗朗尼事后检验用于评估统计学上显著差异。相对于不存在AG情况下的各相应培养物，#P<0.05，##P<0.01。
(B)图像表示在存在和不存在用20μM浓度的AG预处理的情况下，后续暴露于50μg/ml浓度的嗜热链球菌、植物乳杆菌或嗜酸乳杆菌提取物20小时的HaCaT细胞的刮擦单层(放大倍数10倍)。
图5：iNOS抑制剂AG对通过添加20μg/ml浓度的解淀粉芽孢杆菌提取物20小时诱导的HaCaT细胞的刮擦单层的再上皮化的作用。
(A)用20μM浓度的AG预处理15分钟对用20μg/ml浓度的解淀粉芽孢杆菌提取物处理20小时的刮擦单层的封闭相对速率的作用。数据表示为重复两次进行的实验的平均±SD，表示重复两次进行的3个独立实验。双因素方差分析(ANOVA)后接邦弗朗尼事后检验用于评估数据组之间的统计学上显著差异。相对于不存在AG情况下的各相应培养物，(#P<0.05，##P<0.01)。相对于对照，**P<0.01。
(B)图像表示经20μM的AG预处理15分钟或不经预处理且接着添加20μg/ml解淀粉芽孢杆菌提取物处理20小时的HaCaT细胞的刮擦单层(放大倍数10倍)。
图6：细菌提取物的不同组合在所指示的浓度下对刮擦后20小时的HaCaT细胞的刮擦单层的再上皮化的作用。数据表示为相对于未经处理的对照，再上皮化的平均增加率(％)。
图7：
图A：患有糖尿病溃疡且在脚趾切除术之后具有手术后伤口的患者的右足的照片(第36天)。
图B：图7A的足部的放大照片。
图8：
图A：图7A的足部在第48天呈侧视图的照片。
图B：图8A的足部呈正视图的放大照片。
图9：
图A：图7A的足部在第57天呈正视图的照片。
图B：图9A的足部呈侧视图的放大照片。
图10：
图A：图7A的足部在第170天呈正视图的照片。
图B：图10A的足部呈侧视图的放大照片。
具体实施方式
根据本发明以上所提出的植物乳杆菌NCIMB 43029菌株是于2018年4月20日在英国苏格兰亚伯丁AB21 9YA巴克斯本克莱伯斯通区弗格森大厦NCIMB有限公司收藏中心(NCIMB Ltd.collection centre,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,Scotland,UK)保藏且具有NCIMB登录号43029的植物乳杆菌菌株。
所述植物乳杆菌NCIMB 43029已由Claudio De Simone教授(51 Route des Chenolettes 1660,OEx，瑞士)于NCIMB有限公司处保藏。
Claudio De Simone教授已授权本专利申请的所有者在本发明文件中提及植物乳杆菌NCIMB 43029，并且同意根据R.33EPC使植物乳杆菌NCIMB 43029可供公众使用。
如先前所定义的植物乳杆菌NCIMB 43029所展示的主要特征是高度活化和诱导iNOS表达的能力，以显著提高一氧化氮水平，如通过亚硝酸盐剂量所证明，并且因此显著作用于损伤或伤口的再上皮化。
体外和体内证据还显示植物乳杆菌NCIMB 43029发挥高度抗细菌作用。
根据本发明的嗜酸乳杆菌NCIMB 43030是于2018年4月20日在英国苏格兰亚伯丁AB219YA巴克斯本克莱伯斯通区弗格森大厦NCIMB有限公司收藏中心保藏且具有登录号NCIMB 43030的嗜酸乳杆菌菌株。
所述嗜酸乳杆菌NCIMB 43030已由Claudio De Simone教授(51 Route des Chenolettes 1660,OEx，瑞士)于NCIMB有限公司处保藏。
Claudio De Simone教授已授权本专利申请的所有者在本发明文件中提及嗜酸乳杆菌NCIMB 43030，并且给予同意以根据R.33EPC使嗜酸乳杆菌NCIMB 43030可供公众使用。
如先前所定义的嗜酸乳杆菌NCIMB 43030所展示的主要特征是高度活化和诱导iNOS表达的能力，以显著提高一氧化氮水平，如通过亚硝酸盐剂量所证明，并且因此显著作用于损伤或伤口的再上皮化。
体外和体内证据还显示嗜酸乳杆菌NCIMB 43030发挥高度抗细菌作用。
所述益生菌菌株是新型的且为本发明的主题，如上文已提及。
还出人意料地发现，呈组合形式的植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌显示增强的抗细菌和再上皮化作用，此从未在包含本领域中当前已知的益生菌的组合物中观察到。
因此，本发明的一个目标为一种组合物，其包含植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌，所述组合物具有抗细菌和再上皮化作用。
根据本发明的优选方面，本发明的组合物进一步包含嗜热链球菌和/或解淀粉芽孢杆菌。
根据本发明的尤其优选方面，本发明的具有抗细菌和再上皮化作用的组合物包含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌。
根据本发明的另一个尤其优选方面，具有抗细菌、再上皮化和抗真菌作用的组合物包含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和解淀粉芽孢杆菌。
根据本发明的组合物通常为优选地以粉末、颗粒、牙龈用片剂或阴道用片剂的形式供局部使用或优选地以胶囊或凝胶的形式供口服使用的组合物。
根据本发明的组合物发挥增强的抗细菌作用，这是因为呈组合形式的植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌能够在减少细菌来源的分子中发挥协同作用。
根据本发明的组合物发挥再上皮化作用，这是因为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌能够活化和诱导iNOS的表达并且因此引起一氧化氮的产生。
优选地，根据本发明的组合物中的植物乳杆菌是如先前所识别的NCIMB 43029菌株。
优选地，根据本发明的组合物中的嗜酸乳杆菌是如先前所识别的NCIMB 43030菌株。
优选地，根据本发明的组合物中的嗜热链球菌为包括SEQ ID NO:7的16S rRNA编码基因的高变区V1-V2、SEQ ID NO:8的recA基因和SEQ ID NO:9的secA基因的菌株。
优选地，根据本发明的组合物中的解淀粉芽孢杆菌为通过编码16S rRNA的SEQ ID NO:10来表征的已知菌株。
按组合物的总重量计，组合物中植物乳杆菌的重量百分比在1重量％至40重量％范围内。
按组合物的总重量计，组合物中嗜酸乳杆菌的重量百分比在1％至40％范围内。
按组合物的总重量计，组合物中嗜热链球菌的重量百分比在0.5％至20％范围内。
按组合物的总重量计，组合物中解淀粉芽孢杆菌的重量百分比在0.1％至10％范围内。
本发明的优选方面为具有抗细菌和再上皮化作用的组合物，其包括：
10重量％至90重量％的植物乳杆菌，和
90重量％至10重量％的嗜酸乳杆菌，
均按所述组合物的总重量计。
本发明的优选方面还为具有抗细菌和再上皮化作用的组合物，其包括：
20重量％至80重量％的植物乳杆菌，
40重量％至10重量％的嗜酸乳杆菌，和
40重量％至10重量％的嗜热链球菌，
均按所述组合物的总重量计。
本发明的优选方面还为具有抗细菌、再上皮化和抗真菌作用的组合物，其包括：
10重量％至80重量％的植物乳杆菌，
40重量％至10重量％的嗜酸乳杆菌，
40重量％至9重量％的嗜热链球菌，和
10重量％至1重量％的解淀粉芽孢杆菌，
均按所述组合物的总重量计。
在本发明的优选方面，组合物中的细菌植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和/或解淀粉芽孢杆菌为活细菌。
或者，细菌植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和/或解淀粉芽孢杆菌为非存活细菌，通常通过照射或通过替代性技术使其不可存活。
优选地，根据本发明的组合物包括至少一种药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂选自包括以下的群组：海藻、蜂花粉、蜂蜜、通气粘土和沸石。
本发明的另一个目标为一种根据本发明的组合物，其用作药物，尤其用于损伤或伤口的再上皮化。优选地，所述再上皮化过程通过活化或诱导iNOS进行。
根据本发明，术语“伤口”意指开放性伤口、慢性伤口、急性伤口、烧伤伤口、手术后伤口、创伤伤口、皮肤磨削术、溃疡如糖尿病溃疡、压疮或胃肠道溃疡形成。
优选方面为一种根据本发明的组合物，其用于损伤或伤口的再上皮化处理过程，所述损伤或伤口选自包括开放性伤口、慢性伤口、急性伤口、烧伤伤口、手术后伤口、创伤伤口、皮肤磨削术、溃疡如糖尿病溃疡、压疮的群组。
所述损伤或伤口通常可能影响皮肤或粘膜，尤其口腔、阴道或直肠粘膜，但也可为胃肠损伤。
因此，本发明的优选方面为用于皮肤、口腔、阴道或直肠粘膜或胃肠粘膜的损伤或伤口的再上皮化过程中的所述组合物。
优选地，当所述组合物用于皮肤、口腔、阴道或直肠粘膜、溃疡如糖尿病溃疡或压疮的损伤或伤口的再上皮化过程中时，所述组合物以颗粒或粉末、牙龈用片剂或阴道用片剂的形式供局部使用。
优选地，当所述组合物用于胃肠粘膜的损伤或伤口的再上皮化过程中时，所述组合物以胶囊或凝胶的形式供口服使用。
根据本发明，所述损伤或伤口可能受到以下组成的生物膜的感染：革兰氏阴性细菌如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和白色念珠菌(CandidaAlbicans)。
本发明的另一个目标为一种绷带，其包含如先前所定义的根据本发明的组合物。
本发明的优选目标为一种包括根据本发明的组合物的绷带，其用作药物，尤其用于损伤或伤口的再上皮化过程中。
本发明的另一个目标为一种包括无菌可压缩容器或单剂量或多剂量泵的试剂盒，其含有根据本发明的组合物和相对应的包装说明书。
实验部分
细菌菌株提取物对产生于HaCaT细胞(人角质细胞细胞系)的刮擦单层上的伤口进行愈合的作用
本发明人已使用体外人造伤口模型评估获自所选细菌菌株的提取物影响伤口再上皮化的能力。显示未经处理的细胞中以及用50μg/ml浓度的各细菌提取物处理的细胞中的刮擦单层的封闭速率，并且通过在伤口产生之后的不同时间点观察伤口边缘之间的区域的再群体化来评估。为了定量地分析细菌提取物对伤口区域的封闭的作用，获取在刮擦之后0、20、28和45小时时通过使用倒置相差显微镜获得的图像，并且通过使用自动计算系统以评估所述细胞相对于所分析的总表面积占据的面积百分比来表示为封闭百分比。在所有实验中，对照细胞(未经处理)的刮擦单层在36-42小时之后完全愈合。在存在或不存在细菌提取物的情况下，将在20和28小时时的再上皮化百分比与T0时的相应单层的伤口进行比较。结果表示为相对再上皮化的百分比(来自重复两次进行的三个独立实验的平均±SEM)以及表示刮擦单层的显微观察结果的图像分别示于图1A和1B中。在伤口的产生之后20小时和28小时时，用来自嗜热链球菌或植物乳杆菌的提取物进行处理相对于未经处理的对照显著加快了修复速率。相比之下，用长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)和短双歧杆菌(B.breve)的提取物进行处理相对于未经处理的对照显著延迟了单层的修复过程。来自保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)的提取物似乎在两个观测时间点相对于对照并不显著影响伤口封闭速率。
iNOS表达和亚硝酸盐水平
为了研究在上述细菌提取物对HaCaT细胞单层修复过程的作用中iNOS的潜在参与，本发明人最初已经通过蛋白质印迹分析在不存在或存在50μg/ml浓度的细菌提取物情况下刮擦产生之后28小时的单层中的iNOS蛋白质水平。将通过iNOS条带的密度分析获得的值相对于关于β-肌动蛋白的值标准化。表示为重复两次进行的三个独立实验的平均±SEM的数据与表示iNOS免疫印迹的图像分别示于图2A和2B中。结果指示用嗜热链球菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的提取物进行处理与其加速单层的再上皮化的能力一致，导致相对于在对照细胞中所观察到的，iNOS蛋白质表达的显著过度调节。在嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的情况下可观察到最高程度的相关作用。虽然在较低程度上，但嗜热链球菌提取物也能够显著增加iNOS蛋白质的表达水平。相对于针对用作对照的细胞单层所观察到的，对产生于单层上的伤口进行愈合不具有显著作用的保加利亚乳杆菌的提取物也不能够调节iNOS表达。另一方面，暴露于长双岐杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌提取物(所有菌株能够抑制伤口封闭速率)的HaCaT细胞单层相对于未经处理的情况显示出显著较低水平的iNOS蛋白质。
通过测量用AG(选择性iNOS抑制剂)预处理或未用此类抑制剂处理的HaCaT细胞的刮擦单层的上清液中的亚硝酸盐水平来进一步分析细菌提取物调节iNOS的能力(已知来自T.P.Misko et al.,Eur.J.Pharmacol,1993,233:119-125)。
如图3中所示，AG预处理由于其能够抑制由刮擦对照单层所诱导的iNOS活性而显著地阻止亚硝酸盐产生的增加。用能够调节iNOS表达的嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的提取物进行处理诱导了培养基中的亚硝酸盐水平相对于对照单层显著增加，即使程度不同。值得注意的是，通过用AG预处理完全或部分地阻止了嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的提取物对亚硝酸盐的产生的刺激作用，进一步支持这些益生菌诱导iNOS表达和活性的能力的证据。
相反地，相对于对照，长双岐杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌的提取物诱导亚硝酸盐水平的显著降低，证实其对iNOS表达程度的抑制作用。根据对iNOS表达进行的实验的结果，相对于仅用细菌提取物处理的单层，用AG预处理并不显著影响用长双岐杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌处理的细胞培养物中的亚硝酸盐水平。用保加利亚乳杆菌的提取物进行处理相对于未经处理的培养物并不显著影响亚硝酸盐水平，而AG预处理相对于未用抑制剂处理的相应样品显著降低了亚硝酸盐水平。
还基于植物乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌的提取物在体外加速伤口封闭过程的能力评估AG(iNOS抑制剂)对伤口封闭速率的作用。表示为重复两次的三个实验的平均±SEM的结果涉及在存在或不存在50μg/ml浓度的细菌提取物的情况下细胞单层中，相对于T0时所产生的刮擦区域，20小时时的再上皮化％(图4A)。还显示表示显微观察结果的图像(图4B)。正如所预期，根据伤口愈合中iNOS活性的作用，就表示为相对于实验开始时产生的刮擦区域的再上皮化％的单层修复速率来说，用AG预处理对对照单层的生理修复具有强作用并且显著地阻止所有这些细菌提取物的刺激作用。
综上所述，这些结果强烈地表明，iNOS的表达和活性的增加在由所选择的益生菌提取物促进的再上皮化过程中起关键作用。
在用20μg/ml浓度的解淀粉芽孢杆菌提取物处理之后，还证实了加速再上皮化过程的能力(图5)。此外，在此情况下，iNOS的参与通过其特异性抑制剂氨基胍(20μM)阻断由用解淀粉芽孢杆菌进行处理所诱导的刺激作用的能力来证实。图5A显示关于相对于T0时所产生的刮擦区域，在用解淀粉芽孢杆菌提取物处理20小时之后的再上皮化％，表示为平均±SD的结果。结果表示重复两次进行的3个独立实验。相对于不存在AG情况下的相应样品，#P<0.05和##P<0.01；相对于未经处理的对照，**P<0.01。
为了评估用益生菌的不同组合进行的处理对刮擦HaCaT细胞单层的再上皮化过程的作用，单个菌株(植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和解淀粉芽孢杆菌)的使用浓度在单用时显示对损伤的修复没有显著影响。实际上，在损伤20小时之后，用10μg/ml浓度的单个细菌提取物处理刮擦单层相对于未经处理的对照不会显著影响伤口封闭％(再上皮化<10％)。另一方面，用浓度均为10μg/ml的植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的组合处理使受伤单层在损伤后20小时的修复速率增加(约35％)。植物乳杆菌(10μg/ml)、嗜酸乳杆菌(10μg/ml)和嗜热链球菌(10μg/ml)的组合在处理20小时之后可观察到的受伤单层中引起修复速率的显著增加(约60％)。类似地，用植物乳杆菌(10μg/ml)、嗜酸乳杆菌(10μg/ml)和解淀粉芽孢杆菌(10μg/ml)进行的组合处理在处理20小时后引起修复速率的增加(超过70％)。植物乳杆菌(10μg/ml)、嗜酸乳杆菌(10μg/ml)、嗜热链球菌(10μg/ml)和解淀粉芽孢杆菌(10μg/ml)的组合在加快损坏单层的再上皮化方面甚至更有效，在20小时后引起伤口封闭速率的增加(97％-98％)。
结论
考虑到在伤口出现时由表皮发挥的重要屏障功能，有必要通过促进再上皮化过程而尽可能快速且有效地恢复组织完整性。
角质细胞的增殖和迁移是伤口愈合期间的再上皮化过程中的基本步骤。
在本研究中，本发明人比较在相同实验条件下七种不同益生菌菌株对体外伤口愈合模型所发挥的作用。获得的结果证明植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和解淀粉芽孢杆菌的提取物促进HaCaT细胞的刮擦单层的再上皮化。相比之下，婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双岐杆菌的提取物抑制再上皮化过程，而保加利亚乳杆菌的细菌提取物对体外伤口修复没有影响。
由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和解淀粉芽孢杆菌诱导的再上皮化增加的基础机制涉及iNOS的表达和活性增加，如通过免疫印迹数据、亚硝酸盐水平分析和用氨基胍(iNOS特异性抑制剂)预处理的作用所展现。另一方面，婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双岐杆菌显著降低刮擦HaCaT细胞单层中的iNOS的表达和活性。在此情形下，还显示保加利亚乳杆菌的细菌提取物无影响。
综上所述，这些结果强烈地表明，如也由在AG存在下进行的实验支持的，促愈合或抗愈合特性严格地取决于益生菌上调或下调iNOS的表达和活性的能力。从本发明人获得的数据延伸了益生菌对上皮化过程的作用的基础机制范围，并且可以证明其在治疗慢性伤口中的用途。所提供的证据应该是进一步详细研究的主题以研究益生菌的潜在治疗用途，尤其在剂量标准化和有益作用的详细表征方面。此外，就安全性和/或功效来说应密切监测生产过程的改变，这可能引起益生菌产品中的有害差异。
由以上内容得出，益生菌菌株的选择也非常重要，因为这些细菌的作用可以是高度菌株特异性的。
物质和方法
制备用于细胞处理的细菌样品
植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌获自美国特拉华州威明顿(Wilmington,Delaware,USA)的杜邦丹尼斯克(DuPont Danisco)。保加利亚乳杆菌和长双岐杆菌获自法国努瓦扬(Noyant,France)的普尔斯(Bioprox)。短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌获自意大利泽洛博恩佩尔西科(Zelo Buon Persico LO,Italy)的Centro Sperimentale del Latte有限责任公司。解淀粉芽孢杆菌获自印度泰伦加纳海得拉巴(Hyderabad,Telangana,India)的Sanzyme生物制品私人有限公司(Sanzyme Biologics Private Limited)。
对于细菌提取物的制备，在8,600×g下离心用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Euro Clone，英国西约克郡(WestYork))再悬浮的1g各冻干细菌的储备液，洗涤两次，再悬浮于10ml PBS中并且使用Vibracell超声发生器(Sonic andMaterials，康涅狄格州丹伯里(Danbury,CT))进行超声处理(30min，10秒超声处理和10秒暂停交替进行)。
细菌细胞断裂通过在每一超声处理步骤之前和之后测量590nm下的样品的吸光度(德国汉堡埃彭道夫(EppendorfHamburg,Germany))来验证。接着在17,949×g下离心样品，并且使用0.22mm孔式过滤器(康宁公司(Corning Incorporated)，美国纽约州康宁市(Corning,NY,USA))过滤上清液以去除任何剩余的全细菌。通过BioRad DC蛋白质分析(伯乐(BioRad)，加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules,CA))使用牛血清白蛋白(BSA，西格玛阿尔德里奇(SigmaAldrich)，美国密苏里州圣路易斯(Saint Louis,MO,USA))作为标准品测定总蛋白质含量。对于体外实验，沿不同时间间隔将细菌制剂添加到细胞培养物中，如下文所指示，使用不同量以获得不同浓度，以μg蛋白质/ml作为最终浓度表示。
细胞系和培养条件
自发永生化的人角质细胞的HaCaT细胞系购自细胞系服务有限公司(Cell Lines Service GmbH)(德国埃珀尔海姆(Eppel-heim,Germany))。将HaCaT细胞在补充有10％(v/v)胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Euro Clone，英国西约克郡)的DMEM中培养。使培养条件在37℃下在具有5％CO2的潮湿气氛中保持恒定。在达到80％汇合后，将细胞以18,000个细胞/cm2的浓度接种于用于无菌细胞培养的6孔或12孔板(百克顿-迪金森公司(Becton Dickinson)，加利福尼亚州圣荷西(San José,CA))中，如下文所指定。通过在磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中轻轻洗涤来去除非粘附细胞。在20、28和45小时时收集在12孔板中生长的细胞并且用台盼蓝(trypan blue)染料排斥测试(Euro Clone，英国西约克郡)计数活细胞。将细胞与各种浓度的细菌提取物一起培育不同时间间隔(20-48小时)，其后用PBS加以洗涤，在400×g下离心10分钟，且将球粒与0.04％台盼蓝溶液一起培育5分钟以分析总细胞的数目和其活力。还分析未经处理的细胞并且将其用作阴性对照。将细胞转移到Bürker计数板，并且在显微镜Eclipse 50i(尼康公司(Nikon Corporation)，日本(Japan))下计数。对于选择表示为μg蛋白质/ml的适合浓度的细菌提取物，使用台盼蓝排斥测试分析HaCaT角质细胞的活力。在以各种浓度的细菌提取物培育20-48小时之后，相对于未经处理的对照细胞，未检测到对细胞活力或增殖水平的显著影响(数据未示出)。另一方面，用Triton X清洁剂(0.1％)进行处理引起细胞活力(阳性对照)的显著降低(P≤0.01)。对于大多数实验，使用10-50μg/ml范围内的细菌裂解物的浓度。
体外伤口愈合模型
如先前针对体外伤口愈合分析所描述，使用上文所描述的培养条件使HaCaT细胞生长于6孔微板中，并且随后使其增殖直到达到大约90％的汇合；接着从孔中移出DMEM，并且使用200μl移液管的尖端刮擦细胞单层以产生具有可重复大小的均匀无细胞区域(伤口)。通过用无菌PBS轻轻地洗涤从培养物中去除残渣。接着在存在或不存在所指示最终浓度(10-50μg蛋白质/ml范围)的细菌提取物的情况下，使细胞用新制培养基在37℃下在具有5％CO2的潮湿气氛中培育。在指示的情况下，将细胞用20μM氨基胍(AG)(选择性iNOS抑制剂)(西格玛阿尔德里奇，美国密苏里州圣路易斯)预处理15分钟。使用相差倒置显微镜Eclipse TS 100(尼康)监测细胞迁移并且在实验开始(T0)时以及在损伤后至多45小时的不同时间点拍摄。实验重复两次进行，其中针对每一条件评估至少三-六个区域。为了计算伤口封闭％，使用TScratch软件定量地分析所获取的图像。使用以下等式进行相对再上皮化的定量：
其中T为刮擦之后的特定时间点。
iNOS表达的蛋白质印迹分析
对于蛋白质印迹分析，收集未经处理的细胞和用细菌提取物处理28小时的细胞的刮擦单层，在PBS中洗涤且于RIPA缓冲液(RIPA裂解缓冲液，默克集团(Merck KGaA)，德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))中裂解，所述缓冲液含有蛋白酶抑制剂混合物(羧基肽酶抑制剂、5μg/ml胰蛋白酶抑制剂、PMSF 1mM、10μg/ml亮抑酶肽，10μg/ml抑肽酶、10μg/ml抑肽素)(西格玛阿尔德里奇，美国密苏里州圣路易斯)。用BioRad DC蛋白质分析(伯乐，加利福尼亚州赫拉克勒斯)使用BSA作为标准品测试样品的蛋白质含量。将25μg蛋白质与样品缓冲液混合，在100℃下煮沸5分钟，并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、10％SDS分离。使用微型反式印迹细胞(Mini Trans-Blot Cell)(伯乐，加利福尼亚州赫拉克勒斯)设备在4℃下在70V下将蛋白质转移到0.45mm硝酸纤维素膜薄片(伯乐，加利福尼亚州赫拉克勒斯)上1小时。将膜在室温下用5％的不含脂肪酸的奶阻断1小时，且接着在4℃下与1:500多克隆兔抗iNOS抗体(赛信通技术公司(Cell Signaling Technology)，加利福尼亚州(CA))或1:1000抗β-肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology)，加利福尼亚州)一起培育过夜。针对抗iNOS抗体，使用推荐的1:5000稀释度下的与辣根过氧化酶(HRP)结合的山羊抗兔IgG第二抗体，以及针对抗β-肌动蛋白抗体(密理博(Millipore)EMD，德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))使用推荐的1:5000稀释度下的与辣根过氧化酶(HRP)结合的兔抗山羊IgG第二抗体。根据制造商说明书，通过增强型化学发光(ECL，安玛西亚法玛西亚生物技术(Amersham Pharmacia Biotech))显现免疫反应性条带。使用ALLIANCE化学发光检测系统(UVITEC，英国剑桥(Cambridge UK))测定相对条带密度，且所述值表示为相对单位。免疫印迹数据相对于β-肌动蛋白的对应蛋白质水平进行标准化。
亚硝酸盐水平分析
使用格里斯方法，通过使用硝酸还原酶和基于比色分析的格里斯反应测量亚硝酸盐水平来间接评估NO产生。简单地说，将未经处理的细胞和用细菌提取物处理28小时的细胞的刮擦单层的上清液(20μl)连同Hepes 50mM、FAD 5μM、NADPH 0.1mM、0.2U/ml硝酸还原酶、1,500U/ml乳酸脱氢酶和100mM丙酮酸，并且最后为格里斯试剂一起添加至96孔微量滴定板。使用微板读数仪(伯乐(Bio-Rad)，美国加利福尼赫拉克勒斯(Hercules,California,USA))在550nm处通过分光光度读取来测量吸光度。用已知浓度的KNO3的标准曲线对所述值进行插值。
统计分析
使用Prism 6.0软件(GraphPad，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))分析数据。结果表示为重复两次进行的三个实验的平均±SEM。如果P<0.05，那么结果被视为统计显著。对于组别的比较，使用ANOVA测试后接弗邦朗尼或邓尼特事后检验。对于数据的统计分析，*或#作为P<0.05、**或##作为P<0.01、***或###作为P<0.001以及****或####作为P<0.0001在本文中使用。
关于体内评估，本发明人已测试本发明的益生菌，并且尤其，根据本发明的组合物用于治疗损伤或伤口，尤其手术后伤口和糖尿病溃疡，尤其具有对抗生素疗法具抗性的生物膜，以便更好地研究抗细菌作用和再上皮化作用。
下文提供关于将根据本发明的组合物施加于体内伤口和相应结果的实施例。
实施例1-将呈粉末形式的本发明组合物施加于受到由于糖尿病所致的溃疡感染并且带有脚趾切除术伤口的女性患者的足部
已研究包括如先前所识别的植物乳杆菌NCIMB 43029、如先前所识别的嗜酸乳杆菌NCIMB 43030和如先前所识别的已知嗜热链球菌的组合物对糖尿病溃疡和手术伤口的功效。
特别是，一位患有严重肢体缺血(CLI)的83岁女性引起了我们的注意，其右腿溃疡性皮肤损伤，并延伸到第2和第3脚趾。其病史显示有II型糖尿病、全身性动脉高血压、缺血性心脏病(以前做过冠状动脉搭桥手术)和心房颤动(AF)。她也是活跃的吸烟者(20根香烟/天，持续20年)。根据临床观察，存在双侧股动脉搏动，但其余的外周动脉(periferic)搏动(腘动脉、胫后动脉和足趾动脉(pepidia))不存在。存在于右腿上的溃疡延伸到脚趾，在腿的前表面和后表面上具有坏死外皮(excara)，且第2和第3脚趾出现皮革样(parchment)坏死；指压疼痛，保留运动性。两腿的踝肱指数(ABI)无法监测。
在入院时，血液测试得到以下结果：C反应蛋白(CRP)，101,000μg/l；红血球沉降率(ESR)，100mm/h；血红蛋白(HGB)，8.0g/dl；血小板，454,000μg/l；白血球(WBC)，12,800/μl；国际标准化比值(INR)，1.87；部分凝血活酶时间(PTT)，比率2.3。手术治疗由以下组成：对浅表股动脉(SFA)和右侧腘动脉进行再通和利用药物输送球囊(DEB)Ranger(5×100mm)进行经皮腔内血管成形术(PTA)，之后进行前足的坏死性损伤的手术刮除和右足的第二脚趾的切除术。在手术干预之前，传染病专家报告：“……发炎参数显著增加。建议启动用(哌拉西林(piperacillin) 三唑巴坦(tazobactam))，每8小时4.5g的抗生素疗法。”。
在8天之后，随着发炎标记的改善，传染病医师将抗生素疗法更换为(米诺环素(minocycline))100mg，1片剂×2持续15天，并且患者在总共21天的住院之后出院。在家时，患者每周两次门诊，伤口和切除处的边缘局部使用带有抗菌溶液的敷料，先清洁治疗区域并且常规施加聚合膜(Ferries Mfg.)。
出院且家庭治疗后36天，鉴于其中伤口渗出物显著增加的恶化临床图片，尽管由主治医师凭经验开处用阿莫西林(500mg，每12小时口服)进行四周抗生素疗法，但患者还是前往了我们的机构。伤口潮湿，具有大量的分泌物，并且覆盖有纤维蛋白。接着立即对伤口进行局部抹拭，并且确认肺炎克雷伯氏杆菌、粪肠球菌和奇异变形杆菌为阳性。虽然患者未发热，但也进行了三次血液培养，所得结果为阴性。
鉴于存在于伤口上的微生物的多样性和患者的整体情况，所述患者病情严重只能俯卧，因此决定用供局部使用的带有10％聚维酮碘皮肤溶液(10％皮肤溶液)的敷料。30天后，未观察到改善，中断全身性抗生素治疗。出于体恤，告知患者并且获得其同意，将呈干粉形式的益生菌混合物施加于伤口。益生菌制剂为包括植物乳杆菌NCIMB43029、嗜酸乳杆菌NCIMB 43030和已知的嗜热链球菌(SEQ ID NO:7-9)的组合物。每天一次施加0.5g组合物。
在益生菌治疗之后一周，伤口的情况稳定。两周后，微生物分析得到改良，并且在后续时间段中，清楚地观察到缓慢但渐进的伤口愈合。伤口拭子在第48天(开始益生菌施加后12天)对于粪肠球菌为阴性的，并且在第57天(局部益生菌施加后21天)对于肺炎克雷伯氏杆菌和奇异变形杆菌为阴性的。在治疗后24天，即在第60天中断使用益生菌制剂。
在随后的90天内，伤口愈合了，即使极慢，在家用PolyMem进行治疗，改善再次开始行走且独立地执行其每日任务的患者的舒适度。
图7A/7B显示患者在出院之后第36天的右足的照片。
图8A/8B显示患者在出院之后第48天的右足的照片。
图9A/9B显示患者在出院之后第57天的右足的照片。
图10A/10B显示患者在出院之后第170天的右足的照片。
应注意，在用本发明的组合物治疗之前，患者已经用抗生素治疗以便根除足部溃疡上存在的细菌生物膜，但结果几乎为零。
相反地，本发明的组合物被患者很好接受，所述患者也对在影响其足部的溃疡和伤口上获得的愈合结果极为满意。
因此，已发现本发明的组合物就抗细菌和再上皮化作用来说，对还呈现对抗生素具抗性的细菌生物膜的损伤或伤口是安全、极有效的。
序列表
<110> 门德斯公司
<120> 包含益生菌的具有抗细菌和再上皮化作用的组合物
<140> IT102019000009951
<141> 2019-06-24
<160> 10
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 551
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌
<220>
<223> 嗜酸乳杆菌NCIMB43030 – 16S rRNA编码基因的高变区V1-V3
<400> 1
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<213> 嗜酸乳杆菌
<220>
<223> 嗜酸乳杆菌NCIMB43030 – groEL基因
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<220>
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<212> DNA
<213> 植物乳杆菌
<220>
<223> 植物乳杆菌NCIMB43029 – 16S rRNA编码基因的高变区V1-V3
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<210> 5
<211> 1626
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌
<220>
<223> 植物乳杆菌NCIMB43029 – groEL基因
<400> 5
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<211> 1047
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<213> 植物乳杆菌
<220>
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ctggaacaag cagccgttaa tgagcaattg gctgccgaaa aactggacgt gacgttaccg 300
ggtcgggaag ttccacaagg tcagcctcac gtgattaccc agattattac tgaattggaa 360
gatctattta tgggaatggg ctatcaaatt gttgatggtg atgaagttga agaagattac 420
tacaactttg aacggttgaa cttaccgaag gaccatcccg cccgtgacat gcaagacacg 480
ttctatatta ccaaagacgt gctactacgc acgcagacgt ctgctgatca gccgcggtca 540
cttgaaaatc acgatttttc taaaggaccg ctgaaggtct tgtcacctgg ccgcgtttat 600
cggcgtgata cggatgatgc aacccattcc catcaatttc atcaaattga agggttagtc 660
gtggacaagc atattacgat ggctgatttg aagggcacct taattctggt tgccaagact 720
ttgtttggcg atcaattcga tgttcggcta cggccaagct tctttccatt cacggaacca 780
tccgtagaag ctgatgtaac ttgctttaat tgcaatggca agggctgtgc aatctgtaag 840
caaacgggtt ggatcgaagt actgggtgcc ggcatggttc acccccacgt gttagaaatg 900
tctggcattg atccagaaga atatggtggt tttgcctttg ggttaggacc agaccgcttt 960
gcaatgttga aatacggtgt tgacgatatc cgcaacttct acttgaatga cgtgcggttc 1020
ttgtcacagt tctataagaa aggttag 1047
<210> 7
<211> 403
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<220>
<223> 嗜热链球菌 – 16S rRNA编码基因的高变区V1-V2
<400> 7
cggcgttgct cggtcagggt tgcccccatt gccgaagatt ccctactgct gcctcccgta 60
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agtggagcaa ttgccccttt caaataaatg acatgtgtca tccattgtta tgcggtatta 240
gctatcgttt ccaatagtta tcccccgcta caaggcaggt tacctacgcg ttactcaccc 300
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ggcacgccgc cagcgttcgt cctgagccag gatcaaactc tca 403
<210> 8
<211> 1140
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<220>
<223> 嗜热链球菌 – recA基因
<400> 8
gtggctaaga aaacaaagaa aacagaagaa atcacaaaga agtttggtga tgagcgtcgc 60
aaagcactcg acgatgcatt aaaaaacatt gaaaaagatt ttggtaaggg tgcagttatg 120
cgtcttggtg agcgtgcaga gcaaaaagtt caggttatga gctcaggctc actagctttg 180
gatattgctc ttggtgcggg tggttaccct aaaggtcgta ttattgaaat ttacggacca 240
gaatcatcag gtaaaacaac tgttgccctt catgcagttg ctcagactca aaaagaaggt 300
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gccttggtac cacgtgcaga aattgatgga gatattggtg acagtcatgt aggacttcaa 540
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attgctatct ttattaacca gttgcgtgaa aaagttggta tcatgtttgg taacccagag 660
actaccccag gtggacgtgc tttaaaattc tatgcatcag tacgtcttga tgtacgtggt 720
aatacacaaa ttaaaggaac cggtgacaaa aaggaccaaa atgttggtaa ggaaaccaag 780
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<210> 9
<211> 2550
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌
<220>
<223> 嗜热链球菌 – secA基因
<400> 9
atggcaaata tattacgcaa aatcattgaa aatgataagg gcgaaattaa aaaactagaa 60
aaaactgcca agaaagttga gagctatgct gatgcaatgg cggctctttc agatgaagaa 120
cttcaggcaa aaacagaaga atttaaacaa cgatatcaaa acggagaaag tctagatcag 180
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ccatatcgtg tgcaaattat gggtggtatt gtgcttcact atggtgacgt agcggagatg 300
cgtacagggg aagggaaaac ccttactgcg acaatgcctg tctacttgaa tgctatttca 360
ggtgaaggtg tacacgttat caccgttaac gaataccttt cagagcgtga tgcgactgaa 420
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ccagctgaaa aacgtgaagc ttataattgt gacatcactt actcaaccag ctcagaggta 540
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ttgatcgtat cagggcctgt aagttcagaa actaatcagt tgtatcaccg tgcggatgct 720
tttgttaaga cattgactga agatgattat gcgattgata ttccaacaaa aacaattggt 780
ttgaatgact caggtattga caaggctgaa gagttcttca acttggaaaa tttgtacgat 840
attgacaatg ttgccttgac tcactatatt gacaatgccc ttcgtgccaa ctacattatg 900
ttgcgtgata ttgactacgt ggtaagtcct gagcaagaaa tccttattgt tgaccaattt 960
actggtcgta ccatggaagg tcgtcgtttt tcagatgggc tccaccaagc cattgaggct 1020
aaagaaggtg taccagtcca agaggaaacc aagacttctg cctcaatcac ttaccaaaat 1080
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gaattccgtg aaatctataa catgcgagtc atcccaattc caacaaaccg tccaattcaa 1200
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gttacgattg cgaccaatat ggccggtcgt ggtactgaca tcaaacttgg tgaaggtgtt 1500
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aaccagttgc gtggtcgttc gggacgtcaa ggggatccag gggagtctca attctaccta 1620
tctcttgaag acgaattgat gcgtcgtttc ggttctgacc gtatcaagca tgtcttggaa 1680
cgtttgaacg ctgatgacga agatattgtt atcaaatcac gtatgttgac ccgtcaagtg 1740
gaatcagctc aaaaacgtgt cgaagggaat aactacgata ctcgtaaaca agttcttcag 1800
tacgatgacg ttatgcgtga acagcgtgaa atcatctacg ctgagcgtta tgatgttatt 1860
acagcagaac gtgaccttga acctgaaatc aaggctatga tcaagcgtac tattaaccgt 1920
acggttgatg gacacagtcg taacgatcaa gaagaagctc ttaaaggtat cttgaacttt 1980
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gaggtgacta aacgtagtgt taattatgat gctatcaagg tttatctgac tgagttagca 2100
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caaaaagtct tgattttgat ggttgttgat aataagtgga cagaccacat tgatgccctt 2220
gatcaattac gtaacgccgt tggtatgcgt ggttatgcgc aaaacaaccc aatcgttgag 2280
tatcaatctg aaagtttcaa gatgttccaa gatatgattg gtgctattga gtatgatgta 2340
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<210> 10
<211> 1438
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<220>
<223> 解淀粉芽孢杆菌 - 16S rRNA编码基因
<400> 1
gggggctgct aagctgcaag tcgagcgggc agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg 60
cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc 120
ggggctaata ccggatggtt gtctgaaccg catggttcag acataaaagg tggcttcggc 180
taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag 240
gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc 300
agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc 360
aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa 420
gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac 480
gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540
gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc 600
attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga 660
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gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa 840
gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg 900
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960
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cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg 1140
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gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttag gagccagccg ccgaaggt 1438
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。