皂苷纯化的制作方法

1.本技术总体上涉及皂苷提取物，特别是皂树(quillaja saponaria molina)的提取物，其制备方法和相关方面。


背景技术：

2.疫苗中包含佐剂以改善体液和细胞免疫反应，特别是在较差免疫原性的亚单位疫苗的情况下。类似于病原体的自然感染，佐剂依靠先天免疫系统的激活来促进持久的适应性免疫。
3.佐剂系统01(as01)是一种基于脂质体的佐剂，其包含两种免疫刺激剂，3-o-去酰基-4'-单磷酰脂质a(3d-mpl)和qs-21(garcon and van mechelen,2011；didierlaurent et al.,2017)。3d-mpl是一种来自明尼苏达沙门氏菌(salmonella minnesota)的脂多糖的无毒衍生物(其是一种tlr4激动剂)，而qs-21是一种来自南美树木皂树树皮的天然皂苷提取物(kensil et al.,1991；ragupathi et al.,2011)。as01包含在最近开发的疟疾疫苗(rts,s-mosquirix
tm
)和带状疱疹(herpes zoster)疫苗(hz/su-shingrix
tm
)中，以及针对人类免疫缺陷病毒和结核分枝杆菌等病原体开发的多种候选疫苗中。
4.as01注射在动物模型中导致先天免疫的快速和瞬时激活。免疫接种后，嗜中性粒细胞和单核细胞迅速募集到引流淋巴结(dln)。此外，as01诱导mhcii
高
树突细胞(dc)的募集和激活，这是t细胞激活所必需的(didierlaurent a.m.et al.,2014)。关于as01组分的作用机制的一些数据也是可得的。3d-mpl通过tlr4发出信号，从而刺激nf-kb转录活性和细胞因子的产生，并直接激活人类和小鼠中的抗原呈递细胞(apc)(de becker et al.,2000；ismaili et al.,2002；martin et al.,2003；mata-haro et al.,2007)。qs-21促进小鼠中的高抗原特异性抗体反应和cd8 t细胞反应(kensil和kammer,1998；newman et al.,1992；soltysik et al.,1995)和人类中的抗原特异性抗体反应(livingston et al.,1994)。由于其物理特性，人们认为qs-21可能在体内充当危险信号(lambrecht et al.,2009；li et al.,2008)。尽管qs-21已被证明激活asc-nlrp3炎性体和随后的il-1β/il-18释放(marty-roix,r.et al.,2016)，但涉及皂苷佐剂作用的确切分子途径尚未明确。
5.与被批准用作人类药物的产品的任何组分一样，qs-21的生产需要使用经批准的制造工艺并仔细控制最终组成，以确保其符合安全有效的规范。现有工艺的修改需要昂贵且耗时的重新验证，而偏离规范也会导致废品。用于制造qs-21和确定成分的qs-21材料的稳健方法是被持续需要的。
6.市售as01中包含的qs-21皂苷提取物目前含有3％或更少的三萜糖苷组分(称为2018组分)。本发明人已经观察到具有更高百分比的2018组分的qs-21皂苷提取物显示出类似的生物活性特征。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种皂苷提取物，其包含通过214nm的紫外吸光度确定的(i)至少
88％的qs-21主峰和(ii)》3至10％的2018组分。
8.还提供了一种皂苷提取物，其含有(i)通过214nm的紫外吸光度确定的至少为88％的负离子电喷雾质谱m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，以及(ii)通过214nm的紫外吸光度确定的》3至10％的m/z为2017.9的三萜糖苷。
9.此外，提供了一种皂苷提取物，其含有通过214nm的紫外吸光度确定的(i)至少88％的：
10.11.以及(ii)》3至10％的：
[0012][0013]
此外，提供了一种用于制造皂苷提取物的方法，其包括以下步骤：
[0014]
(i)选择具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物；
[0015]
(ii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物；以及
[0016]
(iii)使用苯基树脂(phenyl resion)通过反相色谱法纯化提取物。
[0017]
提供了本发明的皂苷提取物在制备药物中的用途。
[0018]
还提供了包含本发明皂苷提取物的佐剂组合物和疫苗组合物。
附图说明
[0019]
图1：皂树树皮粗水提取物的hplc谱图。
[0020]
图2：皂树树皮粗水提取物的hplc-uv谱图。
[0021]
图3：皂树树皮粗水提取物的uplc-uv谱图。
[0022]
图4：低2018组分含量的聚苯乙烯皂树qs-21纯化皂苷提取物的uplc-uv谱图。
[0023]
图5：低2018组分含量的皂树qs-21纯化皂苷提取物的uplc-uv/ms谱图。
[0024]
图6：低2018组分含量的皂树qs-21纯化皂苷提取物的uplc-uv/ms详细谱图。
[0025]
图7a-7b：低2018组分含量的皂树qs-21纯化皂苷提取物的1988(图7a)和2002(图7b)分子量离子的提取质谱图。
[0026]
图8：低2018组分含量的皂树qs-21纯化皂苷提取物的组合质心谱。
[0027]
图9：用于制备2018组分富集的皂苷提取物的低2018组分含量的皂树qs-21纯化皂苷提取物的uplc-uv谱图。
[0028]
图10a-10b：2018组分富集的纯化皂苷提取物的批次a(图10a)和批次b(图10b)的uplc-uv谱图和峰测量值。
[0029]
图11：由具有增加的2018组分百分比的qs-21纯化皂苷提取物诱导的tnf-α反应。
[0030]
图12：tnf-α反应率(高于2.2％的2018组分的增加的2018组分百分比)。
[0031]
图13：由具有增加的2018组分百分比的qs-21纯化皂苷提取物诱导的il-8反应。
[0032]
图14：il-8反应率(超过2.2％的2018组分的增加的2018组分百分比)。
[0033]
图15：苯基树脂级分的qs-21组浓度(g/l)和2018组分含量。
[0034]
图16：如实施例6所述，在用含有不同qs-21组成的ge vzv抗原制剂接种小鼠后第21天的抗ge抗体滴度。
[0035]
图17：如实施例6所述，用含有不同qs-21组成的ge vzv抗原制剂接种小鼠后第21天抗ge抗体滴度的几何平均比(geometric mean ratio)。
[0036]
图18：如实施例6所述，用含有不同qs-21组成的ge vzv抗原制剂接种小鼠后第21天ge特异性cd4 t细胞的百分比。
[0037]
图19：如实施例6所述，用含有不同qs-21组成的ge vzv抗原制剂接种小鼠后第21天ge特异性cd4 t细胞的几何平均比。
[0038]
图20：如实施例7所述，用含有不同qs-21组成的ge vzv抗原制剂接种小鼠后第21天ge特异性cd4 t细胞的百分比。
[0039]
图21：如实施例7所述，用含有不同qs-21组成的ge vzv制剂接种小鼠后第21天ge特异性cd4 t细胞的几何平均比。
[0040]
图22：如实施例7所述，在用含有不同qs-21组成的ge vzv抗原制剂接种小鼠后第14和21天的抗ge抗体滴度。
[0041]
图23：如实施例7所述，在用含有不同qs-21组成的ge vzv抗原制剂接种小鼠后第14天和第21天抗ge抗体滴度的几何平均比。
[0042]
图24：实施例8中遵循的疫苗接种方案的示意图。
[0043]
图25：在实施例8中第一次(第8天)和第二次(第23天)免疫后对每只动物观察到的最大温差以及所有处理组的平均值和95％置信区间。
[0044]
序列标识的简要说明
[0045]
seq id no.1：rts多肽序列
[0046]
seq id no.2:结核分枝杆菌h37rv株rv1196多肽序列
[0047]
seq id no.3:结核分枝杆菌h37rv株rv0125多肽序列
[0048]
seq id no.4：m72融合多肽序列
[0049]
seq id no.5：m72-2his融合多肽序列
[0050]
seq id no.6:水痘带状疱疹病毒(vzv)截短的ge多肽序列
[0051]
seq id no.7：构象约束的rsv pref抗原多肽序列
[0052]
seq id no.8：hiv tv1 gp120多肽序列
[0053]
seq id no.9：hiv 1086.c gp120多肽序列
具体实施方式
[0054]
如前所述，被授权用作人类药物的产品的任何组分都需要使用经批准的制造工艺并仔细控制最终组成，以确保其符合安全有效的规范。制造过程中偏离规范会导致废品。
[0055]
本发明人已经发现，皂树的粗水提取物的组成不同，特别是关于本文中称为2018组分的组分。目前市售的as01包括qs-21皂苷提取物，其含有3％或更少的2018组分。因此，如果发现2018组分在纯化的qs-21皂苷提取物中的含量超过3％，则当前的制造方法会导致废品。为了解决这种潜在的浪费，本发明人观察到具有更高百分比的2018组分的qs-21皂苷提取物显示出类似的生物活性特征，从而能够使用更大范围的皂树粗水提取物并减少浪费。
[0056]
在本发明的上下文中，包含在含有3％或更少2018组分的市售as01中的纯化qs-21皂苷提取物将被称为“低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物”，与根据本发明定义的纯
化的qs-21皂苷提取物(该提取物包含大于3且高达10％的2018组分)相反。为清楚起见，根据本发明定义的此类纯化皂苷提取物在适当时将被称为“高2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物”。换句话说，“高2018组分含量qs-21纯化皂苷提取物”包含超过3％，但不超过10％的2018组分。
[0057]
本发明提供了一种皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的(i)至少88％的qs-21主峰以及(ii)》3至10％的2018组分，特别是，其中最丰富的物质(species)的单同位素(monoisotope)是1987.9m/z。合适地，皂苷提取物包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的qs-21组。通常，皂苷提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的1％或更少的lyo杂质，尤其是1％或更少的qs-21组之外的最大峰。合适地，皂苷提取物包含至少90％的qs-21主峰，如至少91％、至少92％或至少93％。
[0058]
特别令人感兴趣的是包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的qs-21组的皂苷提取物，其具有(i)至少88％的qs-21主峰，(ii)》3至10％的2018组分，以及(iii)1％或更少的qs-21组之外的最大峰，其中最丰富的物质的单同位素是1987.9m/z。合适地，皂苷提取物含有至少90％的qs-21主峰，例如至少91％、至少92％或至少93％。
[0059]
还提供了一种皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度确定的(i)至少88％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，以及(ii)》3至10％的m/z为2017.9三萜糖苷，特别是，其中最丰富的物质的单同位素是1987.9m/z。理想地，皂苷提取物包含通过214nm处的紫外吸光度确定的(i)至少88％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，不包括b-异构体和lyo杂质，以及(ii)》3至10％的m/z为2017.9的三萜糖苷，特别是，其中最丰富物质的单同位素是1987.9m/z。合适地，皂苷提取物包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的m/z 1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9或2118的三萜糖苷。理想地，皂苷提取物包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的m/z为1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9或2118的三萜糖苷，不包括lyo杂质。通常，通过214nm处的紫外吸光度确定的，皂苷提取物含有1％或更少的lyo杂质。合适地，通过214nm处的紫外吸光度确定的，皂苷提取物包含1％或更少的任何其他峰。合适地，皂苷提取物含有至少90％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，例如至少91％、至少92％或至少93％。
[0060]
特别令人感兴趣的是一种皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的m/z为1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9或2118的三萜糖苷，其具有(i)至少88％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，(ii)》3至10％的m/z为2017.9的三萜糖苷，(iii)1％或更少的任何其他峰，并且其中最丰富物质的单同位素的m/z为1987.9，尤其是其中皂苷提取物包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的m/z为1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9或2118的三萜糖苷，不包括lyo杂质，具有(i)至少88％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，不包括b-异构体和lyo杂质，(ii)》3至10％的m/z为2017.9的三萜糖苷，以及(iii)1％或更少的任何其他峰，且其中最丰富的物质的单同位素是m/z 1987.9。合适地，皂苷提取物含有至少90％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，例如至少91％、至少92％或至少93％。
[0061]
此外，提供了一种皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的(i)至少88％，例如至少90％、至少91％、至少92％或至少93％的：
[0062][0063][0064]
或者
[0065][0066]
以及(ii)》3至10％的：
[0067]
特别是，其中最丰富的物质的单同位素的m/z为1987.9。合适地，所述皂苷提取物包含至少98％的：
[0068]
[0069]
[0070]
或者
[0071]
合适地，皂苷提取物包含98％的上述组分和2118组分。通常，皂苷提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的1％或更少的：
[0072][0073]
尤其是1％或更少的任何其他峰。
[0074]
特别令人感兴趣的皂苷提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的：
[0075]
[0076][0077]
或者
[0078][0079]
其具有(i)至少88％，例如至少90％、至少91％、至少92％或至少93％的：
[0080][0081]
或者
[0082][0083]
(ii)》3至10％的：
[0084]
以及(iii)1％或更少的任何其他峰，并且其中最丰富的物质的单同位素的m/z为1987.9。特别令人感兴趣的皂苷提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的：
[0085]
[0086]
[0087][0088]
或2118组分，
[0089]
其具有(i)至少88％，例如至少90％、至少91％、至少92％或至少93％的：
[0090]
[0091][0092]
或者
[0093][0094]
(ii)》3至10％的：
[0095]
以及(iii)1％或更少的任何其他峰，并且其中最丰富的物质的单同位素的m/z为1987.9。
[0096]
为免于疑问，术语“至少88％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷”，除非被上下文排除，否则是指“m/z为1855.9、1987.9或2001.9或其组合的三萜糖苷”。包括“或”的其他类似术语，例如“至少98％的三萜糖苷具有1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9或2118的m/z”，除非被上下文排除，也应相应地解释为包括组合。
[0097]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少40％，如至少50％，特别是至少60％，尤其是至少65％，例如至少70％的1988
组分。在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和通过相对离子丰度确定的90％或更少，例如85％或更少，或80％或更少的1988组分。在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的40％至90％，如至少50％至85％的1988组分，尤其是70％至80％的1988组分。
[0098]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的30％或更少，例如25％或更少的1856组分。在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少5％，例如至少10％的1856组分。在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的5％至30％的1856组分，例如10％至25％的1856组分。
[0099]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的40％或更少，例如30％或更少，特别是20％或更少，尤其是10％或更少的2002组分。在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少0.5％，例如至少1％的2002组分。在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的0.5％至40％的2002组分，例如1％至10％的2002组分。
[0100]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少3.5％，例如至少4％，或至少4.5％的2018组分。
[0101]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的9％或更少，例如8％或更少，例如7％或更少的2018组分。
[0102]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的4％至8％，例如5％至7％，或约6％(例如5.5％至6.5％)的2018组分。
[0103]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少40％，例如至少50％，特别是至少60％，尤其是至少65％，例如至少70％的：
[0104][0105]
或者
[0106][0107]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的90％或更少，例如85％或更少，或80％或更少：
[0108][0109]
或者
[0110][0111]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的30％或更少，例如25％或更少的：
[0112]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少5％，例如至少10％：
[0113][0114]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的40％或更少，例如30％或更少，特别是20％或更少，尤其是10％或更少的：
[0115]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少0.5％，例如至少1％的，
[0116][0117]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少3.5％，例如至少4％，或至少4.5％
[0118][0119]
在某些实施方案中，皂苷提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的9％或更少，例如8％或更少，例如7％或更少的
[0120][0121]
quil a是一种从南美皂树中分离的皂苷制剂，且dalsgaard et al.1974(“saponin adjuvants”,archiv.f
ü
r die gesamte virusforschung,vol.44,springer verlag,berlin,p243-254)首次描述其具有佐剂活性。quil a的纯化级分已通过高效液相色谱(hplc)分离，其保留了佐剂活性而没有quil a相关的毒性(例如，参见ep03622789)。已发现各种级分具有佐剂活性，例如qs-7、qs-17、qs-18和qs-21，尽管它们的毒性变化很大。
[0122]
如本文所用，术语“皂苷提取物”是指皂树的提取物。
[0123]
如本文所用，术语“三萜糖苷”是指具有由糖衍生的三萜核心的一个或多个实体，其通过糖苷键连接。
[0124]
本文中的某些结构已通过串联质谱法(ms/ms)确定，该技术在区分某些分支的、立体化学和异构糖种类(例如芹菜糖(apiose)和木糖)方面的局限性意味着某些结构是推定的并基于假定的保守核心。因此，在由于任何原因推定结构是不正确情况中，推定的结构应被视为表示另外方面鉴定的组分的实际结构。
[0125]
术语“2018组分”是指图6中标识为“2018峰”的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的2018组分具有大约4.5分钟的保留时间，峰的主要组分具有2017.9的单同位素分子量。2018组分也可以在本文所述的uplc-uv方法中鉴定，保留时间约为5.8分钟。主要2018组分已被ms/ms确定为具有推定结构
[0126][0127]
术语“1988组分”是指在图6中被鉴定为qs-21主峰的一部分并且具有1987.9的单同位素分子量的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的1988组分具有大约4.4分钟的保留时间和1987.9的单同位素分子量。1988组分可能由qs-21a v1：
[0128][0129]
和qs-21a v2
[0130]
组成。
[0131]
术语“1856组分”是指在图6中被鉴定为qs-21主峰的一部分并且具有1855.9的单同位素分子量的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的1856组分具有大约4.4分钟的保留时间和1855.9的单同位素分子量。1856组分可能由：
[0132]
组成。
[0133]
术语“2002组分”是指在图6中被鉴定为qs-21主峰的一部分并且具有2001.9的单同位素分子量的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的2002组分具有大约4.4分钟的保留时间和2001.9的单同位素分子量。2002组分已被ms/ms确定为具有推定的结构：
[0134][0135]
术语“lyo杂质”是指在图6中标识为“冻干峰”的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的lyo杂质具有大约4.7分钟的保留时间和峰的主要组分的单同位素分子量为1855.9。主要lyo杂质已被ms/ms确定为具有推定的结构：
[0136][0137]
术语“b-异构体”是指图6中确定为“b-异构体”的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的b-异构体具有大约4.0分钟的保留时间并且峰的主要组分的单同位素分子量为1987.9。主要b-异构体组分已被ms/ms确定为具有推定的结构：
[0138][0139]
术语“1518组分”是指图6中标识为“1518峰”的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的1518组分具有大约4.2分钟的保留时间并且峰的主要组分的单同位素分子量为1517.7。主要1518组分已被ms/ms确定为具有推定的结构：
[0140][0141]
术语“1712组分”是指图6中标识为“1712峰”的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的1712组分具有大约4.6分钟的保留时间并且峰的主要组分的单同位素分子量为1711.8。主要1712组分已被ms/ms确定为具有推定的结构：
[0142][0143]
术语“2118组分”是指图6中标识为“4.607”的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的2118组分具有大约4.6的保留时间，并且峰的主要组分的单同位素分子量为2118。
[0144]
术语“qs-21主峰”是指图6中标识为“qs-21”的三萜糖苷。合适地，本文所述的uplc-uv/ms方法中的qs-21主峰具有大约4.4分钟的保留时间和1855.9(1856组分)、1987.9(1988组分)和2001.9(2002组分)m/z的分子量组分。qs-21主峰可能由qs-21a v1：
[0145][0146]
qs-21a v2：
[0147][0148]
1856组分：
[0149]
以及
[0150]
2002组分：
[0151]
组成。
[0152]
术语“qs-21组”是指在本文所述的uplc-uv/ms方法中从b-异构体到lyo杂质之前的峰鉴定为具有约4.0分钟至约4.7分钟的保留时间并且主要单同位素分子量为1517.7(1518组分)、1711.8(1712组分)、1855.9(1856组分)、1987.9(1988组分)、2001.9(2002组分)、2017.9(2018组分)或2118(2118组分)的三萜糖苷。qs-21组可能由qs-21a v1：
[0153][0154]
qs-21a v2:
[0155][0156]
1856组分：
[0157][0158]
2002组分：
[0159]
[0160]
2018组分：
[0161]
b-异构体
[0162][0163]
1518组分：
[0164][0165]
1712组分：
[0166][0167]
以及
[0168]
2118组分组成。
[0169]
术语“qs-21组之外的最大峰”是指可在本文所述的uplc-uv/ms方法中检测的紫外的最大峰，它不是qs-21组的部分。
[0170]
术语“前峰(preceding peak)”是指在本文所述的hplc-uv方法中紧接在qs-21主峰之前的峰(参见图2)。
[0171]
术语“m/z”是指单同位素峰的质荷比。除非另有说明，“m/z”由负离子电喷雾质谱测定。
[0172]
术语“离子丰度”是指如上下文要求的在样品中测量的或给定峰中的指定m/z的量。可以从本文所述的uplc-uv/ms方法中的ms总离子谱图中提取指定m/z的质谱图。质谱图绘制了信号强度与时间的关系。离子丰度测量为积分峰的面积。指定m/z的面积/相对参考m/z的面积＝相对丰度。
[0173]
术语“214nm处的紫外吸光度”是指紫外吸光度谱图中积分峰的面积。(指定峰的面积)/(谱图中所有积分峰的面积)x100＝指定峰的面积百分比。
[0174]
术语“214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度”是指对于共流出物质的给定m/z百分比的估计值。(给定uv峰的面积百分比)x(给定峰中感兴趣的m/z的相对离子丰度)/(给定峰的所有相对离子丰度的总和)＝给定uv峰中感兴趣的m/z的百分比,假设包含所有共流出物质的相对离子丰度。
[0175]
术语“其中最丰富的物质的单同位素是1988m/z”是指最丰富的物种的单同位素，每个m/z响应最高的同位素组中的第一个峰是m/z1987.9。可以通过使用本文所述的uplc-uv/ms方法(负离子电喷雾)在整个总离子谱图上创建组合谱来确定最丰富的物质。
[0176]
术语“干燥的”是指基本上所有的溶剂都已被去除。干燥的提取物通常含有少于5％w/w的溶剂(如少于5％w/w的水)。适当地，干燥的提取物将含有100ppm或更少的乙腈(w/w)。
[0177]
提供了一种制备纯化皂苷提取物的方法，该提取物含有如通过214nm处的紫外吸光度确定的至少88％的qs-21主峰和》3至10％的2018组分(例如此处描述的那些)，所述方法包括以下步骤：
[0178]
(i)选择具有合适2018组分组成的皂树材料；
[0179]
(ii)在合适的条件下制备皂树材料的粗水提取物；和
[0180]
(iii)将粗水提取物纯化，以得到纯化皂苷提取物。
[0181]
本领域技术人员应理解，纯化的皂苷提取物的组成将取决于所用的皂树材料、水提取过程中应用的条件和纯化过程中应用的条件。这些参数的适当调整可以确保所需组成的纯化皂苷提取物。步骤(ii)可以包括多次平行提取，该提取的部分或全部产物在进行步骤(iii)之前合并。步骤(iii)可以包括多个平行纯化，该纯化的部分或全部产物组合以获得最终纯化的皂苷提取物。任选地，步骤(iii)产生的纯化皂苷提取物可以通过纯化粗水提取物和加入一些2018组分(即“2018掺杂”，例如如实施例4中所述)的组合来获得。
[0182]
尽管不太理想，含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少88％的qs-21主峰和》3至10％的2018组分的纯化皂苷提取物(例如本文所述的那些)可以通过首先获得高度纯化的qs-21的单个组分，然后将这些单个组分以所需的比例组合来制备。
[0183]
此外，提供了一种用于制造皂苷提取物的方法，包括以下步骤：
[0184]
(i)选择具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物；
[0185]
(ii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物；和
[0186]
(iii)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化提取物。
[0187]
理想地，该过程包含以下步骤：
[0188]
(i)选择具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物；
[0189]
(ii)通过聚乙烯吡咯烷酮吸附纯化提取物；
[0190]
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化提取物；
[0191]
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物；和
[0192]
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化提取物；
[0193]
其中步骤(ii)和(iii)可以任选地以相反的顺序或同时进行，但通常以所示的顺序进行。
[0194]
皂树的粗水提取物通过水提取获得(但不必是水的形式，例如它可能随后已经干燥、进行溶剂交换或重新溶解到不同的溶剂中)。术语“具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物”是指皂树材料的水性提取物，例如皂树树皮的提取物，该提取物具有》0.075的2018组分与qs-21主峰比率(如通过214nm处的uplc-uv吸光度确定的)。合适地，提取物具有》0.078的2018组分与qs-21主峰比率。
[0195]
术语“具有合适的2018组分组成的皂树材料”是指可以提供具有》0.075的2018组分与qs-21主峰比率(如通过214nm处的uplc-uv吸光度确定)的提取物的皂树材料，例如皂树树皮。合适地，提取物具有》0.078的2018组分与qs-21主峰比率。
[0196]
合适地，前峰与qs-21主峰比率为0.45或更低，特别是0.4或更低(如通过214nm处的uplc-uv吸光度确定的)。前峰与qs-21主峰比率可以是0.05或更高，尤其是0.1或更高(如通过214nm处的uplc-uv吸光度确定的)。
[0197]
通常，粗水提取物是树皮提取物。合适地，皂树的粗水提取物的水溶液中的qs-21主峰含量为至少1g/l，例如至少2g/l，尤其是至少2.5g/l，特别是至少2.8g/l(例如，如通过相对于已知浓度的对照样品的紫外吸光度确定)。
[0198]
合适地，选择具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物的步骤包括测试该组合物以确定2018组分含量。
[0199]
通过聚乙烯吡咯烷酮吸附纯化提取物的步骤包括用聚乙烯吡咯烷酮树脂处理提取物。通常，提取物与聚乙烯吡咯烷酮树脂一起搅拌。随后可以通过过滤将提取物与吸附有杂质的聚乙烯吡咯烷酮树脂分离。该工艺步骤通常去除多酚杂质，如单宁类。
[0200]
通过渗滤、超滤或渗析纯化提取物的步骤适当地为通过渗滤，通常使用切向流的纯化。合适的膜的例子是30kda截止值的。该工艺步骤通常去除盐、糖和其他低分子量物质。
[0201]
使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物的步骤通常使用乙腈和水作为溶剂，通常用合适的酸如乙酸酸化。合适树脂的例子是amberchrom xt20。色谱可以使用等度条件进行，但通常在溶剂梯度(连续，例如线性或阶梯)下操作，例如实施例中提供的那些。该工艺步骤通常去除非皂苷物质并富集所需的皂苷。可以合并选定的级分，以最大化符合所需标准(通常％qs-21
·
18％，如由hplc-uv后的紫外吸光度确定，2018/qs-21比率》0.054，如由uplc-uv后的紫外吸光度确定)的材料的产率。每次聚苯乙烯色谱运行通常在25-200gqs-21之间，例如50-150g之间，特别是在70-110g之间的规模(量基于通过紫外光确定的材料中qs-21主峰的含量)。
[0202]
通过使用苯基树脂的反相色谱法纯化提取物通常使用乙腈和水作为溶剂，其通常用合适的酸如乙酸酸化。色谱可以使用溶剂梯度(连续，如线性或阶梯)进行，尽管通常在等度条件下操作。该工艺步骤提供了所需皂苷的最终纯化。可以合并选定的级分以最大化符合所需标准(通常％qs-21组
·
98.5，％qs-21主峰
·
94.5，2002/1988
·
0.027，％2018》2.7％，qs-21组之外的主峰
·
1％，由uplc-uv/ms测定)的材料的产率。每个苯基色谱运行通常在4-40g qs-21之间，如在10-30g之间，特别是在13-21g之间的规模(量基于通过uv确定的材料中qs-21主峰含量)。
[0203]
该方法可包括去除溶剂以提供干燥皂苷提取物的进一步步骤。因此，本发明提供了一种用于制造皂苷提取物的方法，其包括以下步骤：
[0204]
(i)选择具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物；
[0205]
(ii)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物；
[0206]
(iii)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化提取物；和
[0207]
(iv)除去溶剂以提供干燥的皂苷提取物。
[0208]
本发明还提供了一种皂苷提取物的制备方法，其包括以下步骤：
[0209]
(i)选择具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物；
[0210]
(ii)通过聚乙烯吡咯烷酮吸附纯化提取物；
[0211]
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化提取物；
[0212]
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物；
[0213]
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化提取物；和
[0214]
(vi)除去溶剂以提供干燥的皂苷提取物。
[0215]
其中步骤(ii)和(iii)可以任选地以相反的顺序或同时进行，尽管通常以所示的顺序进行。
[0216]
为了提高干燥效率，可能需要进行浓缩提取物的进一步步骤，如通过使用合适的技术例如反相色谱(例如使用c8树脂)捕获和释放，和/或在干燥步骤之前交换溶剂。
[0217]
还提供了一种皂苷提取物的制备方法，其包括以下步骤：
[0218]
(i)选择具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物；
[0219]
(ii)通过聚乙烯吡咯烷酮吸附纯化提取物；
[0220]
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化提取物；
[0221]
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物；
[0222]
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化提取物；
[0223]
(vi)任选地浓缩提取物；
[0224]
(vii)任选地交换溶剂；以及
[0225]
(viii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷提取物；
[0226]
其中步骤(vi)和(vii)可以任选地以相反的顺序或同时进行，尽管通常以所示的顺序进行。
[0227]
还提供了一种皂苷提取物的制造方法，包括以下步骤：
[0228]
(i)选择具有合适的2018组分组成的皂树的粗水提取物；
[0229]
(ii)通过聚乙烯吡咯烷酮吸附纯化提取物；
[0230]
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化提取物；
[0231]
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物；
[0232]
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化提取物；
[0233]
(vi)使用c8树脂通过反相色谱法浓缩提取物；
[0234]
(vii)交换溶剂；和
[0235]
(viii)除去剩余的溶剂以提供干燥的皂苷提取物。
[0236]
提取物的浓缩可以使用任何合适的技术进行。例如，可以使用捕获和释放方法进行浓缩，例如反相色谱，特别是使用c8树脂。反相色谱通常使用乙腈和水作为溶剂，其通常用合适的酸(如乙酸)酸化。色谱法通常在溶剂梯度下操作，皂苷提取物在低有机溶剂中捕获并在高有机溶剂中洗脱，特别是阶梯式溶剂梯度。
[0237]
可以使用任何合适的技术，特别是渗滤、超滤或渗析，尤其是渗滤来进行溶剂的交换。溶剂交换可用于例如降低乙腈含量，如wo2014016374中所述。可选择合适的膜以允许溶剂交换同时保留皂苷提取物，例如1kda膜。
[0238]
通过除去溶剂的干燥可以通过任何合适的方式进行，特别是通过冻干。在干燥过程中，皂苷提取物可能发生降解，导致形成lyo杂质。因此，希望在限制形成lyo杂质的条件下干燥，如通过限制干燥温度和/或干燥时间。适当地，溶剂的去除通过单一冻干过程进行。所需的干燥程度将取决于溶剂的性质，例如非药学上可接受的溶剂将被理想地去除达到较高的程度，而一些药学上可接受的溶剂(如水)可以被去除达到较低的程度。
[0239]
合适地，本发明的方法以25-1000g qs-21，如50-500g，特别是100-500g的规模进行(量基于通过uv确定的材料中qs-21主峰的含量)。
[0240]
还提供了一种鉴定用于制备纯化皂苷提取物，例如本发明的皂苷提取物的皂树的粗水提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0241]
(i)通过214nm处的uplc-uv吸光度确定2018组分与qs-21主峰的比率；
[0242]
(ii)选择2018组分与qs-21主峰比》0.075的粗提取物。
[0243]
在一个实施方案中，步骤(ii)中选择的粗水提取物具有》0.078的2018组分与qs-21主峰比率。
[0244]
本发明还提供了一种测定皂树粗水提取物中2018组分与qs-21主峰比率的方法，所述方法包括以下步骤：
[0245]
(i)通过214nm处的uplc-uv吸光度确定皂树粗水提取物中的2018组分含量；
[0246]
(ii)通过214nm处的uplc-uv吸光度确定皂树粗水提取物中qs-21的主峰含量；和
[0247]
(iii)将2018组分含量与qs-21主峰含量进行比较，以确定2018组分与qs-21主峰的比率。
[0248]
提供了本发明的皂苷提取物在制备药物中的用途。此外，提供了用作药物，特别是用作佐剂的本发明皂苷提取物。还提供了包含本发明皂苷提取物的佐剂组合物。
[0249]
本发明的皂苷提取物可以与其他佐剂组合，例如tlr4激动剂，特别是脂多糖tlr4激动剂，例如脂质a衍生物，尤其是单磷酰脂质a，例如3-脱-o-酰基单磷酰脂质a(3d-mpl)。3d-mpl由glaxosmithkline biologicals n.a.以名称“mpl”出售，并在整个文件中称为3d-mpl。参见，例如，美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3d-mpl可以根据gb 2 220 211a中描述的方法生产。在化学上，它是具有4、5或6个酰化链的3-脱酰基单磷酰脂质a的混合物。
[0250]
可用于本发明的其他tlr4激动剂包括吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)，例如wo2008/153541或wo2009/143457或文献文章coler rn et al.(2011)development and characterization of synthetic glucopyranosyl lipid adjuvant system as a vaccine adjuvant.plos one 6(1):e16333.doi:10.1371/journal.pone.0016333和arias ma et al.(2012)glucopyranosyl lipid adjuvant(gla),a synthetic tlr4agonist,promotes potent systemic and mucosal responses to intranasal immunization with hivgp140.plos one 7(7):e41144.doi:10.1371/journal.pone.0041144中描述的。wo2008/153541或wo2009/143457以定义可用于本发明的tlr4激动剂的目的通过引用并入本文。
[0251]
感兴趣的特定烷基氨基葡糖苷磷酸酯(agp)示出如下：
[0252][0253]
感兴趣的tlr4激动剂包括：
[0254][0255]
3-脱酰基单磷酰基六酰基脂质a。另一种感兴趣的tlr4激动剂是：
[0256]
3-脱酰基单磷酰基脂质a。感兴趣的tlr4激动剂是dlos(如han,2014中所述)：
[0257]
[0258]
佐剂的典型成人剂量包含1至100μg/人剂量的量的皂苷提取物。皂苷提取物的用量可以为约50μg。合适范围的例子是40-60μg，适当地45-55μg或49-51μg，例如50μg。在另一个实施方案中，人用剂量包含约25μg水平的皂苷提取物。较低范围的例子包括20-30μg，适当地22-28μg或24-26μg，例如25μg。与预期用于成人的剂量相比，预期用于儿童的人用剂量可能会减少(例如减少50％)。
[0259]
tlr4激动剂，例如脂多糖，例如3d-mpl，可以以1至100μg/人剂量的量使用。3d-mpl的用量可以为约50μg。合适范围的例子是40-60μg，适当地45-55μg或49-51μg，如50μg。在另一个实施方案中，人用剂量包含约25μg水平的3d-mpl。较低范围的例子包括20-30μg，适当地22-28μg或24-26μg，如25μg。与预期用于成人的剂量相比，预期用于儿童的人用剂量可能会减少(例如减少50％)。
[0260]
当佐剂中同时存在tlr4激动剂和皂苷提取物时，tlr4激动剂与皂苷的重量比合适地在1:5至5:1之间，合适地为1:1。例如，如果3d-mpl以50μg或25μg的量存在，那么qs-21也可以适当地以50μg或25μg/人剂量的量存在。
[0261]
佐剂还可包含合适的载体，如乳液(例如和水包油乳液)或脂质体。
[0262]
脂质体
[0263]
术语“脂质体”在本领域中是众所周知的，并且定义了囊泡的一般类别，所述囊泡包含围绕水性空间的一个或多个脂质双层。因此，脂质体由一个或多个脂质和/或磷脂双层组成，并且在它们的结构中可以包含其他分子，如蛋白质或碳水化合物。因为脂质相和水相都存在，所以脂质体可以包裹或截留水溶性物质、脂溶性物质和/或两亲性化合物。
[0264]
脂质体的大小可能从30nm到几μm不等，这取决于磷脂的组成和用于其制备的方法。
[0265]
用于本发明的脂质体适当地包含dopc，或者基本上由dopc和甾醇(具有皂苷和任选的tlr4激动剂)组成。
[0266]
在本发明中，脂质体尺寸将在50nm至200nm的范围内，尤其是60nm至180nm，如70-165nm。最佳地，脂质体应该是稳定的，且直径为～100nm以允许通过过滤进行方便的灭菌。
[0267]
脂质体的结构完整性可以通过诸如动态光散射(dls)的方法测量脂质体的大小(z平均直径,zav)和多分散性，或通过电子显微镜分析脂质体的结构来评估。在一个实施例中，平均粒径在95和120nm之间，和/或多分散性(pdi)指数不超过0.3(如不超过0.2)。
[0268]
其它辅料
[0269]
在另一个实施方案中，向组合物中加入缓冲剂。考虑到组合物的组分和对受试者施用的必要适用性来调节液体制剂的ph。适当地，液体混合物的ph值是至少4、至少5、至少5.5、至少5.8、至少6。液体混合物的ph值可以小于9、小于8、小于7.5或小于7。在其他实施方案中，液体混合物的ph值介于4和9之间，介于5和8之间，如介于5.5和8之间。因此，ph值将合适地在6-9之间，如6.5-8.5。在一个特别优选的实施方案中，ph在5.8和6.4之间。
[0270]
合适的缓冲剂可以选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和tris。在一个实施方案中，缓冲剂是磷酸盐缓冲剂，如na/na2po4,na/k2po4或k/k2po4。
[0271]
缓冲剂可以以至少6mm、至少10mm或至少40mm的量存在于液体混合物中。缓冲剂可以小于100mm、小于60mm或小于40mm的量存在于液体混合物中。
[0272]
众所周知，肠胃外施用溶液应具有药学上可接受的渗透压以避免细胞变形或裂解。药学上可接受的渗透压通常意味着溶液具有近似等渗或轻度高渗的渗透压。合适地，组合物(如果以干燥形式提供，在重构时)具有在250至750mosm/kg范围内的渗透压，例如，渗透压可以在250至550mosm/kg范围内，如在280至500mosm/kg范围内。在特别优选的实施例中，渗透压可以在280至310mosm/kg的范围内。渗透压可根据本领域已知的技术测量，例如通过使用市售的渗透压计，例如可从advanced instruments inc.(美国)获得的model 2020。
[0273]“等渗剂”是生理上可耐受的并且赋予制剂合适的张力以防止水通过与制剂接触的细胞膜的净流动的化合物。在一些实施方案中，用于组合物的等渗剂是盐(或盐的混合物)，适宜地，盐是氯化钠，合适地浓度为约150nm。在其他实施方案中，然而，该组合物包含非离子等渗剂并且该组合物中氯化钠的浓度小于100mm，如小于80mm，例如小于50mm，如小于40mm，小于30mm，尤其是小于20mm。组合物中的离子强度可以小于100mm，如小于80mm，例如小于50mm，如小于40mm或小于30mm。
[0274]
在一个具体实施方案中，非离子等渗剂是多元醇，如蔗糖和/或山梨糖醇。山梨糖醇的浓度可以例如在约3％至约15％(w/v)之间，例如约4％至约10％(w/v)之间。wo2012/080369中已经描述了包含免疫活性皂苷级分和tlr4激动剂的佐剂，其中等渗剂是盐或多元醇。
[0275]
合适地，人剂量体积为0.05ml至1ml，例如0.1至0.5ml，特别是约0.5ml或0.7ml的剂量体积。所用组合物的体积可能取决于递送途径和位置，通过皮内途径则给予较小剂量。单位剂量容器可包含超量(overage)以允许在单位剂量给药期间材料的适当操作。
[0276]
皂苷:dopc的比率通常为约1:50至1:10(w/w)，合适地1:25至1:15(w/w)，优选为1:22至1:18(w/w)，如1:20(w/w)。
[0277]
合适地，皂苷在较低反应原性的组合物中存在，其中它被外源性甾醇如胆固醇淬灭。在merck index,13th edn.,381页中公开了胆固醇，其为在动物脂肪中发现的天然存在的甾醇。胆固醇的分子式为(c
27h46
o)，也称为(3β)-胆甾-5-烯-3-醇。
[0278]
皂苷:甾醇的比率通常为约1:100至1:1(w/w)，合适地1:10至1:1(w/w)，并且优选地为1:5至1:1(w/w)。存在适当过量的甾醇，皂苷：甾醇的比率至少为1:2(w/w)。在一个实施方案中，皂苷:甾醇的比率为1:5(w/w)。在一个实施方案中，甾醇是胆固醇。
[0279]
脂质体的量(脂质和甾醇的重量)通常在0.1mg至10mg/人剂量组合物的范围内，特别是0.5mg至2mg/人剂量的组合物。
[0280]
在一个特别合适的实施方案中，本发明中使用的脂质体包含dopc和甾醇，特别是胆固醇。因此，在一个具体实施方案中，用于本发明的组合物包含脂质体形式的皂苷提取物，其中所述脂质体包含dopc和甾醇，特别是胆固醇。
[0281]
感兴趣的特定佐剂的特征在于包含dopc和胆固醇，以及tlr4激动剂和本发明的皂苷提取物，尤其是3d-mpl和本发明的皂苷提取物的脂质体。
[0282]
另一种感兴趣的佐剂的特征在于包含dotap和dmpc，以及tlr4激动剂和本发明的皂苷提取物，尤其是dlos和本发明的皂苷提取物的脂质体。
[0283]
抗原
[0284]
根据本发明制备的佐剂可以与免疫原或抗原结合使用。在一些实施方案中，提供
了编码免疫原或抗原的多核苷酸。
[0285]
佐剂可以与免疫原或抗原分开施用给受试者，或者佐剂可以在制造期间或临时地与免疫原或抗原组合以提供用于联合施用的免疫原性组合物。
[0286]
如本文所用，受试者是哺乳动物，如啮齿动物、非人灵长类动物或人。
[0287]
因此，提供了一种制备包含免疫原或抗原或编码免疫原或抗原的多核苷酸的免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0288]
(i)制备包含本发明的皂苷提取物的佐剂组合物；
[0289]
(ii)将佐剂与免疫原或抗原，或编码免疫原或抗原的多核苷酸混合。
[0290]
还提供了包含本发明皂苷提取物的佐剂在制备药物中的用途。合适地，药物包含免疫原或抗原，或编码免疫原或抗原的多核苷酸。
[0291]
进一步提供了用作药物的包含本发明皂苷提取物的佐剂。合适地，药物包含免疫原或抗原，或编码免疫原或抗原的多核苷酸。
[0292]
术语免疫原是指能够引发免疫反应的多肽。合适地，免疫原是包含至少一个b或t细胞表位的抗原。引发的免疫反应可以是抗原特异性b细胞反应，其产生中和抗体。引发的免疫反应可以是抗原特异性t细胞反应，其可以是全身和/或局部反应。抗原特异性t细胞反应可以包括cd4 t细胞反应，如涉及表达多种细胞因子(例如ifnγ、tnfα和/或il2)的cd4 t细胞的反应。可选地或另外地，抗原特异性t细胞反应包括cd8 t细胞反应，如涉及表达多种细胞因子例如ifnγ、tnfα和/或il2的cd8 t细胞的反应。
[0293]
抗原可以源自(如获自)人类或非人类病原体，包括例如细菌、真菌、感染人类和非人类脊椎动物的寄生微生物或多细胞寄生虫，或来自癌细胞或肿瘤细胞。
[0294]
在一个实施方案中，抗原是重组蛋白，例如重组原核蛋白。
[0295]
在一个实施方案中，抗原源自疟原虫属(例如恶性疟原虫)、分枝杆菌属(例如结核分枝杆菌(tb))、水痘带状疱疹病毒(vzv)、人类呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒(hiv)、莫拉氏菌属(如卡他莫拉菌(moraxella catarrhalis))或不可分型的流感嗜血杆菌(nthi)。
[0296]
抗原可包含源自引起疟疾的寄生虫如恶性疟原虫或间日疟原虫的制备物或由该制备物组成。
[0297]
在一个实施方案中，抗原可以是恶性疟原虫环孢子(cs)蛋白或其变体。cs蛋白的合适变体可以是其中cs蛋白的部分是与来自乙型肝炎的表面抗原s(hbsag)的杂合蛋白形式的变体。cs变体抗原可以是例如杂合蛋白的形式，其包含基本上所有cs蛋白的c末端部分、四个或更多个cs蛋白免疫显性区的串联重复和hbsag。杂合蛋白可以包含含有至少160个氨基酸并且与cs蛋白的c-末端部分基本同源但没有疏水性锚定序列的序列。cs蛋白可能缺少c末端的最后12个氨基酸。此外，它可以包含4个或更多个，例如10个或更多个asn-ala-asn-pro四肽(nanp)重复基序。
[0298]
用于本发明的杂合蛋白可以是一种包含基本上对应于恶性疟原虫克隆3d7的氨基酸207-395的恶性疟原虫cs蛋白的一部分的蛋白质，其源自通过线性接头与hbsag的n-末端框内融合的nf54株。接头可以包含来自hbsag的pres2的一部分。适用于本发明的cs构建体在wo93/10152中有概述，其在美国以美国专利号5,928,902和6,169,171授权，两者均出于描述用于本发明的合适蛋白质的目的以引用方式并入。
[0299]
用于本发明的特定杂合蛋白是称为rts的杂合蛋白(seq id no.1，也在wo2015/150568、wo93/10152(其中表示为rts*)和wo98/05355中描述)，其由以下组成：
[0300]-甲硫氨酸残基
[0301]-三个氨基酸残基，met ala pro
[0302]-189个氨基酸的延伸片段，代表恶性疟原虫3d7株的cs蛋白的氨基酸207至395
[0303]-甘氨酸残基
[0304]-四个氨基酸残基，pro vali thr asn，代表乙型肝炎病毒(adw血清型)pres2蛋白的四个羧基末端残基，和
[0305]-226个氨基酸的延伸片段，由核苷酸1653至2330编码，并指定乙型肝炎病毒(adw血清型)的s蛋白。
[0306]
rts可以是rts,s混合颗粒的形式。rts,s颗粒包含两种多肽rts和s，它们可以同时合成并自发形成复合颗粒结构(rts,s)。
[0307]
抗原可以包含源自分枝杆菌属的制备物或由其组成，例如牛分枝杆菌或结核分枝杆菌，特别是结核分枝杆菌。
[0308]
结核病领域感兴趣的抗原包括rv1196和rv0125。rv1196(例如，在dillon et al,infection and immunity 1999 67(6):2941-2950中通过名称mtb39a描述的)高度保守，在h37rv、c、haarlem、cdc1551、94-m4241a、98-r604inh-rif-em、kzn605、kzn1435、kzn4207、kznr506株之间具有100％的序列同一性，f11株具有单点突变q30k(大多数其他临床分离株与h37rv的同一性超过90％)。rv0125(例如，在skeiky et al,infection and immunity 1999 67(8):3998-4007中通过名称mtb32a描述的)也是高度保守的，在许多株之间具有100％的序列同一性。全长rv0125包括n末端信号序列，该序列被切割以提供成熟蛋白质。
[0309]
在一个实施方案中，抗原源自rv1196，如包含与seq id no:2具有至少70％，如至少80％，特别是至少90％，尤其是至少95％，例如至少98％，如至少99％同一性的序列(如由其组成)。典型的rv1196相关抗原将包含具有少量缺失、插入和/或置换的seq id no:2的衍生物(如由其组成)。例子是在0-5个位置具有最多5个残基的缺失、在0-5个五个位置处具有最多5个残基的插入和最多20个残基的置换的那些。rv1196的其他衍生物是包含seq id no:2的片段(如由其组成)的那些，其长度至少为200个氨基酸，如长度至少250个氨基酸，特别是长度至少300个氨基酸，尤其是长度至少350个氨基酸。
[0310]
在一个实施方案中，抗原源自rv0125，如包含与seq id no:3具有至少70％，如至少80％，特别是至少90％，尤其是在至少95％，例如至少98％，如至少99％同一性的序列，如由其组成。典型的rv0125相关抗原将包含具有少量缺失、插入和/或置换的seq id no:3的衍生物(如由其组成)。例子是具有在0-5个位置最多5个残基的缺失、在0-5个五个位置处最多5个残基的插入和最多20个残基的置换的那些。rv0125的其他衍生物是包含seq id no:3的片段(如由其组成)的那些，其长度至少为150个氨基酸，如长度至少为200个氨基酸，特别是长度至少为250个氨基酸，尤其是长度至少为300个氨基酸。rv0125的特定衍生物是包含对应于seq id no:3的残基1-195的seq id no:3的片段(如由其组成)的那些。rv0125的其他免疫原性衍生物是包含对应于seq id no:3的残基192-323的seq id no:3的片段(如由其组成)的那些。特别优选的rv0125相关抗原是seq id no:3的衍生物，其中至少一个(例如一个、两个或甚至所有三个)催化三联体已被取代或删除，使得蛋白酶活性降低且蛋白质更
容易产生—催化的丝氨酸残基可以被缺失或置换(例如被丙氨酸置换)和/或催化的组氨酸残基可以被缺失或置换和/或置换，催化的天冬氨酸残基可以被缺失或置换。特别感兴趣的是其中催化的丝氨酸残基已被置换(例如被丙氨酸置换)的seq id no:3的衍生物。同样令人感兴趣的是rv0125相关抗原，其包含与seq id no:3具有至少70％、如至少80％，特别是至少90％，尤其是至少95％，例如至少98％，如至少99％同一性的序列(如由其组成)并且其中催化三联体中的至少一个已被取代或缺失，或者是那些包含长度至少为150个氨基酸、如长度至少为200个氨基酸，特别是长度至少为250个氨基酸，尤其是长度至少为300个氨基酸的seq id no:3的片段(如由其组成)，并且其中催化三联体中的至少一个已经被取代或缺失。rv0125的其他免疫原性衍生物是包含对应于seq id no:3的残基192-323的seq id no:3的片段(例如由其组成)的那些，其中至少一个(例如一个、两个或甚至所有三个)催化三联体已被取代或缺失。rv0125的特定免疫原性衍生物是包含对应于seq id no:3的残基1-195的seq id no:3的片段(如由其组成)的那些衍生物，其中催化的丝氨酸残基(seq id no:3的第176位)已被置换(例如被丙氨酸置换)。
[0311]
适当地，抗原将包含与seq id no.4具有至少70％，如至少80％，特别是至少90％，尤其是至少95％，例如至少98％，如至少99％同一性的序列(如由其组成)。典型的m72相关抗原将包含具有少量缺失、插入和/或置换的seq id no：4的衍生物(如由其组成)。例子是具有在0-5个位置的最多5个残基的缺失、在0-5个五个位置处最多5个残基的插入和最多20个残基的置换的那些。m72的其他衍生物是包含seq id no:4的片段(如由其组成)的那些，其长度至少为450个氨基酸，如长度至少为500个氨基酸，如长度至少为550个氨基酸，如长度至少为600个氨基酸，如长度至少为650个氨基酸或长度至少为700个氨基酸。由于m72是源自两个单独抗原rv0125和rv1196的融合蛋白，任何至少450个残基的片段将包含来自全长序列的多个表位(skeiky et al,j.immunol.2004 172:7618-7628；skeiky infect.immun.1999 67(8):3998-4007；dillon infect.immun.1999 67(6):2941-2950)。
[0312]
m72相关抗原将包含与seq id no.4具有至少70％，如至少80％，特别是至少90％，尤其是至少95％，如至少98％，例如至少99％同一性的序列(如由其组成)。
[0313]
典型的m72相关抗原将包含(如由其组成)具有少量缺失、插入和/或置换的seq id no:4的衍生物。实例是在0-5个位置具有最多5个残基的缺失、在0-5个五个位置处最多5个残基的插入和最多20个残基的置换的那些。
[0314]
在特定实施方案中，m72相关抗原将包含seq id no.4的残基2-723，例如包含seq id no.4(或由其组成)或包含seq id no.5(或由其组成)。
[0315]
根据本发明可以使用的另外的抗原是结核抗原rv1753及其变体，如wo2010010180中描述的，例如选自wo2010010180的seq id nos:1和2-7，特别是seq id no:1的rv1753序列。结核病领域的另一个感兴趣的抗原是rv2386及其变体，如wo2010010179中所述，例如，选自wo2010010179的seq id no：1和2-7，特别是seq id no:1的rv2386序列。结核病领域中其他感兴趣的抗原包括rv3616及其变体，例如在wo2011092253中描述的，例如选自wo2011092253的seq id no:1和2-7的天然rv3616序列或选自wo2011092253的seq id no:161至169、179和180，特别是seq id no:167的那些的修饰的rv3616序列。感兴趣的另外的抗原是hbha，例如在wo97044463、wo03044048和wo2010149657中描述的。前述专利申请wo2010010180、wo2010010179、wo2011092253、wo97044463、wo03044048和wo2010149657的
全部内容以引用方式并入本文，目的是为了定义可用于本发明的抗原。
[0316]
其他感兴趣的抗原是包含以下(或由其组成)的那些抗原：rv1174，也称为dpv，如wo2010010177的seq id no 8中所述；rv1793，也称为mti或mtb9.9，如wo2010010177的seq id no 10中所述；rv2087，也称为msl或mtb9.8，如wo2010010177的seq id no 9中所述；rv3616，也称为htcc1或mtb40，如wo2010010177的seq id no 1和2-7或wo2011092253的seq id no 161-169、179或180中所述；和/或rv3874，也称为cfp10或tb38.1，如wo2010010177的seq id no 9中所述；或其免疫原性部分(如来自其的至少20、50、75或100个残基)或其变体(如与其具有至少70％、80％、90％或95％的同一性)。(wo2010010177和wo2011092253以定义可用于本发明的抗原为目的通过引用整体并入本文)。
[0317]
结核抗原最适合以多肽形式使用，但也可以替代地以编码所述多肽的多核苷酸形式提供。
[0318]
可根据本发明使用的另外的抗原源自水痘带状疱疹病毒(vzv)。用于本发明的vzv抗原可以是任何合适的vzv抗原或其免疫原性衍生物，适当地是纯化的vzv抗原。
[0319]
在一个实施方案中，vzv抗原是vzv糖蛋白ge(也称为gp1)或其免疫原性衍生物。野生型或全长ge蛋白由623个氨基酸组成，其包括信号肽、蛋白质的主要部分、疏水性锚定区(残基546-558)和c-末端尾部。在一个方面，使用ge c-末端截短物(也称为截短的ge或ge截短物)，由此截短去除了羧基末端的总氨基酸残基的4％至20％。在另一方面，截短的ge缺乏羧基末端锚定区(合适地大约为野生型序列的氨基酸547-623)。在另一方面，ge是具有seq id no:6序列的截短的ge。
[0320]
ep0405867和其中的参考文献中描述了ge抗原、其无锚衍生物(它们也是免疫原性衍生物)及其产生(也参见vafai a.,antibody binding sites on truncated forms of varicalla-zoster virus gpi(ge)glycoprotein,vaccine 1994 12:1265-9)。ep192902还描述了ge及其产生。haumont et al.virus research(1996)vol 40,p199-204也描述了截短的ge，在此全文引入作为参考。wo2006/094756中描述了适合根据本发明使用的含佐剂的vzv ge组合物，即羧基末端截短的vzv ge与包含qs-21、3d-mpl和进一步含有胆固醇的脂质体的佐剂组合。leroux-roels i.et al.(j.infect.dis.2012,206:1280-1290)报道了一项评估佐剂化vzv截短ge亚单位疫苗的i/ii期临床试验。
[0321]
抗原可包含源自人呼吸道合胞病毒(rsv)的制备物(或由其组成)。在某些有利的实施方案中，多肽抗原是来自rsv的f蛋白多肽抗原。在上下文中特别适合作为多肽抗原组分的是构象约束的f多肽抗原。先前已在融合前(pref)和融合后(postf)构象中描述了构象约束的f蛋白。这种构象约束的f蛋白通常包含工程化的rsv f蛋白胞外域。f蛋白胞外域多肽是rsv f蛋白的一部分，其包括rsv f蛋白胞外域的全部或部分并且缺乏功能性(例如，通过缺失或取代)跨膜域，其可以例如在细胞培养物中以可溶(不附着于膜)的形式表达。
[0322]
构象限制在融合前构象中的示例性f蛋白抗原已在本领域中有所描述，并详细公开于例如美国专利号8,563002(wo2009079796)；为了说明融合前f多肽(和核酸)及其产生方法的目的，美国公开专利申请号us2012/0093847(wo2010/149745)、us2011/0305727(wo2011/008974)、us2014/0141037、wo2012/158613和wo2014/160463均通过引用并入本文。通常，抗原是多肽三聚体的形式。提供融合前构象的f蛋白实例的其他出版物包括：mclellan et al.,science,vol.340:1113-1117；mclellan et al.,science,vol 342:
592-598以及rigter et al.,plos one,vol.8:e71072,它们中的每一个也可用于本文公开的免疫原性组合的情况中。
[0323]
例如，在融合前构象中稳定的f蛋白多肽通常包括f蛋白(例如，可溶性f蛋白多肽)的胞外域，其包含稳定f蛋白的融合前构象的至少一种修饰。例如，修饰可以选自添加三聚化结构域(通常添加到c末端)、缺失一个或多个弗林蛋白酶切割位点(在氨基酸～105-109和～133-136)、缺失pep27结构域、取代或添加疏水性结构域(例如hra和/或hrb)中的亲水氨基酸。在一个实施方案中，构象约束的pref抗原包含rsv f蛋白多肽的f2结构域(例如，氨基酸1-105)和f1结构域(例如，氨基酸137-516)而没有插入的弗林蛋白酶切割位点，其中多肽还包含位于f1结构域c末端的异源三聚化结构域。任选地，pref抗原还包含改变糖基化(例如，增加糖基化)的修饰，例如在对应于rsv f蛋白的～500-502氨基酸的位置处一个或多个氨基酸的置换。当存在寡聚化序列时，其优选为三聚化序列。合适的寡聚化序列是本领域众所周知的并且包括例如酵母gcn4亮氨酸拉链蛋白的卷曲螺旋、来自噬菌体t4纤维蛋白(“折叠子”)的三聚化序列和流感ha的三聚体结构域。另外地或可选地，构象限制在融合前构象中的f多肽可以包括至少两个引入的半胱氨酸残基，它们彼此非常接近并形成稳定融合前rsv f多肽的二硫键。例如，两个半胱氨酸可以在彼此约10埃内。例如，可以在位置165和296或位置155和290处引入半胱氨酸。示例性pref抗原由seq id no：7表示。
[0324]
抗原可包含源自hiv的制备物或由其组成。抗原可以是hiv蛋白，如hiv包膜蛋白。例如，抗原可以是hiv包膜gp120多肽或其免疫原性片段。
[0325]
一种合适的抗原是公开的申请wo 2008/107370的seq id no：8的hiv进化枝b gp120多肽(或该多肽的免疫原性片段)。wo 2008/107370的seq id no:8通过引用并入本技术。
[0326]
合适的抗原还包括包含公开的申请wo 2015/036061的seq id no:1的v1v2区的多肽，或seq id no:1的v1v2区的免疫原性衍生物或片段。此外，包含wo 2015/036061的seq id no：5的v1v2区的多肽或seq id no：5的v1v2区的免疫原性衍生物或片段可以用作合适的抗原。wo2015/036061的seq id no：1和seq id no：5以引用方式并入。
[0327]
在另一个实施方案中，抗原可以包含两种或更多种不同的hiv包膜gp120多肽抗原(或这些多肽的免疫原性片段)。合适的抗原包括hiv进化枝c gp120多肽抗原，包括tv1 gp120(seq id no：8)和1086.c gp120(seq id no：9)。
[0328]
其他合适的hiv抗原包括nef、gag和pol hiv蛋白及其免疫原性片段。
[0329]
组合物可包含不可分型流感嗜血杆菌抗原，例如选自：纤维蛋白蛋白[(us 5766608-俄亥俄州立研究基金会)]和包含来自其的肽的融合物[例如lb1(f)肽融合体；us5843464(osu)或wo99/64067]；omp26[wo 97/01638(cortecs)]；p6[ep 281673(state university of new york)]；tbpa和/或tbpb；hia；hsf；hin47；hif；hmw1；hmw2；hmw3；hmw4；hap；d15(wo 94/12641)；蛋白d(ep 594610)；p2；和p5(wo 94/26304)；蛋白e(wo07/084053)和/或pila(wo05/063802)。组合物可包含卡他莫拉菌蛋白抗原，例如选自：omp106[wo 97/41731(antex)&wo 96/34960(pmc)]；omp21；lbpa和/或lbpb[wo 98/55606(pmc)]；tbpa和/或tbpb[wo 97/13785&wo 97/32980(pmc)]；copb[helminen me,et al.(1993)infect.immun.61:2003-2010]；uspa1和/或uspa2[wo 93/03761(university of texas)]；ompcd；hasr(pct/ep99/03824)；pilq(pct/ep99/03823)；omp85(pct/ep00/01468)；lipo06
(gb 9917977.2)；lipo10(gb9918208.1)；lipo11(gb 9918302.2)；lipo18(gb 9918038.2)；p6(pct/ep99/03038)；d15(pct/ep99/03822)；ompla1(pct/ep99/06781)；hly3(pct/ep99/03257)；和ompe。
[0330]
在一个实施方案中，组合物可包含不可分型流感嗜血杆菌(nthi)蛋白抗原和/或卡他莫拉氏菌蛋白抗原。该组合物可包含来自流感嗜血杆菌的蛋白d(pd)。蛋白d可以如wo91/18926中所述。该组合物还可包含来自流感嗜血杆菌的蛋白e(pe)和/或菌毛蛋白a(pila)。蛋白e和菌毛蛋白a可以如wo2012/139225中所述。蛋白e和菌毛蛋白a可以作为融合蛋白呈现；例如，如wo2012/139225中所述的lvl735。例如，该组合物可包含三种nthi抗原(pd、pe和pila，后两种结合为pepila融合蛋白)。该组合物还可包含来自卡他莫拉氏菌的uspa2。uspa2可以如wo2015125118中所述，例如wo2015125118中所述的mc-009((m)(uspa2 31-564)(hh))。例如，该组合物可包含三种nthi抗原(pd、pe和pila，后两种结合为pepila融合蛋白)和一种卡他莫拉氏菌抗原(uspa2)。
[0331]
多种抗原可以被提供。例如，可以提供多种抗原以加强引发的免疫反应(例如以确保强保护)，可以提供多种抗原以扩大免疫反应(例如，确保针对一系列病原体株或在大部分受试者群体中提供保护)或者可以提供多种抗原以当前引发针对多种疾病的免疫应答(从而简化给药方案)。当提供多种抗原时，它们可以是不同的蛋白质或可以是一种或多种融合蛋白的形式。
[0332]
抗原可以以0.1至100ug/人剂量的量提供。
[0333]
本发明可应用于治疗或预防与上述一种或多种抗原相关的疾病或病症。在一个实施方案中，疾病或病症选自疟疾、肺结核、copd、hiv和疱疹。
[0334]
佐剂可以与免疫原或抗原分开施用，或者可以在制造期间或临时与免疫原或抗原组合以提供用于联合施用的免疫原性组合物。
[0335]
灭菌
[0336]
特别是对于肠胃外施用，组合物应该是无菌的。尽管可以通过无菌级过滤器过滤来方便地进行灭菌，但可以通过各种方法进行灭菌。灭菌可以在佐剂或免疫原性组合物的制备过程中进行多次，但通常至少在制造结束时进行。
[0337]“无菌级过滤器”是指在被微生物以大于或等于1x107/cm2有效过滤面积的激发水平激发后产生无菌流出物的过滤器。出于本发明的目的，无菌级过滤器对于本发明领域的技术人员来说是众所周知的，无菌级过滤器的孔径在0.15和0.25um之间，合适地为0.18-0.22um，例如0.2或0.22um。
[0338]
无菌级过滤器的膜可由技术人员已知的任何合适材料制成，例如但不限于醋酸纤维素、聚醚砜(pes)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)。在本发明的一个特定实施方案中，本发明的一个或多个或所有过滤膜包含聚醚砜(pes)，特别是亲水性聚醚砜。在本发明的一个特定实施方案中，在本文所述的方法中使用的过滤器是双层过滤器，特别是具有内置预过滤器的无菌过滤器，该预过滤器的孔径大于末端过滤器的孔径。在一个实施方案中，除菌过滤器是双层过滤器，其中预过滤膜层的孔径在0.3和0.5nm之间，如0.35或0.45nm。根据进一步的实施方案，过滤器包括不对称过滤膜，如不对称亲水pes过滤膜。或者，灭菌过滤层可由pvdf制成，例如与不对称亲水pes预过滤膜层结合。
[0339]
根据预期的医疗用途，材料应为医药级(如肠胃外注射级)。
[0340]
本发明由以下项目说明：
[0341]
项目1.一种皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少88％的qs-21主峰和》3％至10％的2018组分。
[0342]
项目2.根据项目1所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有至少3.5％的2018组分。
[0343]
项目3.根据项目2所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有至少4％的2018组分。
[0344]
项目4.根据项目4所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有至少4.5％的2018组分。
[0345]
项目5.根据项目1至4中任一项所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有9％或更少的2018组分。
[0346]
项目6.根据第5项目所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有8％或更少的2018组分。
[0347]
项目7.根据项目6所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有7％或更少的2018组分。
[0348]
项目8.根据项目1至7中任一项所述的皂苷提取物，其中所述提取物包含至少90％，如至少91％、至少92％或至少93％的qs-21主峰。
[0349]
项目9.根据项目1至8中任一项所述的皂苷提取物，其中最丰富物质的单同位素的m/z为1987.9。
[0350]
项目10.根据项目1至9中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.8％的qs-21组。
[0351]
项目11.根据项目1至10中任一项所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的1％或更少的lyo杂质。
[0352]
项目12.根据项目11所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的1％或更少的qs-21组之外的最大峰。
[0353]
项目13.根据项目1所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的qs-21组，至少88％的qs-21主峰，》3％至10％的2018组分，1％或更少的qs-21组之外的最大峰，并且其中最丰富的物质的单同位素的m/z为1987.9。
[0354]
项目14.根据项目1至13中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和通过相对离子丰度确定的至少40％，如至少50％，特别是至少60％，尤其是至少65％，如至少70％的1988组分。
[0355]
项目15.根据项目1至14中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的90％或更少，如85％或更少，或80％或更少的1988组分。
[0356]
项目16.根据项目1至15中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的30％或更少，例如25％或更少的1856组分。
[0357]
项目17.根据项目1至16中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的uv吸光度和相对离子丰度确定的至少5％，如至少10％的1856组分。
[0358]
项目18.根据项目1至17中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的uv吸光度和相对离子丰度确定的40％或更少，如30％或更少，特别是20％或更少，尤其是10％或更少的2002组分。
[0359]
项目19.根据项目1至18中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的uv吸光度和相对离子丰度确定的至少0.5％，如至少1％的2002组分。
[0360]
项目20.一种皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少88％，如至少90％、至少91％、至少92％或至少93％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，和》3％至10％的m/z为2017.9的三萜糖苷。
[0361]
项目21.根据项目20所述的皂苷提取物，其中最丰富的物质的单同位素的m/z为1987.9。
[0362]
项目22.根据项目20或21所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少88％的m/z为1855.9、1987.9或2001.9的三萜糖苷，不包括b-异构体和lyo杂质。
[0363]
项目23.根据项目20至22中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的m/z为1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9或2118的三萜糖苷。
[0364]
项目24.根据项目20至23中任一项所述的皂苷提取物，其含有至少98％的m/z为1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9或2118的三萜糖苷，不包括lyo杂质。
[0365]
项目25.根据项目20至24中任一项所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的1％或更少的具有lyo杂质的m/z的三萜糖苷。
[0366]
项目26.根据项目25所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的1％或更少的任何其他峰。
[0367]
项目27.根据项目20所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的具有1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9或2118的m/z的三萜糖苷，至少88％的具有1855.9，1987.9或2001.9的m/z的三萜糖苷，》3％至10％的m/z为2017.9的三萜糖苷，1％或更少的任何其他峰，并且其中最丰富物质的单同位素的m/z为1987.9。
[0368]
项目28.根据项目20-27中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少40％，如至少50％，特别是至少60％，尤其是至少65％，如至少70％的1988组分。
[0369]
项目29.根据项目20至28中任一项所述的皂苷提取物，其包含如通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的90％或更少，例如85％或更少，或80％或更少的1988组分。
[0370]
项目30.根据项目20至29中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的30％或更少，如25％或更少的1856组分。
[0371]
项目31.根据项目20至30中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少5％，如至少10％的1856组分。
[0372]
项目32.根据项目20至31中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的10％或更少，例如5％或更少的2002组分。
[0373]
项目33.根据项目20至32中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少0.5％，如至少1％的2002组分。
[0374]
项目34.根据项目20至33中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少3.5％的m/z为2017.9的三萜糖苷。
[0375]
项目35.根据项目34所述的皂苷提取物，其中所述提取物包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少4％的m/z为2017.9的三萜糖苷。
[0376]
项目36.根据项目35所述的皂苷提取物，其中所述提取物包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少4.5％的m/z为2017.9的三萜糖苷。
[0377]
项目37.根据项目20至36中任一项所述的皂苷提取物，其中所述提取物包含通过214nm处的紫外吸光度确定的9％或更少的m/z为2017.9的三萜糖苷。
[0378]
项目38.根据项目37所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的8％或更少的m/z为2017.9的三萜糖苷。
[0379]
项目39.根据项目38所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的7％或更少的m/z为2017.9的三萜糖苷。
[0380]
项目40.一种皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少88％，如至少90％、至少91％、至少92％或至少93％的：
[0381][0382]
或者
[0383][0384]
以及》3％至10％的：
[0385][0386]
项目41.根据项目40所述的皂苷提取物，其中最丰富的物质的单同位素的m/z为1987.9。
[0387]
项目42.根据项目40或41的皂苷提取物，其含有至少98％的
[0388]
[0389]
[0390]
或者
[0391][0392]
项目43.根据项目40至42中任一项所述的皂苷提取物，其含有至少98％的
[0393]
[0394]
[0395]
或者
[0396]
和2118组分。
[0397]
项目44.根据项目40-43任一项所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有1％或更少的
[0398][0399]
项目45.根据项目44所述的皂苷提取物，其中所述提取物含有通过214nm处的紫外吸光度确定的1％或更少的任何其他峰。
[0400]
项目46.根据项目40所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的
[0401]
[0402][0403]
或者
[0404][0405]
至少88％，如至少90％、至少91％、至少92％或至少93％的：
[0406][0407]
或者
[0408][0409]
》3％至10％的：
[0410]
1％或更少的任何其他峰，并且其中最丰富的物质的单同位素的m/z为1987.9。
[0411]
项目47.根据项目40所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度确定的至少98％的
[0412]
[0413]
[0414][0415]
或者2118组分，
[0416]
至少88％，如至少90％、至少91％、至少92％或至少93％的：
[0417]
[0418][0419]
或者
[0420][0421]
》3％至10％的：
[0422]
1％或更少的任何其他峰，并且其中最丰富的物质的单同位素的m/z为1987.9。
[0423]
项目48.根据项目40至47中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少40％，如至少50％，特别是至少60％，特别是至少65％，如至少70％的，
[0424][0425]
和
[0426][0427]
项目49.根据项目40至48中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的30％或更少，如25％或更少的，
[0428][0429]
项目50.根据项目40至49中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少5％，如至少10％的，
[0430][0431]
项目51.根据项目40至50中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的40％或更少，如30％或更少，特别是20％或更少，尤其是10％或更少的
[0432][0433]
项目52.根据项目40至51中任一项所述的皂苷提取物，其含有通过214nm处的紫外吸光度和相对离子丰度确定的至少0.5％，如至少1％的，
[0434][0435]
项目53.根据项目40至52中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度确定的至少3.5％，如至少4％或至少4.5％的
[0436][0437]
项目54.根据项目40-53中任一项所述的皂苷提取物，其包含通过214nm处的紫外吸光度确定的9％或更少，如8％或更少或7％或更少的：
[0438][0439]
项目55.根据项目1至54中任一项所述的皂苷提取物，其被干燥。
[0440]
项目56.一种鉴定用于制备纯化皂苷提取物的皂树粗水提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0441]
(i)通过214nm处的uplc-uv吸光度确定2018组分/qs-21主峰的比率；和
[0442]
(ii)选择2018组分/qs-21主峰的比率》0.075的粗水提取物。
[0443]
项目57.根据项目56所述的方法，其中在步骤(ii)中选择的粗水提物具有》0.078的2018组分/qs-21主峰比率。
[0444]
项目58.根据项目56或57所述的方法，其用于制造项目1至55中任一项的皂苷提取物。
[0445]
项目59.一种纯化皂苷提取物的制备方法，其包括以下步骤：
[0446]
(i)选择具有大于0.075的2018组分与qs-21主峰比率的皂树的粗水提取物；
[0447]
(ii)通过聚乙烯吡咯烷酮吸附纯化提取物；
[0448]
(iii)通过渗滤、超滤或透析纯化提取物；
[0449]
(iv)使用聚苯乙烯树脂通过反相色谱法纯化提取物；以及
[0450]
(v)使用苯基树脂通过反相色谱法纯化提取物。
[0451]
项目60.根据项目59所述的方法，其中步骤(iii)使用通过渗滤的纯化。
[0452]
项目61.根据项目59或60所述的方法，其中步骤(iv)使用乙腈和水，特别是在梯度条件下。
[0453]
项目62.根据项目59至61中任一项所述的方法，其中步骤(v)使用乙腈和水，特别是在等度条件下。
[0454]
项目63.根据项目59至62中任一项所述的方法，其包括去除溶剂以提供干燥皂苷提取物的附加步骤。
[0455]
项目64.根据项目63所述的方法，其中使用冻干法去除溶剂。
[0456]
项目65.根据项目59至64中任一项所述的方法，其包括使用c8树脂通过反相色谱法浓缩提取物的附加步骤。
[0457]
项目66.根据项目65所述的方法，其中使用c8树脂通过反相色谱法浓缩提取物使用乙腈和水，特别是在阶梯式梯度条件下。
[0458]
项目67.根据项目65或66所述的方法，其包括交换溶剂的附加步骤。
[0459]
项目68.根据项目67所述的方法，其中交换溶剂使用渗滤、超滤或渗析，尤其是渗滤。
[0460]
项目69.根据项目59至68中任一项所述的方法，其中皂树的粗水提取物具有》0.078的2018组分与qs-21主峰比率。
[0461]
项目70.根据项目59至69中任一项所述的方法，其中皂树的粗水提取物是含有至少1g/l，如至少2g/l，尤其是至少2.5g/l，特别是至少2.8g/l的qs-21主峰的水溶液。
[0462]
项目71.根据项目59至70中任一项所述的方法，其中皂树的粗水提取物是树皮提取物。
[0463]
项目72.根据项目59至71中任一项所述的方法，其中选择皂树的粗水提取物的步骤(i)包括测试粗水提取物组合物以确定2018组分含量。
[0464]
项目73.根据项目1至55中任一项所述的皂苷提取物在制备药物如佐剂或免疫原性组合物中的用途。
[0465]
项目74.根据项目1至55中任一项所述的皂苷提取物，其被用作佐剂。
[0466]
项目75.包含根据项目1至55中任一项所述的皂苷提取物的佐剂组合物。
[0467]
项目76.根据项目73至75中任一项所述的用途、皂苷提取物或佐剂组合物，其中佐剂是脂质体制剂。
[0468]
项目77.根据项目73至76中任一项所述的用途、皂苷提取物或佐剂组合物，其中佐剂包含tlr4激动剂。
[0469]
项目78.根据项目77所述的用途、皂苷提取物或佐剂组合物，其中tlr4激动剂是3d-mpl。
[0470]
项目79.一种免疫原性组合物，其包含项目75至78中任一项所述的佐剂组合物和免疫原或抗原，或编码免疫原或抗原的多核苷酸。
[0471]
项目80.根据项目79所述的免疫原性组合物，其中所述抗原源自人类或非人类病原体，其包括如感染人类和非人类脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或源自癌细胞或肿瘤细胞。
[0472]
项目81.根据项目80所述的免疫原性组合物，其中所述抗原源自恶性疟原虫或间日疟原虫，例如seq id no 1的抗原。
[0473]
项目82.根据项目80所述的免疫原性组合物，其中所述抗原源自分枝杆菌属，如源自seq id no.2至5中的任一个。
[0474]
项目83.根据项目80所述的免疫原性组合物，其中所述抗原源自水痘带状疱疹病毒，例如seq id no.6的抗原。
[0475]
项目84.根据项目80所述的免疫原性组合物，其中所述抗原源自人呼吸道合胞病毒，例如seq id no.7的抗原。
[0476]
项目85.根据项目80所述的免疫原性组合物，其中所述抗原源自hiv，如seq id no.8或9的抗原。
[0477]
项目86.根据项目80所述的免疫原性组合物，其中所述抗原源自不可分型流感嗜血杆菌(nthi)和/或卡他莫拉氏菌。
[0478]
项目87.根据项目79-86中任一项所述的免疫原性组合物，其中抗原作为多肽提供。
[0479]
项目88.根据项目79至86中任一项所述的免疫原性组合物，其中提供了编码多肽抗原的多核苷酸。
[0480]
项目89.一种测定皂树粗水提物中2018组分/qs-21主峰比率的方法，所述方法包括以下步骤：
[0481]
(i)通过214nm处的uplc-uv吸光度测定皂树粗水提取物中的2018组分含量；
[0482]
(ii)通过214nm处的uplc-uv吸光度测定皂树粗水提取物中的qs-21主峰含量；以及
[0483]
(iii)将2018组分含量与qs-21主峰含量进行比较，以确定2018组分/qs-21主峰的比率。
[0484]
项目90.一种制备纯化皂苷提取物的方法，所述提取物含有通过214nm的紫外吸光度确定的至少88％的qs-21主峰和》3至10％的2018组分，所述方法包括以下步骤：
[0485]
(i)选择具有合适的2018组分组成的皂树材料；
[0486]
(ii)在合适的条件下制备皂树材料的粗水提取物；以及
[0487]
(iii)将水提液粗提物纯化，以得到纯化皂苷提取物。
[0488]
项目91.权利要求90所述的方法，用于制造根据权利要求1至55中任一项所述的皂苷提取物。
[0489]
本技术中所有参考文献的教导，包括专利申请和授权专利，在此全部引入作为参考。定义为“包含”某些元素的组合物或方法或过程被理解为涵盖(分别)由那些元素组成的组合物、方法或过程。如本文所用，“基本上由
……
组成”是指可以存在附加组分，前提是它们不会改变整体特性或功能。
[0490]
将参考以下非限制性实施例进一步描述本发明：
[0491]
实施例
[0492]
实施例1-皂树粗水提取物的hplc
[0493]
使用c4柱和梯度洗脱通过反相hplc分离粗树皮提取物：流动相a-水/乙腈，7/3v/v，含0.15％三氟乙酸；流动相b-含0.15％三氟乙酸的乙腈。uv检测在214nm处。
[0494]
根据需要用纯化水稀释粗树皮提取物样品。加入聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp；60mg/ml)，将混合物搅拌约30分钟，然后离心以从上清液中分离pvpp树脂。
[0495]
然后分析上清液以提供hplc uv谱图。
[0496]
图1提供了hplc uv谱图的代表性示例。显示了对应于qs-21级分的峰。
[0497]
实施例2
–
分析方法
[0498]
hplc-uv
[0499]
设备
[0500]
waters alliance 2690/2695分离模块
[0501]
waters 2487紫外检测器或2996pda检测器
[0502]
vydac protein c4 4.6x250mm 5um柱
[0503]
流动相a(mpa)-0.15％三氟乙酸的水/乙腈(70:30v/v)溶液
[0504]
流动相b(mpb)-0.15％三氟乙酸的乙腈溶液
[0505]
线性梯度条件：
[0506][0507][0508]
注入40ul样品。uv检测设置为214nm。
[0509]
使用空白注射作为参考，谱图中峰的积分提供总吸光度。将感兴趣的峰(例如qs-21主峰)与总吸光度进行比较，以确定作为百分比的峰含量。
[0510]
hplc-uv方法也方便地用于测定qs-21主峰含量和前峰与qs-21主峰比率。
[0511]
uplc-uv
[0512]
设备
[0513]
waters acquity uplc
[0514]
waters acquity可调谐紫外检测器
[0515]
waters acquity beh c18 2.1x100mm 1.7um柱
[0516]
流动相a(mpa)-0.025％乙酸的水/乙腈(70:30v/v)溶液
[0517]
流动相b(mpb)-0.025％三氟乙酸的水/乙腈(30:70v/v)溶液
[0518]
线性梯度条件：
[0519]
时间流速(ml/min)％mpa％mpb00.5881210.20.565.734.311.20.5109013.20.51090
[0520]
柱温28℃。注入10ul样品。uv检测设置为214nm。
[0521]
使用空白注射作为参考，谱图中峰的积分提供总吸光度。将感兴趣的峰(例如qs-21主峰)与总吸光度进行比较，以确定作为百分比的峰含量。
[0522]
uplc-uv方法也方便地用于确定2018/qs-21比率。
[0523]
uplc-uv/ms
[0524]
设备
[0525]
waters acquity uplc
[0526]
waters acquity可调谐紫外检测器
[0527]
waters单四极杆质谱检测器sqd1(扫描范围1400至2040m/z)
[0528]
waters acquity beh c18 2.1x100mm 1.7um柱
[0529]
流动相a(mpa)-0.025％三氟乙酸的水/乙腈/异丙醇(75:20:5v/v)溶液
[0530]
流动相b(mpb)-0.025％三氟乙酸的水/乙腈/异丙醇(10:72:18v/v)溶液
[0531]
线性梯度条件：
[0532]
时间流速(ml/min)％mpa％mpb00.610006.230.62377
[0533]
测试样品在0.2％乙酸的水/乙腈(70:30v/v)中制备。柱温55℃。注入10ul样品。uv检测设置为214nm。
[0534]
尽管运行之间的保留时间略有不同，但qs-21组位于大约3.8分钟(b-异构体)到大约4.5分钟(在lyo杂质之前)。
[0535]
使用空白注射作为参考，对谱图中在0.5到约5.50分钟的溶剂前沿后洗脱且未出现在空白中的峰进行积分。
[0536]
通过在整个谱图上组合tic以创建组合谱识别最丰富的物质的单同位素。
[0537]
2002组分与1988组分的比率是通过比较与2002组分相关的离子电流和与qs-21主峰内的1988组分相关的离子电流来计算的。
[0538]
图5提供了示例性皂苷提取物的谱图。图6显示了该区域的扩展细节，包括qs-21组和lyo组分。
[0539]
图7a和7b提供了示例性纯化的皂树皂苷提取物的1988(图7a)和2002(图7b)分子量离子的提取质谱图。
[0540]
实施例3
–
皂树粗水提取物的纯化
[0541]
用pvpp(每升粗水提物1kg pvpp)处理具有2018组分与qs-21主峰比率0.064或更低且前峰与qs-21主峰比率0.4或更低的皂树材料的粗水提取物。吸附后，过滤混合物以从液体中分离pvpp和结合的杂质。
[0542]
图2提供了皂树粗水提取物的示例hplc-uv谱图(用于前峰与qs-21主峰比率测定和qs-21主峰含量)。
[0543]
图3提供了皂树粗水提取物的示例uplc-uv谱图(用于2018组分与qs-21主峰比率的测定)
[0544]
过滤的液体被浓缩并使用30kd hellicon膜通过超滤/渗滤进一步纯化。
[0545]
使用聚苯乙烯树脂(amberchrom xt20)和以下条件通过反相色谱法纯化所得渗透物：
[0546][0547]
洗脱液a：5％乙腈和0.25％乙酸
[0548]
洗脱液b：90％乙腈和0.25％乙酸
[0549]
柱：30cm id
[0550]
上样量：每注射50-110g
[0551]
合并级分以提供聚苯乙烯纯化的皂苷提取物，其组成为：
[0552]
％qs-21主峰
·
18％(通过hplc)
[0553]
和
[0554]
2018组分/qs-21主峰比率
·
0.054(通过uplc-uv)。
[0555]
图4提供了聚苯乙烯纯化皂苷提取物池的示例uplc-uv谱图。
[0556]
使用苯基树脂(epdm)和以下条件通过反相色谱进一步纯化合并的聚苯乙烯纯化级分池：
[0557]
步骤持续时间(min)％洗脱液c％洗脱液b注射 冲洗2.0100％0％等度洗脱58.0100％0％再生5.00％100％平衡10.0100％0％
[0558]
洗脱液b：90％乙腈和0.25％乙酸
[0559]
洗脱液c：35.2％乙腈和0.25％乙酸
[0560]
色谱柱：45cm id
[0561]
上样量：每注射13-21g
[0562]
合并级分以提供具有以下组成的苯基纯化的皂苷提取物：
[0563]
％qs-21组
·
98.5
[0564]
％qs-21主峰
·
94.5
[0565]
％2018成分
·
2.7％
[0566]
qs-21组之外的主峰
·
1％(通过uplc-uv/ms)。
[0567]
合并的苯基纯化皂苷提取物通过使用c8树脂(lichroprep rp8)和以下条件的反相色谱的捕获和释放进行浓缩：
[0568]
上样到以24％乙腈和0.20％乙酸调理的柱。
[0569]
用60％乙腈和0.20％乙酸洗脱。
[0570]
11cm柱
[0571]
上样量：每注射50-142g
[0572]
使用超滤/渗滤和pellicon 1kda膜对c8浓缩皂苷提取物进行溶剂交换，以将乙腈含量降低至21％以下。
[0573]
然后将所得的经溶剂交换的皂苷提取物一步冻干以提供最终纯化的皂苷提取物产物。
[0574]
从适当的粗提取物开始和/或应用组分掺杂，使用如实施例3中所述的方法可以一致地提供在qs-21主峰和2018组分方面具有确定含量的皂树的纯化皂苷提取物，如始终至少88％的qs-21主峰和》3至10％的2018组分。
[0575]
实施例4
–
高2018含量的纯化的qs-21皂苷提取物
[0576]
4.1 2018组分富集的纯化皂苷提取物的制备
[0577]
使用反相色谱制备2018组分富集的纯化皂苷提取物。从根据实施例3制备的低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物(见图9)开始，经过多次运行，收集对应于2018峰的级分以提供2018组分富集的纯化皂苷提取物(或“2018浓缩物”)的批次a和批次b。
[0578]
系统：带级分收集器的uplc waters
[0579]
柱：uplc waters acquity beh c18，2.1mm x 100mm，1.7um流动相：a：水/acn/ipa(75/20/5，v/v/v)，0.025％tfa
[0580]
b：水/acn/ipa(10/72/18，v/v/v)，0.025％tfa
[0581]
流速：0.6ml/min
[0582]
柱温箱温度：55℃
[0583]
进样量：10μl
[0584]
检测器uv：波长214nm
[0585]
梯度
[0586][0587][0588]
批次a为300μl，总浓度为22.6μg/ml。批次b为750μl，总浓度为66.4μg/ml。在合并以提供最终的2018浓缩物之前，批次a和b通过uplc-uv进行分析。
[0589]
结果
[0590]
图10a(批次a)和10b(批次b)中提供了批次a和b的uplc-uv分析。
[0591]
组分起始*材料批次a批次b合并的2018浓缩物qs-21主峰(％)93.911.512.812.72018组分(％)2.262.071.470.3
[0592]
*根据实施例3制备的低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物
[0593]
4.2低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物用增加百分比的2018组分富集的纯化皂苷提取物的掺杂
[0594]
将4.1节中获得的2018浓缩物以不同比例与低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物(图9)混合，以提供7种具有增加的2018组分含量的qs-21皂苷提取物，每个的总浓度为22μg/ml。下表提供了每种所得qs-21皂苷提取物的qs-21主峰和2018组分的百分比。
[0595]
表1
[0596][0597][0598]
4.3 2018组分富集的皂苷提取物的生物活性
[0599]
根据4.1节和4.2节制备的7种qs-21皂苷提取物的生物活性已通过在体外细胞培养试验中测量tnf-和il-8细胞因子反应进行评估。各提取物中的“qs-21主峰”和“2018组分”的百分比提供于表1中。
[0600]
人thp1细胞系(atcc)在t175烧瓶中的10％fcs-rpmi 添加剂培养基中培养。培养细胞直到它们达到pdl 13(种群倍增水平)，同时每周添加2次新鲜培养基。
[0601]
为了进行测试，将细胞转移到96孔板中。thp1细胞用lps(3ng/ml)刺激1小时，然后用低2018组分含量(2μg/ml)的qs-21纯化的皂苷提取物刺激16小时。然后独立地测试上清液的细胞因子反应。
[0602]
16小时孵育期后，收集不同孔的上清液并在-80℃冷冻直至测试。使用来自bd biosciences的cba试剂盒对分泌的tnf-和il-8进行定量。
[0603]
单个tnf-α和il-8浓度绘制为qs-21纯化皂苷提取物中2018组分百分比的函数。anova模型用于估计浓度的几何平均值(gmc)及每个2018组分的百分比的95％置信区间(ci)和几何平均比(gmr)，如与参考“低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物”(即包含2.2％的2018组分)相比的。所有分析使用sas 9.4版(sas institute inc.,cary,nc,usa)进行。
[0604]
结果
[0605]
■
tnf-α反应
[0606]
图11表示在不存在qs-21纯化皂苷提取物和存在2μg/ml qs-21纯化皂苷提取物(具有增加的2018组分百分比)的情况下测量的个体tnf-α浓度和相应gmc /-ci。
[0607]
对于仅包含lps(完全不添加qs-21纯化皂苷提取物)的培养基，获得低于220pg/ml的弱反应。当添加低2018组分含量(即2.2％)的qs-21纯化皂苷提取物时，观察到在500和700pg/ml之间的反应。当添加增加百分比的2018组分(即5.5％、8.8％、15.9％、29.5％、56.2％和70.3％)的qs-21纯化皂苷提取物时，在5.5％至15.9％的2018组分范围内，未观察到tnf-α反应的显著变化。
[0608]
将每种具有增加的2018组分百分比的qs-21纯化皂苷提取物与参考“低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物”(即含有2.2％的2018组分)进行比较。对于每次比较，将从anova模型估计的gmr(gmc的比率)和95％ci呈现在表2中，并绘制在图12中。
[0609]
表2
[0610][0611]
■
il-8反应
[0612]
图13代表在不存在qs-21纯化皂苷提取物和存在2μg/ml qs-21纯化皂苷提取物(具有增加的2018组分的百分比)的情况下测量的个体il-8浓度和相应gmc /-ci。
[0613]
对于仅包含lps(完全不添加qs-21纯化皂苷提取物)的培养基，获得低于8000pg/ml的弱反应。当添加低2018组分含量(即2.2％)的qs-21纯化皂苷提取物时，观察到接近22000pg/ml的反应。当添加2018组分百分比增加(即5.5％、8.8％、15.9％、29.5％、56.2％和70.3％)的qs-21纯化皂苷提取物时，在5.5％至15.9％的2018组分的范围内，观察到类似的il-8反应。
[0614]
将每种具有增加的2018组分百分比增加的qs-21纯化皂苷提取物与参考“低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物”(即含有2.2％的2018组分)进行比较。对于每次比较，将从anova模型估计的gmr(gmc的比率)和95％ci显示在表3中，并绘制在图14中。
[0615]
表3
[0616][0617]
实施例5
–
级分合并以获得特定最终组成的qs-21纯化皂苷提取物
[0618]
制备了皂树树皮的粗水提取物，其qs-21浓度为2.8g/l，前峰与qs-21主峰比率为0.5，且2018/qs-21主峰比率为0.081。然后使用聚苯乙烯树脂对粗提取物进行反相色谱。收集级分并合并一部分级分以提供部分纯化的提取物，其qs-21纯度为19.5％，且2018与1988的比率为0.084。
[0619]
随后，使用苯基树脂(asahi苯基柱4.6mm x 250mm)对部分纯化的提取物进行反相色谱。在30秒的时间间隔内收集了qs-21主峰的区域内的总共14个级分，并通过uplc-uv/ms分析了它们的含量(图15)。确定各种级分的组合以促进具有以下预期组成的苯基树脂纯化提取物：
[0620][0621]
与上述方法一致，制备了三批的纯化和冻干的qs-21。所得材料通过uplc-uv/ms分析，并发现具有以下组成：
[0622][0623]
结论
[0624]
获得了三种根据本发明的具有高2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物。
[0625]
实施例6
–
免疫反应
[0626]
该研究的目的是评估qs-21组成的变化是否影响佐剂性。更准确地说，该研究评估了与低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物(qs-21低2018)相比，与3d-mpl和vzv ge抗原一起配制的如实施例5所述制备的三个qs-21批次(qs-21高产率量、qs-21高2002和qs-21高2018)的佐剂性。
[0627]
制备四种qs-21组合物中每一种的脂质体佐剂制剂，其含有qs-21和3d-mpl(1:1w/w)；通过与vzv ge抗原混合制备含有抗原的制剂。为每种qs-21脂质体制剂制备了三种不同的ge抗原剂量水平：5μg、1μg和0.4μg ge(相当于人用剂量的shingrixtm中所含ge抗原量的1/10、1/50和1/125)。
[0628]
将每种ge抗原制剂施用于6-8周龄雌性c57bl6小鼠(10只/组)。以14天的间隔肌内注射两次抗原制剂。3只小鼠的对照组仅接受磷酸盐缓冲盐水。
[0629]
在d21收集脾脏和血清，并分别分析t和抗体反应。
[0630]-elisa
[0631]
通过elisa测量抗vzv ge总igg。96孔板在4℃下用抗原包被过夜。去除包被缓冲液，并在37℃下用饱和缓冲液使板饱和1小时。之后，加入100ul稀释的小鼠血清或标准或对照，并在37℃下孵育1h30。洗涤后，将板在37℃下与100μl抗小鼠igg生物素化孵育1小时。洗涤后，将板与100ul链霉亲和素-pod偶联物在37℃下孵育30分钟。洗涤后，每孔加入100ul tmb，并将板在室温下避光保持15分钟。为了停止反应，每孔加入100ul h2so
4 0.4n。用elisa酶标仪在450/620nm波长处读取吸光度。使用softmax-pro软件计算结果。结果如图16和17所示。
[0632]-ics(细胞内细胞因子染色)
[0633]
在rpmi培养基中收集脾脏，并使用波特组织研磨机(匀浆器)使用两次上下冲击进行解离。均质化的样品转移到50ml聚丙烯管中。通过100um尼龙细胞过滤器过滤除去纤维材料。然后洗涤细胞、计数并以107个细胞/ml重新悬浮。
[0634]
在最后4小时内，在存在蛋白质转运抑制剂(布雷菲尔德菌素a)的情况下，用ge肽或培养基在体外重新刺激淋巴样细胞6小时。然后使用荧光抗体通过常规免疫荧光程序处理这些细胞(细胞外染色：cd4；细胞内染色：tnf-α、ifn-γ和il2)。
[0635]
结果表示为对于每只小鼠减去培养基条件后cd4细胞群中细胞因子阳性细胞的频率。数据针对显示至少两种细胞因子(il2、ifn-α或tnf-α)表达的群体提供。结果如图18和19所示。
[0636]
结论
[0637]
无论注射的制剂如何，均未观察到任何动物的临床体征，这表明可接受的安全性特征。
[0638]
测试的3个剂量的每一个，用具有加宽的规格的qs-21(qs-21高qs-21产率，qs-21高2002和qs-21高2018)诱导的cd4 t细胞反应显示出与通过低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物(qs-21低2018)所诱导的反应等同(边际[0.5
–
2])。
[0639]
加宽qs-21的规格对抗体反应的影响有限(观察到几何平均比的低于2倍的差异)，在最低剂量(0.4μg)下具有加宽的规格的qs-21与qs-21纯化皂苷提取物相比具有诱导较高抗体滴度，且在较高剂量下具有比目前滴度更低的略低滴度的趋势。
[0640]
总之，结果表明加宽的qs-21对佐剂性没有影响或影响有限，如qs-21和3d-mpl的脂质体组合物的佐剂性。
[0641]
实施例7
–
免疫反应ii
[0642]
该研究的目的是证明与低2018组分含量的qs-21纯化的皂苷提取物(qs-21低2018)相比，用3d-mpl和vzvge抗原配制的如实施例5所述制备的三个qs-21批次之间的抗体和cd4 t细胞反应的等效性。
[0643]
6-8周龄雌性c57bl6小鼠(16只/组)以28天的间隔肌内注射两次用包含3d-mpl和qs-21(1:1w/w)的脂质体制剂配制的5ug ge抗原。3只小鼠的对照组仅接受磷酸盐缓冲盐水，且3只小鼠的对照组仅接受vzv ge抗原。
[0644]
疫苗用每只动物5ug的各种3d-mpl/qs-21制备(相当于典型人用剂量的1/10)。注射体积为50ul。
[0645]
在d42(第二次免疫后2周)和d49(第二次免疫后3周)收集血清并分析抗体反应。在d49收集脾脏并分析cd4 t细胞反应。
[0646]-ics(细胞内细胞因子染色)
[0647]
在rpmi培养基中收集脾脏，并使用波特组织研磨机(均质器)进行解离。均质化的样品转移到50ml聚丙烯管中。通过100um尼龙细胞过滤器过滤除去纤维材料。然后洗涤细胞、计数并以每ml 107个细胞重新悬浮。
[0648]
在最后4小时内，在存在蛋白质转运抑制剂(布雷菲德菌素a)的情况下，用ge肽或培养基在体外重新刺激淋巴样细胞6小时。细胞用荧光标记的抗体进行染色，细胞外染色(例如cd4)和细胞内染色(例如tnf-α、ifn-γ和il2)用于随后的流式细胞术分析。结果表示为对于每只小鼠减去培养基条件后cd4 t细胞群中细胞因子阳性细胞的频率。对显示至少两种细胞因子(il2、ifn-γ或tnf-α)表达的群体进行统计分析。结果如图20和21所示。
[0649]-elisa
[0650]
elisa方法如实施例6中所述。
[0651]
结果如图22和23所示。
[0652]-统计方法
[0653]
抗体滴度和cd4 频率被认为是对数正态分布的。
[0654]
为了评估抗体反应，方差分析(anova)模型被拟合到log10滴度上，具有测试组、时间点及其相互作用作为固定效应，并具有对于时间点的重复陈述。组间没有假设方差的齐性。该模型用于计算测试组之间的几何平均值和几何平均比及其相应的95％置信区间。
[0655]
cd4 t细胞反应通过表达il-2、tnf-α和ifn-γ中的至少两种细胞因子的细胞的频率来评估，其中去除了体外培养基刺激。然后，方差分析(anova)模型拟合到log10频率上，具有测试组作为固定效应。组间没有假设方差的齐性。该模型用于计算测试组之间的几何平均值和几何平均比及其相应的95％置信区间。
[0656]
结论
[0657]
图20表示在总cd4 t细胞中表达il-2、tnf-a和ifn-g的至少两种细胞因子的vzv ge特异性cd4 t细胞的个体百分比及其几何平均值和95％置信区间。对于低2018组分含量的qs-21(qs-21低2018)和其他三种测试组合物(qs-21高产率、qs-21高2002、qs-21高2018)观察到相似的vzv ge特异性cd4 t细胞频率。在注射单独的pbs或vzv ge的小鼠中检测到最
少的vzv ge特异性cd4 t细胞(《0.05％)(数据未显示)。
[0658]
观察到的vzv ge特异性cd4 t细胞百分比和低2018组分含量的qs-21(qs-21低2018)之间的几何平均比(和95％置信区间)如图21所示。这些几何平均比接近1(在0.89和1.06之间)，置信区间在[0.5和2]区间内。因此，证明了cd4 t细胞反应方面的等效性。
[0659]
由具有低2018组分含量的qs-21(qs-21低2018)和其他三种测试组合物(qs-21高产率、qs-21高2002、qs-2高20181)诱导的抗vzv ge抗体滴度在d42和d49相似。请注意，在仅注射pbs vzv ge的小鼠中检测到低抗vzv ge抗体滴度(《1200eu/ml)(数据未显示)。
[0660]
与低2018年组分含量的qs-21(qs-21低2018)相比，观察到的抗vzv ge抗体滴度之间的几何平均比(和95％置信区间)如图23所示。观察到的几何平均比(黑色方块)接近1，且95％置信区间(误差棒)在[0.5和2]区间内。因此，证明了抗体反应方面的等效性。
[0661]
总而言之，这些结果在统计上表明，qs-21高产率、qs-21高2002和qs-21高2018诱导了与对于低2018组分含量的qs-21观察到的适应性免疫反应同等有效的适应性免疫反应，因此对佐剂性没有影响，如qs-21和3d-mpl的脂质体组合物的佐剂性。
[0662]
实施例8
–
反应原性
[0663]
该研究的目的是证明与具有低2018组分含量的qs-21纯化皂苷提取物相比，用3d-mpl和vzv ge抗原配制的如实施例5所述制备的三个qs-21批次之间的反应原性等效性。
[0664]
雌性ofa大鼠(8只/组)在三个时间点注射pbs或用包含3d-mpl和qs-21(1:1w/w)的脂质体制剂配制的vzv ge抗原。疫苗用每只动物20ug 3d-mpl/qs-21中的每一种配制的20ug vzv ge抗原制备(对应于典型人剂量的2/5，每个注射部位施用1/5)。注射量为每个部位100ul。在第1天向左右腓肠肌施用pbs，在第8天和第22天向左右股四头肌施用疫苗。
[0665]
从第-10天到第36天，使用植入式温度探头监测体温。从第1天到第36天监测临床体征、注射部位反应和体重。在第25天和第36天进行尸检微观和宏观评估。
[0666]
结果
[0667]
临床体征和局部反应：
[0668]-研究期间未发生意外死亡。
[0669]-在任何处理的动物中均未观察到与处理相关的临床体征。
[0670]-在第8天(1后6小时)，对于所有vzv ge/as01制剂，一些动物在施用疫苗后出现预期的局部反应，如水肿、红斑、干燥和脱皮。
[0671]-在制剂组之间没有观察到这些瞬时反应的发作和持续时间的相关差异，因为它们通常在注射后几小时出现并在几天内消失。
[0672]
体温：
[0673]-与初始pbs注射相比，所有组中第一次和第二次肌内注射后平均体温相似地升高(约1.5℃)。
[0674]-每次肌内注射后温度升高(相对于基线)的平均差异和t
°
的峰值显示出相当的模式特征，其在所有组中具有相同的比例。
[0675]-图25显示了在第一次(第8天)和第二次(第23天)免疫后对每只动物观察到的最大温度差异以及所有处理组的平均值和95％置信区间。
[0676]
体重：
[0677]-所有组在疫苗注射后的第二天均观察到短暂和轻微的平均体重减轻。组间未观
activation by alum and alum's adjuvant effect are mediated by nlrp3.journal of immunology.181:17-21.
[0693]
livingston,p.o.,s.adluri,f.helling,t.j.yao,c.r.kensil,m.j.newman,and d.marciani.1994.phase 1 trial of immunological adjuvant qs-21 with a gm2 ganglioside-keyhole limpet haemocyanin conjugate vaccine in patients with malignant melanoma.vaccine.12:1275-1280.
[0694]
ragupathi,g.,j.r.gardner,p.o.livingston,and d.y.gin.2011.natural and synthetic saponin adjuvant qs-21 for vaccines against cancer.expert review of vaccines.10:463-470
[0695]
martin,m.,s.m.michalek,and j.katz.2003.role of innate immune factors in the adjuvant activity of monophosphoryl lipid a.infection and immunity.71:2498-2507.
[0696]
marty-roix,r.et al.identification of qs-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants.j.biol.chem.291,1123
–
36(2016)
[0697]
mata-haro,v.,c.cekic,m.martin,p.m.chilton,c.r.casella,and t.c.mitchell.2007.the vaccine adjuvant monophosphoryl lipid a as a trif-biased agonist of tlr4.science.316:1628-1632.
[0698]
newman,m.j.,j.y.wu,b.h.gardner,k.j.munroe,d.leombruno,j.recchia,c.r.kensil,and r.t.coughlin.1992.saponin adjuvant induction of ovalbumin-specific cd8 cytotoxic t lymphocyte responses.journal of immunology.148:2357-2362.
[0699]
soltysik,s.,j.y.wu,j.recchia,d.a.wheeler,m.j.newman,r.t.coughlin,and c.r.kensil.1995.structure/function studies of qs-21adjuvant:assessment of triterpene aldehyde and glucuronic acid roles in adjuvant function.vaccine.13:1403-1410.