一类新型壳寡糖衍生物杀线剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于海洋化工工程技术，具体涉及一类壳寡糖衍生物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.植物寄生线虫是农业作物病害的一大病原，其种类包括根结线虫 (meloidogyne spp.)、胞囊线虫(heterodera spp.)、茎线虫(ditylenchusspp.)、滑刃线虫(aphelenchoides spp.)等。我国每一种大田、大棚作物都会受到一种或多种线虫寄生，并造成不同程度的减产。由于生活隐瞒、防治难、传染性强，线虫病害每年给我国的农业生产造成巨大的经济损失，防治形势十分严峻。然而由于环境问题、生态问题、食品安全问题，大多数化学杀线剂已被禁用，少数可供选择的杀线剂也存在高毒、耐药性、种类单一等问题。在我国可持续发展战略下，研制高效、低毒、低残留的生物源多功效杀线剂是一条可行且紧迫的途径。
3.我国海洋面积辽阔，有丰富的海洋生物资源。从海洋活性物质中开发新型海洋生物源农药，具有广阔的应用前景，并正成为一个新的研究领域。甲壳素来源于虾、蟹、昆虫等节肢动物(甲壳纲、昆虫纲)的外壳或软体动物的外壳以及真菌、低等藻类的细胞壁。其含量丰富，可再生，是含量仅次于纤维素的第二大天然生物多糖。壳寡糖，是一种碱性多糖，具有无毒、水溶性好、生物相容性好、可自然降解等特点。有研究表明，壳寡糖能够促进作物生长、提高作物对病虫害的免疫力，同时多羟基和氨基使其容易通过改性获得特定生物活性，因此在农业领域有广阔的研究潜力。
4.三氟丁烯基是农药研发中的一类活性基团，其通过与其他杀线活性基团连用，能明显提高杀线活性，而酚酸(醛)结构就是一种杀线活性基团。植物源酚酸(醛)类物质与植物对各种病虫害的抗性有关。有研究显示酚酸(醛)类物质水平的升高与植物对线虫感染的抗性或反应有关，说明酚酸(醛)类可能会对线虫产生杀灭活性。研究显示水杨酸虽然是一种信号分子，但其在 50μg/ml表现出对南方根结线虫的毒性；在橄榄油加工过程中的废水检测出香草酸，咖啡酸，丁香酸和邻香豆酸，其在15μg/ml时表现出对爪哇根结线虫的活性。苯甲醛、糠醛虽然不是酚醛物质，但能够在温室中抑制南方根结线虫根结的形成。
5.因此，可将多氨基壳寡糖作为载体，接枝三氟丁烯基及酚醛类活性基团，通过协调增效作用提高壳寡糖的杀线活性，同时兼具壳寡糖本身的低毒性、提高免疫力的活性，由此通过多重功效获得良好的线虫防治效果。


技术实现要素：

6.本发明就是针对上述问题，提供了一类结构新颖、杀线活性好、低毒的壳寡糖衍生物及其制备方法和应用。
7.为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案为：
8.1.壳寡糖衍生物为羧甲基壳寡糖-(o-三氟丁烯基)苯甲醛希夫碱衍生物通式如式
i或ⅱ所示：
[0009][0010]
式中n＝2-30，m,t＝0-2。
[0011]
2.壳寡糖衍生物的制备方法为：
[0012]
(1)壳寡糖在有机溶剂中，在碱的存在下，于60℃与氯乙酸反应12h。降至室温，过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，水溶后，透析，冷冻干燥，得o-羧甲基壳寡糖。
[0013]
(2)单或多羟基苯甲醛在有机溶剂中，在缚酸剂的存在下，与4-溴-1,1,2
-ꢀ
三氟-1-丁烯(btf)在60～70℃下反应12h，得o-三氟丁烯基-羟基苯甲醛衍生物混合液。其中，醛、缚酸剂、btf的摩尔比为1:1～1.2:1.1～1.5。
[0014]
(3)向步骤(2)中的o-三氟丁烯基-羟基苯甲醛衍生物混合液中，加入步骤(1)所制备的o-羧甲基壳寡糖，在常温下反应6-10h，反应后经过滤、醇洗、水溶、透析、冷冻干燥，得羧甲基壳寡糖-(o-三氟丁烯基)苯甲醛希夫碱衍生物。其中，以壳寡糖单糖为基准，碱、o-三氟丁烯基-羟基苯甲醛衍生物的摩尔比为1:1.5～2:1～1.5。
[0015]
3.壳寡糖衍生物的制备方法中：
[0016]
所述壳寡糖的分子量为300-5000。
[0017]
所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺等碱性溶剂。
[0018]
缚酸剂为吡啶、三乙胺、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或碳酸钾。
[0019]
所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
[0020]
本发明的优点：
[0021]
三氟丁烯基类农药是农业上一大杀虫、杀线类农药，其与其他活性基团结合，会发挥协同总效作用，而酚酸(醛)类是一类可与可供选择的杀线活性基团；本发明采用活性亚结构拼接法，以天然壳寡糖为先导化合物，引入多三氟丁烯基 酚醛结构，制备兼具杀线、促免疫、低毒的新型多功能壳寡糖衍生物。所合成的衍生物为开发新型生物杀线剂的开辟了新途径。
附图说明
[0022]
图1羧甲基壳寡糖-(o-三氟丁烯基)苯甲醛希夫碱衍生物的红外谱图；
[0023]
图2羧甲基壳寡糖-(o-三氟丁烯基)苯甲醛希夫碱衍生物的虫卵孵化抑制活性。
具体实施方式
[0024]
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
[0025]
实施例1羧甲基壳寡糖-(4-三氟丁烯基)氧基苯甲醛希夫碱(1-1f)的制备
[0026]
取8g壳寡糖于60ml dmf中，加入5ml吡啶，在加入6.16g氯乙酸， 60℃反应12h。降至室温，过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，烘干，得o-羧甲基壳寡糖。
[0027]
取0.06mol对羟基苯甲醛(hba)于20ml dmf中，加入2ml吡啶、1.2 倍摩尔质量的4-溴-1,1,2-三氟-1-丁烯(btf)，升温至70℃反应过夜。加入1go-羧甲基壳寡糖，常温搅拌6h，抽滤，滤饼用乙醇洗涤3次，烘干，即得羧甲基壳寡糖-(4-三氟丁烯基)氧基苯甲醛希夫碱(1-1f)(褐色，收率 48.3％)。
[0028]
实例2羧甲基壳寡糖-(2-三氟丁烯基)氧基水杨醛希夫碱(1-s1f)的制备
[0029]
取0.06mol水杨醛(sa)于20ml dmf中，加入2ml吡啶、1.2倍摩尔质量的4-溴-1,1,2-三氟-1-丁烯(btf)，升温至70℃反应过夜。加入1g o-羧甲基壳寡糖，常温搅拌6h，抽滤，滤饼用乙醇洗涤3次，烘干，即得羧甲基壳寡糖
-ꢀ
(2-三氟丁烯基)氧基水杨醛希夫碱(1-s1f)(褐色，收率34.3％)。
[0030]
实例3羧甲基壳寡糖-((4-三氟丁烯基)氧基-3-羟基)苯甲醛希夫碱(1
-ꢀ
2f)的制备
[0031]
取0.06mol 2,4-二羟基苯甲醛(dba)于20ml dmf中，加入2ml吡啶、 1.2倍摩尔质量的4-溴-1,1,2-三氟-1-丁烯(btf)，升温至70℃反应过夜。加入 1g o-羧甲基壳寡糖，常温搅拌6h，抽滤，滤饼用乙醇洗涤3次，烘干，即得羧甲基壳寡糖-((4-三氟丁烯基)氧基-3-羟基)苯甲醛希夫碱(1-2f)(咖啡色，收率30.8％)。
[0032]
实例4羧甲基壳寡糖-((4-三氟丁烯基)氧基-2,3-二羟基)苯甲醛希夫碱 (1-3f)的制备
[0033]
取0.06mol 2,3,4-三羟基苯甲醛(tba)于20ml dmf中，加入2ml吡啶、1.2倍摩尔质量的4-溴-1,1,2-三氟-1-丁烯(btf)，升温至70℃反应过夜。加入1g o-羧甲基壳寡糖，常温搅拌6h，抽滤，滤饼用乙醇洗涤3次，烘干，即得羧甲基壳寡糖-((4-三氟丁烯基)氧基-2,3-二羟基)苯甲醛希夫碱(1
-ꢀ
3f)(灰褐色，收率36.7％)。
[0034]
红外光谱表明：合成含三氟丁烯壳聚糖希夫碱类衍生物消耗氨基，因此壳寡糖的氨基峰(1508cm-1
)、酰胺ⅰ类峰(1607cm-1
)消失(见图1)，同时，在1630cm-1
处出现c＝n伸缩振动峰，在1610cm-1
、1480cm-1
左右出现苯环特征峰。引入的三氟丁烯结构，其c＝c特征峰出现在1498cm-1
处。另外，羧基 c＝o伸缩振动峰出现在1736cm-1
。综上，衍生物1-1f、1-s1f、1-2f、1-3f合成成功。
[0035]
虫卵孵化抑制活性测定
[0036]
采用浸虫法测定样品对南方根结线虫(meloidogyne incognita)的杀线活性。测试在4个样品浓度下即：2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、 0.25mg/ml，对南方根结线虫的抑制效果。
[0037]
实验以相同0.1mg/ml、0.025mg/ml和0.01mg/ml的噻唑磷药剂(溶剂为 1％的吐温
20)为阳性对照，以蒸馏水为空白对照。方法参照农业部标准ny/t 1833.1-2009,具体步骤如下：
[0038]
将被感染线虫的植物根部组织剪成小段，置于1％次氯酸钠溶液中震荡4min，依次通过200目、500目筛，用水洗涤，收集根结线虫虫卵，配成悬浮液。配制2mg/ml的样品母液，依次稀释至1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml。用移液器从低浓度到高浓度，依次吸取药液及对照100μl分别加到96孔板中，然后吸取制备好的虫卵悬浮液20μl(约50个)加入到96孔板中，加盖于25℃恒温培养3d。每处理4次重复，于解剖镜下观测虫卵孵化情况，记录虫卵数和孵化出的线虫数量。
[0039]
虫卵孵化抑制计算方法如下：
[0040][0041][0042]
实验结果见图2。
[0043]
植物毒性评价
[0044]
衍生物对种子萌发和根伸长的影响来评估衍生物的植物毒性。选取10个均匀饱满的黄瓜种子，放入一个直径为90mm、内衬滤纸的培养皿中。然后，加入4ml样品溶液(0.5和1.0mg/ml)。将种子放在25.0
±
2.0℃黑暗中培育。48h 后，测定种子发芽率和胚根伸长。每个处理重复三次，蒸馏水作为空白对照。发芽指数(gi)用以下公式计算：
[0045]
gi(％)＝(rls×
gss)/(rlc×
gsc)
[0046]
其中，下标s和c分别代表样品处理组和空白对照组的结果。rl和gs分别表示种子的胚根长度和萌发种子的数目。当gi超过1时，衍生物被认为没有植物毒性。
[0047]
表3.l壳寡糖衍生物的发芽指数
[0048][0049]
如图2所示，衍生物1-1f、1-s1f在2mg/ml时对根结线虫虫卵的孵化抑制在90％以上，而在1mg/ml时抑制率在80％以上，此浓度与噻唑磷的 0.025mg/ml孵化抑制效果类似。在1mg/ml时，壳寡糖衍生物1-1f和1-s1f具有更大的di值(均大于1)，而噻唑磷稍小于1，即壳寡糖衍生物没有植物毒性，相反具有促进作用，而阳性对照对黄瓜幼苗有弱抑制作用。也就是说，在相同虫卵抑制效果时，壳寡糖衍生物具有更低的植物毒性。
[0050]
另外，1-1f及1-s1f的虫卵孵化抑制活性明显高于壳寡糖原料，可见通过接枝三氟
丁烯基 酚酸(醛)活性基团可以明显提高壳寡糖的杀线活性，同时兼具壳寡糖的促植物生长作用。
[0051]
综上，本发明所得衍生物在较低的毒性下发挥高的虫卵抑制活性。本发明为利用海洋生物活性物质开发新型生物杀线剂提供了一条新的思路。