基于Caco-2细胞高效诱变筛选肠道定植益生菌的育种方法与流程

基于caco
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2细胞高效诱变筛选肠道定植益生菌的育种方法
技术领域
1.本发明涉及益生菌培育技术领域，特别是属于一种基于caco
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2细胞高效诱变筛选肠道定植益生菌的育种方法。


背景技术：

2.诱变育种是指在人为的条件下，为了提高基因的随机突变频率、扩大变异幅度，利用物理、化学等因素，诱发生物体的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成动植物或微生物新品种的育种方法。
3.诱变育种主要分为随机诱变和定向诱变，随机诱变属于传统的诱变育种方式，通过将细胞或生物暴露于诱变剂，选择具有所需特征的突变体。诱变剂的作用本质是改变生物体的遗传物质，由于许多突变可能导致癌症，因此诱变剂也可能是致癌物质，常用的诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。目前，益生菌的诱变方式主要为随机诱变，诱变效率低、工作量大，往往得不到理想的突变菌株。
4.诱变筛选长时间定植于动物肠道内的益生菌，现在普遍做法为首先添加诱变剂随机诱变益生菌，然后通过灌胃的方式接种益生菌，在不同时间段从动物肠道或粪便中分离疑似突变益生菌并进行pcr鉴定，重复此诱变方法直至筛选到稳定遗传的能够长时间定植于动物肠道的益生菌。该诱变筛选动物肠道定植性益生菌方法的缺点是操作繁琐、工作量大、诱变效率低。


技术实现要素：

5.本发明的目的即在于提供一种基于caco
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2细胞高效诱变筛选肠道定植益生菌的育种方法，以达到体外快速高效诱变筛选能够长时间定植于动物肠道的益生菌的目的。
6.本发明所提供的基于caco
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2细胞高效诱变筛选肠道定植益生菌的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、制备益生菌株1
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1、将益生菌种划线接种于微生物培养基， 30~41 ℃恒温培养，直至出现单菌落；1
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2、挑取步骤1
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1所述单菌落接种于微生物液体培养基中，30~41℃，180~220 r/min，摇床培养8~12 h，得菌液；1
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3、取步骤1
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2所得菌液转移至灭菌离心管中，3000~5000 r/min，离心5~10 min，弃上清液，得菌沉淀物；1
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4、将步骤1
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3所得菌沉淀物，置于离心管中，加入磷酸缓冲盐溶液重悬，调整菌液浓度至1~2
×
107个/ml，即得菌悬液；步骤2、诱变筛选2
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1、取步骤1
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4所得菌悬液，置于离心管中，加入诱变剂0.2 份（“份”为质量单位，下同），避光，常温静置30~40分钟，即得诱变菌液；
2
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2、取步骤2
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1所得诱变菌液，避光，3000~5000 r/min，离心5~10 min，去除上清液，即得诱变菌沉淀物；2
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3、取步骤2
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2所得诱变菌沉淀物，避光，加入磷酸缓冲盐溶液重悬，3000~5000 r/min离心5~10 min，去除上清液，即得诱变后菌沉淀物；步骤3、基于体外模拟肠道环境耐受性筛选3
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1、制备模拟胃酸胆盐筛选液；3
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2、接种步骤2
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3所得诱变后菌沉淀物于步骤3
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1所述模拟胃酸胆盐筛选液中，37~41℃，摇菌培养18~24h，即得胃酸胆盐筛选菌液；3
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3、取步骤3
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2所得胃酸胆盐筛选菌液，37~41℃，3000~5000 r/min，离心5~10 min，去除上清液，加入磷酸缓冲盐溶液重悬，即得胃酸胆盐筛选后菌液；步骤4、基于caco
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2细胞模型黏附性筛选4
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1、caco
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2细胞活化及传代；4
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2、使用血球计数板计数，并用细胞培养基调整caco
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2细胞浓度为1~2
×
105个/ml，接种于细胞培养皿中，37~41℃，5% co2培养15~20天，每周换细胞培养液1~2次，至显微镜检可见典型的肠细胞分化特征；4
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3、取步骤3
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4所得胃酸胆盐筛选后菌液加入到步骤4
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2所述细胞培养皿中，轻柔混匀，37~41℃，5% co2培养，培养时间至少大于筛选黏附caco
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2细胞的时间，每隔5h用细胞培养基轻柔清洗细胞；4
‑
4、培养结束后，去除培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗细胞；用细胞刮勺剥离步骤4
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3的caco
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2细胞，刮取得到的益生菌和caco
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2细胞的结合体接种于微生物液体培养基中，30~41℃，180~220 r/min，摇床培养8~12 h，即得细胞筛选后菌液；4
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5、用接种环蘸取步骤4
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4所得的细胞筛选后菌液划线接种于微生物固体培养基，30~41℃恒温培养，直至出现单菌落；4
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6、挑取步骤4
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5所述单菌落培养，并重复步骤1
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步骤4，最终经分子生物学鉴定后保存备用。
7.进一步的，所述诱变剂为1
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甲基
‑3‑
硝基
‑1‑
亚硝基胍。
8.进一步的，所述步骤3
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1中，模拟胃酸胆盐筛选液的制备是这样实现的：取浓盐酸，加磷酸缓冲盐溶液调节ph至2.0，每100 份液体中分别加入1份胃蛋白酶、0.3份牛胆盐混匀，滤器过滤，即得模拟胃酸胆盐筛选液。
9.进一步的，所述益生菌种包括真菌和细菌。
10.进一步的，所述真菌包括酿酒酵母、布拉氏酵母菌、解脂耶氏酵母。
11.进一步的，所述细菌包括乳酸杆菌、双歧杆菌。
12.肠道益生菌发挥益生作用的前提是能够在动物肠道内生存、并长时间滞留在动物肠道内，而不随胃肠蠕动被排除体外，一般认为，在肠道内滞留的时间越长其益生作用越好。基于此结论，诱变筛选长时间定植于动物肠道内的益生菌可以提高益生菌的益生效果。现有技术中普遍采用活体，即动物肠道，来筛选黏附能力强的菌株，需经过微生物接种、宰杀动物、再分离纯化微生物，这种方法实验周期长、效率低、操作繁琐。
13.本方法采用caco
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2细胞进行体外筛选，caco
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2细胞是一种人结肠癌细胞，在细胞培养条件下，能够分化形成类似肠上皮结构，形成连续的单层，具有类似肠上皮的细胞极性
和紧密连接。利用体外模拟胃酸胆盐来筛选出耐胃酸胆盐的变异株，建立caco
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2细胞模型黏附性筛选，通过体外筛选最终获得能长时间定植于动物肠道内的益生菌。
14.微生物具有基因自我修复的特性，通过诱变筛选获得的变异菌株，一部分会在传代几次后基因修复恢复原先的性状，只有连续传代多次始终能保持目的性状的变异菌株才算具有遗传稳定性。
15.本发明所提供的基于caco
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2细胞高效诱变筛选肠道定植益生菌的育种方法，具有以下积极效果：1、本发明通过caco
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2细胞分化的类似肠上皮结构替代动物进行筛选，有效节约了诱变筛选周期，提高诱变效率；2、本发明采用caco
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2细胞替代动物进行诱变筛选育种，极大的缩短了试验周期；3、本发明采用caco
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2细胞不需要宰杀动物从肠道中取目的菌株；4、细胞层面诱变筛选育种比动物层面诱变筛选操作容易、精确性高。
附图说明
16.附图部分公开了本发明具体实施例，其中，图1为本发明的实施例1中caco
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2分化的肠上皮结构；图2为本发明的实施例1中基因序列测序对比图；图3为本发明的实施例1中菌株遗传稳定性示意图。
具体实施方式
17.下面通过实施例并结合附图对本发明进一步的说明。
18.实施例：以布拉氏酵母菌为例1、制备布拉氏酵母菌株布拉氏酵母菌种划线接种于ypd固体培养基，置于37 ℃恒温培养箱中培养，直至出现单菌落，挑取平板上的单菌落接种于装有3 ml ypd液体培养基的试管中，37℃，220 r/min，摇床培养12 h，得菌液。取培养后的菌液1 ml转移至1.5 ml灭菌离心管中， 5000 r/min，离心5 min，弃上清液，加入磷酸缓冲盐溶液重悬，调整菌液浓度为2
×
107个/ml。
19.2、诱变筛选取步骤1浓度为2
×
107个/ml的菌悬液4 ml，置于10 ml离心管中，加入1
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甲基
‑3‑
硝基
‑1‑
亚硝基胍200 mg，避光，常温作用40分钟后，4℃，5000 r/min离心5 min，去除上清液，避光条件下，加入5 ml磷酸缓冲盐溶液清洗管壁，并重悬菌液，5000 r/min离心5 min，去除上清液，即得诱变后布拉氏酵母菌沉淀物。
20.3、基于体外模拟肠道环境耐受性筛选取1 mol/ml的浓盐酸，加磷酸缓冲盐溶液调至ph为2.0，每100 ml液体中分别加入1 g胃蛋白酶、0.3g牛胆盐混匀，用0.2 μm的滤器过滤，即得模拟胃酸胆盐筛选液。接种适量诱变后布拉氏酵母菌沉淀物于模拟胃酸胆盐筛选液中，37℃摇菌培养24h，即得胃酸胆盐筛选菌液。37℃，5000 r/min离心5 min，去除上清液，彻底去除盐酸和胆盐，防止侵害caco
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2细胞，加入磷酸缓冲盐溶液重悬，即得胃酸胆盐筛选后布拉氏酵母菌液。
21.4、基于caco
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2细胞模型黏附性筛选
按照常规方法对caco
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2细胞活化及传代，使用血球计数板计数，并用dmem培养基调整细胞浓度为1
×
105个/ml，接种于细胞培养皿中，37℃，5% co2培养20天，每周更换细胞培养液1~2次，至显微镜检可见典型的肠细胞分化特征。如图1所示，可见 caco
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2 细胞顶部出现了小肠整齐的微绒毛样结构，相邻的细胞之间的顶端出现了紧密连接结构，紧密连接位于两侧的膜上。
22.将步骤3中所得胃酸胆盐筛选后布拉氏酵母菌液加入到上述培养皿中，轻柔混匀，37℃，5% co2培养20h，每隔5h用dmem培养基轻柔清洗细胞。培养结束后，去除培养液，加入2ml磷酸缓冲盐溶液清洗细胞，用细胞刮勺剥离附着在培养皿上的caco
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2细胞，此时益生菌黏附于caco
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2细胞上，将刮取得到的益生菌和caco
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2细胞的结合体接种于装有3 ml ypd液体培养基的试管中，30℃，220 r/min摇床上培养12 h，以实现布拉氏酵母菌扩增，由于caco
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2细胞在ypd液体培养基是不生长的，并且会很快死亡，由此获得细胞筛选后布拉氏酵母菌液。用接种环蘸取细胞筛选后菌液划线接种于ypd固体培养基，37℃培养24h，出现单菌落。挑取单菌落进行pcr反应并用真菌通用引物测序分析，如图2所示，11株菌与标准菌株sbsc比较，其一致性均大于98%，说明筛选的这11株菌均为布拉氏酵母菌。经分子生物学鉴定后的这11株菌重复步骤1
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步骤4，以获取能够稳定遗传目的的性状，重复15次后，编号sd
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9的菌株仍能黏附caco
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2细胞20h，说明此菌株黏附特性能够稳定遗传，布拉氏酵母菌sd
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9为最终获取的目的菌株，如图3所示。
23.需要说明的是，本发明的特定实施方案已经对本发明进行了详细描述，对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围的情况下对它进行的各种显而易见的改变都在本发明的保护范围之内。