原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法及培养试剂盒与流程

1.本发明涉及细胞技术领域，特别是涉及一种原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法及培养试剂盒。


背景技术：

2.黑色素瘤细胞在相关的生物医学研究中是必不可少的，而永生化黑色素瘤细胞系因其易培养、能在体外多代增殖而被广泛应用。但是，由于肿瘤的异质性，不同患者的肿瘤细胞往往具有不同的生物学特征，因而永生化黑色素瘤细胞系并不是可靠的肿瘤研究模型。尤其是肢端黑色素瘤，这是一个具有独特的临床、形态学和遗传学特征的不同于其他皮肤黑色素瘤的亚群。肢端黑色素瘤是非白人人群中黑色素瘤的主要亚型，且占这些人群中所有黑色素瘤的多半以上。与其他黑色素瘤相比，肢端黑色素瘤侵袭力更强，患者生存率更低。大多数皮肤黑素瘤都有基因突变，常见的突变包括braf、nras或nf1突变，但是大多数肢端黑素瘤缺乏这些突变。此外，与其他皮肤黑色素瘤相比，肢端黑色素瘤具有广泛的结构变异和较低的突变负担。因此，永生化黑色素瘤细胞系并不是研究肢端黑色素瘤的理想模型，有必要进行肢端黑色素瘤原代细胞的培养。


技术实现要素：

3.基于此，有必要提供一种简单有效的原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法。
4.一种原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法，包括以下步骤：
5.提供含有肢端黑色素瘤的组织样本；
6.向所述组织样本注射肿瘤靶向造影剂后通过荧光成像确定肿瘤的位置，然后切割得到肿瘤组织块；
7.将所述肿瘤组织块切碎后，加入胶原酶iv消化液和分散酶ii消化液联合消化，收集消化液中的细胞并接种至培养基中进行贴壁培养。
8.本发明的培养方法使用近红外荧光染料吲哚菁绿辅助选取肿瘤组织，根据实体瘤的高通透性和滞留效应(epr效应，即实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性)，吲哚菁绿会在肿瘤部位富集，通过荧光成像能够快速准确地定位肿瘤的位置，从而尽量避免其他组织中其他细胞的干扰。而且，通过研究发现，由于肢端黑色素瘤组织质韧，不易消化，单纯采用物理剪切，肢端黑色素瘤细胞并不能自己从组织块中爬出来进行贴壁生长，因此该常用方法无法得到存活的原代细胞。在物理剪切的基础上，进一步使用胶原酶消化，发现消化时间较久，消化下的细胞依旧不能贴壁存活。通过不断探索研究实验条件，本发明的培养方法改进了消化获得单细胞悬液的方法，最终发现使用胶原酶iv和分散酶ii联合消化效果最好，得到的细胞48h内可以逐渐贴壁，十几天后慢慢开始分裂增殖。采用本发明的培养方法能够快速有效地获得可存活和传代的原代肢端黑色素瘤细胞，为研究相关药物反应和个体化治疗提供更好的工具，有助于促进相关生物学研究的探索和患者分子靶向治疗药物的鉴
定。
9.在一个具体示例中，所述肿瘤靶向造影剂为吲哚菁绿。
10.在其中一个实施例中，在所述消化的步骤中，所述胶原酶iv消化液中胶原酶iv的质量百分比为0.1％～0.3％，所述分散酶ii消化液中分散酶ii的质量百分比为0.05％～0.15％。
11.在其中一个实施例中，在所述消化的步骤中，消化时间为20min～40min。
12.在其中一个实施例中，所述培养基中含有完全培养基、5wt％的胎牛血清、80～120u/ml的青霉素、80～120u/ml的链霉素和1.0～1.5u/ml的制霉菌素。
13.在其中一个实施例中，在所述切碎的步骤之前，还包括以下步骤：将所述肿瘤组织块用洗涤液洗涤，然后用磷酸缓冲液洗涤；所述洗涤液中含有磷酸缓冲液、450～500u/ml的青霉素、450～500u/ml的链霉素和6.0～6.5u/ml的制霉菌素。
14.在其中一个实施例中，在所述切碎的步骤中，将所述肿瘤组织块切成体积小于1立方毫米的碎片。
15.在其中一个实施例中，还包括以下步骤：在所述培养基中培养至贴壁后，采用不含有edta的胰蛋白酶消化液消化细胞，弃去前90s内消化脱落的细胞，将剩余的细胞接种至所述培养基中继续培养。
16.在其中一个实施例中，在所述切割的步骤中，将所述组织样本的表面全部切除。
17.在其中一个实施例中，在所述切碎的步骤之前，所述肿瘤组织块在4℃条件下保存于收集液中；所述收集液中含有完全培养基、5wt％的胎牛血清、180～220u/ml的青霉素、180～220u/ml的链霉素和2.25～2.75u/ml的制霉菌素。
18.本发明还提供了一种原代肢端黑色素瘤细胞的培养试剂盒，包括吲哚菁绿、胶原酶iv消化液、分散酶ii消化液和培养基。
附图说明
19.图1为实施例1的原代肢端黑色素瘤细胞的培养流程示意图；
20.图2为实施例1四个样本的原代肢端黑色素瘤细胞的形态学图片和细胞免疫荧光方法检测蛋白表达图片；其中，图2a为原代肢端黑色素瘤细胞的显微照片，图2b为细胞免疫荧光检测s100的表达阳性的原代黑色素瘤细胞，图2c为细胞免疫荧光检测波形蛋白的表达阳性的原代黑色素瘤细胞。
具体实施方式
21.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
22.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，并非旨在限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
23.术语解释
24.原代细胞是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。
25.肢端黑色素瘤是黑色素瘤的一种亚型，发病与种族有关，有色人种的发病率明显高于白种人，是我国黑色素瘤中最常见的亚型。肢端黑色素瘤最常见的原发部位为足底、足趾、手指末端及甲下等部位，中位发病时间在60～70岁。
26.荧光是光子与分子的相互作用产生的，这种相互过程可以通过雅布隆斯基分子能级图描述：大多数分子在常态下，是处于基态的最低振动能级so，当受到能量(光能、电能、化学能等等)激发后，原子核周围的电子从基态能级so跃迁到能量较高的激发态(第一或第二激发态)，激发态的电子处于高能量状态，不稳定，会通过两种途径释放能量回到基态。一种是以光子形式释放能量的辐射跃迁(包括荧光和磷光过程)，一种是以热能等形式释放能量的非辐射跃迁。通常原子核外电子受到激发从基态so跃迁到激发态si后，会通过非辐射跃迁的方式快速降落在最低振动能级，随后由最低振动能级回到基态，以光子辐射的形式释放出能量，具有这种性质的出射光称为荧光。荧光成像的理论基础是荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定的范围内与荧光素的量成线性关系。荧光成像系统包括荧光信号激发系统(激发光源、光路传输组件)、荧光信号收集组件、信号检测以及放大系统(ccd、pmt)等。
27.本发明一实施方式的原代肢端黑色素瘤细胞的培养方法，包括以下步骤s1～s3：
28.s1、提供含有肢端黑色素瘤的组织样本。
29.s2、向组织样本注射肿瘤靶向造影剂后通过荧光成像确定肿瘤的位置，然后切割得到肿瘤组织块。
30.s3、将肿瘤组织块切碎后，加入胶原酶iv消化液和分散酶ii消化液联合消化，收集消化液中的细胞并接种至培养基中进行贴壁培养。
31.肢端黑色素瘤是一种罕见的黑色素瘤亚型，其治疗仍然具有挑战性，使用原代细胞进行肿瘤生物学和治疗学研究的必要性日益凸显。然而，由于肢端黑色素瘤难以获得可存活和传代的原代细胞，目前还没有原代肢端黑色素瘤细胞培养方法的报道，在此我们提供了一种简单有效的培养方法。
32.本发明的培养方法使用近红外荧光染料吲哚菁绿辅助选取肿瘤组织，根据实体瘤的高通透性和滞留效应(epr效应，即实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性)，吲哚菁绿会在肿瘤部位富集，通过荧光成像能够快速准确地定位肿瘤的位置，从而尽量避免其他组织中其他细胞的干扰。而且，通过研究发现，由于肢端黑色素瘤组织质韧，不易消化，单纯采用物理剪切，肢端黑色素瘤细胞并不能自己从组织块中爬出来进行贴壁生长，因此该常用方法无法得到存活的原代细胞。在物理剪切的基础上，进一步使用胶原酶消化，发现消化时间较久，消化下的细胞依旧不能贴壁存活。通过不断探索研究实验条件，本发明的培养方法改进了消化获得单细胞悬液的方法，最终发现使用胶原酶iv和分散酶ii联合消化效果最好，得到的细胞48h内可以逐渐贴壁，十几天后慢慢开始分裂增殖。采用本发明的培养方法能够快速有效地获得可存活和传代的原代肢端黑色素瘤细胞，为研究相关药物反应和个体化治疗提供更好的工具，有助于促进相关生物学研究的探索和患者分子靶向治疗药物的鉴定。
33.可以理解，本发明的培养方法中是向离体的组织样本注射吲哚菁绿，组织样本可以是来自已经死亡的人体或动物体，因此不属于外科手术方法，本发明的培养方法也不是以治疗为目的，因此也不属于疾病的诊断和治疗方法。
34.在一个具体示例中，肿瘤靶向造影剂为吲哚菁绿。可选地，肿瘤靶向造影剂的注射量根据肿瘤大小一般为0.4ml～0.6ml。
35.在一个具体示例中，胶原酶iv消化液中胶原酶iv的质量百分比为0.1％～0.3％，分散酶ii消化液中分散酶ii的质量百分比为0.05％～0.15％，消化效果最佳。
36.在一个具体示例中，在消化的步骤中，消化时间为20min～40min，消化效果最佳。
37.在一个具体示例中，培养基中含有完全培养基、5wt％的胎牛血清、80～120u/ml的青霉素、80～120u/ml的链霉素和1.0～1.5u/ml的制霉菌素。肢端黑色素瘤多发生于四肢，而这些部位大多有大量真菌生长，因而如何防止真菌的污染很是重要。单纯使用含抗生素的磷酸缓冲液(pbs)洗涤组织，培养几天后仍会出现大量真菌污染，因此在培养基中加入80～120u/ml的青霉素、80～120u/ml的链霉素和1.0～1.5u/ml的制霉菌素进行培养，可以更有效地防止真菌污染。
38.在一个具体示例中，在切碎的步骤之前，还包括以下步骤：将肿瘤组织块用洗涤液洗涤，然后用磷酸缓冲液洗涤；洗涤液中含有磷酸缓冲液、450～500u/ml的青霉素、450～500u/ml的链霉素和6.0～6.5u/ml的制霉菌素。如此，通过洗涤液的洗涤可以更好地防止真菌污染。
39.在一个具体示例中，在切碎的步骤中，将肿瘤组织块切成体积小于1立方毫米的碎片。如此，可以增加酶消化液与组织块的接触面积，提高消化的效率。
40.在一个具体示例中，培养方法还包括以下步骤：在培养基中培养至贴壁后，采用不含有edta的胰蛋白酶消化液消化细胞，弃去前90s内消化脱落的细胞，将剩余的细胞接种至培养基中继续培养。从前一步骤获得的细胞中可能含有成纤维细胞，为了去除成纤维细胞，采用不含edta的胰蛋白酶消化液消化细胞，原代黑色素瘤细胞比成纤维细胞粘附性更强，因此丢弃前90s内消化的细胞，消化传代时连续重复几次上述操作可以获得更高纯度的黑色素瘤原代细胞。
41.在一个具体示例中，在切割的步骤中，将组织样本的表面全部切除。尽管肢端黑色素瘤组织很珍贵且大多体积很小，但为了防止真菌污染，在尽量保留更多组织的前提下最好切除组织样本的整个表面。
42.在一个具体示例中，在切碎的步骤之前，肿瘤组织块在4℃条件下保存于收集液中；收集液中含有完全培养基、5wt％的胎牛血清、180～220u/ml的青霉素、180～220u/ml的链霉素和2.25～2.75u/ml的制霉菌素。
43.本发明一实施例的原代肢端黑色素瘤细胞的培养试剂盒，包括吲哚菁绿、胶原酶iv消化液、分散酶ii消化液和培养基。
44.在一个具体示例中，胶原酶iv消化液中胶原酶iv的质量百分比为0.1％～0.3％，分散酶ii消化液中分散酶ii的质量百分比为0.05％～0.15％。
45.在一个具体示例中，培养基的配方为：完全培养基，添加5wt％的胎牛血清、80～120u/ml的青霉素、80～120u/ml的链霉素和1.0～1.5u/ml的制霉菌素。
46.下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
47.实施例1
48.1.1患者样本来源
49.所有的黑色素瘤样本均来自湘雅医院皮肤科。所有入选患者均提供书面知情同意书。这项研究得到了相关伦理审查委员的批准。
50.1.2试剂制备
51.洗涤液(wash buffer)：磷酸盐缓冲液(pbs)，添加500u/ml青霉素、500u/ml链霉素和6.25u/ml制霉菌素(genview，cat ga3503，中国)。
52.收集液：培养基，添加5％胎牛血清(gibco，cat 31985070，美国)和抗生素(200u/ml青霉素、200u/ml链霉素和2.5u/ml制霉菌素)。
53.培养基：完全培养基，添加5％胎牛血清(gibco，cat 10099-141)和抗生素(100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和1.25u/ml制霉菌素)。
54.1.3样本的获得
55.原代肢端黑色素瘤细胞的培养流程示意图如图1所示。在肿瘤组织周围注射近红外荧光染料吲哚菁绿，根据实体瘤的高通透性和滞留效应(epr效应，即实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性)，吲哚菁绿会在肿瘤部位富集，接着使用近红外荧光成像系统成像：
56.(1)开机后先确认显示屏、主机和录像模块是否正常运行。
57.(2)打开led开关。
58.(3)调节白平衡(在彩色状态下，先打开页面右下方的“自曝”按钮，然后手柄对着白色纱布约10cm左右的距离，点击白平衡完成对白操作，然后再关闭“自曝”)。
59.(4)调节彩色及荧光状态的参数：
60.彩色状态：曝光参数约1.954，如果背景操作光线较暗，可以再升高一个档。红增益参数约18左右。其他参数保持不动。
61.荧光状态：曝光参数约25左右。灰度起点一般是降低荧光灶点(浮影)的，如果浮影很大，灰度起点的参数值相应提高。灰度终点约150左右，根据荧光是否过曝再调节。
62.(5)需要看荧光时：第一步先打开显示屏靠左下方的“led准备就绪”，第二步踩下脚踏(持续踩住脚踏)，第三步手柄对准术野目标区域观察。
63.(6)此时黑素瘤组织部分发出绿色荧光，根据荧光部位的提示，用无菌剪刀切取荧光最强的的肿瘤细胞聚集部位，获取活性高，纯度更高的肿瘤组织块。
64.1.4样品运输和处理
65.肿瘤组织取出后放入50ml离心管内，加10ml收集液，然后在4℃下立即运送到实验室。无菌操作台中切除表皮部分，由于肿瘤组织稀少，切除时要尽可能多地保留无菌的样本。然后，将组织块在洗涤液中洗涤五次，再在pbs中洗涤一次。
66.1.5肢端黑色素瘤组织单细胞悬液的制备
67.为了获得单个黑色素瘤细胞悬液，我们首先用无菌剪刀和镊子移除脂肪和坏死组织，并在无菌细胞培养皿上将黑色素瘤组织切成体积小于1mm3的碎片。之后向其中加入含
有collagenase(胶原酶)iv(sigma,cat#v900893,usa)and dispase(分散酶)ii(sigma,cat#d4693,usa)的消化液，在37摄氏度的细胞培养箱中孵育约30分钟。然后通过无菌细胞过滤器过滤细胞悬浮液，并将收集到的液体在室温下以1000rpm离心10分钟。弃掉上清，收集细胞沉淀，加入opti-mem完全培养基2ml，在3.5cm培养皿中重悬细胞，并放入37℃和5％的二氧化碳中培养。2天后，取出培养皿，用pbs清洗细胞并每隔两天更换一次新的培养基，直到原代细胞生长融合。
68.1.6细胞培养和细胞纯化
69.从上述步骤获得的细胞可能含有成纤维细胞。为了去除成纤维细胞，采用不含edta的胰蛋白酶消化液消化细胞，原代黑色素瘤细胞比成纤维细胞粘附性更强，因此丢弃前90s内消化的细胞，消化传代时连续重复几次上述操作即可以获得更高纯度的黑色素瘤原代细胞。
70.2.原代黑色素瘤细胞的验证
71.为了确认我们获得的细胞是否是黑色素瘤细胞，我们用s100和波形蛋白标记细胞进行荧光分析。s100蛋白家族是被认为与黑色素瘤的发生和转移有关的蛋白。s100和波形蛋白也都是公认的相对特异的黑色素瘤诊断标志物。图2为原代肢端黑色素瘤细胞的形态学和使用细胞免疫荧光的方法检测s100和波形蛋白的表达结果图，比例尺为200μm。图2a为原代肢端黑色素瘤细胞图片，图2b为细胞免疫荧光检测s100的表达阳性的原代黑色素瘤细胞，图2c为细胞免疫荧光检测波形蛋白的表达阳性的原代黑色素瘤细胞。如图2b和2c所示，结果显示获得的原代细胞中s100和波形蛋白表达呈阳性。
72.为了检测原代肢端黑色素瘤细胞的突变情况，我们使用qiaamp dna mini kit(qiagen gmbh,cat#51304,germany)试剂盒从原代肢端黑色素瘤细胞中提取dna，并将dna进行全外显子测序分析。如表1所示，为四个组织样本来源患者的临床特点。如表2所示，为原代黑色素瘤细胞的分子分型，如表3所示，为原代黑色素瘤细胞突变具体信息。结果显示只有一个原代细胞株有kras突变，而其他所有的原代细胞都有tp53突变(表2)，主要表现为16号染色体上的tp53重复或缺失(表3)。
73.表1
[0074][0075]
表2
[0076]
原代细胞编号brafnrashraskraskitnf1pik3catp53xyam-1
-------
xyam-2
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xyam-3
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xyam-4
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[0077]
表3
[0078][0079]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0080]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。