腺苷A1/A的制作方法

腺苷a1/a
2a
受体双重拮抗剂
技术领域
1.本发明涉及小分子药物领域，更具体而言，涉及一种腺苷a1/a
2a
受体双重拮抗剂及其在治疗疾病中的应用。


背景技术：

2.腺苷是多种生理活动中普遍存在的调节剂，特别是在心血管和神经系统中，通过与特异性细胞表面受体的相互作用，调节多种生理功能。已知的腺苷受体有四种亚型，分别为a1、a
2a
、a
2b
、a3，属于g蛋白偶联受体家族。腺苷a1和a3受体通过与抑制腺苷酸环化酶的g蛋白偶联来下调细胞camp水平，而腺苷a
2a
和a
2b
受体通过与活化腺苷酸环化酶的g蛋白偶联上调细胞内的camp水平。通过这些受体，腺苷调控广泛的生理功能。
3.一项流行病学研究表明，咖啡或咖啡因的摄入与帕金森(pd)发生风险降低之间存在关联(ross等人，association of coffee and caffeine intake with the risk of parkinson disease.jama-j am med assoc.2000，283(20)：2674-2679.)，咖啡因是一种黄嘌呤衍生物，是非选择性的a1和a
2a
受体拮抗剂。
4.对于pd的治疗，a
2a
受体亚型受到广泛关注。a
2a
受体拮抗剂的抗帕金森效应涉及多种不同的机制。腺苷a
2a
受体位于纹状体内，更具体地说是在纹状脑啡肽的gaba能神经元中，该神经元伸向苍白球并构成间接途径。在gaba能级纹状体神经节神经元中，a
2a
受体与多巴胺d2受体共表达。刺激a
2a
受体可以降低d2受体的结合亲和力并改变基底神经节内gaba、乙酰胆碱和谷氨酸的释放，从而影响参与运动行为调节的关键递质。另外，腺苷a
2a
受体可对纹状体苍白球神经元进行阻断，这将抑制它们的过度活动，并恢复纹状体黑质和纹状体苍白球神经元之间的平衡，从而减轻丘脑皮质的活动，缓解帕金森病的运动减退症状。a
2a
受体拮抗剂还可缓解抑郁，这是pd的非运动症状。研究中发现患有重度抑郁症的患者血清ada活性降低(因此腺苷基调升高)，这与疾病的严重程度呈负相关(elg
ü
n等，dipeptidyl peptidase iv and adenosine deaminase activity：decrease in depression.psychoneuroendocrinology.1999，24：823-832.)。实验证明腺苷a
2a
受体拮抗剂kw-6002可逆转尾部悬吊和强迫游泳测试中行为绝望的迹象，具有抗抑郁活性(yamada等，antidepressant-like activity of the adenosine a
2a receptor antagonist，istradefylline(kw-6002)，in the forced swim test and the tail suspension test in rodents.pharmacol biochem be.2013，114：23-30.)。此外，流行病学和实验数据表明，腺苷a
2a
受体拮抗剂具有神经保护作用。
5.腺苷a1受体在中枢神经系统内分布更广泛，a1受体在包括海马和前额叶皮层在内的大脑区域高表达，这些区域是情感和认知功能的重要区域，a1受体拮抗剂可增加乙酰胆碱和谷氨酸的释放，并改善认知功能障碍。实验表明a1拮抗剂可改善由东莨菪碱引起的认知障碍(maemoto等，pharmacological characterization of fr19492l，a new potent，selective，orally active antagonist for central adenosine alreceptors.j pharmacol sci.2004，96：42-52.)。
6.目前已经在动物中研究了几种a1/a
2a
受体双重拮抗剂，它们不仅显示出改善运动障碍的功效，而且还显示出增强认知的功效，同时通过a
2a
受体的拮抗作用发挥神经保护作用，但由于安全性等问题，未能作为药物进行进一步开发(mihara等，pharmacological characterization of a novel，potent adenosine a
1 and a
2a receptor dual antagonist，5-[5-amino-3-(4-fluorophenyl)pyrazin-2-yl]-1-isopropylpyridine-2(1h)-one(asp5854)，in models of parkinson
′
s disease and cognition.j pharmacol exp ther.2007，323(2)：708-719.shook等，in vivo characterization of a dual adenosine a
2a
/a
1 receptor antagonist in animal models of parkinson
′
s disease.j med chem.2010，53(22)：8104-8115.)。


技术实现要素：

[0007]
本发明建立了深度学习(deep learning)dnn、cnn模型、基于多配体的药效团模型、分子对接模型，并首次利用多级筛选的方法在chemdiv数据库中筛选得到化合物d481-2135(methanone，[5-amino-3-(2-chlorophenyl)-1h-1，2，4-triazol-1-yl](3-methoxyphenyl)-)(cas r egistry number 1031578-47-8)，体外生物实验发现其具有腺苷a1/a
2a
受体双重拮抗活性。化合物d481-2135与腺苷a1受体结合(binding assay)的ic
50
为0.14μm，ki为0.0644μm；与腺苷a
2a
受体结合的ic
50
为0.06μm，ki为0.051μm。化合物d481-2135腺苷a1受体功能实验(a
1 antagonist camp assay)的ic
50
为0.1669μm，其腺苷a
2a
受体功能实验(a
2a antagonist camp assay)的ic
50
为0.3613μm，证明该化合物是选择性的腺苷a1/a
2a
受体双重拮抗剂，可用于治疗a1/a
2a
受体相关疾病，特别是帕金森，以及可作为神经退行性疾病例如中风，癫痫和阿尔茨海默氏病的神经保护剂。
[0008]
本发明的化合物d481-2135结构如附图1所示。
[0009]
d481-2135分子式：c
16h13
cln4o2。
[0010]
d481-2135分子量：328.75。
附图说明
[0011]
附图1.化合物d481-2135的结构式；
[0012]
附图2.结合实验中化合物d481-2135对腺苷a1受体的抑制率曲线；
[0013]
附图3.结合实验中化合物d481-2135对腺苷a
2a
受体的抑制率曲线；
[0014]
附图4.功能实验中化合物d481-2135对腺苷a1受体的抑制率曲线；
[0015]
附图5.功能实验中化合物d481-2135对腺苷a
2a
受体的抑制率曲线。
具体实施方式
[0016]
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不意于限制本发明的保护范围。
[0017]
本发明利用多级虚拟筛选技术，首先利用已有的腺苷a1以及a
2a
受体拮抗剂数据构建深度学习(deep learning)模型，使用深度神经网络(dnn)以及卷积神经网络(cnn)对chemdiv数据库进行第一级筛选，挑选出dnn以及cnn筛选结果中共有的分子进入下一轮筛选；第二部分为药效团模型筛选，采用基于多配体药效团模型，使用已知的腺苷a1/a
2a
受体
拮抗剂分子建立药效团模型，经过评价选用最优的两个药效团模型对上一步结果进行筛选，保留两组筛选结果中共有的分子；最后利用腺苷a1受体的晶体结构(pdb id：5n2s)以及a
2a
受体的晶体结构(pbd id：5iu4)进行基于分子对接的第三级筛选。将第三级筛选得到的化合物d481-2135进行结合活性测试(a1/a
2a binding assay)和功能活性测试(a1/a
2a antagonist camp assay)。
[0018]
化合物d481-2135结合活性测试实验过程：
[0019]
一、a
1 binding assay：
[0020]
1.试剂配制
[0021]
a)反应缓冲液：50mm tris-hcl ph 7.4，10mm mgcl2，1mm edta，1μg/ml adenosine deaminase，4℃储存。
[0022]
b)洗液：50mm tris-hcl ph 7.4，154mm nacl，4℃储存。
[0023]
c)0.5％pei溶液：100ml ddh2o中加入0.5ml pei，4℃储存。
[0024]
2.实验过程
[0025]
a)用echo550加入250nl化合物到opti-plate中。
[0026]
b)总反应体系是50μl，每个孔中加入1μl a1膜和[3h]-dpcpx(终浓度2.5nm)和50μl反应缓冲液到opti-plate中。
[0027]
c)在27℃孵育50min。
[0028]
d)用0.5％pei处理unifilter-96 gf/b板，每孔加入150ul的0.5％pei，在4℃预孵育1.5小时。
[0029]
e)用洗液洗unifilter-96 gf/b板2次，每次每孔1ml洗液。
[0030]
f)将孵育后的反应液转移到unifilter-96 gf/b板上，冲洗4次。
[0031]
g)洗后的unifilter-96 gf/b板27℃烘干10分钟。
[0032]
h)每孔加入40μl ultima gold闪烁液，使用top count读数。
[0033]
3.数据分析
[0034]
a)kd值通过graphpad prism 6软件作图获得。.
[0035]
b)ic
50
通过使用xlfit 5.3.1分析数据获得，x轴是化合物浓度，y轴是cpm值。
[0036]
化合物ic
50
的拟合曲线：
[0037]
y＝bottom (top-bottom)/(1 10^((logic
50-x)*hillslope))
[0038]
x：log of cpd concentration；y：percent inhibition(％inh)
[0039]
top and bottom：plateaus in same units as y
[0040]
logic
50
：same log units as x
[0041]
hillslope：slope factor or hill slope
[0042]
c)ki＝ic
50
/(1 (c)/kd)
[0043]
二、a
2a binding assay：
[0044]
1.试剂配制
[0045]
a)反应缓冲液：50mm tris-hcl ph 7.4，10mm mgcl2，1mm edta，1μg/ml adenosine deaminase，4℃储存。
[0046]
b)洗液：50mm tris-hcl ph 7.4，154mm nacl，4℃储存。
[0047]
c)0.5％pei溶液：100ml ddh2o中加入0.5ml pei，4℃储存。
[0048]
2.实验过程
[0049]
a)总反应体系为500μl，每个孔中加入100μl的反应缓冲液和5μl稀释后的化合物(1％dmso)到96深孔板中。
[0050]
b)每个孔中加入1μl a
2a
膜(1u/μl)和299μl反应缓冲液到96孔板中，600rpm震荡5min混匀。
[0051]
c)每个孔中加入100μl的反应缓冲液和[3h]-zm 241385(终浓度为0.5nm)混合液到反应体系中，600rpm震荡5min混匀。
[0052]
d)在27℃孵育1.5h。
[0053]
e)用0.5％pei处理unifilter-96 gf/b板，每孔加入150ul的0.5％pei，在4℃预孵育1.5小时。
[0054]
f)用洗液洗unifilter-96 gf/b板2次，每次每孔1ml洗液。
[0055]
g)将孵育后的反应液转移到unifilter-96 gf/b板上，冲洗4次。
[0056]
h)洗后的unifilter-96 gf/b板27℃烘干10分钟。
[0057]
i)每孔加入40μl ultima gold闪烁液，使用top count读数。
[0058]
3.数据分析
[0059]
a)kd值通过graphpad prism 6软件作图获得。.
[0060]
b)ic
50
通过使用xlfit 5.3.1分析数据获得，x轴是化合物浓度，y轴是cpm值。
[0061]
化合物ic
50
的拟合曲线：
[0062]
y＝bottom (top-bottom)/(1 10^((logic
50-x)*hillslope))
[0063]
x：log of cpd concentration；y：percent inhibition(％inh)
[0064]
top and bottom：plateaus in same units as y
[0065]
logic
50
：same log units as x
[0066]
hillslope：slope factor or hill slope
[0067]
c)ki＝ic
50
/(1 (c)/kd)
[0068]
化合物d481-2135功能活性测试实验过程：
[0069]
一、a
1 antagonist camp assay
[0070]
1.细胞培养和接种：
[0071]
a)cho-adenosine a1稳定细胞株培养于37℃，5％co2的细胞完全培养基中。
[0072]
b)实验缓冲液：1x hbss，0.1％bsa，20mm hepes，100nm ibmx。
[0073]
c)细胞接种：将细胞重悬于实验缓冲液中，每孔接种8000个细胞于384孔(6007680-50，pe)检测板中。
[0074]
2.化合物拮抗剂活性检测：
[0075]
a)用实验缓冲液制备8x待测化合物工作液(化合物编号：d481-2135)。
[0076]
b)添加2.5μl 8x待测化合物工作液至上述384孔检测板中，于37℃孵育10分钟。
[0077]
c)用实验缓冲液制备forskolin(8μm)和neca(40nm)混合物。
[0078]
d)添加2.5μl forskolin和neca的混合物至检测板中，于37℃孵育30min。
[0079]
e)用裂解缓冲液制备20x camp-d2和20x anti-camp-eu
3
检测试剂。
[0080]
f)向检测板中加入10μl camp-d2，随后加入10μl anti-camp-eu
3
。
[0081]
g)将检测板于室温孵育1小时。
[0082]
h)利用envision 2104酶标仪收集波长为665nm和615nm的htrf信号。
[0083]
3.数据分析：
[0084]
a)z’factor＝1-3*(sdmax sdmin)/(meanmax-meanmin)；
[0085]
b)cvmax＝(sdmax/meanmax)*100％；
[0086]
c)cvmin＝(sdmin/meanmin)*100％；
[0087]
d)s/b＝singal/background；
[0088]
e)使用graphpad的非线性拟合公式计算化合物ec
50
/ic
50
：
[0089]
y＝bottom (top-bottom)/(1 10^((logec
50
/ic
50-x)*hillslope))
[0090]
x：log of compound concentration；y：％activation or inhibition％.
[0091]
二、a
2a antagonist camp assay
[0092]
1.细胞培养及材料：
[0093]
a)hek293
--
adenosine a
2a
稳定细胞株培养于37℃，5％co2的细胞完全培养基中。
[0094]
b)实验缓冲液：1x hbss，0.1％bsa，20mm hepes，100nm ibmx。
[0095]
c)细胞接种：将细胞重悬于实验缓冲液中，每孔接种15000个细胞于384孔(6007680-50，pe)检测板中。
[0096]
2.化合物拮抗剂活性检测：
[0097]
a)用实验缓冲液制备8x待测化合物工作液(化合物编号：d481-2135)。
[0098]
b)添加2.5μl 8x待测化合物工作液至上述384孔检测板中，于37℃孵育10分钟。
[0099]
c)用实验缓冲液制备8xneca(12nm)混合物。
[0100]
d)添加2.5μl 8x neca的混合物至检测板中，于37℃孵育30min。
[0101]
e)用裂解缓冲液制备20x camp-d2和20x anti-camp-eu
3
检测试剂。
[0102]
f)向检测板中加入10μl camp-d2，随后加入10μl anti-camp-eu
3
。
[0103]
g)将检测板于室温孵育1小时。
[0104]
h)利用envision 2104酶标仪收集波长为665nm和615nm的htrf信号。
[0105]
3.数据分析：
[0106]
a)z’factor＝1-3*(sdmax sdmin)/(meanmax-meanmin)；
[0107]
b)cvmax＝(sdmax/meanmax)*100％；
[0108]
c)cvmin＝(sdmin/meanmin)*100％；
[0109]
d)s/b＝singal/background；
[0110]
e)使用graphpad的非线性拟合公式计算化合物ec
50
/ic
50
：
[0111]
y＝bottom (top-bottom)/(1 10^((logec
50
/ic
50-x)*hillslope))
[0112]
x：log of compound concentration；y：％activation or inhibition％
[0113]
参考文献
[0114]
[1]ross，g.w.，abbott，r.d.，petrovitch，h.，et al.association of coffee and caffeine intake with the risk of parkinson disease[j].jama-j am med assoc.2000，283(20)：2674-2679.
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[2]elg
ü
n，s.，elg
ü
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[3]yamada，k.，kobayashi，m.，mori，a.，et al.antidepressant-like activity of the adenosine a
2a receptor antagonist，istradefylline(kw-6002)，in the forced swim test and the tail suspension test in rodents[j].pharmacol biochem be.2013，114：23-30.
[0117]
[4]maemoto，t.，tada，m.，mihara，t.，et al.pharmacological characterization of fr194921，a new potent，selective，orally active antagonist for central adenosine a
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[5]mihara，t.，mihara，k.，yarimizu，j.，et al.pharmacological characterization of a novel，potent adenosine a
1 and a
2a receptor dual antagonist，5-[5-amino-3-(4-fluorophenyl)pyrazin-2-yl]-1-isopropylpyridine-2(1h)-one(asp5854)，in models of parkinson
′
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[0119]
[6]shook，b.c.，rassnick，s.，osbome，m.c.，et al.in vivo characterization of a dual adenosine a
2a
/a
1 receptor antagonist in animal models ofparkinson
′
s disease[j].j med chem.2010，53(22)：8104-8115.