一种预防或治疗心肌损伤的药物组合物的制作方法

1.本发明属于药物领域，具体涉及一种预防或治疗心肌损伤的药物组合物及其制备方法、药物制剂和用途。


背景技术：

2.心血管疾病是一类严重影响人类健康的疾病，是我国国民健康的第一杀手。据推算，我国约有3.3亿心血管病人。心血管疾病会诱发多种疾病，尤其是心肌损伤等重大疾病。心肌损伤是由冠心病、心肌缺血、心肌梗死等原因导致心肌细胞供血或供氧不足，从而造成心肌细胞受损或者坏死。由于成熟心肌细胞不能再生,随着心肌细胞的坏死,心脏功能不断下降，病情最终走向心力衰竭终末期。近年来，如何有效改善各种原因导致的心肌损伤的研究方兴未艾，涌现出了药物干预、过饱和氧疗、超低温疗法等多种治疗方法，但是这些方法能够真正有效运用于临床实践的却乏善可陈。因此，寻找有效预防、改善或治疗各种原因导致的心肌损伤的手段和方法，仍是目前心肌保护领域的研究热点。
3.长期以来，中医临床多采用益气活血的中药复方预防和治疗包括心肌梗死在内的心肌损伤疾病。传统中药复方临床疗效明确，体现着中医宏观、辨证、多成分、多靶的特点。但由于其化学成分复杂，主要药效成分不明确，药效成分与作用机制关系不明，多靶点干预机制尚未全面阐释等一系列问题，制约了中药复方的临床精准用药。中药活性单体化合物则体现着西医微观、结构清晰、靶点精准等思维方式。以青蒿素和三氧化二砷等为代表的小分子药物是中医药献给世界的礼物。将中药复方和单体化合物药物的优势互补，以来自复方的单体小分子结合中医药理论进行配伍，深入研究其协同互补的作用机制，不仅能够解决中药复方有效成分不清、毒副作用不明、作用机制不清等问题，也能够为中药复方配伍理论的阐明提供依据，为分子配伍创新药物的研发奠定基础。
4.活性小分子组合物由复方基本物质单位的小分子化合物组成，一方面通过将物质基础精简到最底层、最明确的单体化合物后对两者的配伍方式和比例进行研究，达到有助于剖析有效组分配伍机理及其治疗疾病的作用机制的目的；另一方面，也可将小分子配伍的药理作用与有效组分配伍进行对比，是否能达到与原方相近或更优的药效。活性小分子组合物配伍是对应用较为广泛、疗效显著的中药复方进行深入的研究。安全、有效并具有特定功效是中药配伍所追求的主要目标。发现化学成分及药理机制明确的单体小分子，有望为中药配伍研究带来突破性的进展。
5.三七(notoginseng)和红花(safflower)均为常用益气、活血的代表性中药，具有散瘀止血、活血通经的功效，在中医临床上被广泛用于心血管疾病的防治。本发明人前期以三七和红花中的主要有效组分——三七总皂苷(notoginseng total saponins,ns)和红花总黄酮(safflower total flavonoids,sf)进行配伍研究，发现ns和sf配伍后对治疗心肌缺血大鼠具有明显的协同增效作用，并将其组成了三七
‑
红花有效组分复方新药(combination of ns and sf,cns)。此外，还通过lc/ms分析手段对ns和sf中的化学成分进行了系统研究，对给予cns的大鼠的一系列药代动力学参数进行了测定和计算，为进一步探
究cns药对的配伍规律奠定了基础。
6.本发明在本发明人前期工作的基础上，从中药复方cns的单味药材红花三七中选择其代表性的活性单体化合物组成分子配伍并进行深入研究，首次发现了由羟基红花黄色素a(hsya)和人参皂苷rb1(grb1)组成的药物组合物在预防或治疗心肌损伤方面具有显著的协同增效作用，有较好的临床应用前景。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，实现采用现代药物研究方法对天然产物进行开发利用，结合大量药效学实验筛选，提供了一种具有协同增效作用的预防或治疗心肌损伤的药物组合物，为临床上能够安全、有效、方便、经济地预防或治疗心肌损伤提供一种新思路。
8.具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
9.在第一个方面中，本发明提供了一种预防或治疗心肌损伤的药物组合物，所述药物组合物包含羟基红花黄色素a和人参皂苷rb1。
10.作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述羟基红花黄色素a与所述人参皂苷rb1的重量比为10：1
‑
1：10。
11.作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述羟基红花黄色素a与所述人参皂苷rb1的重量比选自10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。
12.优选地，所述羟基红花黄色素a与所述人参皂苷rb1的重量比选自1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。
13.更优选地，所述羟基红花黄色素a与所述人参皂苷rb1的重量比选自1：3、1：4、1：5或1：6。
14.作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述药物组合物由羟基红花黄色素a和人参皂苷rb1组成，且所述羟基红花黄色素a与所述人参皂苷rb1的重量比选自1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。
15.更优选地，所述羟基红花黄色素a与所述人参皂苷rb1的重量比选自1：3、1：4、1：5或1：6。
16.最优选地，所述羟基红花黄色素a与所述人参皂苷rb1的重量比选自1：5。
17.作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述心肌损伤选自冠心病、心肌肥大、心绞痛、心力衰竭、高血压、心律不齐、肺源性心脏病、心肌梗死、心肌细胞炎症、心肌缺血、心肌纤维化、心肌缺血再灌注，以及由化疗药物、细菌、病毒等引起的心肌损伤。
18.在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物的制备方法，具体为：将上述第一个方面所述的各种活性成分混合。
19.在第三个方面中，本发明提供了一种预防或治疗心肌损伤的药物制剂，所述药物制剂由上述第一个方面所述的药物组合物与药学上可接受的载体混合制成。
20.作为可选的方式，在上述药物制剂中，所述药物制剂口服制剂或注射剂。
21.优选地，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。
22.更优选地，所述药物制剂为片剂或胶囊剂。
23.在第四个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物或者上述第三个方面所述的药物制剂在制备用于预防或治疗心肌损伤的药物中的用途。
24.作为可选的方式，在上述用途中，所述心肌损伤选自冠心病、心肌肥大、心绞痛、心力衰竭、高血压、心律不齐、肺源性心脏病、心肌梗死、心肌细胞炎症、心肌缺血、心肌纤维化、心肌缺血再灌注，以及由化疗药物、细菌、病毒等引起的心肌损伤。
25.本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
26.(1)本发明结合我国在天然产物研究方面的优势，首次发现了由羟基红花黄色素a和人参皂苷rb1组成的药物组合物在预防或治疗心肌损伤方面具有显著的协同增效作用，为中医药现代化提供了一种新思路。
27.(2)经药理学实验证明，本发明药物组合物在巨噬细胞介导的心肌炎症损伤模型和iso诱导的小鼠心肌缺血模型上针对与心肌损伤相关的各项检测指标表现出显著的协同增效作用，且无毒副作用，有较好的临床应用前景。
28.(3)本发明使用的各种天然产物单体来源广泛，均能够通过成熟方法生产，使得本发明药物组合物便于工业化大规模生产。此外，通过加入可药用载体将本发明药物组合物制成常规口服制剂或注射剂，使药物疗效稳定，且使用方便。
附图说明
29.图1：心肌炎症损伤模型对红花中小分子的活性筛选结果。(a)槲皮素、(b)山柰酚、(c)羟基红花黄色素a(hsya)、(d)芦丁、(e)山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷、(f)山柰酚
‑3‑
o
‑
槐糖苷、(g)6
‑
羟基山柰酚
‑
3,6,7
‑
三
‑
o
‑
葡萄糖苷、(h)6
‑
羟基芹菜素
‑6‑
o
‑
葡萄糖
‑7‑
o
‑
葡萄糖醛酸苷和(i)6
‑
羟基山柰酚
‑
3,6
‑
二
‑
o
‑
葡萄糖苷进行浓度梯度筛选。相对于空白组
#
p<0.05，
##
p<0.01；相对于模型组
*
p<0.05，
**
p<0.01。
30.图2：心肌炎症损伤模型对三七中小分子的活性筛选结果。心肌炎症细胞模型下对(a)三七皂苷r1(ngr1)、(b)人参皂苷rb1(grb1)、(c)人参皂苷rg1(grg1)、(d)人参皂苷re(gre)、(e)人参皂苷rd(grd)进行浓度梯度筛选。相对于空白组
#
p<0.05，
##
p<0.01；相对于模型组
*
p<0.05，
**
p<0.01。
31.图3：体内药代动力学的最大血药浓度为依据时配伍的活性筛选结果。(a)hsya:ngr1＝29:1，hsya* ngr1代表以hsya的ce为基准，按比例计算出对应的ngr1的浓度进行配伍；hsya ngr1*代表以ngr1的ce为基准，按比例计算出对应的hsya的浓度进行配伍，下同；(b)hsya:grb1＝1:5；(c)hsya:grg1＝19:1；(d)hsya:gre＝60:1。相对于对照组
#
p<0.05，
##
p<0.01；相对于模型组
*
p<0.05，
**
p<0.01；相对于配伍组
&&
p<0.01。
32.图4：生药含量为配比依据时配伍的活性筛选结果。(a)hsya:ngr1＝1:1；(b)hsya:grb1＝1:5；(c)hsya:grg1＝1:4；(d)hsya:gre＝1:0.6；(e)25μm hsya 100μm grg1与25μm hsya 125μm grb1的抗心肌炎症损伤作用比较。相对于对照组
##
p<0.01；相对于模型组
*
p<0.05，
**
p<0.01；相对于配伍组
&&
p<0.01。
33.图5：hsya与grb1配伍后的增效研究。(a)活性小分子单独及配伍后的抗心肌炎症的细胞活力，hsya：给予20μm hsya；grb1：给予100μm grb1；hsya
‑
grb1：同时给予20μm hsya和100μm grb1；(b)活性小分子单独及配伍后的量效关系比较。相对于对照组
##
p<0.01；相对于模型组
**
p<0.01；相对于hsya
‑
grb1组
&
p<0.05，
&&
p<0.01。
34.图6：心肌炎症损伤模型下hsya
‑
grb1配伍对细胞活力的影响。(a)钙黄绿素荧光染色图像，绿色表示活细胞，红色表示死细胞，比例尺：100μm；(b)凋亡细胞占总细胞数的比例。相对于对照组
##
p<0.01；相对于模型组
**
p<0.01；相对于hsya
‑
grb1组
&
p<0.05。hsya：给予20μm hsya；grb1：给予100μm grb1；hsya
‑
grb1：同时给予20μm hsya和100μm grb1。
35.图7：不同给药下iso致心肌缺血模型小鼠心肌组织的he染色结果。箭头指向炎症浸润细胞。hsya：灌胃给药9.0mg/kg的hsya；grb1：灌胃给药45.0mg/kg的grb1；hsya
‑
grb1
‑
1：灌胃给药45.0mg/kg的grb1和9.0mg/kg的hsya；cns：灌胃给药45.0mg/kg的三七总皂苷(ns)和37.5mg/kg的红花总黄酮(sf)；hsya
‑
grb1
‑
2：灌胃给药15.0mg/kg的grb1和3.0mg/kg的hsya。
36.图8：不同给药对iso致心肌缺血模型小鼠血浆中(a)ck
‑
mb和(b)ldh含量变化的影响。相对于正常组
##
p<0.01；相对于模型组
*
p<0.05，
**
p<0.01；相对于hsya
‑
grb1
‑
1组
&
p<0.05，
&&
p<0.01。cns：灌胃给药45.0mg/kg的ns和37.5mg/kg的sf。hsya
‑
grb1
‑
2：灌胃给药15.0mg/kg的grb1和3.0mg/kg的hsya。hsya：灌胃给药9.0mg/kg的hsya；grb1：灌胃给药45.0mg/kg的grb1；hsya
‑
grb1
‑
1：灌胃给药45.0mg/kg的grb1和9.0mg/kg的hsya。
37.图9：不同给药对iso致心肌缺血模型小鼠血浆中(a)gsh
‑
px和(b)sod活性变化的影响。相对于正常组
##
p<0.01；相对于模型组
*
p<0.05，
**
p<0.01；相对于hsya
‑
grb1
‑
1组
&
p<0.05，
&&
p<0.01；相对于cns组
￥￥
p<0.01。cns：灌胃给药45.0mg/kg的ns和37.5mg/kg的sf。hsya
‑
grb1
‑
2：灌胃给药15.0mg/kg的grb1和3.0mg/kg的hsya。hsya：灌胃给药9.0mg/kg的hsya；grb1：灌胃给药45.0mg/kg的grb1；hsya
‑
grb1
‑
1：灌胃给药45.0mg/kg的grb1和9.0mg/kg的hsya。
具体实施方式
38.从中药复方cns的单味药材红花三七中选择其代表性的活性单体化合物组成分子配伍并进行深入研究，通过大量筛选，首次发现通过将一定用量比例的羟基红花色素a和人参皂苷rb1联合使用，在预防或治疗心肌损伤方面具有显著的协同增效作用。在此基础上完成了本发明。
39.为了便于本领域技术人员的理解，下面对本发明中涉及的各种主要活性成分进行描述。
40.如本文所用，“红花”是菊科植物红花(carthamus tinctorius l.)的干燥花，始载于《开宝本草》，味辛，性温，归心、肝经，是传统的活血化瘀、祛瘀止痛的良药。截止目前，已从红花中分离超过200种成分，主要包括黄酮类、生物碱类、聚炔类、木脂素类、有机酸类等烷基二醇类以及甾体类等。红花中的黄酮类成分主要是醌式查耳酮碳苷类，迄今已分离出25个，大部分是水溶性的红花黄色素类。除了醌式查耳酮碳苷类成分以外，还从红花中分离出35个黄酮类成分，包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮类化合物。从红花中分离得到生物碱类成分主要以5
‑
羟色胺衍生物为主。从红花油中分离得到13个生物碱，干燥花中分离得到11个生物碱，主要以5
‑
羟色胺衍生物为主。从红花中分离得到26个聚炔类化合物，以十碳、十三碳、十四碳聚炔类化合物为主。
41.如本文所用，“三七”为五加科人参属植物三七(panax notoginseng(burk.)f.h.chen)的干燥根及根茎。三七别名田七、参三七、滇三七，味甘、微苦、温，归肝、胃经，具
有散瘀止血、消肿定痛的功效。迄今三七中已分离获得超过200种成分，主要类型为皂苷、黄酮、甾醇、糖类和氨基酸。其中三七总皂苷是三七的主要活性成分，主要包括三七皂苷r1(notoginsenoside r1,ngr1)、人参皂苷rg1(ginsenoside rg1,grg1)、人参皂苷re(ginsenoside re,gre)、grb1和人参皂苷rd(ginsenoside rd,grd)，其含量分别是6.2％、26.6％、4.1％、32.5％和6.6％。
42.如本文所用，本发明药物组合物中的羟基红花色素a和人参皂苷rb1可以在同一药物制剂中施用，也可以在不同药物制剂中施用。在不同药物制剂中施用的情况下，羟基红花色素a和人参皂苷rb1的剂型可以是相同的，也可以是不同的。并且，羟基红花色素a和人参皂苷rb1可以同时或顺序施用。
43.如本文所用，本发明药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂或吸入剂。优选地，本发明的剂型为片剂或胶囊剂。
44.如本文所用，本发明的“药学上可接受的载体”是指药物制剂领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、色素、矫味剂、溶剂、表面活性剂中的一种或几种。
45.本发明所述填充剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述助悬剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。
46.优选地，可以将本发明的药物制成各种固体口服制剂、液体口服制剂等。药剂学可接受的口服剂固体制剂有：普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、散剂等，口服液体制剂有口服液、乳剂等。
47.另外，还可以将本发明的药物制成注射剂，包括水针剂或冻干粉针剂等。
48.上述各种剂型可以根据药物制剂领域的常规工艺制备而成。
49.如本文所用，本发明的“羟基红花色素a”和“人参皂苷rb1”可以采用生物提纯方法从含有该活性成分的红花和三七等植物中提取分离得到，也可以购自市售产品。
50.在上文所述的医药用途中，对于“羟基红花色素a”和“人参皂苷rb1”的给药时间、给药次数和给药频率等等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。例如，将对小鼠或大鼠的治疗方案应用于人体上，所有药物对人的有效剂量可以通过该药物对小鼠或大鼠的有效剂量进行换算，这对于本领域的普通技术人员而言也是容易实现的。
51.下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
52.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
53.下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
54.除非另外说明，否则本发明中涉及的百分比和份数均为重量百分比和重量份数。
55.实施例
56.实施例1：本发明药物组合物的发现和配伍增效体外研究
57.1.主要实验材料
58.1.1实验细胞
59.实验中使用的两种细胞分别是小鼠巨噬细胞系(raw264.7)和大鼠心肌细胞(h9c2)；前者购于北京协和医学院细胞库，后者购于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。
60.1.2主要药品
61.羟基红花黄色素a(批号：a308，纯度为98.61％)、槲皮素(批号：a0083，纯度为99.35％)、芦丁(批号：a0103，纯度为99.95％)、山柰酚(批号：a0129，纯度为99.80％)、山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷、山柰酚
‑3‑
o
‑
槐糖苷、6
‑
羟基山柰酚
‑
3,6
‑
二
‑
o
‑
葡萄糖苷、6
‑
羟基山柰酚
‑
3,6,7
‑
三
‑
o
‑
葡萄糖苷、6
‑
羟基芹菜素
‑6‑
o
‑
葡萄糖
‑7‑
o
‑
葡萄糖醛酸苷。人参皂苷rb1(批号：a0234，纯度为98.58％)、人参皂苷rg1(批号：a0237，纯度为99.44％)、三七皂苷r1(批号：a0237，纯度为99.98％)、人参皂苷re(批号：a0244，纯度为99.52％)、人参皂苷rd(批号：a0245，纯度为98.55％)。以上标准品全部购自中国成都曼斯特公司。
62.2.主要实验方法
63.2.1心肌炎症损伤模型的建立
64.以1
×
106个/孔，2ml/孔的密度将巨噬细胞raw264.7种于6孔板。向模型组加入1μg/ml的lps刺激6小时，pbs清洗一遍，并将对照组和模型组都更换为不含fbs的空白培养基，孵育24小时后离心(1000rpm，2min)收集巨噬细胞的上清，检测上清中的no浓度。
65.以8000个/孔，200μl/孔的密度将心肌细胞h9c2种于96孔板，对照组给予空白培养基，模型组分别给予未经lps刺激的巨噬细胞上清、经过lps刺激的巨噬细胞上清、用空白培养基依次倍半稀释lps刺激的巨噬细胞上清，如检测od值。
[0066][0067]
如表达式(1)通过od值计算细胞损伤率，选择最大损伤率下的no浓度的巨噬细胞上清作为后续实验条件，并简化称为条件上清。
[0068]
以8000个/孔，200μl/孔的密度将h9c2种于96孔板，待细胞完全贴壁，pbs清洗一遍，更换为不含fbs的空白培养基，饥饿12小时后，给予条件上清造模及药物处理，孵育24小时后检测细胞活力。
[0069]
2.2三七
‑
红花有效组分中的小分子活性筛选
[0070]
通过构建的心肌炎症损伤模型来筛选三七和红花的有效组分中具有抗心肌炎症损伤的活性小分子。包括本发明人从红花提取物中分离并鉴定出的9种小分子：槲皮素、山柰酚、hsya、芦丁、山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷、山柰酚
‑3‑
o
‑
槐糖苷、6
‑
羟基山柰酚
‑
3,6,7
‑
三
‑
o
‑
葡萄糖苷、6
‑
羟基芹菜素
‑6‑
o
‑
葡萄糖
‑7‑
o
‑
葡萄糖醛酸苷和6
‑
羟基山柰酚
‑
3,6
‑
二
‑
o
‑
葡萄糖苷。以及三七中含量最多的5种小分子：
[0071]
ngr1、grb1、grg1、gre和grd。上述小分子粉末提前用dmso溶解配制成浓度为200mm的储备液，4℃保存。
[0072]
h9c2种板后分为三组，对照组、模型组和给药组，每组平行6孔。对照组仅更换空白培养基，模型组给予含条件上清的空白培养基。给药组则用含条件上清的空白培养基将药物储备液依次稀释成浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56和0.78μm的溶液后给予细胞。孵育24小时后检测细胞活力，寻找能发挥最大抗心肌炎症损伤作用的浓度，本文定义为ce。
[0073]
2.3活性小分子配伍比例选择
[0074]
根据目前分子配伍常采用的依据体内血药浓度和依据生药中的含量进行配伍的方法，分别考察三七
‑
红花活性小分子的最佳配伍比例。
[0075]
2.3.1根据体内血药浓度进行配伍比例选择
[0076]
首先以hsya体外筛选出的ce为基准，按照表1中的比例算出三七中五个小分子对应的配伍浓度；再以三七中的五个小分子的ce为基准，按照比例算出hsya对应的配伍浓度。对比心肌炎症损伤模型下不同配伍给药的细胞活力差别。
[0077]
表1：以体内药代动力学的最大血药浓度为基础计算得到的配伍比例
[0078][0079]
2.3.2根据生药含量进行配伍比例选择
[0080]
同样先以hsya的ce为基准，按照前期通过正交实验筛选出ns和sf配伍后协同增效的最佳配比为6∶5(meng y q，du z y，li y，et al.integration of metabolomics with pharmacodynamics to elucidate the anti
‑
myocardial ischemia effects of combination of notoginseng total saponins and safflower total flavonoids[j].front pharmacol，2018，9(07)：667
‑
682.)，再根据表2中的比例算出三七中五个小分子对应的配伍浓度；再以三七中的五个小分子的ce为基准，按照比例算出hsya对应的配伍浓度。对比心肌炎症损伤模型下不同配伍给药的细胞活力差别。
[0081]
表2：以生药含量为基础计算得到的配伍比例
[0082][0083]
*该含量为各小分子在sf和ns中的含量占有比例。
[0084]
2.4活性小分子的配伍增效研究
[0085]
2.4.1活性小分子配伍增效
[0086]
h9c2种板后分为三组，对照组、模型组和给药组，每组平行6孔。对照组仅更换空白培养基，模型组给予含条件上清的空白培养基，给药组在模型组的基础上分别加入符合配伍比例不同浓度的红花活性小分子、三七活性小分子和活性小分子组合物。孵育24小时后检测细胞活力或进行细胞染色。
[0087]
2.4.2浓度梯度下的小分子配伍增效
[0088]
确认三七和红花中的活性小分子组合物及其配伍比例后，将配伍比值大的一方从200μm开始用含条件上清的空白培养基逐级倍半稀释得到浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56μm的溶液，按比例计算配制得到另一方与之对应浓度下的溶液，再配制一组同时含有上述浓度下两种小分子的溶液。对照组仅更换空白培养基，给药组给予h9c2这三组溶液，孵育24小时后检测得到三组浓度梯度平台下的细胞活力，用之考察配伍组能否整体性提升抗心肌炎症损伤作用。
[0089]
2.5成像和数据分析
[0090]
image
‑
pro plus 6.0软件(media cybernetics,usa)和graphpad prism 8(graphpad software,usa)分别用于图像处理和统计分析。
[0091]
所有数据均以“均数
±
标准平均误差(means
±
s.d.)”呈现，多组间均数比较采用单因素方差分析(anova)，两组间均数比较采用双侧t检验。p<0.05表示具有统计学差异。
[0092]
3.实验结果
[0093]
3.1三七
‑
红花有效组分中的小分子活性筛选
[0094]
红花有效组分的小分子活性筛选结果如图1，红花中在抑制心肌炎症损伤方面具有较好活性的小分子山柰酚、hsya、芦丁、山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷和山柰酚
‑3‑
o
‑
槐糖苷。
[0095]
红花有效组分中小分子含量占比最高的两者是占8.0％的hsya和占0.7％的山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷。红花黄色素是红花中的主要活性成分，hsya是红花黄色素中含量最高的化合物。综合考虑活性筛选结果、量效关系和化合物的生药含量，最终选择hsya作为红花的代表性活性小分子。由图1(c)所示，hsya在心肌炎症损伤模型中发挥最佳效用的浓度ce是25μm。
[0096]
三七有效组分的小分子活性筛选结果如图2，三七中在抑制心肌炎症损伤方面具有较好活性的小分子是ngr1、grb1、grg1和gre。三七有效组分中四者含量占比分别是6.2％、32.5％和26.6％和4.1％，其在心肌炎症损伤模型中发挥最佳效用的浓度ce分别是25、100、12.5和3.125μm。
[0097]
3.2活性小分子组合及其配伍比例和浓度优化
[0098]
以体内药代动力学的最大血药浓度为配比依据时，配伍的抗心肌炎症损伤结果如图3。hsya与ngr1、grg1、gre配伍时相对于模型组表现出显著性的改善作用(p<0.01)，但并未显著性好于单独小分子。hsya与grb1配伍时不仅相对于模型组表现出显著性的改善作用(p<0.01)，相对于hsya和grb1也表现出显著性的更佳作用(p<0.01)。
[0099]
以生药含量为配比依据时，配伍的抗心肌炎症损伤结果如图4。hsya与ngr1、gre配伍时相对于模型组表现出显著性的改善作用(p<0.05)，但并未好于单独的小分子。hsya与grb1、grg1配伍时不仅相对于模型组表现出显著性的改善作用(p<0.01)，相对于hsya、grb1
和grg1也表现出显著性的更佳作用(p<0.01)。进一步直接对比上述的两组配伍，结果如图4(e)，hsya与grb1配伍的抗心肌炎症损伤作用显著性好于hsya与grg1配伍(p<0.01)。
[0100]
综合考虑生药含量、体内血药浓度的暴露量以及两种配伍方式下的抗心肌炎症损伤作用，最终选择grb1为三七中的活性小分子。hsya和grb1生药含量比是1:5，体内药代动力学的最大血药浓度比也是1:5，因此配伍比例设定为1:5。
[0101]
hsya和grb1在心肌炎症损伤模型中发挥最佳效用的浓度ce是25和100μm。需要进一步考虑后续实验所适用的最佳浓度应该选择以hsya的ce为基准得到的25μm hsya 125μm grb1还是以grb1的ce为基准得到的20μm hsya 100μm grb1。根据图4(b)结果所示，两者抗心肌炎症损伤作用没有显著性差异，故选择浓度较小的20μm hsya 100μm grb1进行后续实验。3.3活性小分子组合物hsya
‑
grb1的配伍增效研究
[0102]
首先，根据上述确定的配伍方案，对配伍增效结果进行验证。20μm hsya、100μm grb1及两者配伍后测出的细胞活力如图5(a)，在模型组造成约13％的显著性损伤(p<0.01)的基础上，相对于模型组，单独给予hsya、grb1的细胞活力为0.97和0.99，分别提高了10％和12％；两者配伍之后的细胞活力是1.09，细胞活力相对于模型组显著提升了22％，相对于hsya和grb1显著提升了13％和10％(p<0.05)。
[0103]
进一步对配伍增效的量效关系进行考察，每个浓度按照1:5的比例配伍。如图5(b)所示，hsya与grb1配伍后在所有浓度下的活力都高于单独给予hsya或者grb1，配伍组能整体性提升抗心肌炎症损伤能力。
[0104]
然后，采用细胞死活试剂盒对细胞活力进行表征，结果如图6所示，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。模型组中的红色荧光明显多于对照组，三个给药组中的红色荧光都少于模型组。统计一个视野下的凋亡细胞占总细胞数的比例结果如图6(b)，模型组的凋亡率为19％，要显著高于对照组的2％(p<0.01)。单独给予hsya、grb1及hsya
‑
grb1配伍时凋亡率降到了9％、7％和3.6％，相对于模型组显著性下降(p<0.01)。hsya
‑
grb1配伍后的凋亡率同时显著低于单独给予hsya和grb1的凋亡率(p<0.05)。因此，相比于单独给予hsya和grb1，hsya
‑
grb1配伍组的细胞存活率进一步提高。
[0105]
4.实验结论
[0106]
综上，本发明人建立和优化了巨噬细胞介导的心肌炎症损伤模型，从三七和红花中优选出小分子活性组合物hsya和grb1。相对于单独给予小分子治疗，hsya和grb1配伍后表现出显著性的配伍增效作用。
[0107]
实施例2：本发明药物组合物的体内药效学研究
[0108]
1.主要实验材料
[0109]
1.1主要药品
[0110]
ns：购于云南植物药业有限公司，含ngr16.2％，grb132.5％，grg126.6％，gre 4.1％，grd 6.6％；
[0111]
sf：红花药材购自新疆，经鉴定为红花(carthamus tinctorius l.)。取红花药材提取三次，第一次加12倍量去离子水80℃浸提1小时，第二、三次各加10倍量去离子水80℃浸提，每次半小时。将三次提取液过滤后合并，70～80℃下减压浓缩至每1ml药液含1g生药。浓缩液注入d101型大孔吸附树脂柱，用1.5倍柱体积量去离子水洗脱，再用50％乙醇洗脱，收集2倍柱体积量的50％乙醇洗脱液，60℃下减压浓缩至相对密度1.08
‑
1.10，喷雾干燥，粉
碎过80目筛。经hplc测定，sf中含hsya不得少于8.0％，含山柰酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷不得少于0.70％。
[0112]
cns：由ns与sf以6:5的比例组成。
[0113]
iso(异丙肾上腺素，北京百灵威科技有限公司，中国)、hsya(批号：a380，纯度为98.61％；成都曼斯特公司，中国)、grb1(批号：a0234，纯度为98.58％；成都曼斯特公司，中国)。
[0114]
1.2实验动物
[0115]
雄性c57bl/6j小鼠，体重20
±
5g，购于北京大学医学部实验动物中心。饲养条件为：温度：20
±
2℃；湿度：60
±
5％；12h光照和黑暗循环；自由饮水，实验前适应3天。实验动物伦理证批准号：la2019099。
[0116]
2.主要实验方法
[0117]
2.1小鼠心肌缺血模型
[0118]
参考文献得出大鼠的急性心肌缺血模型中iso的最佳造模剂量为100mg/kg/d。根据大、小鼠体表面积的换算公式得出的相对应的小鼠中剂量造模的iso浓度是150.0mg/kg/d，本研究中以此浓度进行小鼠心肌缺血的模型建立。
[0119]
2.2动物分组和给药
[0120]
小鼠称重后随机分为7组：正常(normal)组、模型(model)组、活性小分子组配伍(hsya
‑
grb1)组1、羟基红花黄色素a(hsya)组、人参皂苷rb1(grb1)组、三七
‑
红花有效组分复方配伍(cns)组以及活性小分子配伍(hsya
‑
grb1)组2，每组各6只。采用1.0ml注射针，安装9号灌胃针，严格按下述剂量给药。
[0121]
normal组：腹腔注射等体积生理盐水，间隔24小时，连续注射2次。第三天开始灌胃给予同体积的生理盐水，每日一次，连续7天。第十天取样前禁食12小时，其余时间不禁食、不禁水。
[0122]
model组：腹腔注射iso(150.0mg/kg/d)，间隔24小时，连续注射2次。第三天开始灌胃给予同体积的生理盐水，每日一次，连续7天。第十天取样前禁食12小时，其余时间不禁食、不禁水。
[0123]
hsya
‑
grb1
‑
1组：腹腔注射iso(150.0mg/kg/d)，间隔24小时，连续注射2次。造模成功后第三天开始按54.0mg/kg(45.0mg/kg的grb1和9.0mg/kg的hsya)的给药剂量灌胃给药，每天一次，连续7天。第十天取样前禁食12小时，其余时间不禁食、不禁水。
[0124]
hsya组：腹腔注射iso(150.0mg/kg/d)，间隔24小时，连续注射2次。造模成功后第三天开始按9.0mg/kg的给药剂量灌胃给药，每天一次，连续7天。第十天取样前禁食12小时，其余时间不禁食、不禁水。
[0125]
grb1组：腹腔注射iso(150.0mg/kg/d)，间隔24小时，连续注射2次。造模成功后第三天开始按45.0mg/kg的给药剂量灌胃给药，每天一次，连续7天。第十天取样前禁食12小时，其余时间不禁食、不禁水。
[0126]
cns组：腹腔注射iso(150.0mg/kg/d)，间隔24小时，连续注射2次。造模成功后第三天开始按82.5mg/kg(45.0mg/kg的ns和37.5mg/kg的sf)的给药剂量灌胃给药，每天一次，连续7天。第十天取样前禁食12小时，其余时间不禁食、不禁水。
[0127]
hsya
‑
grb1
‑
2组：腹腔注射iso(150.0mg/kg/d)，间隔24小时，连续注射2次。造模成
功后第三天开始按18.0mg/kg(15.0mg/kg的grb1和3.0mg/kg的hsya)的给药剂量灌胃给药，每天一次，连续7天。第十天取样前禁食12小时，其余时间不禁食、不禁水。
[0128]
2.2.1hsya
‑
grb1配伍增效的动物药效验证
[0129]
hsya
‑
grb1
‑
1组：共计54.0mg/kg的给药剂量，由45.0mg/kg的grb1和9.0mg/kg的hsya组成。
[0130]
hsya组：9.0mg/kg的hsya。
[0131]
grb1组：45.0mg/kg的grb1。
[0132]
2.2.2cns和对应生药含量比例下的hsya
‑
grb1配伍的药效比较
[0133]
cns组：共计82.5mg/kg的给药剂量，由45.0mg/kg的ns和37.5mg/kg的sf组成。
[0134]
hsya
‑
grb1
‑
2组：共计18.0mg/kg的给药剂量，由15.0mg/kg的grb1和3.0mg/kg的hsya组成。
[0135]
2.3生化指标检测
[0136]
本实施例采用常规方法对以下生化指标进行了检测：心肌组织病理学检查、肌酸激酶同工酶(ck
‑
mb)、超氧化物岐化酶(sod)以及谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)。
[0137]
2.4统计学方法
[0138]
采用graphpad prism 8(graphpad software,usa)用于数据的统计分析。所有数据均以“均数
±
标准平均误差(means
±
s.d.)”呈现，并保证每组至少有三个独立的实验。多组间均数比较采用单因素方差分析(anova)，组间两两均数比较采用双侧t检验。p<0.05表示具有统计学差异。
[0139]
3.实验结果
[0140]
3.1he染色
[0141]
如图7所示，与正常组相比，iso模型组小鼠心肌组织发生了极为显著的病理变化。其切片结果表现出模型组小鼠心肌细胞肿胀，细胞核皱缩或消失，心肌细胞纤维排列紊乱、纤维横纹模糊不清甚至萎缩断裂，间质出现广泛的炎症细胞浸润，偶可见局部坏死区域等现象。造模成功的基础上，治疗性给予较高浓度的hsya与grb1单独及两者以1:5的比例配伍时的he染色结果如图7所示，心肌细胞的排列趋于正常，细胞肿胀也相对改善，纤维细胞及炎症浸润也显著减少。三组给药组一定程度上都能够改善iso造成的心肌损伤，但hsya
‑
grb1配伍组相对于单独小分子在改善心肌细胞肿胀和炎症浸润方面有更好的表现。治疗性给予cns及对应生药含量比例下的hsya
‑
grb1配伍时的he染色结果如图7所示，在改善炎症浸润的方面，cns的治疗效果要好于等含量下的hsya与grb1配伍。但hsya与grb1配伍在改善心肌细胞肌丝断裂和细胞紧密排列方面的效果好于cns。
[0142]
3.2心肌酶
[0143]
在临床中，血浆中ck、ldh的含量升高是心肌缺血的重要诊断指标。如图8所示，与正常组相比，iso模型组动物的血浆中ck
‑
mb和ldh表现出显著性升高(p<0.01)，不同给药组能不同程度地降低模型小鼠血浆中的ck
‑
mb和ldh水平(p<0.05)。cns药效稍好于对应生药含量比例下的hsya
‑
grb1
‑
2配伍，但无显著性差异(p>0.05)。hsya
‑
grb1
‑
1配伍的药效要显著优于模型组、hsya组、grb1组、cns组(p<0.05)。
[0144]
3.3氧化应激指标
[0145]
血浆或血清中gsh
‑
px、sod酶活水平是重要的机体抗氧化防御系统的评价指标。如
图9所示，与正常组相比，iso模型组动物的血浆中gsh
‑
px和sod表现出显著的下降(p<0.01)。不同给药组能不同程度地上调模型小鼠血浆中的gsh
‑
px和sod含量(p<0.05)。在改善gsh
‑
px活性方面，cns药效稍好于对应生药含量比例下的hsya
‑
grb1
‑
2配伍，但无显著性差异(p>0.05)。在改善sod活性方面，cns药效显著性好于对应生药含量比例下的hsya
‑
grb1
‑
2配伍(p<0.01)。hsya
‑
grb1
‑
1配伍的药效要显著优于模型组、hsya组和grb1组(p<0.05)。
[0146]
3.4对协同作用的分析
[0147]
协同作用的定义是几种药物的联合使用所产生的效果大于各自单独使用时的效果之和，常见的在数学上用于计算协同增效的方法包括边际剂量反应法(marginal dose
‑
response curve method,mdrcm)、反应面法(response surface method,rsm)和无模型法(model free test,mft)。由于前两者的计算过程中都需要单一药物的剂量反应曲线，mft只需要特定的三个剂量，故选择了mft对实施例2数据进行协同增效的评估。
[0148]
在具体应用中，可将mft简化如下：药物相互作用指数γ＝a/a b/b，其中a、b为两药单独使用时与两者联合使用时产生相同相应的剂量，a、b为两药联合使用时各自的剂量。γ>1时，两药的相互作用为拮抗；γ＝1时，两药的相互作用为相加；γ<1时，两药的相互作用为协同。
[0149]
实施例2研究中设置了hsya(9mg/kg)、grb1(45mg/kg)、hsya
‑
grb1
‑
1(9mg/kg 45mg/kg)和hsya
‑
grb1
‑
2(3mg/kg 15mg/kg)。数据量的限制下，将hsya(9mg/kg)、grb1(45mg/kg)和hsya
‑
grb1
‑
2(3mg/kg 15mg/kg)带入上述计算药物相互作用指数的公式得到γ＝3/9 15/45＝2/3<1，此时我们只需要证明单独的hsya、grb1与hsya
‑
grb1
‑
2的药效相当或者hsya
‑
grb1
‑
2的药效更强(hsya
‑
grb1
‑
1的药效强于hsya
‑
grb1
‑
2的前提下，我们认为随着固定配比下联合用药的剂量的上升，药效会随之上升)，即可得到γ<1的结论，即hsya与grb1配伍后协同增效。
[0150]
对以上指标依次分析，可大致分为hsya
‑
grb1
‑
2的药效强于两者或者与其中之一相当(ck
‑
mb、gsh
‑
px)、hsya
‑
grb1
‑
2的药效处于两者之间(ldh)以及hsya
‑
grb1
‑
2的药效弱于两者(sod)三类。因此得出结论，hsya与grb1配伍后在降低心肌酶ck
‑
mb，提升抗氧化指标gsh
‑
px的水平上有明确的协同增效作用。
[0151]
4.实验结论
[0152]
实施例2利用iso诱导的小鼠心肌缺血模型对活性小分子组合物hsya
‑
grb1体内药效进行确证，he染色病理切片和生化指标检测的结果表明：hsya
‑
grb1能明显改善iso诱导小鼠心肌组织的炎症、纤维化、心肌细胞坏死等病理表型，降低小鼠血浆中心肌酶、炎症因子水平、提高gsh
‑
px、sod等抗氧化指标的表达。单独小分子hsya、grb1有一定功效，但hsya
‑
grb1配伍的抗心肌损伤药效有显著的协同增效作用。
[0153]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。