一种黄花菜益生菌发酵粉、制备方法及其发酵黄花固体饮料与流程

1.本发明涉及一种益生菌发酵粉，具体涉及一种黄花菜益生菌发酵粉、制备方法及其发酵黄花固体饮料。


背景技术：

2.黄花菜(hemerocallis citrina)，在我国有着悠久的种植与食疗历史，其性味甘甜，据《本草纲目》记载具有平肝养血、消肿利尿、抗菌消炎、安神镇痛、缓解郁症和改善睡眠等功效，属药食同源性蔬菜。黄花菜不仅滋味鲜美，而且营养丰富，属高蛋白、低热值、富含维生素和矿物质的绿色保健蔬菜；此外根据植物化学和药理学的研究表明，黄花菜中含有生物碱、黄酮类和多酚类等有效功能活性成分，这也是赋予黄花菜诸多营养保健功能的主要成分。然而黄花菜花期短，采收后易腐烂变质，因此常以干制品形式储存与食用，这使得黄花菜中重要的功能活性成分损失严重，极大降低了其功能价值。此外，黄花菜冲调产品主要为黄花菜干制茶，是冲泡形式的单一饮用方式，此方式不仅口感与风味较差，严重影响饮用时的舒适度；而且简单的浸泡方式也无法使得黄花菜中的活性成分完全释放。因此，有效分离提取黄花菜中的有益功能成分并辅以合适的加工方式与辅料，在提升其功能价值与改善其食用接受度方面迫切需求。
3.同时，益生菌是一类在适量摄取的情况下对人体健康有益的微生物，其在进入肠道后与肠道细菌共生，可调节肠道粘膜免疫系统，维护肠道粘膜屏障；组织致病菌在肠道内吸附定殖，提高人体的免疫力；分泌有机酸或酶等抑制有害微生物生长的物质从而改善肠道内的菌落环境。因此，黄花菜能辅以益生菌发酵，不但可以提高黄花菜的附加价值、营养功能价值，而且能赋予黄花菜汁独特的风味，明显改善其食用接受度。但益生菌发酵果蔬产品仍以液态为主，不仅保藏与运输较为困难，且由于保藏过程中的不稳定性和后发酵现象，使得常温保藏时需要经灭菌处理，导致发酵产品中营养物质损失以及活性益生菌的丧失保健功能。因此，开发一款安全有效、风味显著改善、不生产依赖性的方便携带的具有较高保健功能的黄花菜产品，在一定程度上解决黄花菜高产后的深加工问题，具有很大的发展优势。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的在于提供一种黄花菜益生菌发酵粉；制备该发酵粉的方法包括如下步骤：
5.1)将黄花菜榨汁，得到黄花菜浆液；再加入纤维素酶和果胶酶的复合酶，进行酶解；酶解完成后，灭酶并离心，取上清液获得黄花菜酶解液；
6.2)在所述黄花菜酶解液中，按体积百分比为3～6％的量，接种活菌数不低于1
×
107cfu/ml的植物乳杆菌与嗜热链球菌的种子液，进行发酵，获得黄花菜益生菌发酵液；
7.3)将所述黄花菜益生菌发酵液冷冻干燥，获得所述黄花菜益生菌发酵粉。
8.其中，灭酶采用本领域常规操作，如95℃处理3～5min。灭酶完成后，冷却至室温，
离心(8000rpm，15min)，收集上清液得黄花酶解液，4℃保藏备用。
9.本发明以新鲜黄花菜为原料，经过酶解、益生菌发酵、真空冷冻干燥、粉碎等冷加工方式，不仅充分保留了黄花菜中的功能活性成分，并且借以酶解技术使得活性物质充分释放，显著提升黄花菜安神镇痛、缓解郁症和辅助睡眠等功能作用，也能有效改善黄花菜汁的风味与食用可接受度。
10.本发明提供的酶解，选取纤维素酶和果胶酶的复合酶进行酶解，由于黄花菜细胞壁主要为果胶、纤维素等,其彼此缠绕交联,使得细胞壁难以裂解。常规酶解技术大多使用单一酶,黄花菜出汁率低、酶解时间长；利用含纤维素酶和果胶酶的复合酶能选择性的将黄花菜细胞壁充分降解，进而显著提高出汁率，且促进黄花菜中黄酮、多酚、多糖等功能活性成分溶出。
11.本发明提供的发酵，采用活菌数不低于1
×
107cfu/ml的种子液，以植物乳杆菌与嗜热链球菌的为混合益生菌。该类益生菌在发酵过程中，能通过大量繁殖以足够量顺利进入人体肠道并定植，从而实现调节和改善肠道菌群结构、维持肠道菌群生态平衡以及调节机体免疫反应等功效；并且相比未发酵和单菌种发酵，复合菌种发酵又能显著提升醛、酮、酯类物质的产生，赋予黄花菜酶解汁更加醇厚的香气，以及益生菌代谢产物乳酸、醋酸、草酸等有机酸可为黄花菜酶解汁带来更加酸甜爽口的滋味，有效提升的黄花菜益生菌发酵粉风味。
12.其中，黄花菜主要功能活性成分存在于细胞中，而细胞受细胞壁和细胞膜保护，细胞壁中含有纤维素和果胶等物质相互交联形成框架结构难以裂解，细胞膜主要由磷脂双分子层构成机械强度较弱，因此加以特定用量和比例的纤维素酶和果胶酶能有效释放出黄花菜细胞中的功能活性成分，相比传统单一酶解法，此复合酶能充分裂解细胞壁，提高出汁率。酶解过程涉及的条件通过优化实验，使其能最大限度适宜从黄花菜中获取功能活性成分。
13.本发明优选的这类复合菌种，植物乳杆菌是一类在自然界广泛存在的，尤其存在于植物表面，也是肠道内重要的微生物群之一，其具有优良的耐受强酸、胆盐、高渗透压等能力，在发酵植物原料方面相比其他菌株具有优势；嗜热链球菌是经典的酸奶发酵剂菌种之一，迅速代谢乳糖和氨基酸的能力极为突出，其产生的胞外多糖 (extracellular polysaccharide，eps)具有抗菌和抗氧化活性，有益于宿主的健康，并刺激上皮细胞再生和宿主的免疫防御机制。复合菌种发酵的相比单菌中发酵，有效提升的黄花菜益生菌发酵粉风味；此处发酵条件通过优化实验，能最优的适用于黄花菜酶解的发酵，从而提升其品质与功能活性。本发明进一步提出的，步骤1)中，所述黄花菜与水按料液比1:0.8～2(质量体积比w:v)的比例混合榨汁，获得黄花菜浆液；
14.本发明为了护色，优选所述黄花菜还包括预处理，具体为：将新鲜黄花菜清洗、去梗后，置于65～70℃的热水中，烫2～3min，沥干备用。
15.本发明进一步提出的，步骤1)中，所述酶解具体为：将复合酶按质量百分比为0.1～0.6％的量加入所述黄花菜浆液中，在30～60℃的温度下，酶解的2～6h；
16.其中，所述复合酶为质量比1:1～5的纤维素酶和果胶酶；
17.优选的，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为1:3～5，所述复合酶按质量百分比为0.3～0.5％的量加入；
18.优选的，所述酶解的温度为40～50℃，酶解的时间为3～5h。
19.本发明进一步提出的，步骤2)中，在所述黄花菜酶解液中，加入质量体积比5～8％的糖、0.01～0.05％的羧甲基纤维素钠(cmc-na)，混合均匀后，灭菌，待发酵；
20.其中，添加糖为葡萄糖，是为了为微生物提供初始碳源；添加 cmc-na可提高体系稳定性。
21.优选的，所述混合采用均质的方式，所述均质条件为20～25mpa， 2～3次。
22.其中，所述灭菌采用本领域常规方式进行；本发明采用如下方式：灭菌条件为80～95℃灭菌25～30min。灭菌完成后，冷却至接近发酵的温度(例如40～45℃)，再加入发酵菌。
23.本发明进一步提出的，步骤2)中，所述种子液中，植物乳杆菌与嗜热链球菌的比例为1:0.8～1.2；所述比例为种子液的体积比。
24.优选的，所述发酵的温度为35～40℃，发酵的时间为72～78h。
25.其中，发酵完成后，将黄花酶发酵液迅速冷却至10℃以下，放入0～4℃的冰箱冷藏后熟20～30h，得到黄花菜益生菌发酵液。冷藏过程中，能进一步产生双乙酰、乙醛、酯类等芳香味物质，提升其风味。
26.本发明进一步提出的，步骤3)中，冷冻干燥具体为：将所述黄花菜益生菌发酵液在-65～-70℃的条件下，预冻3～6h；然后真空冷冻干燥处理24～48h，得到黄花菜益生菌发酵粉；
27.其中，所述真空冷冻干燥采用本领域常规操作，优选为压力为 1～5pa，温度为-50～-55℃的条件进行真空冷冻干燥。
28.优选的，还包括所述黄花菜益生菌发酵粉在无菌条件下，进行粉碎，过不小于40目筛。
29.本发明提供一种优选方案，制备所述黄花菜益生菌发酵粉的方法包括如下步骤：
30.1)将黄花菜与水按料液比1:0.8～2的比例混合榨汁，获得黄花菜浆液；
31.2)将复合酶按质量百分比为0.3～0.5％的量加入所述黄花菜浆液中，在40～50℃的温度下，酶解的3～5h；酶解完成后，灭酶并离心，取上清液获得黄花菜酶解液；
32.其中，所述复合酶为质量比1:3～5的纤维素酶和果胶酶；
33.3)在所述黄花菜酶解液中，加入质量体积比5～8％的糖、 0.01～0.05％的羧甲基纤维素钠，混合均匀后，灭菌；
34.4)在灭菌后的黄花菜酶解液中，加入体积百分比3～6％、活菌数不低于1
×
107cfu/ml的种子液，在35～40℃为温度下，发酵72～78 h，获得黄花菜益生菌发酵液；
35.其中，所述种子液为体积比1:0.8～1.2的植物乳杆菌与嗜热链球菌；
36.优选的，发酵完成后，将黄花酶发酵液迅速冷却至10℃以下，放入0～4℃的冰箱冷藏后熟20～30h，得到黄花菜益生菌发酵液；
37.5)将所述黄花菜益生菌发酵液冷冻干燥，获得所述黄花菜益生菌发酵粉。
38.本发明的又一目的在于，提供一种发酵黄花固体饮料，包括上述任一方法制得的黄花菜益生菌发酵粉。
39.所述发酵黄花固体饮料同时辅以益生元、膳食纤维等功能原料，从而进一步提升产品的保健功效，保证益生菌能以足够数量进入肠道，使其充分发挥促进肠蠕动、维持肠道微生态平衡等功能。
40.所述发酵黄花固体饮料包括黄花菜益生菌发酵粉和益生元；
41.优选的，所述益生元选自低聚木糖、低聚半乳糖中的一种或多种。
42.优选的，所述发酵黄花固体饮料还包括甜味剂，优选为罗汉果甜苷。
43.优选的，所述发酵黄花固体饮料还包括环糊精。
44.本发明进一步提出的，所述发酵黄花固体饮料，包括如下重量份的组分：
45.黄花菜益生菌发酵粉50～80份、环糊精5～10份、低聚木糖2～3份、低聚半乳糖2～3份、罗汉果甜苷2～3份。
46.在实际操作中，将黄花菜益生菌发酵粉与环糊精、低聚木糖、低聚半乳糖、罗汉果甜苷混合均匀，称重并无菌包装，得益生菌发酵黄花固体饮料。
47.本发明提供的益生菌发酵黄花固体饮料品质稳定、携带方便、易于保存，加工工艺简便、快捷，适合大规模生产，能为黄花菜的精深加工提供了依据，扩大了黄花菜的综合应用范围。
48.本发明至少具有以下优势：
49.(1)本发明以新鲜黄花为原料，经过酶解、益生菌发酵、真空冷冻干燥、粉碎等冷加工方式，黄花菜中的活性功能成分能够得到有效保留，并且通过酶解的方式使得此类活性物质充分释放，能显著提升黄花菜安神镇痛、缓解郁症和改善睡眠等功能作用。同时，辅以益生菌发酵，不仅能进一步提升黄花菜的附加值，也能有效改善黄花菜汁的风味与食用可接受度；本产品加工工艺简便、快捷，适合大规模生产，能为黄花菜的精深加工提供了依据，扩大了黄花菜的综合应用范围。
50.(2)益生菌发酵黄花菜固体饮料以益生菌发酵黄花菜粉为主，并与益生元、膳食纤维等功能辅料合理配伍，该产品不仅品质稳定、携带方便、易于保存，而且能够进一步提升产品的保健功效，有效保证益生菌能以足够数量进入肠道，使其充分发挥促进肠蠕动、维持肠道微生态平衡等功能。
附图说明
51.图1a为黄花菜酶解过程中酶配比的对比效果图；
52.图1b为黄花菜酶解过程中酶解时间对比效果图；
53.图1c为黄花菜酶解过程中酶解温度对比效果图；
54.图1d为黄花菜酶解过程中复合酶的加酶总量对比效果图；
55.图2为黄花菜酶解前后总酚含量对比图；
56.图3a为黄花菜酶解液发酵过程中还原糖含量变化图；
57.图3b为黄花菜酶解液发酵过程中乳酸菌活菌数的变化图；
58.图4a为黄花菜酶解液发酵过程中草酸的变化图；
59.图4b为黄花菜酶解液发酵过程中抗坏血酸的变化图；
60.图4c为黄花菜酶解液发酵过程中乳酸的变化图；
61.图4d为黄花菜酶解液发酵过程中乙酸的变化图；
62.图5a为黄花菜酶解液发酵前后对黄花醛类香气总量的影响图；
63.图5b为黄花菜酶解液发酵前后对黄花醇类香气总量的影响图；
64.图5c为黄花菜酶解液发酵前后对黄花酸类香气总量的影响图；
65.图5d为黄花菜酶解液发酵前后对黄花酯类香气总量的影响图；
66.图5e为黄花菜酶解液发酵前后对黄花酮类香气总量的影响图；
67.图6为黄花菜酶解液发酵前后香气pls-da分析图。
具体实施方式
68.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
69.如下实施例中所使用的菌种具体操作如下：
70.在超净工作台内复苏植物乳杆菌和嗜热链球菌，首先从冻存管中各挑取一环菌液于mrs液体培养基中，在36℃下培养24h活化乳酸菌。再在mrs固体培养基平板划线，37℃培养24h后，挑取单菌落至 mrs液体培养基中扩培乳酸菌。当菌落浓度＞1
×
107cfu/ml时，作为种子液。
71.实施例1
72.本实施例提供一种益生菌黄花菜发酵粉的制备方法，具体如下：
73.1)选取新鲜黄花清洗、去梗，于65～70℃热烫2～3min后沥干，按黄花菜：水＝1:1(w:v)的比例混合榨汁，得黄花菜浆液；
74.2)将黄花菜浆液预热至35～40℃，加入质量百分比0.4％的复合酶，置于酶解温度50℃的恒温水浴摇床中，酶解3h，达到酶解时间后，灭酶(95℃，3min)，冷却，离心(8000rpm，15min)，收集上清液获得黄花酶解液，4℃保藏备用；
75.其中，复合酶为质量比3:1的纤维素酶和果胶酶；
76.3)在所述黄花菜酶解液中，加入质量体积比5～8％的葡萄糖、 0.01～0.05％的羧甲基纤维素钠(w/v)，混合均匀；将黄花菜酶解液预热(60～70℃)，经均质(20～25mpa，2～3次)、灭菌(80～95℃， 25～30min)、冷却(40～45℃)后得无菌黄花菜酶解液；
77.4)在灭菌后的黄花菜酶解液中，加入体积百分比6％、活菌数不低于1
×
107cfu/ml的种子液，在35～39℃为温度下，发酵72～78h，获得黄花菜益生菌发酵液；将发酵完成的黄花酶解液迅速冷却至10℃以下，放入0～4℃的冰箱冷藏后熟24h，得到黄花菜益生菌发酵液；
78.其中，所述种子液为1:1(体积比v:v)的植物乳杆菌与嗜热链球菌。
79.5)将得到的黄花菜发酵液在-65℃的条件下预冻6h，预冷冻后进行真空冷冻干燥(5pa，-50℃)处理48h，得到发酵黄花菜固体；然后在无菌条件下，进行粉碎，过40目筛，得到黄花菜益生菌发酵粉；
80.粉末呈显黄色，具有浓郁的发酵风味，无异味。
81.实施例2～7
82.本实施例提供一种益生菌黄花菜发酵粉的制备方法，与实施例1 的区别在于，纤维素酶与果胶酶的添加比例不同；分别为1:0、5:1、 1:1、1:3、1:5、0:1。
83.实施例8～11
84.本实施例提供一种益生菌黄花菜发酵粉的制备方法，与实施例1 的区别在于，酶解时间不同；分别为1h、2h、4h、5h。
85.实施例12～15
86.本实施例提供一种益生菌黄花菜发酵粉的制备方法，与实施例1 的区别在于，酶
解温度不同；分别为30℃、40℃、60℃、70℃。
87.实施例16～19
88.本实施例提供一种益生菌黄花菜发酵粉的制备方法，与实施例1 的区别在于，复合酶的加入质量百分比不同，分别为0.1％、0.2％、 0.3％、0.5％。
89.实施例20
90.本实施例提供一种发酵黄花固体饮料，由如下重量份的组分：
91.实施例1黄花菜益生菌发酵粉50份、环糊精10份、低聚木糖3份、低聚半乳糖3份、罗汉果甜苷3份
92.实施例21
93.本实施例提供一种发酵黄花固体饮料，由如下重量份的组分：
94.实施例1黄花菜益生菌发酵粉60份、环糊精10份、低聚木糖2份、低聚半乳糖2份、罗汉果甜苷3份
95.实施例22
96.本实施例提供一种发酵黄花固体饮料，由如下重量份的组分：
97.实施例1黄花菜益生菌发酵粉80份、环糊精5份、低聚木糖2份、低聚半乳糖2份、罗汉果甜苷2份
98.对比例1
99.本对比例提供一种益生菌黄花菜发酵粉的制备方法，与实施例1 的区别在于，种子液的不同，将植物乳杆菌与嗜热链球菌复合菌替换为植物乳杆菌。
100.对比例2
101.本对比例提供一种益生菌黄花菜发酵粉的制备方法，与实施例1 的区别在于，种子液的不同，将植物乳杆菌与嗜热链球菌复合菌替换为嗜热链球菌。
102.试验例1
103.将实施例1～19进行实验效果对比，以黄花菜酶解出汁率进行比较。
[0104][0105]
1、图1a为酶配比(纤维素酶:果胶酶)的对比效果图，具体为实施例1与实施例2～7对比；图1b为酶解时间对比效果图，具体为实施例 1与实施例8～11对比；图1c为酶解温度对比效果图，具体为实施例1 与实施例12～15对比；图1d为复合酶的加酶总量对比效果图，具体为实施例1与实施例16～19对比。
[0106]
如图1a～图1d所示，当纤维素酶与果胶酶的质量比为3:1，酶解时间为3h，酶解温度为50℃，复合酶的加入量为0.4％；黄花菜酶解出汁率效果较优。
[0107]
2、利用box-benhnken的中心组合实验设计，选取对黄花出汁率影响最显著的3个因素，酶解时间、酶解温度和加酶总量，利用3因素 3水平的响应面分析方法进行优化实验设计，如表1。
[0108]
表1响应面试验因素水平
[0109][0110]
利用box-behnken实验设计和响应面分析方法(rsm)对三个主要酶解参数进一步优化。其实验结果及回归模型方差分析结果分别见表2和3。
[0111]
表2 box-behnken实验设计结果
[0112][0113][0114]
表3回归模型方差分析
[0115]
方差来源平方和自由度均方f值p值总模型71.979837.62《0.0001a酶用量35.91135.91168.95《0.0001
b酶解温度0.6210.622.90.1325c加酶总量4.1314.1319.440.0031ab9.2719.2743.620.0003ac2.4612.4611.60.0114bc0.00310.0030.0140.9084a29.6619.6645.470.0003b23.8213.8217.970.0038c26.3216.3229.730.001残差1.4970.21
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失拟项1.2230.415.970.0586总和73.4516///
[0116]
根据design-expert.v 8.0.6.1软件得出的最优酶解条件为40℃条件下酶解3h，加酶总量为0.46％，预计出汁率为78.84％，对模型进行三次验证实验，实际出汁率为78.97％(实施例1)，与理论值接近，因此可以判断出该模型可以较好地预测黄花酶解出汁率。因此选用酶解温度为50℃，酶解时间3h，复合酶的加酶总量为0.4％，其中纤维素酶：果胶酶＝3:1。
[0117]
试验例2
[0118]
将实施例1步骤2)获得黄花酶解液进行总酚的检测
[0119]
(1)黄花酶解液多酚的提取
[0120]
取1g黄花酶解液冻干粉于20ml 70％甲醇中，冰水浴超声提取30 min，离心(8000rpm，15min，4℃)，收集上清液，将下层沉淀物再加入20ml 70％甲醇，冰水浴超声提取30min，离心(8000rpm，15min，4℃)，收集上清液，再提取一遍沉淀物，将三次离心后的上清液合并后旋蒸，70％甲醇定容至25ml。提取进行三次重复。
[0121]
(2)黄花酶解液总酚的检测
[0122]
黄花酶解液总酚的检测使用福林酚法。
[0123]
准确称量0.5000g没食子酸于烧杯中，用乙醇溶解并定容至100 ml容量瓶中，分别取不同体积溶液于具塞试管，用乙醇定容至10ml。分别取0.1ml标品溶液或样品于具塞比色管，依次用蒸馏水定至6 ml，加入福林酚试剂0.5ml，振荡，静置5min后加入20％na2co3溶液，蒸馏水定容至10ml，摇匀，避光静置2h，765nm下测吸光值。总酚标准曲线以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，标准曲线方程为y＝0.001x 0.0219，r2＝0.9992。
[0124]
黄花菜酶解前后总酚的变化如图2所示，酶解后的黄花汁中的总酚含量明显高于未酶解的黄花汁，具有显著性差异(p＜0.05)，酶解后的总酚含量约是酶解前的1.3倍。
[0125]
(3)酶解液中单体多酚分析
[0126]
将(1)中的提取液过0.22μm滤膜，利用agilent 1260-6460型高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对样品中的多酚进行检测，色谱柱型号为agilent proshell 120 ec-c18(3
×
100mm，2.7μm)。定性定量通过标样在多反应检测mrm模式下的质谱信息、保留时间以及标准曲线确定。
[0127]
由表4可知，共检测到17种多酚类物质，其中12种多酚类物质在酶解后含量增加，结合总酚的含量变化情况可以分析对黄花汁使用纤维素酶和果胶酶进行处理可以增加酚
类物质的溶出率，并且使黄花汁的体外抗氧化活性增强。绿原酸是检测出酚酸中含量最高的化合物酶解前为16.05mg/kg，酶解后可达到10.80mg/kg。绿原酸为咖啡酸与奎宁酸合成的一种酚酸类物质，有着抗氧化、抗癌、抑菌等多种生理活性。共检测的14种黄酮类物质中，异槲皮素、山柰酚-3-o葡萄糖苷、杨梅酮、花旗松素、槲皮素、橙皮素、柚皮素、杨梅苷的含量在酶解后显著升高(p＜0.05)。
[0128]
表4黄花汁酶解前后多酚含量的变化(μg/l)
[0129][0130][0131]
试验例3
[0132]
将实施例1与对比例1～2的步骤4)获得黄花菜益生菌发酵液进行对比
[0133]
1、黄花菜益生菌发酵液还原糖及活菌数检测
[0134]
在发酵过程中，分别于0、4、8、12、24、36、48、60、72h取样检测发酵液还原糖、活菌数等指标。黄花酶解液中还原糖的检测参考国标《gb 5009.7-2016食品安全国家标准食品中还原糖的测定》；活菌数的检测参考国标《gb 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》；有机酸的检测参考国标《gb5009.157-2016食品安全国家标准食品有机酸的测定》。
[0135]
由图3a黄花酶解液发酵过程中还原糖的变化可以看出，单一的植物乳杆菌、嗜热链球菌和两种菌种1:1的复配对还原糖的利用能力没有很大差异。三种接种方式发酵的黄花酶解液中还原糖的含量都在24 h内快速下降，到24h时还原糖基本被消耗完，说明发酵完成，确定发酵时间为24h。
[0136]
由图3b可知，乳酸菌在接种至黄花酶解液后很快进入到对数生长期，在发酵的前12h内，黄花酶解液内乳酸菌可利用的糖类和其他营养物质含量丰富，利于菌种繁殖，三种接种方式的活菌数都呈指数增长。其中嗜热链球菌在发酵的前36h内活菌数对比起前两种发酵方式较低，并且在48h后开始生长缓慢。植物乳杆菌的活菌数在36h内含量都是三种发酵方式中最高，两种乳酸菌复配发酵在24h时活菌数达到最高。
[0137]
2、黄花菜酶解液发酵过程中有机酸的检测
[0138]
在发酵过程中，分别于0、4、8、12、24、36、48、60、72h取样，参考国标《gb 5009.157-2016食品安全国家标准食品有机酸的测定》。
[0139]
乳酸菌在发酵黄花酶解液时会消耗其中的营养物质产生乳酸等有机酸代谢产物为酶解液带来独特的风味，还可抑制果汁中有害微生物的生长。因此，对黄花乳酸发酵过程产生的有机酸进行检测，其有机酸标准曲线如表5。
[0140]
表5有机酸的线性范围及方程
[0141][0142]
由图4a可以看出黄花酶解液在发酵过程中草酸的含量整体呈先上升后下降的趋势，从初始的34mg/l到发酵72h后的46.10mg/l。发酵至50h时草酸含量达到最高为51.21mg/l。
[0143]
由图4b可以发现在整体的发酵过程中抗坏血酸的含量呈减少趋势，未发酵时的抗坏血酸含量最高为64.62mg/l，发酵前期含量快速减少，发酵至48h含量已经降至1.38mg/l，72h时含量仅为0.64mg/l。抗坏血酸含量减少的原因可能是发酵过程中乳酸菌不断产生乳酸，降低ph值，抗坏血酸受到ph变化的影响而分解，从而导致在黄花酶解液发酵过程中抗坏血酸的含量逐渐降低。
[0144]
乳酸是乳酸发酵黄花酶解液产生的主要有机酸，初始浓度为 762.81mg/l，由图4b
可以看出在发酵初期乳酸在酶解液中大量积累，直至发酵40h后乳酸的含量升高速率开始放缓，在60h后达到稳定，含量最高值可达到18628.03mg/l，较发酵前显著升高。
[0145]
由图4c发酵前的酶解液中乙酸含量较低，初始浓度为14.45mg/l，随着发酵时间的延长，乙酸的含量也逐渐升高，可以看出在发酵前期 0～8h内乙酸含量迅速升高，在12-48h内含量升高幅度较为缓慢，乙酸浓度最高可为550.34mg/l。适量的乙酸会给果汁带来令人愉悦的香味，但过高含量的乙酸会使果汁有一种腐败味，因此应该严格控制发酵时间。
[0146]
由图4d可以看出发酵过程中琥珀酸含量的变化呈现先增加后减少的趋势，在发酵的24h时含量最高为53.60mg/l，乳酸菌在三羧酸循环(tga)过程中合成琥珀酸和乳酸等有机酸，对果汁的酸味有着直接的影响。在24h后琥珀酸的含量开始降低，到发酵72h时含量降至20.92mg/l，原因可能是发酵后期琥珀酸逐渐分解。
[0147]
试验例4
[0148]
将实施例1所提供的黄花菜酶解液发酵前后香气成分分析
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(1)样品前处理
[0150]
在15ml玻璃样品瓶中加入5ml待测样品、10μl溶于乙醇的4
‑ꢀ
甲基-2-戊醇(0.522g/l)，2g nacl以及磁力搅拌子，将预先在气相进样口在老化1h的萃取头插入样品瓶的顶空部分，磁力搅拌的条件下顶空萃取后，将萃取头从样品瓶中拔出插入gc-ms进样口，每个样品重复三次平行。
[0151]
(2)gc-ms技术条件
[0152]
使用agilent 7890b型气相色谱，搭载agilent 5977b型质谱。色谱柱使用innowax(60mm
×
0.25mm
×
0.25μm)毛细色谱柱。进样模式为固相微萃取手动不分流进样，载气为he，流速为1ml/min；离子源为ei源，电离能量为70ev，采用全离子扫描模式。
[0153]
(3)定性定量分析
[0154]
定性主要是由气相色谱-质谱中nist 17质谱数据库、匹配度和保留时间对各个物质进行检索。按如下公式计算各样品中香气物质的含量，取3次检测结果的平均值为最终结果。
[0155][0156]
(4)roav值的计算
[0157]
roav值也称相对香气活性值，计算公式为：
[0158][0159]
式中：oav为各挥发性成分的气味活度值，c代表物质的质量浓度(μg/l)， t代表感觉阈值(μg/l)。
[0160]
(5)结果与分析
[0161]
①
乳酸发酵黄花酶解液香气组成
[0162]
对黄花酶解液的香气物质检测方法使用gc-ms结合顶空固相微萃取(spme)，从样品基质中提取和浓缩或富集挥发性化合物。
[0163]
图5反映了乳酸发酵前后的各类香气总量的变化，总体来看，发酵前后香气物质存在显著差异，大部分香气成分含量在发酵后都呈现升高趋势。部分香气物质由于发酵菌种
不同也存在显著差异。
[0164]
醛类：醛类物质主要为果汁提供植物香和麦芽烘焙香。黄花发酵前后共检测出10种醛类物质，复合菌种发酵产生的醛类物质最多，与其他发酵液存在显著差异。其中发酵前后都以2-甲基-2-丁烯醛为主，为果汁提供绿色植物香气。此外，发酵前的香气以3-甲基丁醛为主，呈现麦芽的香气。
[0165]
醇类：醇类物质主要为果汁提供花香、果香和植物香。由图5(b) 可以看出复合菌种发酵液的醇类物质含量最高，发酵前的果汁醇类物质浓度最低。1-戊醇和1-己醇是发酵前后含量变化不大的醇类物质，提供了愉悦的果香。乙酰甲基甲醇、α-松油醇、左薄荷脑、苯甲醇和苯乙醇等呈愉悦乳香和花果香的醇类物质在发酵后含量显著升高。2
‑ꢀ
庚烯-1-醇和1-辛烯-3-醇在发酵前的香气物质中含量较高，主要体现出辛辣、塑料味和泥土味，在发酵后含量显著降低，说明乳酸发酵可以减少黄花果汁中不良风味的含量。
[0166]
酸类：酸类物质是发酵前后含量差异最大的香气成分，除了2-甲基-3-羟基丙酸外，其他7种酸的含量都在发酵后显著升高。挥发性酸类物质为黄花果汁带来酸味和乳香，为果汁的香气丰富度做出贡献。
[0167]
酯类：黄花在发酵前后共检测出10种酯类物质，发酵前有4种，发酵后的酯类物质的种类明显增多，复合乳酸发酵产生的酯类香气物质含量最高。为发酵液带来愉悦的果香和乳香。
[0168]
酮类：酮类物质赋予果汁乳香、果香和甜味。复合乳酸发酵产生的酮类物质香气浓度最高，与其他样品存在显著性差异。发酵前的1
‑ꢀ
辛烯-3-酮呈现出金属味，在发酵后该挥发性成分含量显著降低，说明乳酸发酵减少了黄花汁中不良的的含量。具有令人愉悦的乳香和果香的成分2，3-丁二酮和二异丁基酮含量有所升高。
[0169]
从发酵前后的挥发性物质含量变化可以发现，发酵后的黄花酶解液酸味增强(乙酸)，乳制品的风味突出(乙酰甲基甲醇)，生青味减少(2-庚烯-1-醇)，分析可能是因为乳酸菌发酵副产物乳酸和其他有机酸给发酵液带来酸味，发酵前灭菌的步骤的加热也可能使酶解液中的香气成分有所分解或聚合。对比不同接种方式的发酵液中挥发性成分发现复合菌种发酵后产生愉悦香气的物质更多，香气的种类更丰富，因此本实验选择复合接种方式作为黄花乳酸发酵饮料的发酵方式。
[0170]
②
主要香气物质分析
[0171]
产品的香气不仅由香气物质的浓度决定，还与气味阈值有关， oav值是单个化合物的浓度与阈值的比值，可以用来评价挥发性化合物对香气的贡献。roav值是由香气物质的半定量结果计算出的相对气味活性值，一般将roav＞1的香气化合物视为总体香气的主要贡献者。0.1＜roav＜1的成分视为对总体香气起贡献。
[0172]
在计算了黄花发酵前后的roav值后，可以发现对发酵前的黄花酶解液香气影响最大的是乙酸丁酯，体现出梨和香蕉的愉悦果香，该香气成分对发酵液的香气也有贡献，其中两种菌种复合发酵液中体现的较明显。在发酵液中对香气贡献最大的物质是α-大马酮，以花香和甜味为主。
[0173]
③
黄花发酵前后香气物质的pls-da分析
[0174]
为了筛选出区分不同样品间的高贡献香气组分，在主成分分析的基础上再使用偏最小二乘分析所有样品里的香气成分。由图6可以看出植物乳杆菌发酵液中高贡献相对较
多，其中含量较高的关键挥发性成分为2-甲基丁醇、3-糠醛、香叶醇、二甲基三硫等；丁酸、3-甲基呋喃、乙酸和苯乙醇是复合菌种发酵液中的关键挥发性成分；三氯甲烷、4-乙酰氧基苯乙炔、1-辛烯-3-酮、3-甲基丁醛、乙酸和2-乙基己醇等是发酵前黄花酶解液的关键性挥发成分。
[0175]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。